專利名稱：小型基因分析裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸分析裝置。更具體地說，涉及可進(jìn)行基因排序分析、基因多型分析及基因變異分析的裝置。
背景技術(shù)：
在確定DNA堿基排列順序時(shí)廣泛地使用采用了電泳及螢光檢測的方法。這種方法首先制作了許多用以進(jìn)行排序分析的DNA片段的復(fù)制品。以DNA的5’末端為起點(diǎn)制作各種長度的螢光標(biāo)記片段。另外，根據(jù)這些DNA片段的3’末端的堿基種類預(yù)先附加波長不同的螢光標(biāo)記。利用凝膠電泳識別一個(gè)堿基之差的長度不同，分別檢測各片段組所發(fā)出的光。根據(jù)發(fā)光波長的顏色便可知道測定中的DNA片段組的DNA末端的堿基種類。由于DNA從短的片段組起依次通過螢光檢測部，因而，通過測定螢光顏色便可以知道從短的DNA起依次的末端堿基種類。由此確定排序。這種螢光式DNA測序器廣泛地普及，并在人體基因組分析中非?；钴S。另一方面，如2003年宣言那樣，人體基因組排序分析已經(jīng)完成，進(jìn)入了將排序信息有效應(yīng)用到醫(yī)療及各種產(chǎn)業(yè)的時(shí)代。因此，已沒有必要對整個(gè)長的DNA進(jìn)行分析，而只要知道作為目標(biāo)的短的DNA排序往往已經(jīng)足夠了。對于這種DNA排序分析需要簡便的方法及裝置。
在作為滿足這樣的要求的方法而產(chǎn)生的技術(shù)中，有以熱測序?yàn)榇淼睦秒A段化學(xué)反應(yīng)確定排序的方法(例如專利文獻(xiàn)1-國際公開第98/13523號文件，專利文獻(xiàn)2-國際公開第98/28440號文件)。這種方法是使引物與作為目標(biāo)的DNA鏈雜交，將4種互補(bǔ)鏈合成核酸基質(zhì)(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)每一種依次加入到反應(yīng)液中以進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)。當(dāng)進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)時(shí)，DNA互補(bǔ)鏈加長，作為副產(chǎn)物生成了焦磷酸(ppi)。焦磷酸在共存的酶的作用下轉(zhuǎn)換成ATP，在螢光素和螢光素酶共存之下進(jìn)行反應(yīng)而發(fā)光。通過檢測這種光便可知道所加入的互補(bǔ)鏈合成基質(zhì)被連接到DNA鏈中，從而知道了互補(bǔ)鏈的排序信息，便相應(yīng)地知道了作為目標(biāo)的DNA鏈的排序信息。另一方面，在反應(yīng)中未使用的互補(bǔ)鏈合成基質(zhì)由于腺苷三磷酸雙磷酸酶等酶的作用而迅速分解，對以后的反應(yīng)階段沒有影響(例如專利文獻(xiàn)2)。進(jìn)行這種熱測序的裝置往往使用將具有96孔的反應(yīng)池(體積100μL以下)的滴定板用作反應(yīng)池板的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)。這種裝置將4種互補(bǔ)鏈合成核酸基質(zhì)(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)分別保持在各自的反應(yīng)試劑槽中，并依次注入反應(yīng)池(例如專利文獻(xiàn)3-國際公開第00/56455號文件)。即，預(yù)先將DNA、引物、互補(bǔ)鏈合成酶、化學(xué)發(fā)光試劑等加入到反應(yīng)池中，然后，使由4個(gè)管嘴構(gòu)成的試劑分注器的管嘴或滴定板沿X-Y方向和轉(zhuǎn)動(dòng)方向動(dòng)作，對試劑槽中的空氣加壓，從而使試劑液滴從管嘴前端部依次滴下而檢測發(fā)光。
另外，還公開了可進(jìn)行以上熱測序的小型化技術(shù)(例如，專利文獻(xiàn)4-日本特開2001-258543號公報(bào))。這種技術(shù)采用將細(xì)管從各dNTP槽連接到反應(yīng)部，利用這些細(xì)管依次注入4種dNTP的方法，暗示了實(shí)現(xiàn)小型而簡便的分析。
另一方面，作為小型的生物發(fā)光檢測裝置，公開了以加壓分配方式進(jìn)行試劑分注的發(fā)光檢測裝置(例如專利文獻(xiàn)5-日本特開2004-12411號公報(bào))。該技術(shù)將分注用毛細(xì)管與反應(yīng)池1對1地配置，通過加壓控制進(jìn)行試劑分注。
另外，作為可應(yīng)用于熱測序反應(yīng)的試劑，公開了與先前敘述的技術(shù)不同的反應(yīng)系統(tǒng)的例子(例如專利文獻(xiàn)6-日本特開平9-234099號公報(bào))。這種現(xiàn)有技術(shù)是使用丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的逆反應(yīng)，將AMP和PPi合成為ATP來測定AMP濃度的方法。
