專利名稱：一種結(jié)核桿菌重組卡介苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型的重組卡介苗。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌是引起人類和動物結(jié)核病的病原菌，由于其獨特的生物特性，如細(xì)胞壁厚、生長周期長、多為潛伏感染和易于耐藥等特點使結(jié)核病藥物治療面臨很大的困難。雖然在上世紀(jì)上半葉，已成功的研制出預(yù)防結(jié)核病的卡介苗(BCG)，以及治療結(jié)核病的特效藥物(如異煙肼，利福平等)，但到了上世紀(jì)末，結(jié)核病仍然是全球感染和傳染病的第一“殺手”。而且隨著艾滋病(HIV)在全球的肆虐，以及結(jié)核多重抗藥菌株(multi-drug resistantstrains)的出現(xiàn)等諸多原因，使得治療結(jié)核病的形勢更加嚴(yán)峻。
目前研制成功的唯一的能夠預(yù)防結(jié)核病的疫苗——卡介苗，雖然已在全球范圍內(nèi)廣泛使用，但在近期研究中發(fā)現(xiàn)，其許多臨床試驗結(jié)果并不是十分有效，免疫預(yù)防效果不穩(wěn)定，在全球范圍的免疫保護(hù)力檢測，由0-80％不等，并且對成人幾乎無效，對已感染患者更是沒有治療作用，因此就要求人們研究新型結(jié)核疫苗來代替BCG。研制新型疫苗的目的就是要在天然免疫過程中刺激更有效的免疫反應(yīng)來控制疾病的發(fā)生而不僅僅是刺激免疫反應(yīng)，這些疫苗應(yīng)盡可能的延長無癥狀感染的持續(xù)期，這樣就可以在結(jié)核發(fā)病期或是結(jié)核桿菌再次感染過程中延緩疾病的發(fā)生。
現(xiàn)階段研究結(jié)核病疫苗主要集中在以下幾個領(lǐng)域1.以BCG為載體，重組進(jìn)新基因的重組BCG。
2.營養(yǎng)缺陷型結(jié)核減毒活疫苗。
3.結(jié)核亞單位疫苗。
4.結(jié)核DNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種免疫效果穩(wěn)定的新型結(jié)核桿菌重組卡介苗，并提出該疫苗的制備方法。
本發(fā)明提出的結(jié)核桿菌重組卡介苗為rBCG-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
雖然卡介苗在臨床的使用已經(jīng)超過了半個世紀(jì)，但是由于其免疫保護(hù)效果在不同地區(qū)存在著明顯的差距.為了避免BCG的這些缺陷，可以利用結(jié)核桿菌的具有免疫保護(hù)效果的蛋白質(zhì)抗原重組入BCG中，從而增強(qiáng)卡介苗的免疫保護(hù)力。
實驗結(jié)果一再證明，結(jié)核桿菌的活菌苗對動物的免疫保護(hù)力要明顯高于死菌苗，這是因為結(jié)核桿菌分泌到菌體外的抗原在結(jié)核感染的初期階段能被第一類輔助性T細(xì)胞(Th1)所識別而誘發(fā)有效的免疫保護(hù)反應(yīng).這個結(jié)果對亞單位疫苗抗原的選擇提供了方向.由于抵抗結(jié)核桿菌的侵襲，主要依賴巨噬細(xì)胞內(nèi)的抗原特異性T細(xì)胞的活化，以及IFN-γ途徑的激活.所以如何發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)這兩方面的作用，也就成了本發(fā)明選擇抗原的依據(jù).
本發(fā)明所選用的重組進(jìn)入卡介苗的結(jié)核抗原Agg5B，Mpt64，Mtb8.4就屬于這樣的抗原。
Ag85B(SEQ.ID.NO1)屬于結(jié)核桿菌抗原85復(fù)合物家族成員.該家族是一類纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白，是結(jié)核桿菌ST-CF(short-term culture filtrates短期培養(yǎng)物的過濾后蛋白質(zhì))中早期的主要分泌性蛋白質(zhì).已被證明是一種潛在的毒力因子，可以特異結(jié)合纖維結(jié)合素及宿主體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，從而增強(qiáng)病原體的毒力.實驗證明Agg5B基因是重要的結(jié)核桿菌免疫保護(hù)性抗原.將其免疫小鼠，都獲得了明顯的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng).在用氣霧攻擊結(jié)核桿菌H37Rv毒株后，均獲得了接近BCG的免疫保護(hù)力.
