專利名稱：睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑒定奶牛胚胎性別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑒定奶牛胚胎性別的方法。
背景技術(shù)：
一直以來，人們就渴望控制家畜的性別，特別是對(duì)于有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家畜，如牛、羊、豬等。對(duì)早期胚胎尤其是附植前胚胎進(jìn)行性別鑒定，再進(jìn)行移植，在畜牧生產(chǎn)中具有重要的科學(xué)研究價(jià)值和商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。鑒定胚胎性別的方法主要有細(xì)胞遺傳學(xué)分析、X染色體關(guān)聯(lián)酶活性的測定、胚胎發(fā)育率差異性分析、雄性特異性抗原的探測以及Y染色體特異性DNA探針的應(yīng)用。雖然使用流式細(xì)胞分類儀已成功分離了X、Y精子，并且有商品化的精液出售，但兩種限制因素依然存在，即分選的速度(可用性和價(jià)格)和受精率。一時(shí)還很難像常規(guī)精液一樣在實(shí)際生產(chǎn)中大面積推廣。胚胎移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用為控制家畜性別創(chuàng)造了另一條新途徑。如果一個(gè)胚胎在移植之前能夠確定性別，移植那些理想性別的胚胎，就可以達(dá)到性別控制的目的。隨著胚胎移植技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化推廣，早期胚胎的性別鑒定技術(shù)日益發(fā)展成熟，對(duì)奶牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定也是奶牛性別控制的有效途徑之一。
聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction。以下簡稱PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，為性別鑒定提供了新的思路。PCR法因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在家畜早期胚胎的性別鑒定中占有越來越重要的位置，其實(shí)質(zhì)就是Y-染色體特異性片段或Y-染色體上的性別決定基因的檢測技術(shù)。Herr等利用PCR技術(shù)，通過擴(kuò)增牛胚胎的性別決定基因(SRY)鑒定胚胎性別(Herr CM，Theriogenology，1990，33247-248)。我國的曾溢淘等采用兩對(duì)引物兩次擴(kuò)增牛的雄性單拷貝基因SRY基因鑒定了胚胎性別(曾溢淘，科學(xué)通報(bào)，1992，37479-480)。但由于SRY基因是單拷貝基因，其靈敏度較低，需擴(kuò)增2次，而且擴(kuò)增產(chǎn)物均采用凝膠電泳進(jìn)行檢測，一般的應(yīng)用單位不具備條件，所需時(shí)間也比較長。Bredbacka針對(duì)牛Y染色體高度重復(fù)序列區(qū)btDYZ-1設(shè)計(jì)出能擴(kuò)增出數(shù)千kb產(chǎn)物的引物，不用凝膠電泳的方法鑒定胚胎性別，但是無組內(nèi)對(duì)照，易出現(xiàn)假陰性，引起誤判(Bredbacka P，Theriogenology，1995，44167-176)。陳從英等采用嵌套式引物鑒定牛早期胚胎性別(畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，34(3)209～212)，但巢式PCR法擴(kuò)增雄性特異基因并采用電泳的方法檢測產(chǎn)物，擴(kuò)增過程中需2次加入引物，花費(fèi)的時(shí)間較長。奶牛胚胎性別鑒定技術(shù)是否成功，取決于其靈敏度和穩(wěn)定性。由于從胚胎取得的細(xì)胞樣品細(xì)胞數(shù)目較少，其靈敏度如何至關(guān)重要。由于SRY、ZFY(鋅指結(jié)構(gòu)蛋白基因)等為單拷貝基因，國內(nèi)外多采取相同引物對(duì)兩次擴(kuò)增法或套式PCR法。我國已利用牛的SRY基因和ZFY基因等建立了牛胚胎性別鑒定的PCR技術(shù)，但在該技術(shù)產(chǎn)業(yè)化方面的工作還比較薄弱。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是提供一種睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑒定奶牛胚胎性別的方法。