熱測序法由于所使用的反應(yīng)機(jī)理簡單，因而可以認(rèn)為是適合于裝置小型化和價(jià)格低廉化的方法。如上所述，由于在測定中需要四種互補(bǔ)鏈合成核酸基質(zhì)，因而需要將它們進(jìn)行高精度的分注。另外，為了實(shí)現(xiàn)小型化及價(jià)格低廉化，必須將所使用的試劑的總量微量化。
現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是，精度高的試劑分注機(jī)構(gòu)的價(jià)格高而且不能小型化。例如，為了小型化，需要在誤差10％以內(nèi)進(jìn)行0.1-0.2μL左右的分注。但是，現(xiàn)在，采用簡便的試劑分注方法的試劑滴下的方式，在分注例如0.4μL時(shí)，產(chǎn)生的分注誤差為15％左右，并且，在進(jìn)行0.4μL以下的分注時(shí)，由于液體的表面張力的作用，分注還往往不能實(shí)現(xiàn)。另外，作為實(shí)現(xiàn)微量分注的其它例子，在一般的噴墨方式的打印機(jī)中所使用的“噴泡”(注冊商標(biāo))技術(shù)存在的問題是，因加熱使試劑劣化，并難以實(shí)現(xiàn)方便的補(bǔ)給及維修。另外，能夠?qū)崿F(xiàn)簡便、廉價(jià)而且精度高的分注的利用了毛細(xì)管的加壓分配方式，由于毛細(xì)管的前端與反應(yīng)槽內(nèi)的試樣溶液接觸，所以有時(shí)存在在未對空氣進(jìn)行加壓時(shí)試劑泄漏的問題。
另外，還必須按預(yù)定的順序?qū)⑺姆N試劑注入反應(yīng)槽。現(xiàn)有技術(shù)的管嘴方式存在的問題是，既難以小型化，也難以并列進(jìn)行。即，在本技術(shù)領(lǐng)域中廣泛使用的96孔滴定板，雖然96個(gè)反應(yīng)槽(孔)以9mm的間距配置，但是不可能以9mm的間距設(shè)置多個(gè)現(xiàn)有技術(shù)的管嘴。因此，由于用一組管嘴對多個(gè)反應(yīng)槽進(jìn)行分注，因而存在的問題是，測定效率較低，橫向移動(dòng)機(jī)構(gòu)的體積大，價(jià)格昂貴。
另外，還需要使已分注的基質(zhì)能與反應(yīng)槽內(nèi)的試樣高效混合的機(jī)構(gòu)。為了實(shí)現(xiàn)簡便、小型而價(jià)格低廉的裝置，必須解決這些問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于解決這些問題。
為了解決上述問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是具有保持四種試劑的空間的一體型分注用芯片。本芯片采用使用了分注精度高的毛細(xì)管的加壓分配方式。為了實(shí)現(xiàn)以9mm的間距進(jìn)行配置，將芯片做成芯片裝在測定頭上的一次性的任意型號，從而可實(shí)現(xiàn)小型化并方便地進(jìn)行試劑的補(bǔ)充等。
再有，在保持芯片的測定頭部分上設(shè)有上下機(jī)構(gòu)。由此，在進(jìn)行試劑的分注時(shí)和攪拌時(shí)，可以控制毛細(xì)管和反應(yīng)槽內(nèi)的液體接觸或非接觸的狀態(tài)。在毛細(xì)管中還設(shè)有氣隙。這樣，可以防止試劑從接頭毛細(xì)管的前端部泄漏。另外，作為小型、簡便的氣隙的形成方法，通過設(shè)置利用在加壓分配方式中所使用的高壓氣體(空氣或氮?dú)獾?的微噴射器，利用由此而產(chǎn)生的負(fù)壓。這樣，便能可靠地生成氣隙。
作為本發(fā)明的分析裝置的一個(gè)例子，其特征在于，具有保持容納試劑的試劑容器的試劑容器保持機(jī)構(gòu)，使上述試劑容器保持機(jī)構(gòu)在上下方向移動(dòng)的移動(dòng)機(jī)構(gòu)，用于接受從上述試劑容器供給的上述試劑并容納液體的反應(yīng)槽，用于通過加壓將上述試劑從上述試劑容器供給給上述反應(yīng)槽的加壓機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽施加振動(dòng)的振動(dòng)施加機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽進(jìn)行光學(xué)檢測的檢測器。
作為本發(fā)明的分析裝置的一個(gè)例子，其特征在于，具有具備試劑導(dǎo)出部并保持容納試劑的試劑容器的試劑容器保持機(jī)構(gòu)，使上述試劑容器保持機(jī)構(gòu)在上下方向移動(dòng)的移動(dòng)機(jī)構(gòu)，用于接受從上述試劑容器供給的上述試劑并容納試樣的反應(yīng)槽，用于通過加壓將上述試劑從上述試劑容器供給給上述反應(yīng)槽的加壓機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽施加振動(dòng)的振動(dòng)施加機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽進(jìn)行光學(xué)檢測的檢測器，及用于將氣體層設(shè)置在上述試劑導(dǎo)出部的內(nèi)部的負(fù)壓發(fā)生機(jī)構(gòu)。