(引自1.Patti，J.M.，B.L. Allen，M.J.McGavin，and M.Hook.1994.MSCRAMMmediatedadherence of microorganisms to host tissues.Annu.Rev.Microbiol.48585-617.VOL.68，2000DISRUPTION OF fbpA AND fbpB IN M.TUBERCULOSIS 7772.Ratliff，T.L.，R.McCarthy，W.B.Telle，and E.J.Brown.1993.Purificationof a mycobacterial adhesin for fibronectin.Infect.Irmmun.611889-1894.
3.Ratliff，T.L.，J.A.McGarr，C.Abou-Zeid，G.A.Rook，J.L. Stanford，J.Aslanzadeh，and E.J.Brown.1988.Attachment of mycobacteria to fibronectin-coated surfaces.J.Gen.Microbiol.1341307-1313.
4.李忠明當(dāng)代新疫苗)Mpt64(SEQ.ID.NO2)是結(jié)核桿菌的分泌性蛋白質(zhì)，也是結(jié)核桿菌ST-CF中的主要成分，可以占到結(jié)核桿菌培養(yǎng)基上清濾過液中蛋白質(zhì)總量的8％.相對分子質(zhì)量24KDa，既能刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)，又能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng).由Mpt64蛋白的免疫原性表位中，本發(fā)明選取了其(190～198)這段多肽為H-2D(b)限制性的CD8+T細(xì)胞表位.因為加入激活特異性的CD8+T細(xì)胞抗原成分可以提高疫苗的整體保護(hù)率(引自1.柏銀蘭，薛瑩，李元，徐志凱，師長宏，張海；結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白MPT64的免疫學(xué)特性；第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(J Fourth Mil Med Univ)2004；25(13)2.Harboe，M.，S.Nagai，M.E.Patarroyo，M.L.Torres，C.Ramirez，and N.Cruz.1986.Properties of proteins MPB64，MPB70，and MPB80 of Mycobacterium bovis BCG. Infect.Immun.52293-302.
3.李忠明當(dāng)代新疫苗)。
Mtb8.4(SEQ.ID.NO3)一種低分子量的T-細(xì)胞抗原.來源于結(jié)核桿菌濾過后培養(yǎng)物(culture filtrate)，是結(jié)核桿菌潛伏感染期的T細(xì)胞免疫反應(yīng)性抗原．能夠激起Th1型細(xì)胞反應(yīng)，刺激高水平的IFN-Y的分泌.(引自李忠明當(dāng)代新疫苗)本發(fā)明提出的重組BCG為rBCG-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4，它是由ag85B基因mpt64的190-198位的氨基酸序列所對應(yīng)的核酸序列以及mtb8.4基因連在一起，克隆進(jìn)原核生物一結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒中，將帶有重組基因的穿梭質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化到BCG中，而獲得重組BCG。
具體步驟如下ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4的構(gòu)建首先設(shè)計引物擴(kuò)增mpt64(190-198)-mtb8.4(簡稱8.4f)，(引物由DNA的5’端-3’端)上游ACAGTCGAC ATGAGGCTGTCGTTGAC(SEQ.ID.NO2)說明雙下劃線代表編碼Mpt64(190-198)肽段的基因.
單下劃線代表Sal I酶切位點下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG(SEQ.ID.NO5)說明單下劃線Hind III酶切位點以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv(上海市肺科醫(yī)院提供)DNA為模板，用以上兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用Sal I和Hind III雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒PET28a(+)(市售)中。
其次擴(kuò)增ag85B全長基因(ag85B)和成熟肽基因(Mag85B)上游TGGCCAATGACAGACGT(SEQ.ID.NO6)說明單下劃線代表Bal I酶切位點下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG(SEQ.ID.NO7)說明單下劃線代表Sal I酶切位點去掉信號肽的ag85B基因上游引物CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCT(SEQ.ID.NO8)說明單下劃線代表EcoR I酶切位點SEQ.ID.NO6和SEQ.ID.NO7組成ag85B全長基因，SEQ.ID.NO8和SEQ.ID.NO7組成ag85B成熟肽基因。
將擴(kuò)增的mpt64(190-198)-mtb8.4分別和ag85B全長基因以及成熟肽基因經(jīng)酶切，連接后，形成重組新基因(ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4)，測序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv結(jié)核全基因組相應(yīng)基因序列完全一致。
將重組好的基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4，克隆到原核生物一結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒PMV261(圖4)，制備BCG感受態(tài)細(xì)胞，將帶有重組基因的穿梭質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化到BCG中，形成重組BCG。重組BCG經(jīng)由western-blot(圖6)檢測后，證明重組基因確實已轉(zhuǎn)入到BCG中。
