專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)紫杉醇的新菌種及其選育和制備紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌種，具體涉及一種產(chǎn)紫杉醇的新菌種及其選育和制備紫 杉醇的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴(yán)重地威脅著人類(lèi)的健康，而癌癥是目前人類(lèi)疾病中僅次于心 腦血管疾患的第二大死因。
紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取出來(lái)的具有多種抗腫瘤療效的二萜生物堿 類(lèi)藥物。由于紅豆杉，又名紫杉，是兩億年前的史前植物，是珍稀樹(shù)種，生長(zhǎng) 速度緩慢，并且其生物學(xué)特性對(duì)生態(tài)環(huán)境要求較高，天然更新能力差，所以種 群數(shù)量極為有限，屬瀕危保護(hù)植物，資源十分有限，因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都在積 極地研究開(kāi)發(fā)紫杉醇的新藥源。
微生物發(fā)酵生產(chǎn)是降低成本、大量獲取紫杉醇的理想方法。1993年美國(guó)蒙 塔那(Montana)州立大學(xué)化學(xué)家Andrea Stierle和植物病理學(xué)家Gary Strobel 在蒙塔那西北部國(guó)家冰川公園的短葉紅豆杉中分離到一株內(nèi)生真菌ra;^邁j^" 朋c/rea/^e,在Stierle等的工作一經(jīng)發(fā)表，美國(guó)細(xì)胞克隆公司就出價(jià)100萬(wàn)美 元支持蒙塔那州立大學(xué)的這項(xiàng)研究。在這美妙前景的鼓舞下，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者紛 紛展開(kāi)了這方面的研究，分離新的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌、進(jìn)行菌種選育和培養(yǎng)條 件的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從紅豆杉中分離的能夠產(chǎn)紫杉醇的新菌種及其選 育和制備紫杉醇的方法。
上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種產(chǎn)紫杉醇的新菌種，所述的新菌種為從東北紅豆杉(7: c"s;^Va"Sieb. &Zucc.)的樹(shù)皮中分離的菌種又經(jīng)誘變選育得到的菌株、該菌株保藏于中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏號(hào)為206035。
該菌株的物理形態(tài)特性
在PDA培養(yǎng)基上28'C培養(yǎng)4d，菌落圓形，邊緣較整齊，初期白色絨毛狀，后
期顏色變深，逐漸變?yōu)榛揖G色，直徑達(dá)6. 1 8. 0 cm，菌絲初期無(wú)色，后期呈深 綠色，匍匐，分枝，具隔膜，直徑2.0-5.9 ii邁，分生孢子梗側(cè)生在菌絲上，灰 黑色，直立或彎曲，常二叉或三叉狀分枝，具隔膜，光滑，1400pm長(zhǎng)，18-33ym 寬。產(chǎn)孢細(xì)胞頂端膨大成球形，全壁多芽產(chǎn)孢，分生孢子卵圓形，灰黑色，聚 集成葡萄穗狀，無(wú)隔膜，長(zhǎng)8.0-19um，寬5.0-16lim。
該菌株的最適培養(yǎng)溫度25-28°C，最適pH為4. 5-6. 0，代謝可產(chǎn)生紫杉醇。 上述的產(chǎn)紫杉醇的新菌種的選育，將紅豆杉的樹(shù)皮等先用無(wú)菌水沖洗掉表 面的塵土等，再用7596的酒精浸泡3-10min;用無(wú)菌水洗掉表面的酒精；用無(wú)菌 剪刀將樹(shù)皮剪成0. 5X0. 5cm的小塊；將經(jīng)上述表面消毒的樹(shù)皮分別栽種PDA培 養(yǎng)基、查氏(Czapek)培養(yǎng)基、馬丁 (Martin)瓊脂培養(yǎng)基平板，25'C恒溫培 養(yǎng)；待樣品周?chē)黠@長(zhǎng)出菌絲，采用尖端菌絲挑取法，挑取不同形態(tài)的菌落， 轉(zhuǎn)到PDA斜面，22-27'C純化培養(yǎng)，儲(chǔ)藏備用； 菌株HD104的紫外線誘變，