作為本發(fā)明的試劑成套件的一個(gè)例子，其特征在于，具有具備第一液體導(dǎo)出部、容納第一液體的第一槽，具備第二液體導(dǎo)出部、容納第二液體的第二槽，具備第三液體導(dǎo)出部、容納第三液體的第三槽，及具備第四液體導(dǎo)出部、容納第四液體的第四槽；上述第一液體導(dǎo)出部和上述第二液體導(dǎo)出部、上述第三液體導(dǎo)出部及上述第四液體導(dǎo)出部實(shí)質(zhì)上呈點(diǎn)對稱布置。
根據(jù)本發(fā)明，可以實(shí)現(xiàn)小型而又廉價(jià)的核酸分析裝置、基因排序分析裝置。首先，采用本發(fā)明的方法，分注芯片能廉價(jià)地實(shí)現(xiàn)需要的并列。并且，能夠小型、簡便地實(shí)現(xiàn)所要求的分注精度，進(jìn)而，試劑的補(bǔ)充等也很方便。另外，確定反應(yīng)效率的試劑的混合也適當(dāng)，能進(jìn)行高精度的排序分析。再有，就使用了毛細(xì)管的加壓分配方式而言，可以防止試劑的泄漏，使反應(yīng)精度提高。


圖1是裝置結(jié)構(gòu)的例子圖。
圖2是分注芯片的例子圖。
圖3是設(shè)有分注芯片的分注頭的說明圖。
圖4是說明測定時(shí)的裝置動(dòng)作順序的例子圖。
圖5是排序分析結(jié)果的例子圖。
圖6是測定時(shí)的裝置動(dòng)作順序的例子圖。
圖7是表示ATP分注量與發(fā)光量的關(guān)系圖。
圖8是表示微噴射器的圖及包含微噴射器的裝置結(jié)構(gòu)的例子圖。
圖9是改變了分注試劑的濃度進(jìn)行兩次分注時(shí)的發(fā)光量的例子圖。
圖10表示其他例子的微噴射器的剖面。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1下面，通過實(shí)施例說明本發(fā)明。
本發(fā)明使用在現(xiàn)有技術(shù)中已說明的熱測序法的原理來確定測定對象的基因排序。首先，圖1(a)表示了本發(fā)明的分析裝置的結(jié)構(gòu)例子。首先，裝置具有反應(yīng)槽架101。反應(yīng)槽架101以9mm間距將四個(gè)反應(yīng)槽1011～1014保持為一列。本裝置雖然利用酶進(jìn)行核酸鏈的加長，但由于酶反應(yīng)是在大致比室溫高的溫度條件下高效率地進(jìn)行反應(yīng)，因而，在反應(yīng)槽架101上最好連接有可以將它加熱或冷卻到任意溫度的溫度控制機(jī)構(gòu)(珀耳帖元件等)。此外，本實(shí)施例雖然表示的是反應(yīng)槽的數(shù)量是4個(gè)，并以9mm間距(96孔的滴定板的間距)配置的情況，但在實(shí)施時(shí)，個(gè)數(shù)和間距都是任意的，沒有限定。進(jìn)而，通過將圖中的一列配置設(shè)置成多列，就可以增加反應(yīng)槽的總數(shù)。反應(yīng)槽架101可以通過振動(dòng)電機(jī)等的振動(dòng)發(fā)生器使其整體進(jìn)行振動(dòng)。這種振動(dòng)在試劑分注時(shí)起到了使已分注的試劑和反應(yīng)槽內(nèi)的試樣混合的作用。
光檢測部102整體用導(dǎo)電性材料的框體覆蓋。向反應(yīng)槽一側(cè)看到有與反應(yīng)槽的間距一致的四個(gè)光電二極管，在與反應(yīng)槽的邊界部具有在里面裝有透明電極層(ITO等)的玻璃1021。這種透明電極與覆蓋整體的導(dǎo)電性框體電連接，并連接在裝置的接地電位上。另外，在框體內(nèi)部包含有對光電二極管的信號進(jìn)行放大的放大器，并將其與檢測部外的A/D轉(zhuǎn)換電路連接。
A/D轉(zhuǎn)換電路103將光檢測信號數(shù)字化，并將數(shù)據(jù)傳輸?shù)窖b置控制及數(shù)據(jù)讀取用計(jì)算機(jī)。
分注頭104具有作為將分注芯片保持在內(nèi)部的分注芯片保持機(jī)構(gòu)的功能。在此，芯片具有分注用的毛細(xì)管，分注用毛細(xì)管的端面與反應(yīng)槽相對地保持。另外，與四種試劑分別對應(yīng)的4個(gè)加壓用的氣體管組105連接在電磁閥組106上。此外，也可以將分注頭和電磁閥組做成一體，還具有使分注頭整體上下移動(dòng)的機(jī)構(gòu)107。作為上下機(jī)構(gòu)107，簡單的結(jié)構(gòu)如圖1(b)所示，在分注頭104上設(shè)有齒條1071，用電機(jī)等對小齒輪1072進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。這時(shí)，利用接觸開關(guān)或電機(jī)的轉(zhuǎn)數(shù)便可控制分注頭的高度。此外，對于可進(jìn)行高度控制的這種情況的效果將于后述。另外，為了簡單，也可以使用從高壓氣體源供給的氣體的氣缸來使其上下移動(dòng)。在這種情況下，由于上下控制可以通過密封使用了一個(gè)電磁閥的氣體來實(shí)現(xiàn)，因而極其簡便。