將重組BCG免疫C57/BL小鼠，對重組BCG進(jìn)行一系列的免疫水平檢測，包括運用ELISPOT方法對IFN-γ水平進(jìn)行檢測，ELISA方法檢測IgG(H+L)，IgG1，IgG2a等抗體水平，并與BCG進(jìn)行比較。
本發(fā)明將結(jié)核分枝桿菌三種具有明顯免疫保護(hù)力的抗原基因連接在一起，形成新的重組基因.這種組合不是簡單的疊加組合，而是選用Ag85B蛋白的基因與具CD8+T細(xì)胞表位的一段Mpt64抗原的肽段還有Mtb8.4抗原基因連接在一起，在大腸桿菌載體內(nèi)進(jìn)行克隆，并通過原核生物-結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BCG中，形成重組BCG。初步實驗表明用這種重組BCG免疫的小鼠與用普通BCG免疫的小鼠相比，在細(xì)胞因子分泌水平上要好于BCG，而在抗體水平上，兩者則相差不大?？梢姡撝亟MBCG將成為優(yōu)于BCG的新型抗結(jié)核桿菌疫苗。


圖1Ag85B基因克隆進(jìn)大腸桿菌載體PET28a(+)。
M代表Marker1.質(zhì)粒PET-28a-(+)2.ag85B基因組入質(zhì)粒PET-28a(+)3.PET28a(+)質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)物4.PET28a(+)-ag85BPCR產(chǎn)物。
圖2.mtp64(190-198)-mtb8.4基因克隆進(jìn)質(zhì)粒PET28a(+)中。
圖3重組基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4克隆進(jìn)入PET28a(+)質(zhì)粒。
圖4原核生物-結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒PMV261。
圖5重組基因轉(zhuǎn)入到穿梭質(zhì)粒PMV261中。
圖6Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4融合蛋白純化。
M代表Marker1-3雜蛋白漂洗4-5目的蛋白洗脫。
圖7 western方法檢測重組BCG。
圖8 ELISOPT方法檢測檢測IFN γ水平。
圖9 ELISA方法檢測抗Ag85B IgG(H+L)水平。
AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
圖10 ELISA方法檢測抗Ag85B IgG1水平。
AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
圖11 ELISA方法檢測抗Ag85B IgG2a水平。
AMMAg85B-Mpt64190-198-Mtb8.4。
具體實施例方式
1.重組基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4的構(gòu)建1)首先設(shè)計引物擴(kuò)增mpt64(190-198)-mtb8.4(簡稱8.4f)，上游ACAGTCGAC ATGAGGCTGTCGTTGAC說明雙下劃線代表編碼mpt64(190-198)肽段的基因．單下劃線代表Sal I酶切位點下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG說明單下劃線Hind III酶切位點以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株(H37Rv)DNA為模板，用以上兩條引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下98℃預(yù)變性5分鐘；98℃變性45秒，62℃復(fù)性45秒，72℃延伸2分30秒，30個循環(huán)；72℃延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用Sal I和Hind III雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒PET28a(+)中．2)擴(kuò)增ag85B全長基因(ag85B)和成熟肽基因(Mag85B)上游TGGCCAATGACAGACGT說明單下劃線代表Bal I酶切位點下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG說明單下劃線代表Sal I酶切位點去掉信號肽的ag85B基因上游引物CGAATTCTTCTCCCGCCCGGCGCT說明單下劃線代表EcoR I酶切位點以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株(H37Rv)DNA為模板，用以上兩條上游引物分別和下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下98℃預(yù)變性5分鐘；98℃變性45秒，62℃復(fù)性45秒，72℃延伸2分30秒，30個循環(huán)；72℃延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別用Bal I和Sal I雙酶切以及EcoRI和SalI雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒PET28a(+)中。
3)將擴(kuò)增的mpt64(190-198)-mtb8.4分別和ag85B全長基因以及成熟肽基因經(jīng)酶切，連接后，形成重組新基因(ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4和Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4)，蛋白的制備(利用重組基因Mag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4)活化菌體，移入1升培養(yǎng)基中搖2-3h經(jīng)IPTG(1mM)37℃誘導(dǎo)4h，10000rpm離心10’，分別將上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)所需的目的重組蛋白，說明目的蛋白是以包涵體形式存在于沉淀中.利用傳統(tǒng)的Ni-NTA Hisbind樹脂柱進(jìn)行分離純化，效果不好，雜蛋白的洗脫效果不明顯.于是用下列方法對包涵體進(jìn)行分離.
