專利名稱：一種用于固定青霉素?；傅妮d體的制備和負(fù)載方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于固定青霉素酰化酶的載體的制備和負(fù)載方法，主要應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺類抗生素及其母核的工業(yè)制備和合成過程。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)60年代早期β-內(nèi)酰胺抗生素半合成工業(yè)漸漸興起，這使得β-內(nèi)酰胺的母核6-氨基青霉素烷酸(6-APA)成為重要的藥物合成中間體。因此，人們首先開始通過青霉素?；?PGA)裂解青霉素G來合成6-APA。隨后，由于PGA獨(dú)特的選擇性，人們又研究利用PGA的選擇催化作用，以6-APA或7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)為β-內(nèi)酰胺的母核，再加上適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈來半合成β-內(nèi)酰胺抗生素。
四十余年來，經(jīng)過不斷的篩選和基因重組的PGA變得越來越穩(wěn)定，酶的生產(chǎn)能力也不斷的得到提高，再加上有效的固定化方法使得酶的回收變成可能，該方法的成本也被大大的降低。
現(xiàn)在，通過酶的這一催化作用，全世界一年可以生產(chǎn)20000噸的6-APA，而相應(yīng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，如頭孢氨芐，阿莫西林和頭孢羥氨芐等，也已經(jīng)逐漸實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化的酶促合成。
但值得注意的是，有效的PGA固定化方法是酶促裂解青霉素G和β-內(nèi)酰胺抗生素半合成的關(guān)鍵。所以現(xiàn)在對于這一領(lǐng)域的研究也相當(dāng)重視。
許多材料都被研究和開發(fā)用來進(jìn)行青霉素酰化酶的固定化，總體說來這些材料可以分為三大類一、高分子聚合物主要是一些聚丙烯酸及其衍生化的多孔性樹脂材料，有代表性的如Eupergit C和Amberlite系列樹脂。
二、生物相容性材料這一類主要是一些天然或具有一定生物相容性的材料，例如殼聚糖，葡聚糖，海藻酸鈉，明膠等等。
三、無機(jī)材料這主要是一些具有多孔性的無機(jī)材料，例如分子篩，硅藻土或硅膠等等。但是這一類材料通常會通過一些化學(xué)方法進(jìn)行改性。
這三種材料已廣泛用于酶固定化之中，不僅僅是青霉素?；傅墓潭ǎ沁@三種材料各有利弊。通常說來，無機(jī)材料載體具有較好的機(jī)械性能和較高的比表面積，而高分子聚合物則有較高的固定化效率和較好的回收率及選擇性。而生物材料則由于它們較好的生物相容性，會給固定化的酶提供一些幫助，如提高它們的化學(xué)穩(wěn)定性，減小固定化過程中酶的失活，但是往往這一類載體的機(jī)械性能不是很理想，對于工業(yè)上苛刻的反應(yīng)條件也不能很好的適應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于固定青霉素?；傅妮d體的制備和負(fù)載方法，以具有一定活性官能團(tuán)的高分子聚合物為基材，再通過殼聚糖和一些助劑的吸附修飾作用，對載體內(nèi)部孔道表面進(jìn)行修飾，使得高分子聚合物載體內(nèi)部孔道表面更適于酶的吸附和固定，以獲得更高的穩(wěn)定性和活性。
這種用于固定青霉素?；傅妮d體的制備方法包括如下步驟(1)將帶有側(cè)鏈官能團(tuán)的多孔樹脂進(jìn)行研磨，篩選，干燥，活化后與殼聚糖溶液混合，烘干得到固體；(2)將步驟(1)得到的固體加入極性親水性溶劑中，在機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速100～800r/min，時間10～100分鐘后，調(diào)節(jié)pH值為7～11，加入助劑進(jìn)行修飾反應(yīng)，修飾反應(yīng)2～10小時后抽濾，洗滌，烘干。
所述的多孔樹脂為顆粒狀的固體多孔樹脂，粒徑為0.05～2.0mm，孔徑為2～100nm。
所述的多孔樹脂分子骨架為聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等，多孔樹脂帶有的側(cè)鏈官能團(tuán)為羥基、氨基、羧基、磺酸基、硫脲基、膦酸基或環(huán)氧基中的一種或多種。