電磁閥組具有四個(gè)三通式電磁閥，其高壓氣體源一側(cè)連接在裝置具有的高壓氣體罐或?qū)嶒?yàn)室設(shè)置的高壓氣體管路源上。另外，排氣一側(cè)再通過一個(gè)電磁閥108連接在負(fù)壓源109即微噴射器上。負(fù)壓源109使用微噴射器和高壓氣體源來產(chǎn)生約0.5個(gè)大氣壓左右的負(fù)壓。負(fù)壓的發(fā)生由電磁閥108進(jìn)行控制。
圖2表示分注芯片的俯視圖及剖視圖。分注芯片具有用以分別單獨(dú)保持四種試劑的試劑槽201-204。試劑槽分別具有作為分注路徑的毛細(xì)管2011-2014。本實(shí)施例中，作為毛細(xì)管，使用總長為20mm、外徑約為350μm、內(nèi)徑約為50μm的玻璃毛細(xì)管，一個(gè)試劑槽的內(nèi)徑為2.4mm，長度為10mm。試劑槽的容量約為45μL。作為容納在試劑槽中的四種試劑的例子，假定為脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。具體地，假定為在四個(gè)試劑槽的各個(gè)中分別容納有脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)及脫氧烏苷三磷酸(dGTP)。此外，也可以使用dNPP的類似體。例如，有不是三磷酸，而是相當(dāng)于α位置的一個(gè)磷原子被硫原子取代了的dNTPαS等。
分注芯片通過實(shí)質(zhì)上點(diǎn)對稱地配置四個(gè)試劑槽，從而將各試劑間的分注位置從中心均勻地配置。這具有以下優(yōu)點(diǎn)。首先，通過使分注芯片和反應(yīng)容器的中心一致，四種試劑不會(huì)產(chǎn)生位置上的差異。即，反應(yīng)容器內(nèi)的毛細(xì)管位置與分注后的試劑的混合程度緊密相關(guān)。由于反應(yīng)容器是圓筒，因而考慮到了試劑的混合性能的理想的分注位置是容器的中心。但是，在將四種試劑一起分注的情況下，要將全部都作為中心就必須有水平方向的移動(dòng)機(jī)構(gòu)等，裝置的成本則隨之增加。因此，為了均勻地對四種試劑進(jìn)行操作，將反應(yīng)容器的中心實(shí)質(zhì)上配置成同心圓狀是最佳的。
另外，將試劑槽的底面，即與毛細(xì)管的接觸部分做成以毛細(xì)管配置位置為中心的實(shí)質(zhì)上的圓錐形狀(2021)。這樣，可以減少死區(qū)的容積，即不能進(jìn)行試劑分注的量。另外，由于分注芯片主體做成線對稱，因此，為了使四種試劑的配置不會(huì)弄錯(cuò)，預(yù)先加上定位用標(biāo)記2022也很方便。再有，將芯片的上面2023設(shè)計(jì)成其端面實(shí)質(zhì)上位于同一平面上。這樣作的優(yōu)點(diǎn)是，在芯片架上容易利用后述的氣密保持用部件3001-3004保持氣密狀態(tài)。另外，同樣地在上部使用密封用蓋或密封劑，可以方便地防止試劑的干燥。
另外，由于本芯片主體是直徑9mm以下的圓筒狀，能有效地配置在滴定板上。
圖3是示意地說明分注頭的圖。圖3(1)是分注頭上部的仰視圖，圖3(2)是有關(guān)頭部分的剖視圖，圖3(3)是分注頭下部的俯視圖。分注頭組裝成使圖3(1)的底面和圖3(3)的上面合在一起。詳細(xì)地說，分注頭是做成可以分離為分注頭下部301和分注頭上部302兩部分，在其間夾住圖2所示的分注芯片的結(jié)構(gòu)。分注頭下部設(shè)有各分注芯片的毛細(xì)管通過的孔。分注頭上部對一個(gè)芯片設(shè)有四個(gè)與各芯片的試劑槽連接的高壓氣體流入口。標(biāo)號303表示了一個(gè)高壓氣體流道。一個(gè)高壓氣體流道對應(yīng)于一個(gè)試劑槽，并與分注芯片的氣體流入口連接。流道匯聚成一個(gè)并連接在一條氣管上。標(biāo)號3001-3004與芯片密合，可以保持各試劑槽的氣密。作為密合性最佳的部件，以硅橡膠或合成橡膠(商品名)等具有橡膠彈性的材料制成為佳。
下面，首先說明本發(fā)明的分注芯片等的特性。使用了毛細(xì)管的加壓分配方式的特征是對于微量分注的分注精度高。例如，在進(jìn)行本實(shí)施例的分注量為0.20μL的分注時(shí)，其分注誤差可以達(dá)到約10％以下。另外，內(nèi)徑為25μm的比本實(shí)施例更細(xì)的毛細(xì)管，其分注誤差為約8％以下。在此，對使用細(xì)管(毛細(xì)管)的效果進(jìn)行說明。對于本發(fā)明的分注方法，試劑分注量Q根據(jù)所施加的外壓力和加壓時(shí)間按照以下的哈根—泊肅葉定律確定。
Q＝ΔP·π·r4·t/(8μL)此處，ΔP壓力，r；細(xì)管直徑，t加壓時(shí)間，μ溶液的粘度，L細(xì)管的長度。