菌體沉淀用不加尿素的bufferB溶解(不加尿素的bufferB0.1MNaH2PO4，0.01MTris-Cl，PH8.0)經(jīng)超聲破碎(超聲破碎1s，間隔一秒，持續(xù)時間0.5h，超聲功率不超過300w)，10000rpm，離心40min，沉淀重懸于6M尿素中(PH8.5)，4℃，10000rpm離心15min，沉淀用含8M尿素的bufferB溶解，離心后取上清.電泳結(jié)果顯示，目的蛋白已經(jīng)得到分離.將上清裝入透析袋中，分別用6M，4M，2M，1M，0.5M尿素洗液(每種尿素洗液中均含5mMTris-Cl)各洗一次，最后用0M尿素(含Tris-Cl 0.6057g)洗兩次，將透析液用30KD的超濾管10000rpm，40min離心收集.
2、重組BCG的構(gòu)建1)將重組好的基因ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4，克隆在原核生物-結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒PMV261中，通過電擊轉(zhuǎn)入到BCG中。
a.BCG感受態(tài)細(xì)胞的制備在7H9培養(yǎng)基中(干粉0.49g，甘油0.2ml，Tween800.05ml水90ml，121℃滅菌10min后，待培養(yǎng)基冷卻至45℃左右，加入ADC10ml，從而配成100ml培養(yǎng)基)培養(yǎng)BCG(約2-3周)，將培養(yǎng)好的BCG冰浴1小時后，6000rpm(4000g)，4℃離心10min收集菌體；菌團(tuán)用預(yù)冷的10％甘油洗3-4次，重懸于10％的甘油中。
b.電擊轉(zhuǎn)化BCG取200μl BCG感受態(tài)細(xì)胞，加入50μl重組質(zhì)粒，冰浴30min，小心地將菌液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2mm電穿孔杯中，電轉(zhuǎn)條件是電壓1.25kV，電容25μF，電阻1000歐姆。電轉(zhuǎn)后，冰浴10min后，與等體積的2×7H9培養(yǎng)基混合，37℃靜止培養(yǎng)1天。
2)將靜止培養(yǎng)一天的重組BCG涂在含有卡那抗性(卡那霉素終濃度為15μg/ml)的7H10固體平板上(干粉4.9g，甘油0.5ml，水90ml，121℃滅菌10min后，待培養(yǎng)基冷卻至45℃左右，加入ADC10ml，從而配成100ml固體培養(yǎng)基)，37℃倒置培養(yǎng)。
2、重組BCG的鑒定1)培養(yǎng)好的重組BCG經(jīng)由熱誘導(dǎo)，即45℃水浴1h，后在37℃烘箱放置1h，再在45℃水浴1h后，37℃過夜。將熱誘導(dǎo)過夜的重組BCG，12000rpm離心15min后，收集培養(yǎng)上清；沉淀用dH2O處理重懸后，超聲(超聲步驟超聲時間1s，間隔時間2s，超聲次數(shù)90次)，離心收集超聲上清。
2)Western-blot檢測首先將上步驟得到的經(jīng)過熱誘導(dǎo)處理過的菌體培養(yǎng)上清，超聲上清，超聲沉淀在Tris-Gly系統(tǒng)下進(jìn)行蛋白電泳，電泳結(jié)束后，剪好PVDF膜(大小要正好能夠包含膠上所有樣品)，并在甲醇溶液浸濕后，與取下的膠，以及海綿，濾紙，western板子均放入轉(zhuǎn)移緩沖液(3.03gTris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇，加水至1L)中15-30min，從下到上依次按照western負(fù)板(黑色)，海綿，四層濾紙，膠，膜，四層濾紙，海綿，western正板(白色)順序，在緩沖液中仔細(xì)的擺好，注意不要出現(xiàn)氣泡。裝好western裝置，并將其放在冰上，恒壓100v，1h或恒流400mA，2h。結(jié)束后，取下膜，并將其放入封閉液(100mMTris-HCL，0.9％NaCL，0.1％Tween20，5％脫脂奶粉，pH7.5)4℃過夜。一抗(兔抗Ag85B蛋白)用10ml封閉液稀釋1000倍后，將膜放入含有稀釋一抗的封閉液中，37℃ 1h。TTBS(100mMTris-HCL，0.9％NaCL，0.1％Tween20，pH7.5)洗膜4次，每次5min。將二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)用封閉液以1∶5000稀釋，37℃，1h，TTBS洗膜4次，每次5min；最后用PBS洗15min，加入堿性磷酸酶顯色液顯色。
3、鑒定好的重組BCG進(jìn)行菌落計數(shù)a)鑒定好的重組BCG的收集將菌體經(jīng)過10000rpm，5min離心收集，菌體沉淀用20％的甘油洗2-3次后，用20％甘油重懸沉淀，分裝入EP管中。
b)菌落計數(shù)將上述用20％甘油重懸的菌體分別以20倍，400倍，8000倍，16000倍稀釋，稀釋好之后，均勻涂布在含有卡那霉素抗性的7H10固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)。
4、計好數(shù)的重組BCG與普通BCG免疫C57BL小鼠免疫計量106cfu，免疫時間3周，5、檢測用BCG和重組BCG免疫后的小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫水平。