所述的殼聚糖溶液是將殼聚糖溶于乙酸或鹽酸溶液中，殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5％～10.0％，所述的殼聚糖為生物級或工業(yè)級殼聚糖，去乙酰度為60％～95％，分子量為10000～500000。所述的殼聚糖與樹脂的質(zhì)量比在1∶1～1∶50之間。
所述的殼聚糖溶液中可添加有質(zhì)量百分比濃度為1.0％～10％親水性的物質(zhì)，所述的親水性的物質(zhì)為聚乙二醇(PEG)2000、聚乙二醇(PEG)5000、聚乙二醇(PEG)20000、葡聚糖、葡聚醛或聚胺類。
步驟(2)中所述的極性親水性溶劑為水、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、甲醇、乙醇中的一種或幾種。
步驟(2)中所述的助劑為甲醛、乙醛、戊二醛、環(huán)氧氯丙烷、三甲氧基氯甲基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷或2-氯乙胺/鹽酸鹽中的一種或幾種，助劑添加量為修飾反應(yīng)體系重量的1.0％～10％。
按本發(fā)明所述的制備方法制備的載體負(fù)載青霉素酰化酶的方法，包括如下步驟(a)將所述的載體用無機(jī)助劑活化，所述的無機(jī)助劑為氨水、碳酸氫鈉、碳酸鈉或多聚磷酸鈉的水溶液，濃度為0.1～4.0mol/L，活化溫度20～70℃，活化時間6～20小時；(b)將無機(jī)助劑活化后的載體用雙官能團(tuán)試劑進(jìn)行活化，所述的雙官能團(tuán)試劑為甲醛、乙二醛或戊二醛的水溶液，質(zhì)量百分比濃度為0.5％～5.0％，活化溫度20～70℃，活化時間1～8小時；(c)活化后的載體在溫度20～70℃陳化12～48小時，與濃度為50～2000U/ml青霉素酰化酶的游離酶溶液混合，5～40℃反應(yīng)12～60小時，在體系中加入硼氫化鈉，每毫升游離酶溶液的硼氫化鈉用量為0.05～10mg，反應(yīng)15～200min，抽濾，洗滌，室溫真空干燥可得細(xì)顆粒狀或粉末狀的青霉素?；腹潭ɑa(chǎn)物。
所述的載體負(fù)載青霉素?；傅姆椒ㄍ瑯舆m用于其他一些種類酶的負(fù)載，只要將步驟(c)中的游離青霉素?；傅娜芤簱Q成其他一些游離酶的溶液即可，如水解酶，氧化還原酶，合成酶等等。優(yōu)選氨基酰化酶，豬胰脂肪酶，色氨酸合成酶，脲酶。
所述的負(fù)載青霉素?；傅姆椒ǖ牟襟E(c)中，可以根據(jù)需要確定載體、游離酶溶液用量的關(guān)系，一般每克載體使用游離酶溶液2～20毫升。
制備本發(fā)明載體首先要選用一種具有大孔顆粒狀樹脂作為基材，例如，美國羅門哈斯公司的Amberlite IRC76C，Amberlite 1000Na；國內(nèi)離子交換樹脂通用型號的D101，D201，D316等常見樹脂。這種大孔樹脂通常含有一定的官能團(tuán)，如羥基，氨基，羧基，磺酸基，硫脲基，膦酸基，環(huán)氧基，以及它們的衍生化基團(tuán)等。殼聚糖首先通過多孔的吸附作用吸附進(jìn)樹脂的孔道內(nèi)，再通過不同助劑的作用將其牢靠的與樹脂連接在一起。
以三個例子說明一個是以羥基為官能團(tuán)的樹脂與殼聚糖共價結(jié)合的原理，由于樹脂上具有很多的羥基，因此可以通過這些羥基，利用三甲氧基(或三乙氧基)氯烷基硅烷與殼聚糖的氨基發(fā)生作用，從而達(dá)到一個修飾化的目的，將殼聚糖固定并修飾在樹脂上。
一個是以氨基為官能團(tuán)的樹脂與殼聚糖共價結(jié)合的原理，由于樹脂上具有很多的氨基，因此可以通過這些氨基，利用環(huán)氧氯丙烷的交聯(lián)作用，與殼聚糖的氨基發(fā)生反應(yīng)，從而達(dá)到一個修飾化的目的，將殼聚糖固定并修飾在樹脂上。
一個是以酯基為官能團(tuán)的樹脂與殼聚糖共價結(jié)合的原理，由于樹脂上具有很多的酯基，因此可以通過這些酯基，再添加入二氯乙胺(鹽酸鹽)，與殼聚糖的酯基發(fā)生反應(yīng)，從而達(dá)到一個修飾化的目的，將殼聚糖固定并修飾在樹脂上。
這樣，殼聚糖修飾的多孔樹脂載體就可以通過這些不同的方法得以制備，然后采用常見的共價固定法，利用殼聚糖的氨基和雙官能團(tuán)試劑的活化作用對酶進(jìn)行共價固定。
在這一載體中，不僅僅需要利用到殼聚糖較高的氨基密度，給共價交聯(lián)提供基礎(chǔ)和保障，還需要利用殼聚糖糖環(huán)上豐富的羥基，只有這些羥基才能給固定上的酶提供一個優(yōu)良的親水性微環(huán)境，這樣才能保持酶具有較高的水活度，使酶失活率大大降低，保持一個較高的活力穩(wěn)定性。所以，這也是采用殼聚糖作為樹脂載體修飾劑的一個重要目的之一。
綜上看來，第一，多孔大孔型樹脂為殼聚糖的吸附和酶的吸附提供了基礎(chǔ)；第二，殼聚糖穩(wěn)定的共價修飾于樹脂表面提高了整個載體的穩(wěn)定性；第三，殼聚糖豐富的羥基為酶提供了一個非常優(yōu)良的微環(huán)境；第四，可變的樹脂骨架和官能團(tuán)以及不同的共價修飾過程使得固定化載體具有多樣性以適應(yīng)不同酶和使用環(huán)境的需求。
