專利名稱：從全基因組中富集甲基化dna的方法及其所用層析柱組的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從全基因組中富集甲基化 DNA的方法及其所用層析柱組。
背景技術(shù)：
正常細(xì)胞功能的發(fā)揮與細(xì)胞本身的遺傳信息、遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào) 控相關(guān)，隨著人類基因組計劃的實施，國內(nèi)外對基因組所攜帶的遺傳信息 在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用己有比較深入的研究。相對而言，染色質(zhì) 所攜帶的表觀遺傳信息在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用才剛開始被認(rèn)識， 表觀遺傳學(xué)基因組正在興起。表觀遺傳學(xué)的過程包括DNA甲基化，組蛋白 的修飾和ATP依賴的染色質(zhì)的修飾，都可以引起基因表達(dá)的改變。其中 DNA的甲基化是目前的一個研究熱點。
疾病的發(fā)生、發(fā)展是細(xì)胞內(nèi)遺傳本身、遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控的紊 亂。大量的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果表明除了遺傳因素，環(huán)境因素在大多數(shù)疾 病發(fā)生、發(fā)展中有巨大的影響，而表觀遺傳調(diào)控機制在遺傳因素和環(huán)境因 素的互動關(guān)系中起了橋梁的作用，已有的研究結(jié)果表明表觀遺傳因素的作 用占百分之七十左右。近年的研究更進(jìn)一步指出表觀遺傳調(diào)控機制在多種 疾病發(fā)生中起主導(dǎo)作用?；虮磉_(dá)的表觀遺傳調(diào)控是保證細(xì)胞內(nèi)基因的時 空正確表達(dá)所必需的。因此，當(dāng)表觀遺傳調(diào)控出現(xiàn)異常時，在胚胎發(fā)育階 段可能引起各種先天性的發(fā)育缺陷，在成體階段可能造成各種疾病的發(fā)
生。后基因組時代表觀遺傳學(xué)的興起為解開生命奧秘及征服疾病帶來了希 望。
.在哺乳類動物中，胞嘧啶的甲基化是惟一已知的DNA內(nèi)源性修飾方 式，即通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)的催化作 用，將甲基基團(tuán)加在胞嘧啶的5' C位置處。在哺乳類動物細(xì)胞中，大多 數(shù)5，-甲基胞嘧啶(5mC)以雙核苷酸CpG的形式出現(xiàn)。CpG雙核苷酸在 人類基因組中的分布很不均勻，其中密度較高的區(qū)域稱為CpG島(CpG island)。人類50% 60%的基因有CpG島，據(jù)估計整個基因組有45,000 個CpG島，并且?guī)缀蹩偸俏挥诨騿幼雍?或)外顯子周圍。除了印記 基因和女性失活的X染色體的幾個基因外，正常情況下，在CpG島的CpGs 總是非甲基化的，而大多數(shù)CpG島之外的CpGs則是甲基化的。
DNA甲基化的機制及其作用尚未完全清楚，目前認(rèn)為它與控制基因表 達(dá)、DNA修復(fù)、外源基因的識別和剔除、以及染色體的穩(wěn)定性等相關(guān)。已 證實，CpG島的甲基化可以直接導(dǎo)致相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)沉默，啟動子 區(qū)域CpG島甲基化是與基因突變和缺失相并列的抑癌基因失活的第3種途 徑，并成為近年來腫瘤研究的熱點之一。
隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，DNA甲基化的檢測手段日漸豐富，常用技術(shù) 的基本原理主要可以歸納為四個方面:一種是依賴化學(xué)物質(zhì)對甲基化和非 甲基化胞嘧啶的化學(xué)活性不同，將甲基修飾基團(tuán)的差別轉(zhuǎn)變?yōu)閴A基序列的 不同，從而加以分離；另一種是依賴甲基化和非甲基化胞嘧啶對特定的限 制性內(nèi)切酶處理的不同反應(yīng)而實現(xiàn)；第三種是依據(jù)差異性雜交的原理；第 四種則是依靠甲基化CpG結(jié)合(methyl-CpG-binding domain, MBD)蛋白