(1) 取4mL制備好的孢子懸液置于滅過(guò)菌的并帶有磁力攪拌棒的直徑為 7.5cm的培養(yǎng)皿中，然后蓋上皿蓋，將其放置在磁力攪拌器的載物臺(tái)上，紫外線 照射10min，進(jìn)行培養(yǎng)皿的表面消毒；
(2) 開(kāi)啟磁力攪拌器，打開(kāi)皿蓋，邊照射邊攪拌，并計(jì)時(shí)；分別在45s、 90s、 120s時(shí)關(guān)閉紫外燈，在無(wú)菌、無(wú)光照操作的條件下，取出0.5ml孢子液，選取 三個(gè)稀釋度，即10°、 10—\ 10—2，然后從每個(gè)稀釋度中取出0.2raL，
傾注在PDA固體平板上，涂板，每個(gè)稀釋度三個(gè)平行樣，用黑布蓋好倒置于 28t:恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，獲得誘變菌株即為本發(fā)明新菌種。
上述的產(chǎn)紫杉醇的新菌種的選育，所用的培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基馬鈴薯加Og, 葡萄糖20g,瓊脂20g，水1000mL，將馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30min，然后用紗 布過(guò)濾，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至lOOOmL， 121'C滅菌30min;所述的查 氏(Czapek)培養(yǎng)基NaN032g， K2HP(Ug, KC10. 5g， MgS040. 5g， FeSO40. Olg，蔗糖30g， 瓊脂20g,水lOOOmL pH自然，121'C滅菌20min;所述的馬丁 (Martin)瓊脂 培養(yǎng)基葡萄糖10g,蛋白胨5g， KH2P04lg，MgS04 7H20 0. 5g， 1/3000孟加拉紅 100mL,瓊脂15-20g，蒸餾水800mL，臨用前，加入0. 03%鏈霉素稀釋液100mL。 一種產(chǎn)紫杉醇的新菌種制備紫杉醇的方法，1).菌體活化將4t:保存的
新菌種接種于PDA斜面，28"活化48h,將斜面活化兩次后的菌種接于裝有 50mLPDA液體培養(yǎng)基的小搖瓶，28°C， 120r/min搖床培養(yǎng)，繼續(xù)活化48h;
2) .發(fā)酵培養(yǎng)將生長(zhǎng)均勻的菌絲體懸液按3。/。的接種量轉(zhuǎn)入改良后的S-7 (在Strobel, 1993原S-7培養(yǎng)基基礎(chǔ)上將苯丙氨酸、酪氨酸、亞油酸增
至終濃度1. 5-5. Omg/L) (200mL/500mL三角搖瓶)中，28。C， 120r/min培養(yǎng); 分別于發(fā)酵12d測(cè)定紫杉醇的產(chǎn)量，每組設(shè)3個(gè)平行樣；
3) .紫杉醇的提取將培養(yǎng)不同時(shí)間的菌體發(fā)酵液抽濾，濾液和固體均回
收；用等體積的乙酸乙酯分兩次對(duì)濾液進(jìn)行萃取，分液漏斗靜止lh分層；上層
有機(jī)相中溶有紫杉醇，下層水相棄掉；同時(shí)研磨抽濾后的菌體，加入30mL的 乙酸乙酯，震蕩萃取30min過(guò)濾，將濾液與發(fā)酵液萃取后的有機(jī)相混合；用旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑乙酸乙酯，待剩下5mL左右的溶液時(shí)，將溶液倒入平皿中， 50'C干燥；用少量的乙腈反復(fù)沖洗平皿表面的微量的紫杉醇，定溶2mL， 4'C保 存。
這個(gè)技術(shù)方案有以下有益效果-
1. 紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是一種二萜類(lèi)化合物，最早由Wani 等從短葉紅豆杉(7kros 6reWfbh'a)的樹(shù)皮中分離到并確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)， 但因天然更新能力弱，屬瀕危保護(hù)植物，資源十分有限，即使將全部天然紅豆 杉資源砍伐，也難以滿(mǎn)足市場(chǎng)需要，而且必然破壞自然環(huán)境與生態(tài)平衡，并將 導(dǎo)致資源枯竭，解決藥源不足已成為限制紫杉醇在臨床中大量應(yīng)用的瓶頸，因 此本發(fā)明的研制從根本上解決了作為藥源的紫杉醇難于取得的問(wèn)題。