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是按以下方式實(shí)現(xiàn)的，該序列引物為5’-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3’5’-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3’。
以及所述的睪丸特異蛋白基因序列引物在奶牛胚胎性別鑒定中的應(yīng)用。
非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，該方法如下步驟先對(duì)胚胎分割取樣，然后，采用堿處理法提取樣品中胚胎細(xì)胞DNA模板，將胚胎細(xì)胞DNA模板分別放入兩個(gè)PCR反應(yīng)管中；之后，其中一管加入睪丸特異蛋白基因序列引物和反應(yīng)溶液，另一管加入雌雄共有序列引物和反應(yīng)溶液，在相同PCR反應(yīng)程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后直接將PCR反應(yīng)管置于紫外燈下激發(fā)檢測，觀察管內(nèi)熒光，根據(jù)熒光的有無或強(qiáng)弱來判斷睪丸特異蛋白基因片段是否成功擴(kuò)增，即該胚胎是公牛還是母牛；如果，兩管同時(shí)出現(xiàn)熒光，則判斷胚胎為公牛；如果只有雌雄共有序列引物反應(yīng)管出現(xiàn)熒光，則判斷為母牛；如果兩管均無熒光，則表明胚胎取樣失敗。
所述的堿處理法的步驟先將分割的胚胎樣品轉(zhuǎn)入預(yù)先加入5μl堿性裂解液的PCR反應(yīng)管中，50-70℃，5-15min，其中堿性裂解液包含50mM二硫蘇糖醇和200mM的氫氧化鉀；然后，再加入5μl中和液，中和液包含900mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH8.3，300mM氯化鉀，200mM鹽酸；這樣便獲得了胚胎細(xì)胞DNA模板。
所述的反應(yīng)溶液其中含胚胎樣品溶液5μl，10倍的緩沖溶液，1.5mM氯化鎂，100mM脫氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0-1μl溴化乙錠，ddH2O。
本發(fā)明的睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑒定奶牛胚胎性別的方法，提高了反應(yīng)的靈敏度，縮短了性別鑒定所需的時(shí)間，不容易產(chǎn)生污染，而且適合在胚胎移植現(xiàn)場操作，便于在生產(chǎn)實(shí)際中推廣應(yīng)用。


附圖為非電泳檢測鑒定奶牛胚胎性別的方法的流程框圖；具體實(shí)施方式
實(shí)施例1在培養(yǎng)皿中放3-4滴(每個(gè)液滴200μl)磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，在體視顯微鏡(SZX7-3121，OLYMPUS)下用MN-151金屬刀片割取胚胎。切割桑椹胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的10％左右或囊胚營養(yǎng)外胚層的10％左右樣進(jìn)行活組織檢查，切割后的胚胎待移植。每切割一枚胚胎需用70％的酒精和滅菌的超純水清洗刀片。將6枚胚胎按上述方法分別進(jìn)行分割取樣。
將分割后的6個(gè)胚胎樣品分別用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗3次，用移液槍(規(guī)格0.5-10μl)分別吸取分割的胚胎樣品(總體積約2μl)，轉(zhuǎn)入0.2mlPCR反應(yīng)管中(6個(gè))，每個(gè)PCR反應(yīng)管中預(yù)先放入5μl堿性裂解液(ALB)(ALB的組成50mM DTT和200mM KOH，即50mM二硫蘇糖醇和200mM的氫氧化鉀)，65℃，10min。然后加入5μl中和液(900mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH8.3，300mM氯化鉀，200mM鹽酸)。這樣便獲得了胚胎細(xì)胞的DNA模板溶液約12μl。每份胚胎樣品制備的上述溶液又分別加入雄性特異PCR反應(yīng)管和雌雄共有PCR反應(yīng)管中，各加入5μl作為PCR反應(yīng)模板。其中雄性特異PCR反應(yīng)管含睪丸特異蛋白基因序列引物(5’-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3’和5’-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3’)。雌雄共有PCR反應(yīng)管含雌雄共有序列引物(5’-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3’和5’-TCGTGAAAACCGCACACTG-3’)。