家族對甲基化以及非甲基化的CpG序列的結(jié)合能力的不同進(jìn)行分離。此 外，還有單核苷酸法、甲基化接受力的檢測法等多種技術(shù)，這些技術(shù)極大 地促進(jìn)了表觀遺傳學(xué)的研究，推動了表觀基因組學(xué)研究的開展。目前雖然 已經(jīng)存在較多的DNA甲基化的檢測技術(shù)，但是每種方法都有一定的局限 性，難以達(dá)到大規(guī)模和全基因組范圍的分析。例如目前大量使用的基于 亞硫酸氫鈉對DNA的修飾的各項技術(shù)，包括甲基化特異性的PCR，即MSP， 以及被視為金標(biāo)準(zhǔn)的亞硫酸鹽測序法，即BSP，均由于亞硫酸氫鈉對DNA 修飾技術(shù)本身的瓶頸——改變了原有DNA的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA不穩(wěn)定； 難以準(zhǔn)確有效的保證亞硫酸氫鹽對DNA的修飾程度;改變了原有DNA的堿 基序列，增加了后續(xù)實驗室操作，包括PCR等的難度，而難以得到大規(guī)模 的應(yīng)用；同樣的，基于限制性內(nèi)切酶的檢測技術(shù)由于受到酶切位點的限制， 也難以在全基因組的范圍內(nèi)大規(guī)模應(yīng)用?，F(xiàn)有的表觀基因組學(xué)急需在高通 量、大規(guī)模的研究技術(shù)方面得到突破，以滿足全面地了解在疾病的發(fā)生過 程中甲基化譜式的改變的需要。如果能出現(xiàn)一種靈敏而特異的富集甲基化 和/或非甲基化DNA的方法，將有效規(guī)避上述幾種常用實驗技術(shù)的弊端， 大大增加大規(guī)模DNA甲基化檢測的發(fā)展和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從全基因組中富集甲基化DNA 的方法，能有效提高甲基化DNA富集的特異性和敏感性。為此，本發(fā)明還 要提供該方法所用的層析柱組。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法 包括如下步驟(1) 制備層析柱組，該層析柱組包括甲基化DNA特異的親和層析柱和 非甲基化DNA特異的親和層析柱；
(2) 抽提待測樣品DNA;
(3) 將待測樣品DNA與步驟(1)制備的非甲基化DNA特異的親和層 析柱進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以去除待測樣品DNA中的非甲基化DNA;
(4) 把經(jīng)步驟(3)所得的濾過液與甲基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行 結(jié)合反應(yīng)，以富集甲基化DNA。
一種適用于上述方法的層析柱組，包括甲基化DNA特異的親和層析柱 和非甲基化DNA特異的親和層析柱。
本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法，顯著提高從全基因組范 圍內(nèi)富集甲基化DNA的效率，且能明顯增加甲基化DNA富集的特異性和敏 感性。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 附圖是本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法的流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法，利用特異性非甲基化 CpG結(jié)合蛋白和甲基化CpG結(jié)合蛋白制成DNA親和層析柱組，對基因組DNA 進(jìn)行初步篩選，對甲基化的DNA進(jìn)行富集，具體實驗步驟如下(見附圖) l.制備DNA層析柱組
包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析 柱，其中
1) 構(gòu)建CGBP蛋白(麗—014593 ， Homo sapiens CpG binding protein) 的質(zhì)粒表達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的蛋白經(jīng)純化后結(jié)合 于固體基質(zhì)制成非甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4°C備用。
2) 構(gòu)建MBD2b (NM_015832， Homo sapiens methyl-CpG binding domain protein 2， isoform 2)蛋白的質(zhì)粒表達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行表 達(dá)，得到的蛋白純化后結(jié)合于固體基質(zhì)制成甲基化DNA特異的親和層析 柱，置于4。