2. 利用本發(fā)明方法產(chǎn)生紫杉醇，從而可以不用砍伐樹(shù)木作為材料提取紫杉醇。
本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
菌株HD104是從黑龍江省穆棱林業(yè)局某林場(chǎng)東北紅豆杉(r. cws/^cfe&Sieb. &ZUCC.)的樹(shù)皮中分離得到，并經(jīng)過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)、TLC及HPLC，證明可以產(chǎn)紫杉 醇。
分離方法如下:將紅豆杉的樹(shù)皮等先用無(wú)菌水沖洗掉表面的塵土等，再用75% 的酒精浸泡3-10min;用無(wú)菌水洗掉表面的酒精；用無(wú)菌剪刀將樹(shù)皮剪成0. 5X
0.5cm的小塊；將經(jīng)上述表面消毒的樹(shù)皮分別栽種PDA培養(yǎng)基；査氏(Czapek) 培養(yǎng)基；馬丁 (Martin)瓊脂培養(yǎng)基平板，25'C恒溫培養(yǎng)；待樣品周?chē)黠@長(zhǎng) 出菌絲，采用尖端菌絲挑取法，挑取不同形態(tài)的菌落，轉(zhuǎn)到PDA斜面，22-27'C 純化培養(yǎng)，儲(chǔ)藏備用。
所用的培養(yǎng)基有馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂 20g，水1000mL，將馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30min,然后用紗布過(guò)濾，再加糖 及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000mL， 121"C滅菌30min;査氏(Czapek)培養(yǎng) 基腿。32g， K風(fēng)lg， KC10. 5g， MgS040. 5g， FeS040. Olg,蔗糖30g,瓊脂20g, 水1000mLpH自然，121'C滅菌20min;馬丁 (Martin)瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖10g， 蛋白胨5g， KH2P04 lg， MgS04 7H2O0. 5g， 1/3000孟加拉紅100mL，瓊脂15-20g, 蒸餾水800mL，臨用前，加入0.0396鏈霉素稀釋液100mL。
試驗(yàn)方法為將HD104菌分別接種在PDA、査氏、馬丁培養(yǎng)基上，在28'C溫 箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，采用載玻片培養(yǎng)法，無(wú)菌挑取PDA固體平板上的菌絲，在顯微 鏡下觀察并進(jìn)行顯微測(cè)量。
在PDA培養(yǎng)基上28'C培養(yǎng)4d，菌落圓形，邊緣較整齊，初期白色絨毛狀，后 期顏色變深，逐漸變?yōu)榛揖G色，直徑達(dá)6. 1 8.0 cm。菌絲初期無(wú)色，后期呈深 綠色，匍匐，分枝，具隔膜，直徑2.0-5.9ym，分生孢子梗側(cè)生在菌絲上，灰 黑色，直立或彎曲，常二叉或三叉狀分枝，具隔膜，光滑，1400nm長(zhǎng)，18-33uni 寬。產(chǎn)孢細(xì)胞頂端膨大成球形，全壁多芽產(chǎn)孢，分生孢子卵圓形，灰黑色，聚 集成葡萄穗狀，無(wú)隔膜，長(zhǎng)8.0-19iim，寬5.0-16um。
該菌株的最適培養(yǎng)溫度25-28°C，最適pH為4. 5-6.0，代謝可產(chǎn)生紫杉醇。 模式菌株的培養(yǎng)物保存在黑龍江大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室(HD104， Holotypus)， 菌株HD104的紫外線誘變
(1) 取4mL制備好的孢子懸液置于滅過(guò)菌的并帶有磁力攪拌棒的直徑為 7.5cm的培養(yǎng)皿中，然后蓋上皿蓋，將其放置在磁力攪拌器的載物臺(tái)上，紫外線 照射10min，進(jìn)行培養(yǎng)皿的表面消毒；