分注精度由于通過可控制的機(jī)構(gòu)確定，因而，這種情況對加壓壓力的誤差和加壓時(shí)間的評價(jià)是至關(guān)重要的。如上式所示，在這些誤差相等的情況下，源于這些誤差的分注量的誤差與細(xì)管的半徑的4次方成正比，而與細(xì)管的長度成反比。因此，直徑越小，加壓壓力及分注時(shí)間的誤差、對分注誤差的影響越小。在本實(shí)施例中，所使用的細(xì)管的直徑范圍為50μm-25μm。作為管徑，雖然也可以使用管徑為1-25μm左右者，但根據(jù)分注對象的試劑的情況，容易發(fā)生堵塞。另一方面，當(dāng)使用比50μm大的管徑時(shí)，如上所述，分注精度惡化。所使用的管徑雖然可以根據(jù)使用方式的分注量和所要求的分注精度適當(dāng)決定，但在本實(shí)施例的分注量及考慮了堵塞的條件下，以采用25-50μm的細(xì)管為宜。分注量由分注前后的質(zhì)量變化求得，其誤差基本上在測定界線內(nèi)。另外，在本系統(tǒng)中，通過在未進(jìn)行分注時(shí)，也預(yù)先使毛細(xì)管的前端部與反應(yīng)槽內(nèi)的液體接觸，也可以省掉裝置的上下機(jī)構(gòu)107。但是，在使其預(yù)先接觸的情況下，可以想像到不需要的試劑從毛細(xì)管的前端會(huì)發(fā)生泄漏。也就是說，對于通常的使用方法，用試劑充滿了毛細(xì)管內(nèi)部。但本裝置在核酸檢測中，由于需要能以任意的量分注四種試劑中的任一種，因而，不希望的試劑泄漏到反應(yīng)容器內(nèi)的情況將導(dǎo)致不希望的反應(yīng)的發(fā)生，從而引起重大的測定誤差。因此，按以下方式評價(jià)本裝置的因試劑的擴(kuò)散引起的泄漏量。評價(jià)使用生物發(fā)光的試劑進(jìn)行。首先，將作為生物發(fā)光試劑的螢光酶及螢光劑溶解在緩沖液中并分注到反應(yīng)容器內(nèi)，并將試劑ATP分注到毛細(xì)管中。相對于ATP的分注量的發(fā)光量如圖7的例子所示，由于其為直線且是已知的，因此，通過測定未分注，即未流入高壓氣體時(shí)在放置狀態(tài)下所得到的弱的發(fā)光，就可以評價(jià)ATP的泄漏量。
首先，在將反應(yīng)槽保持靜止的狀態(tài)下，測定了二分鐘的試劑泄漏量時(shí)，沒觀測到泄漏。另一方面，為了攪拌試劑，當(dāng)用振動(dòng)發(fā)生器使反應(yīng)槽振動(dòng)20秒鐘時(shí)，觀測到了大量的泄漏。即，我們知道，在進(jìn)行試劑的攪拌時(shí)，在攪拌前使毛細(xì)管的前端與試劑脫離是很重要的。但是，在使用上下機(jī)構(gòu)的情況下，再次將毛細(xì)管的前端部插入到反應(yīng)槽內(nèi)的液體中時(shí)，觀測到了可以認(rèn)為是插入時(shí)的沖擊為主要原因的試劑的泄漏。例如，對于內(nèi)徑為50μm的毛細(xì)管，由于將其前端部插入到反應(yīng)槽的液面時(shí)的沖擊，觀測到了約6nL的試劑泄漏。另外，對于內(nèi)徑為25μm的毛細(xì)管，同樣地觀測到了約3nl的試劑泄漏。對于這些問題，在試劑分注后，使毛細(xì)管的前端部與反應(yīng)槽的液面脫離，然后，通過在毛細(xì)管的前端部(液體溶出端部)精制成氣體(此處為空氣)的層，即氣隙便可得到解決。這是因?yàn)?，由于氣體層的存在，使毛細(xì)管內(nèi)部的試劑邊界位置進(jìn)入管內(nèi)約5mm左右，可以避免從毛細(xì)管的前端部偶然產(chǎn)生的試劑泄漏。氣隙通常只要用注射器等抽吸試劑槽即可生成。但是，在使用注射器的場合，存在的問題是，因其需要包含機(jī)構(gòu)的系統(tǒng)而變得復(fù)雜并使成本增高。因此，本實(shí)施例中，作為更簡便的方法，利用使用了微噴射器的產(chǎn)生負(fù)壓的方法。所謂微噴射器如圖8(a)的剖視圖所示，是一種具有與細(xì)管81和高壓氣體源連接的殼體82的負(fù)壓發(fā)生機(jī)構(gòu)。內(nèi)部的高壓氣體從流入口801流到排出口802時(shí)，在內(nèi)部的細(xì)管附近便產(chǎn)生如803那樣的氣流，其結(jié)果，細(xì)管內(nèi)部的空氣向804方向抽吸，結(jié)果便在805方向產(chǎn)生負(fù)壓。圖10表示其他例子的微噴射器的剖面。在本例中，微噴射器由細(xì)管1101、殼體1100及管子1102構(gòu)成。細(xì)管1101與高壓氣體源連接。管子1102與試劑槽連接。如1111與1112所示，在高壓氣體從微噴射器的流入口導(dǎo)入排氣口時(shí)，在細(xì)管的周圍產(chǎn)生如1113所示的流動(dòng)。其結(jié)果，發(fā)生1114所示的負(fù)壓。本裝置由于已經(jīng)有高壓氣體源，因而，如果用微噴射器，則可以簡單地得到負(fù)壓。通過僅以極短的時(shí)間使試劑槽與微噴射器連接，便可在毛細(xì)管中形成并施加負(fù)壓。