C備用；構(gòu)建MBD3L1 (AY038022, Homo sapiens methyl_CpG binding domain protein 3-like)蛋白的質(zhì)粒表達(dá)載體，在原核表達(dá)系 統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的蛋白純化后，于實驗時在加入待測DNA之前，與甲 基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行預(yù)孵育，加強甲基化DNA特異的親和層析 柱上MBD2b與甲基化的DNA的結(jié)合力。構(gòu)建kaiso (NM—006777， Homo sapiens zinc finger and BTB domain containing 33， ZBTB33)蛋白的 質(zhì)粒表達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的蛋白純化后結(jié)合于固 體基質(zhì)制成甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4。C備用。其中，所述固 體基質(zhì)包括溴化氰活化的S印herose 4B、 Agarose和磁珠。
2. 抽提待測樣品DNA
3. 利用親和層析柱組對待測樣品中甲基化和非甲基化的DNA成分進(jìn) 行分離和富集
1) 將待測樣品DNA與上述非甲基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合， 除去其中的非甲基化修飾的DNA成分;也可對通過對洗脫液中非甲基化的 DNA成分進(jìn)行富集，以備非甲基化DNA的后續(xù)檢測。
2) 將上述非甲基化DNA特異的親和層析柱的濾過液與甲基化DNA特異
的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。
3)將結(jié)合在甲基化DNA特異的親和層析柱上的DNA洗脫、純化。以實 現(xiàn)對甲基化修飾的DNA的富集。如果該部分DNA量較少，可通過PCR等方 法進(jìn)行放大。
為了保證本發(fā)明方法的特異性和靈敏度，每次實驗，均嚴(yán)格設(shè)置陰性 對照和陽性對照。其中，陰性對照為全基因組DNA經(jīng)全基因組PCR放大， 而后取其產(chǎn)物，稀釋500倍后作為模板，再次進(jìn)行全基因組放大，取第二 次全基因組放大的產(chǎn)物作為非甲基化狀態(tài)的陰性對照(由于PCR體系中的 dNTP未經(jīng)甲基修飾，無論原始模板的甲基化修飾狀態(tài)怎樣，經(jīng)兩次PCR 放大后，PCR產(chǎn)物中的剩余甲基可以忽略不計)；陽性對照為取全基因 組DNA作為模板(無論其甲基化狀態(tài)如何)，經(jīng)Sss-I甲基化酶進(jìn)行處理， 在其全部CpG結(jié)構(gòu)上加以甲基修飾，取其修飾產(chǎn)物作為甲基化DNA的陽性 對照。
實施例 1
應(yīng)用本發(fā)明的富集甲基化DNA的方法，對臨床肝癌樣本進(jìn)行DNA甲基 化異化譜的研究，具體步驟為 1.親和層析柱組的制備
包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析
柱，其中
1)構(gòu)建CGBP蛋白(麗—014593 ， Homo sapiens CpG binding protein, 人CpG結(jié)合蛋白)的質(zhì)粒表達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的 蛋白經(jīng)純化后結(jié)合于固體基質(zhì)制成非甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4"C備用。
2)構(gòu)建MBD2b (麗—015832， Homo sapiens methy卜CpG binding domain protein 2， isoform 2，人甲基化CpG結(jié)合蛋白異構(gòu)體2)蛋白的質(zhì)粒表 達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的蛋白純化后結(jié)合于固體基質(zhì) 制成甲基化DNA特異的親和層析柱，置于4。C備用；構(gòu)建MBD3L1(AY038022， Homo sapiens methyl-CpG binding domain protein 3-like)蛋白的質(zhì) 粒表達(dá)載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的蛋白純化后置于4'C備 用。
2. 抽提臨床肝癌樣本DNA