這樣，既通過殼聚糖的生物相容性作用保留了酶自身較高的穩(wěn)定性和活性，又因?yàn)橛懈叻肿泳酆衔镒鳛榛亩哂辛己玫臋C(jī)械性能和化學(xué)穩(wěn)定性，使得整個固定化產(chǎn)物能較好的適應(yīng)β-內(nèi)酰胺抗生素工業(yè)化生產(chǎn)中惡劣的條件。


圖1為樹脂未修飾前的剖面SEM2為殼聚糖修飾樹脂后的剖面SEM圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取5.0g聚甲基丙烯酸甲酯球狀多孔樹脂研磨并過篩得粒徑為0.5mm的樹脂顆粒。將1.0g殼聚糖溶于50ml的2％乙酸溶液中，再加入0.5gPEG20000，配成透明澄清溶液。將樹脂與殼聚糖溶液混合均勻，40℃烘干。將混合固體轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，加入50ml水，機(jī)械攪拌200r/min，30分鐘后，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值為10，加入0.5g 2-氯乙胺鹽酸鹽，控制溫度40℃，反應(yīng)5小時后，抽濾，洗滌，40℃烘干。
取1.0g制備好的載體于錐形瓶中，加入1mol/L的碳酸氫鈉溶液，溫度50℃，反應(yīng)12小時，分離，再加入10ml 2.0％的乙二醛溶液，搖床振蕩，200r/min，溫度控制為40℃。6小時后取出，30℃陳化24小時，加入游離的青霉素酰化酶溶液400U/ml共5ml，10℃反應(yīng)24小時，再在體系中加入NaBH415mg，處理30min后，抽濾，洗滌，室溫真空干燥。分離可得固定化青霉素?；府a(chǎn)品，活力約為600～800U/g。
實(shí)施例2取20.0g聚對苯乙烯烷羥基球狀多孔樹脂研磨并過篩得粒徑為0.5mm的樹脂顆粒。將1.0g殼聚糖溶于50ml的1％鹽酸溶液中，再加入0.5gPEG2000，配成透明澄清溶液。將樹脂與殼聚糖溶液混合，40℃烘干。將混合固體轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，加入50ml DMSO，30分鐘后，機(jī)械攪拌500r/min，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值為9，加入5ml的三甲氧基氯甲基硅烷，控制溫度60℃，反應(yīng)4小時后，抽濾，洗滌，40℃烘干。
取1.0g制備好的載體于錐形瓶中，加入1mol/L的氨水，溫度60℃，反應(yīng)15小時，分離，再加入10ml 2.0％的戊二醛溶液，搖床振蕩，200r/min，溫度控制為40℃。4小時后取出，30℃陳化36小時，加入游離的青霉素?；溉芤?00U/ml共5ml，20℃反應(yīng)36小時，再在體系中加入NaBH410mg，處理60min后，抽濾，洗滌，室溫真空干燥。分離可得固定化青霉素?；府a(chǎn)品，活力約為500～700U/g。
實(shí)施例3取10.0g聚丙烯酸叔氨基多孔樹脂研磨并過篩得粒徑為0.5mm的樹脂顆粒。將1.0殼聚糖溶于50ml的1％鹽酸溶液中，再加入0.5g葡萄糖，配成透明澄清溶液。將樹脂與殼聚糖溶液混合均勻，40℃烘干。將混合固體轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，加入25ml DMF和25ml乙醇，30分鐘后，機(jī)械攪拌500r/min，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值為11，加入5ml的環(huán)氧氯丙烷，控制溫度90℃，反應(yīng)8小時后，抽濾，洗滌，50℃烘干。
取1.0g制備好的載體于錐形瓶中，加入1mol/L的多聚磷酸鈉溶液，溫度30℃，反應(yīng)12小時，分離，再加入10ml 2.0％的乙二醛溶液，搖床振蕩，200r/min，溫度控制為40℃。6小時后取出，30℃陳化48小時，加入游離的青霉素?；溉芤杭尤胗坞x的青霉素酰化酶溶液800U/ml共5ml，30℃反應(yīng)50小時，再在體系中加入NaBH420mg，處理150min后，抽濾，洗滌，室溫真空干燥，可得固定化青霉素?；府a(chǎn)品，活力約為700～900U/g。
權(quán)利要求