a)細(xì)胞免疫水平的檢測運用ELISPOT方法對細(xì)胞因子IFNγ進(jìn)行檢測將經(jīng)過BCG和重組BCG免疫3周后的小鼠，先進(jìn)行眼眶取血后，脫頸處死；取出小鼠脾臟，在200目篩網(wǎng)上研磨后，PBS(NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4-12H2O 1.923g；KH2PO40.24g，配成1L溶液，pH7.4)重懸后，加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液，2300rpm，離心20min；小心取出淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌兩次，分別在2100rpm，1800rpm條件下，離心各10min；最后一遍用1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌，1500rpm，離心10min。最后用1ml1640培養(yǎng)液重懸，取出部分進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)；調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml，根據(jù)ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行以下步驟，細(xì)胞終濃度為5×106/ml，刺激蛋白分別為，結(jié)核菌素PPD(刺激濃度10μg/ml)，Ag85B蛋白(刺激濃度2μg/ml)，Mpt64190-198合成肽段(0.6μg/ml)，重組蛋白Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4(2μg/ml)。
b)體液免疫水平檢測Ag85B蛋白溶解于PBS中(終濃度5μg/ml)，然后將該溶液加入96孔板中(100μl/孔)4℃過夜。將板洗干凈后，加入含1％的小牛血清(BSA)的PBS封閉板(200μl/孔).待檢血清(重組BCG免疫的小鼠，眼眶取血所得血清)用PBS稀釋100倍，再連續(xù)對倍稀釋，加入板中(200μl/孔)孵育，37℃，1.5h。洗板后分別加稀釋10000倍酶標(biāo)羊抗鼠IgG(H+L)，稀釋1000倍的酶標(biāo)兔抗鼠IgG1或IgG2a，37℃孵育2h。板子加入鄰苯二胺溶液(含0.03％過氧化氫，pH5.0)，用2mol/LH2SO4終止反應(yīng)。測OD492。根據(jù)OD492≥陰性O(shè)D492二倍以上者，判定為陽性，再根據(jù)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的抗體溶液稀釋最大倍數(shù)的倒數(shù)判斷其效價。
結(jié)果顯示重組BCG疫苗rBCG-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4能有效刺激γ-IFN表達(dá)，分泌量比BCG有所增高。rBCG-AMM疫苗引起對Agg5B蛋白的IgG1反應(yīng)比BCG高，而引起的IgG2a反應(yīng)要低于BCG，整體IgG水平兩者接近。
序列表SEQ ID NOlATGACAGACG TGAGCCGAAA GATTCGAGCT TGGGGACGCC GATTGATGAT CGGCACGGCAGCGGCTGTAG TCCTTCCGGG CCTGGTGGGG CTTGCCGGCG GAGCGGCAAC CGCGGGCGCGTTCTCCCGCC CGGGGCTCCC GGTTGAGTAC CTGCAGGTGC CGTCGCCGTC GATGGGCCGCGACATCAAGG TTCAGTTCCA GAGCGGTGGG AACAACTCAC CTGCGGTTTA TCTGCTCGACGGCCTGCGCG CCCAAGACGA CTACAACGGC TGGGATATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGGTACTACCAGT CGGGACTGTC GATAGTCATG CCGGTCGGCG GGCAGTCCAG CTTCTACAGCGACTGGTACA GCCCGGCCTG CGGTAAGGCT GGCTGCCAGA CTTACAAGTG GGAAACCTTCCTGACCAGCG AGCTGCCGCA ATGGTTGTCC GCCAACAGGG CCGTGAAGCC CACCGGCAGCGCTGCAATCG GCTTGTCGAT GGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGC CTACCACCCCCAGCAGTTCA TCTACGCCGG CTCGCTGTCG GCCCTGCTGG ACCCCTCTCA AGGGATGGGGCCTAGCCTGA TCGGCCTCGC GATGGGTGAC GCCGGCGGTT ACAAGGCCGC AAACATGTGGGGTCCCTCGA GTGACCCGGC ATGGGAGCGC AACGACCCTA CGCAGCAGAT CCCAAAGCTGGTCGCAAACA ACACCCGGCT ATGGGTTTAT TGCGGGAACG GCACCCCGAA CGAGTTGGGCGGTGCCAACA TACCCGCCGA GTTCTTGAAG AACTTCGTTC GTAGCAGCAA CCTGAAGTTCCAGGATGCGT ACAACGCCGC GGGCGGGCAC AACGCCGTGT TCAACTTCCC GCCCAACGGCACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCTCAA CTCAACGCCA TGAAGGGTGA CCTCCAGAGT