使用傳統(tǒng)的酚-氯仿方法從臨床肝癌樣本(-8(TC保存)中抽提DNA， 將抽提溶解好的DNA移入高壓滅菌過的1. 5ml離心管中，取lul進(jìn)行電 泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE, EB， 80MV, 1. 5小時電泳)，在FR-200紫 外與可見分析裝置上拍攝照片，并對照marker ( Lambda DNA/EcoRI+Hindlll)進(jìn)行定量。
3. 目的DNA的富集
1) 將待測DNA進(jìn)行超聲斷裂，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)進(jìn)行純化后測定濃度。而后，將DNA與上述非甲基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合，除去其中的非甲基化修飾的 DNA成分，收集濾過液；同時收集洗脫液，對非甲基化的DNA成分進(jìn)行富 集，以備非甲基化DNA的后續(xù)檢測。
2) 在上述甲基化DNA特異的親和層析柱中，加入MBD3L1蛋白進(jìn)行預(yù) 孵育，以加強甲基化DNA特異的親和層析柱中MBD2b蛋白與甲基化DNA
的親和能力。
3)將上述非甲基化DNA特異的親和層析柱的濾過液加入甲基化DNA 特異的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。收集洗脫液，采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)進(jìn)行純化。 4.甲基化DNA的進(jìn)一步檢測 將上述富集的甲基化DNA與人類全基因組CpG島檢測芯片進(jìn)行雜交， 依據(jù)雜交結(jié)果確定甲基化DNA所在的CpG島位置，與正常肝組織的DNA 甲基化譜進(jìn)行比較，得到肝癌的DNA甲基化異化譜。
權(quán)利要求
1. 一種從全基因組中富集甲基化DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備層析柱組，該層析柱組包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析柱；(2)抽提待測樣品DNA；(3)將待測樣品DNA與步驟(1)制備的非甲基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以去除待測樣品DNA中的非甲基化DNA；(4)把經(jīng)步驟(3)所得的濾過液與甲基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以富集甲基化DNA。
2. —種適用于權(quán)利要求1所述方法的層析柱組，其特征在于，包括甲 基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析柱。
3. 如權(quán)利要求2所述的層析柱組，其特征在于，所述甲基化DNA特異 的親和層析柱通過將特異性結(jié)合甲基化DNA的蛋白固定于層析柱的基質(zhì) 而制得。
4. 如權(quán)利要求3所述的層析柱組，其特征在于，所述特異性結(jié)合甲基 化DNA的蛋白包括MBD2b蛋白和kaiso蛋白。
5. 如權(quán)利要求2所述的層析柱組，其特征在于，所述非甲基化DNA 特異的親和層析柱通過將特異性結(jié)合非甲基化DNA的蛋白固定于層析柱 的基質(zhì)而制得。
6. 如權(quán)利要求5所述的層析柱組，其特征在于，所述特異性結(jié)合非甲 基化DNA的蛋白包括CGBP蛋白。7.如權(quán)利要求3或5所述的層析柱組，其特征在于，所述層析柱的基 質(zhì)包括溴化氰活化的S印herose 4B、 Agarose禾口磁珠。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種從全基因組中富集甲基化DNA的方法，包括制備層析柱組，該層析柱組包括甲基化DNA特異的親和層析柱和非甲基化DNA特異的親和層析柱；抽提待測樣品DNA；將待測樣品DNA與非甲基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以去除待測樣品核酸中的非甲基化DNA；把所得的濾過液再與甲基化DNA特異的親和層析柱進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以實現(xiàn)富集甲基化DNA的目的。本發(fā)明還公開了適用于該方法的層析柱組。本發(fā)明從全基因組中富集甲基化DNA的方法，能顯著提高從全基因組范圍內(nèi)富集甲基化DNA的效率，且明顯增加甲基化DNA富集的特異性和敏感性。
文檔編號C12N15/10GK101205536SQ200610147409
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月18日
發(fā)明者穎 秦, 肖華勝 申請人:上海生物芯片有限公司