反應(yīng)終體積為50μl。其中含胚胎樣品溶液5.5μl，10倍的緩沖溶液，1.5mM氯化鎂，100mM脫氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0或1μl溴化乙錠，ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5℃4min；94℃1.5min，Tm 1min，72℃30s.35個(gè)循環(huán)；4℃保存。PCR反應(yīng)在PTC-200(MJ Research)上進(jìn)行。產(chǎn)物采用非凝膠電泳法檢測，它是在反應(yīng)體系中加入溴化乙錠(10μg/ml)后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增后直接在紫外燈下(302nm)觀察管內(nèi)熒光，采用數(shù)碼相機(jī)記錄結(jié)果。結(jié)果第一行得M為雄性對(duì)照，含睪丸特異蛋白基因序列引物的雄性特異PCR反應(yīng)管1，3，6出現(xiàn)紅色熒光；2，4，5無紅色熒光。第二行為含雌雄共有序列引物的雌雄共有PCR反應(yīng)管M為空白對(duì)照(無基因組DNA)，1-6均有熒光，則判定1，3，6為雄性奶牛胚胎，2，4，5為雌性奶牛胚胎。
權(quán)利要求
1.睪丸特異蛋白基因序列引物，其特征在于該序列引物為5’-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3’5’-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3’。
2.權(quán)利要求1所述的睪丸特異蛋白基因序列引物在奶牛胚胎性別鑒定中的應(yīng)用。
3.非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，其特征在于該方法如下步驟先對(duì)胚胎分割取樣，然后，采用堿處理法提取樣品中胚胎細(xì)胞DNA模板，將胚胎細(xì)胞DNA模板分別放入兩個(gè)PCR反應(yīng)管中；之后，其中一管加入睪丸特異蛋白基因序列引物和反應(yīng)溶液，另一管加入雌雄共有序列引物和反應(yīng)溶液，在相同PCR反應(yīng)程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后直接將PCR反應(yīng)管置于紫外燈下觀察管內(nèi)熒光，根據(jù)熒光的有無或強(qiáng)弱來判斷睪丸特異蛋白基因片段是否成功擴(kuò)增，即該胚胎是公奶牛還是母奶牛；如果，兩管同時(shí)出現(xiàn)熒光，則判斷胚胎為公奶牛；如果只有雌雄共有序列引物反應(yīng)管出現(xiàn)熒光，則判斷胚胎為母奶牛；如果兩管均無熒光，則表明胚胎取樣失敗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，其特征在于所述的堿處理法的步驟先將分割的胚胎樣品轉(zhuǎn)入預(yù)先加入5μl堿性裂解液的PCR反應(yīng)管中，50-70℃，5-15min，其中堿性裂解液包含50mM二硫蘇糖醇和200mM的氫氧化鉀；然后，再加入5μl中和液，中和液包含900mM三羥甲基氨基甲烷—鹽酸，PH8.3，300mM氯化鉀，200mM鹽酸；這樣便獲得了胚胎細(xì)胞DNA模板。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，其特征在于所述的反應(yīng)溶液其中含胚胎樣品溶液5-6μl，10倍的緩沖溶液，1.5-4mM氯化鎂，100mM脫氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0-1μl溴化乙錠，ddH2O。
全文摘要
本發(fā)明雄開了一種睪丸特異蛋白基因序列引物，該序列引物為5’－CCGCCATTACGCCCCCGACTTG－3’5’－GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT－3’。以及用常規(guī)PCR方法和非凝膠電泳法來鑒定奶牛早期胚胎性別的方法。本發(fā)明的睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，提高了反應(yīng)的靈敏度，縮短了性別鑒定所需的時(shí)間，不容易產(chǎn)生污染，而且適合在胚胎移植現(xiàn)場操作，便于在生產(chǎn)實(shí)際中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1995391SQ200610146220
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者黃金明, 劉玉慶, 游偉, 張俊功, 譚秀文, 吳乃科, 朱榮生, 柳堯波, 武英, 張秀美 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所