1.一種用于固定化青霉素?；傅妮d體制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將帶有側(cè)鏈官能團(tuán)的多孔樹脂進(jìn)行研磨，篩選，干燥，活化后與殼聚糖溶液混合，40～120℃直接烘干，得到固體；(2)將步驟(1)得到的固體加入極性親水性溶劑中，在機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速100～800r/min，時間10～100分鐘后，調(diào)節(jié)pH值為7～11，加入助劑進(jìn)行修飾反應(yīng)，修飾反應(yīng)2～10小時后抽濾，洗滌，40～120℃烘干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的多孔樹脂為顆粒狀的固體多孔樹脂，粒徑為0.05～2.0mm，孔徑為2～100nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的多孔樹脂分子骨架為聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等，帶有的側(cè)鏈官能團(tuán)為羥基、氨基、羧基、磺酸基、硫脲基、或環(huán)氧基中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的殼聚糖溶液是將殼聚糖溶于2％的乙酸或1％鹽酸溶液中，殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5％～10.0％，所述的殼聚糖為生物級或工業(yè)級殼聚糖，去乙酰度為60％～95％，分子量為10000～500000。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的殼聚糖與多孔樹脂的質(zhì)量比1∶1～1∶50。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的殼聚糖溶液中添加有質(zhì)量百分比濃度為1.0％～10％親水性的物質(zhì)，所述的親水性的物質(zhì)為聚乙二醇2000、聚乙二醇5000、聚乙二醇20000、葡聚糖、葡聚醛或聚胺類。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的極性親水性溶劑為水、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇、乙醇中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的助劑為甲醛、乙醛、戊二醛、環(huán)氧氯丙烷、三甲氧基氯甲基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷或2-氯乙胺鹽酸鹽中的一種或幾種，助劑添加量為修飾反應(yīng)體系重量的1.0％～10％。
9.一種如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的載體。
10.一種如權(quán)利要求9所述的載體的負(fù)載方法，其特征在于包括如下步驟(a)將所述的載體用無機(jī)助劑活化，所述的無機(jī)助劑為氨水、碳酸氫鈉、碳酸鈉或多聚磷酸鈉的水溶液，濃度為0.1～4.0mol/L，活化溫度20～70℃，活化時間6～20小時；(b)將無機(jī)助劑活化后的載體用雙官能團(tuán)試劑進(jìn)行活化，所述的雙官能團(tuán)試劑為甲醛、乙二醛或戊二醛的水溶液，質(zhì)量百分比濃度為0.5％～5.0％，活化溫度20～70℃，活化時間1～8小時；(c)活化后的載體在溫度20～70℃陳化12～48小時，與濃度為50～2000U/ml青霉素?；傅挠坞x酶溶液混合，5～40℃反應(yīng)12～60小時，在體系中加入硼氫化鈉，每毫升游離酶溶液的硼氫化鈉用量為0.05～10mg，反應(yīng)15～200min，抽濾，洗滌，室溫真空干燥可得細(xì)顆粒狀或粉末狀的青霉素?；腹潭ɑa(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化青霉素?；傅闹苽浞椒?，其特征在于包括如下步驟(1)將帶有側(cè)鏈官能團(tuán)的多孔樹脂進(jìn)行研磨，篩選，干燥，活化后與殼聚糖溶液混合，烘干，得到固體；(2)將步驟(1)得到的固體加入極性親水性溶劑中，加入助劑進(jìn)行修飾反應(yīng)后抽濾，洗滌，烘干得到多孔樹脂載體；(3)將青霉素?；肛?fù)載于多孔樹脂載體上；得到的固定化青霉素?；?。發(fā)明通過殼聚糖的生物相容性作用提高了酶的活性并維持較高穩(wěn)定性，而且高分子聚合物基材具有良好的機(jī)械性能，使得本發(fā)明的固定化青霉素?；父玫臐M足β－內(nèi)酰胺抗生素工業(yè)化生產(chǎn)條件的要求。
文檔編號C12N9/78GK1995339SQ20061015552
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月28日
發(fā)明者林賢福, 金鑫, 吳起, 呂德水, 陳志春 申請人:浙江大學(xué)