TCGTTAGGCG CCGGCTAG....(酶切位點) SEQ ID NO2TTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTSEQ ID NO3ATGAGGCTGTCGTTGACCGCATTGAGCGCCGGTGTAGGCGCCGTGGCAATGTCGTTGACCGTCGGGGCCGGGGTCGCCTCCGCAGATCCCGTGGACGCGGTCATTAACACCACCTGCAATTACGGGCAGGTAGTAGCTGCGCTCAACGCGACGGATCCGGGGGCTGCCGCACAGTTCAACGCCTCACCGGTGGCGCAGTCCTATTTGCGCAATTTCCTCGCCGCACCGCCACCTCAGCGCGCTGCCATGGCCGCGCAATTGCAAGCTGTGCCGGGGGCGGCACAGTACATCGGCCTTGTCGAGTCGGTTGCCGGCTCCTGCAACAACTATTAASEQ ID NO4ACAGTCGACTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTATGAGGCTGTCGTTGACSEQ ID NO5GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAGSEQ ID NO6TGGCCAATGACAGACGTSEQ ID NO7ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAGSEQ ID NO8CGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCT
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核桿菌重組卡介苗，其特征在于由ag85B基因，mpt64的第190-198位的氨基酸序列所對應(yīng)的核苷酸序列以及mtb8.4基因連在一起，克隆進(jìn)大腸桿菌載體而獲得重組基因；再由該重組基因經(jīng)過原核生物一結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入到BCG中，從而獲得所述結(jié)核桿菌重組卡介苗記為rBCG-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4；其中BCG為現(xiàn)有的卡介苗，ag85B的序列為SEQ.ID.N01，mpt64190-198序列為SEQ.ID.NO2，mtb8.4為SEQ.ID.NO3。
2.一種如權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌重組卡介苗的制備方法，其特征在于具體步驟如下ag85B-mpt64(190-198)-mtb8.4的構(gòu)建首先設(shè)計引物擴(kuò)增mpt64(190-198)-mtb8.4上游ACAGTCGAC ATGAGGCTGTCGTTGAC說明雙下劃線代表編碼Mpt64(190-198)肽段的基因，單下劃線代表Sal I酶切位點，下游GCGAAGCTTTTAATAGTTGTTGCAGGAG說明單下劃線HindIII酶切位點，以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株H37RvDNA為模板，用以上兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用Sal I和HindIII雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒PET28a(+)中；其次擴(kuò)增ag85B基因上游TGGCCAATGACAGACGT，說明單下劃線代表Bal I酶切位點，下游ATAGTCGACGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG，說明單下劃線代表Sal I酶切位點，將擴(kuò)增的mpt64(190-198)-mtb8.4和ag85B經(jīng)酶切，連接后形成重組新基因，測序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv結(jié)核全基因組相應(yīng)基因序列完全一致；將重組好的基因，克隆到原核生物一結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒PMV261，制備BCG感受態(tài)細(xì)胞，將帶有重組基因的穿梭質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)入到BCG中，形成重組BCG；重組BCG經(jīng)由western-blot檢測后，證明重組基因確實已轉(zhuǎn)入到BCG中。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種新型的結(jié)核桿菌重組卡介苗。該重組卡介苗為rBCG－Ag85B－Mpt6文檔編號C12N15/09GK101024077SQ20061014766
公開日2007年8月29日 申請日期2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者王洪海, 郄亞卿, 王九玲, 祝秉東, 徐穎, 王慶忠, 陳嘉臻 申請人:復(fù)旦大學(xué)