其結(jié)果，所形成的約5mm的氣隙便能防止試劑的泄漏，對于內(nèi)徑為50μm的毛細(xì)管，泄漏量可減少到約0.6nL。使用了微噴射器形成的負(fù)壓，由于機(jī)構(gòu)很小而簡便，因而，很適合于小型的基因檢測等的核酸分析裝置。圖8(b)表示具有微噴射器的裝置的結(jié)構(gòu)例子。此處，微噴射器1000具有細(xì)管81和殼體82。殼體82通過電磁閥108和管子810直接連接到高壓氣體源上。另外，細(xì)管81通過管子811連接到電磁閥組106的排氣口上。當(dāng)氣體由高壓氣體源經(jīng)管子810流入到殼體82中時(shí)，便如上所述在細(xì)管81中產(chǎn)生負(fù)壓，對電磁閥組106的排氣口進(jìn)行抽吸。電磁閥組106如上所述，由于是三通式電磁閥，因而在電磁閥斷開時(shí)，排氣口便直接與管子組105連通。因此，抽吸排氣口就是抽吸分注芯片的試劑槽中的空氣。抽吸時(shí)間由于可以通過電磁閥108的通/斷控制，因而，只對試劑槽的空氣抽吸所要求的時(shí)間。因此，只要將抽吸時(shí)間適當(dāng)設(shè)定，便可以在毛細(xì)管的前端形成所要求的氣隙。
試劑泄漏的問題在核酸分析裝置中是很重要的。例如，在利用熱測序的排序分析中，分注四種核酸基質(zhì)中的一種，其結(jié)果，由于以發(fā)光來確認(rèn)核酸是否產(chǎn)生伸長，因而，當(dāng)混入目標(biāo)核酸基質(zhì)以外的物質(zhì)時(shí)，這將成為其原有狀態(tài)的分析誤差。當(dāng)連續(xù)地評價(jià)多堿基的排序時(shí)，由于其分析誤差隨所分析的排序數(shù)呈指數(shù)地增加，因而，能夠分析的堿基長受到顯著的限制。因此，試劑的泄漏量的減少是重要的任務(wù)。本實(shí)施例的核酸分析裝置的反應(yīng)槽的液體試樣量使用約20μL左右。泄漏量0.6nL相對于此為萬分之一以下，是可以忽略不計(jì)的值。即，采用本結(jié)構(gòu)，可將泄漏量降低到可忽略不計(jì)的程度。
下面，說明使用了本實(shí)施例的裝置的基因分析方法。圖4表示利用本實(shí)施例的分注芯片分注作為試劑的四種dNTP(即，dATPαS、dGTP、dCTP、dTTP)中的一種時(shí)的分注頭，加壓和攪拌用振動(dòng)電機(jī)的動(dòng)作的時(shí)序圖。其動(dòng)作如下。首先，使分注頭下降，使毛細(xì)管前端與反應(yīng)槽內(nèi)的液體的液面接觸。其次，利用高壓氣體加壓與需要的試劑分注量相應(yīng)的加壓時(shí)間以進(jìn)行試劑的分注。然后，使分注頭上升，使毛細(xì)管前端與反應(yīng)槽內(nèi)的液體的液面脫離。最后，使攪拌電機(jī)工作預(yù)定的攪拌時(shí)間，同時(shí)進(jìn)行負(fù)壓抽吸規(guī)定的時(shí)間以在毛細(xì)管內(nèi)生成氣隙?；蚺判蚍治鲋灰獙γ總€(gè)堿基的分析重復(fù)進(jìn)行這一系列的動(dòng)作即可。圖5表示在本實(shí)施例中得到的基因排序分析的例子。此外，圖5所示的所謂“基質(zhì)”的A、G、C、T是分別指dATPαS、dGTP、dCTP、dTTP。即，其中只有A使用dATP的類似體，分析的結(jié)果表明，與作為預(yù)先已知的試樣的堿基排序完全一致。
實(shí)施例2使用了實(shí)施例1所述的裝置，記載了有關(guān)試劑分注的再一個(gè)實(shí)施例。首先，在分注一種基質(zhì)時(shí)，預(yù)先將基質(zhì)的濃度及分注量減小，分多次進(jìn)行分注。若采用本裝置，可簡單地實(shí)現(xiàn)這種分注方法。這種方法對以下各種情況是有效的，即上述的泄漏量為0.6nL左右的情況，以減小泄漏的分子量為目的而降低試劑的濃度的情況以及連續(xù)進(jìn)行排序分析時(shí)，隨著觀測到相同的堿基的連續(xù)而有必要補(bǔ)加試劑的情況等。本實(shí)施例中對進(jìn)行兩次分注進(jìn)行說明。圖6表示的是將一種試劑分成進(jìn)行兩次分注時(shí)的分注頭，加壓和攪拌用振動(dòng)電機(jī)的動(dòng)作的時(shí)序圖。將相同的試劑分成兩次分注，當(dāng)將由第一次分注引起的發(fā)光和由第二次分注引起的發(fā)光進(jìn)行比較時(shí)，可以對作為試樣的核酸的伸長反應(yīng)已完全進(jìn)行或者還剩余了未反應(yīng)的試樣進(jìn)行判斷。圖9是改變分注的試劑的濃度進(jìn)行了兩次分注的例子。虛線是相對于實(shí)線的條件，將分注的試劑濃度變成1/2，對兩者901及902都進(jìn)行了兩次分注。由該圖可見，在已注入的試劑充分的情況下，在902的分注中幾乎未見到發(fā)光峰值，與此相對，在試劑濃度為1/2的情況下，由于剩余了未反應(yīng)成分，因而，即使在第二次分注中也見到了發(fā)光。本實(shí)施例雖是一個(gè)例子，但從這樣經(jīng)多次注入的結(jié)果所得到的發(fā)光信號，可以判斷已注入的試劑是否充分。