(2) 開(kāi)啟磁力攪拌器，打開(kāi)皿蓋，邊照射邊攪拌，并計(jì)時(shí)；分別在45秒、 90秒、120秒時(shí)關(guān)閉紫外燈，在無(wú)菌、無(wú)光照操作的條件下，取出0.5mL孢子 液，選取三個(gè)稀釋度，即10°、 10—'、 10—2,然后從每個(gè)稀釋度中取出0.2mL，傾 頁(yè)
注在PDA固體平板上，涂板，每個(gè)稀釋度三個(gè)平行樣，用黑布蓋好倒置于28。C 恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，獲得誘變菌株(HD104-1),誘變菌株與原始菌株在形態(tài) 特征上沒(méi)有差別。 實(shí)施例2:
一種產(chǎn)紫杉醇的新菌種(HD104-1)制備紫杉醇的方法， 1).菌體活化將4'C保存的菌種Jw接種于PDA斜面，28T活化48h， 將斜面活化兩次后的菌種接于裝有50inL PDA液體培養(yǎng)基的小搖瓶，28'C， 120r/min搖床培養(yǎng)，繼續(xù)活化48h;
2) .發(fā)酵培養(yǎng)將生長(zhǎng)均勻的菌絲體懸液按3。/。的接種量轉(zhuǎn)入改良后的S-7 (為在Strobel， 1993原S-7培養(yǎng)基基礎(chǔ)上將苯丙氨酸、酪氨酸、亞油酸
增至終濃度1.5-5. Omg/L) (200mL/500mL三角搖瓶)中，28。C, 120r/min 培養(yǎng)；分別于發(fā)酵12d測(cè)定紫杉醇的產(chǎn)量，每組設(shè)3個(gè)平行樣；
3) .紫杉醇的提取將培養(yǎng)不同時(shí)間的菌體發(fā)酵液抽濾，濾液和固體均回 收；用等體積的乙酸乙酯分兩次對(duì)濾液進(jìn)行萃取，分液漏斗靜止lh分層；上層 有機(jī)相中溶有紫杉醇，下層水相棄掉；同時(shí)研磨抽濾后的菌體，加入30mL的 乙酸乙酯，震蕩萃取30過(guò)濾，將濾液與發(fā)酵液萃取后的有機(jī)相混合；用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀除去溶劑乙酸乙酯，待剩下5mL左右的溶液時(shí)，將溶液倒入平皿中，50 'C干燥；用少量的乙腈反復(fù)沖洗平皿表面的微量的紫杉醇，定溶2mL， 4'C保存。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)紫杉醇的新菌種，其特征是所述的新菌種為從東北紅豆杉(T.cuspidate Sieb.& Zucc.)的樹(shù)皮中分離的菌種又經(jīng)誘變選育得到的菌株，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏號(hào)為206035。
2. —種權(quán)利要求1所述的產(chǎn)紫杉醇的新菌種的選育，其特征是將紅豆杉的 樹(shù)皮等先用無(wú)菌水沖洗掉表面的塵土，再用75%的酒精浸泡3-10min;用無(wú)菌水 洗掉表面的酒精；用無(wú)菌剪刀將樹(shù)皮剪成0.5X0.5cm的小塊；將經(jīng)上述表面消 毒的樹(shù)皮分別栽種馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基、査氏(Cz即ek)培養(yǎng)基、馬丁 (Martin) 瓊脂培養(yǎng)基平板，25'C恒溫培養(yǎng)；待樣品周?chē)黠@長(zhǎng)出菌絲，采用尖端菌絲挑 取法，挑取不同形態(tài)的菌落，轉(zhuǎn)到PDA斜面，22-27'C純化培養(yǎng)，儲(chǔ)藏備用；菌株HD104的紫外線誘變(1) 取4mL制備好的孢子懸液置于滅過(guò)菌的并帶有磁力攪拌棒的直徑為 7.5cm的培養(yǎng)皿中，然后蓋上皿蓋，將其放置在磁力攪拌器的載物臺(tái)上，紫外線 照射10min，進(jìn)行培養(yǎng)皿的表面消毒；(2) 開(kāi)啟磁力攪拌器，打開(kāi)皿蓋，邊照射邊攪拌，并計(jì)時(shí)；分別在45s、 90s、 120s時(shí)關(guān)閉紫外燈，在無(wú)菌、無(wú)光照操作的條件下，取出0.5mL孢子液，選取 三個(gè)稀釋度，即10Q、 10—1、 10—2,然后從每個(gè)稀釋度中取出0.2mL，傾注在PDA 固體平板上，涂板，每個(gè)稀釋度三個(gè)平行樣，用黑布蓋好倒置于28'C恒溫培養(yǎng) 箱中暗培養(yǎng)，獲得誘變菌株即為本發(fā)明新菌種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)紫杉醇的新菌種的選育，其特征是所用的培養(yǎng) 基有馬鈴薯培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水lOOOmL，將馬鈴 薯去皮，切成塊煮沸30min，然后用紗布過(guò)濾，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至 lOOOmL， 121。