這對提高排序分析的精度是有效的。這是因?yàn)?，注入的試劑量對反?yīng)來說應(yīng)是最佳量。假如注入的量不足，未反應(yīng)的核酸將成為其后的測定的干擾源。當(dāng)混入過剩的量時(shí)，注入下一個(gè)試劑時(shí)，由于前一個(gè)試劑未完全分解而殘留將引起滯留。滯留成為預(yù)先反應(yīng)等的重要原因，從而使測定精度惡化。
最佳的試劑量隨加長的堿基數(shù)而不同。即，加長2個(gè)堿基時(shí)比加長一個(gè)堿基時(shí)需要2倍的試劑量。作為測定對象的核酸由于多為排序數(shù)是未知的情況，因而注入的試劑的堿基長是未知的。因此，不能預(yù)先確定最佳試劑量。這時(shí)，根據(jù)需要多次分注是有效的。
實(shí)施例3使用了實(shí)施例1所述的裝置，記載了有關(guān)一次分注多種試劑的方法的再一個(gè)實(shí)施例。
實(shí)施例2中雖然是一種一種地分注了四種基質(zhì)，但根據(jù)需要，也可以同時(shí)分注四種中的二種、三種或全部，即二種以上的基質(zhì)。這時(shí)，分注芯片可以利用與通常的排序分析用的芯片相同的芯片是重要的。例如，多型分析中，有在伸長探針側(cè)為了可進(jìn)行多型判定而將3’末端做成多型，以判斷其互補(bǔ)性，進(jìn)行多型分析的技術(shù)。這時(shí)，所用的試劑是四種基質(zhì)的混合液。因此，與通常的排序分析試劑在操作上是不同的，在進(jìn)行多型分析時(shí)必須特別準(zhǔn)備四種基質(zhì)的混合溶液。但是，本裝置在進(jìn)行了排序分析之后，只更換反應(yīng)槽的試樣，可以將相同的試劑分注管用于多型分析中，可以簡便地實(shí)現(xiàn)種種分析。
另外，在進(jìn)行已知的排序的確認(rèn)分析的場合，在預(yù)先有SNP異質(zhì)的可能性的場合，通過同時(shí)分注其兩種堿基，從而在熱測序中不會(huì)產(chǎn)生成為問題的位相偏差。
實(shí)施例4
對于實(shí)施例1所述的分注芯片，記載了有關(guān)向?qū)嶒?yàn)者的供給的再一個(gè)實(shí)施例。此處，有使實(shí)驗(yàn)者和供給者的試劑管理變得簡便的例子。本發(fā)明雖然可以采用將四種核酸基質(zhì)注入分注芯片的試劑槽的方法，但也可以預(yù)先將四種核酸基質(zhì)分注到該分注芯片中，并在該狀態(tài)下密封冷凍的方法。假如試劑銷售者預(yù)先對試劑進(jìn)行密封和冷凍，則實(shí)驗(yàn)者只要通過將密封好的分注芯片安裝到分注頭上就可以開始實(shí)驗(yàn)。由于分注芯片因進(jìn)行了滅菌和冷凍而不會(huì)變質(zhì)，生產(chǎn)成本也低，因此，通過將分注芯片做成一次性用品，可以顯著降低因試劑的污染帶來的實(shí)驗(yàn)缺陷的可能性。
本發(fā)明可以將作為生命科學(xué)和生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的基本工具的核酸應(yīng)用到分析裝置，更具體的說，應(yīng)用到DNA排序確定裝置及DNA檢測裝置。
權(quán)利要求
1.一種分析裝置，其特征在于，具有保持容納試劑的試劑容器的試劑容器保持機(jī)構(gòu)，使上述試劑容器保持機(jī)構(gòu)在上下方向移動(dòng)的移動(dòng)機(jī)構(gòu)，用于接受從上述試劑容器供給的上述試劑并容納液體的反應(yīng)槽，用于通過加壓將上述試劑從上述試劑容器供給給上述反應(yīng)槽的加壓機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽施加振動(dòng)的振動(dòng)施加機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽進(jìn)行光學(xué)檢測的檢測器。
2.一種分析裝置，其特征在于，具有具備試劑導(dǎo)出部并保持容納試劑的試劑容器的試劑容器保持機(jī)構(gòu)，使上述試劑容器保持機(jī)構(gòu)在上下方向移動(dòng)的移動(dòng)機(jī)構(gòu)，用于接受從上述試劑容器供給的上述試劑并容納試樣的反應(yīng)槽，用于通過加壓將上述試劑從上述試劑容器供給給上述反應(yīng)槽的加壓機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽施加振動(dòng)的振動(dòng)施加機(jī)構(gòu)，對上述反應(yīng)槽進(jìn)行光學(xué)檢測的檢測器，用于將氣體層設(shè)置在上述試劑導(dǎo)出部的內(nèi)部的負(fù)壓發(fā)生機(jī)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析裝置，其特征在于上述試劑容器是具有試劑槽部和試劑導(dǎo)出部的試劑容器，上述移動(dòng)機(jī)構(gòu)使上述試劑容器保持機(jī)構(gòu)移動(dòng)，從而在供給上述試劑時(shí)使上述試劑導(dǎo)出部的導(dǎo)出端與上述液體接觸，并在供給上述試劑之后使上述試劑導(dǎo)出部的導(dǎo)出端脫離上述液體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析裝置，其特征在于上述加壓機(jī)構(gòu)是通過供給氣體進(jìn)行加壓的加壓機(jī)構(gòu)，上述試劑容器保持機(jī)構(gòu)還具有連接上述加壓機(jī)構(gòu)和上述試劑容器的氣體流道。