C滅菌30min;所述的查氏(Czapek)培養(yǎng)基:NaN03 2g ， K2HP04 lg ， KC1 0. 5g , MgS04 0. 5g ， FeS04 0. Olg ，蔗糖30g ，瓊脂20g,水lOOOmL pH自 然，12rC滅菌20min;所述的馬丁 (Martin)瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖10g，蛋白 胨5g， KH2P04 lg， MgS04 7H20 0. 5g, 1/3000孟加拉紅100mL，瓊脂15-20g，蒸餾水 800mL，臨用前，加入0.0396鏈霉素稀釋液100mL。
4. 一種權(quán)利要求1或2所述的產(chǎn)紫杉醇的新菌種制備紫杉醇的方法，其特征是 1).菌體活化將4'C保存的新菌種接種于PDA斜面，28'C活化48h,將斜面 活化兩次后的菌種接于裝有50mLPDA液體培養(yǎng)基的小搖瓶，28'C， 120r/min 搖床培養(yǎng)，繼續(xù)活化48h;2) .發(fā)酵培養(yǎng)將生長(zhǎng)均勻的菌絲體懸液按3%的接種量轉(zhuǎn)入改良后的S-7培 養(yǎng)基(500mL三角搖瓶)中，28°C， 120r/min培養(yǎng)；分別于發(fā)酵12d測(cè)定紫杉 醇的產(chǎn)量，每組設(shè)3個(gè)平行樣；3) .紫杉醇的提取將培養(yǎng)不同時(shí)間的菌體發(fā)酵液抽濾，濾液和固體均回收; 用等體積的乙酸乙酯分兩次對(duì)濾液進(jìn)行萃取，分液漏斗靜止lh分層；上層有機(jī) 相中溶有紫杉醇，下層水相棄掉；同時(shí)研磨抽濾后的菌體，加入30mL的乙酸 乙酯，震蕩萃取30min過(guò)濾，將濾液與發(fā)酵液萃取后的有機(jī)相混合；用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀除去溶劑乙酸乙酯，待剩下5mL左右的溶液時(shí)，將溶液倒入平皿中，50 'C干燥；用少量的乙腈反復(fù)沖洗平皿表面的微量的紫杉醇，定溶2mL， 4'C保存。
全文摘要
產(chǎn)紫杉醇的新菌種及其選育和制備紫杉醇的方法，紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取出來(lái)的具有多種抗腫瘤療效的二萜生物堿類(lèi)藥物，由于紅豆杉，又名紫杉，是兩億年前的史前植物，是珍稀樹(shù)種，生長(zhǎng)速度緩慢，并且其生物學(xué)特性對(duì)生態(tài)環(huán)境要求較高，天然更新能力差，所以種群數(shù)量極為有限，屬瀕危保護(hù)植物，資源十分有限，因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都在積極地研究開(kāi)發(fā)紫杉醇的新藥源，本發(fā)明產(chǎn)紫杉醇的新菌種，所述的新菌種為從東北紅豆杉(T.cuspidate Sieb.& Zucc.)的樹(shù)皮中分離的菌種又經(jīng)誘變選育得到的菌株，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏號(hào)為206035。本發(fā)明用于生產(chǎn)紫杉醇的藥源。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101177666SQ200610151019
公開(kāi)日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2006年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月12日
發(fā)明者周東坡, 平文祥, 婧 朱, 強(qiáng) 李, 穎 王, 凱 趙, 濤 金, 璽 馬 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)