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分析裝置，其特征在于上述試劑容器具有容納第一液體的第一槽、容納第二液體的第二槽、容納第三液體的第三槽和容納第四液體的第四槽；上述加壓機(jī)構(gòu)對上述第一液體、上述第二液體、上述第三液體和上述第四液體中的任意一種進(jìn)行加壓以將其供給給上述反應(yīng)槽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分析裝置，其特征在于上述試劑容器具有容納第一液體的第一槽、容納第二液體的第二槽、容納第三液體的第三槽和容納第四液體的第四槽；上述加壓機(jī)構(gòu)對上述第一液體、上述第二液體、上述第三液體和上述第四液體中的任意二種以上進(jìn)行加壓以將它們供給給上述反應(yīng)槽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分析裝置，其特征在于上述試劑容器保持機(jī)構(gòu)以9mm的間隔保持多個(gè)上述試劑容器。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分析裝置，其特征在于上述負(fù)壓發(fā)生機(jī)構(gòu)是微噴射器。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分析裝置，其特征在于上述負(fù)壓發(fā)生機(jī)構(gòu)具有細(xì)管和連接在上述加壓機(jī)構(gòu)上的殼體。
10.一種試劑供給成套件，其特征在于，具有具備第一液體導(dǎo)出部、容納第一液體的第一槽；具備第二液體導(dǎo)出部、容納第二液體的第二槽；具備第三液體導(dǎo)出部、容納第三液體的第三槽；及具備第四液體導(dǎo)出部、容納第四液體的第四槽，上述第一液體導(dǎo)出部、上述第二液體導(dǎo)出部、上述第三液體導(dǎo)出部及上述第四液體導(dǎo)出部實(shí)質(zhì)上呈點(diǎn)對稱布置。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑供給成套件，其特征在于上述第一液體導(dǎo)出部、上述第二液體導(dǎo)出部、上述第三液體導(dǎo)出部及上述第四液體導(dǎo)出部的外徑在9mm以下。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑供給成套件，其特征在于上述第一液體導(dǎo)出部、上述第二液體導(dǎo)出部、上述第三液體導(dǎo)出部及上述第四液體導(dǎo)出部分別是毛細(xì)管。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑供給成套件，其特征在于上述第一液體、上述第二液體、上述第三液體和上述第四液體各個(gè)予以凍結(jié)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑供給成套件，其特征在于上述第一槽、上述第二槽、上述第三槽和上述第四槽的各個(gè)，其上述第一液體導(dǎo)出部、上述第二液體導(dǎo)出部、上述第三液體導(dǎo)出部和上述第四液體導(dǎo)出部的連接部分的各個(gè)實(shí)質(zhì)上是以上述第一液體導(dǎo)出部、上述第二液體導(dǎo)出部、上述第三液體導(dǎo)出部和上述第四液體導(dǎo)出部的各自的配置位置為中心的圓錐形。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸分析裝置。高精度地分注多種試劑的技術(shù)，由于現(xiàn)有技術(shù)的機(jī)構(gòu)復(fù)雜，所以難于實(shí)現(xiàn)小型化和低價(jià)格。為了以多種試劑實(shí)現(xiàn)使用毛細(xì)管的加壓分注方式，并減少除分注試劑以外的其它試劑的泄漏，通過在分注后在毛細(xì)管的前端部設(shè)置空氣層便可實(shí)現(xiàn)小型、簡便、價(jià)格低廉的分析裝置。
文檔編號C12Q1/68GK1975376SQ20061014688
公開日2007年6月6日 申請日期2006年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月28日
發(fā)明者梶山智晴, 神原秀記, 原田邦男 申請人:株式會(huì)社日立制作所