專利名稱：：一種微生物轉(zhuǎn)化制備(r)-3-羥基丁酸乙酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，屬于生物催化
技術(shù)領(lǐng)域：
。(二)
背景技術(shù)：
3-羥基丁酸乙酯(ethy-3-hydroxybutyrate，EHB)是一種重要的藥物中間體，分子中含有多功能基團(tuán)，其手性單一對(duì)映異構(gòu)體(R)-EHB和(S)"EHB羥基丁酸乙酯均是非常有前景的重要的手性砌塊，例如(S)"EHB是熏衣草醇、食菌曱誘醇、核球殼菌、格哈菌素、卡包霉素和灰綠霉素前體等天然產(chǎn)物的手性源，(R—EHB也是合成L-肉堿、亞胺培南等碳青霉烯類抗生素等手性藥物的重要中間體。由于乙酰乙酸乙酉旨(ethyl3-oxobutanoate/ethylacetoacetate，EOB)易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行微生物催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)獲取手性EHB是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑。而且反應(yīng)產(chǎn)物(i)-EHB不易為微生物代謝利用，用微生物活細(xì)胞催化方法制備(i)-EHB非常有利。目前所知的從EOB還原為手性醇的方法主要有三條路徑(1)化學(xué)法。化學(xué)法采用的主要是過(guò)渡金屬配合物作為催化劑催化C-O基加氬生成產(chǎn)物?；瘜W(xué)法可獲得較高的產(chǎn)率，但主要缺點(diǎn)是反應(yīng)的立體選擇性偏低，且手性催化劑的制備比較困難。(2)直接利用醇脫氬酶催化乙酰乙酸乙酯。這種方法不僅要有酶蛋白參加反應(yīng)，而且還要添加價(jià)格昂貴的輔酶因子，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。(3)孩史生物全細(xì)月包生物轉(zhuǎn)4匕法(Biotransformation)。即通過(guò)完整的樣i生物細(xì)胞(如面包酵母)的立體選擇性生物催化來(lái)實(shí)現(xiàn)，微生物細(xì)胞含有完整的酶系，例如酵母細(xì)胞中舍有醇脫氫酶系，可以實(shí)現(xiàn)輔酶的原位再生，不需要另外添加昂貴的輔酶因子，但現(xiàn)有已知可用于乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原制備C^)-EHB的菌種(如紅酵母、產(chǎn)骯假絲酵母、活性干酵母假絲酵母等)，轉(zhuǎn)化率普遍較低(低于50%)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明即是為了提供一種產(chǎn)率高、所得產(chǎn)物光學(xué)純度高、產(chǎn)物濃度高的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-幾基丁酸乙酯的方法。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酉吏乙酉旨為底4勿,以膜醭畢赤酵母(尸/c/2/awem6n3wae/ac/e;w//awsew)纟田胞為酶源，進(jìn)行微生物催化不對(duì)稱還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯。所述膜醭畢赤酵母細(xì)胞來(lái)自膜醭畢赤酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液或由發(fā)酵液過(guò)濾得到的濕菌體?？蓪窬w加入含有底物的溶液中，或直接按需要量將底物加入發(fā)酵液中，作為反應(yīng)體系。所述的微生物細(xì)胞催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為2050°C,反應(yīng)時(shí)間為140小時(shí)。在此條件下所得的轉(zhuǎn)化液采用氣相色譜分析(GC)測(cè)定產(chǎn)物濃度，再結(jié)合產(chǎn)物的旋光測(cè)定得到產(chǎn)物e.e.值，表明已轉(zhuǎn)化的主要組分為(i)-EHB。所述底物質(zhì)量濃度為150%,加入發(fā)酵產(chǎn)物使?jié)窬w量為0.3~6g/g底物，所述不對(duì)稱還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為2050°C,反應(yīng)時(shí)間為140小時(shí)。所述反應(yīng)體系還可添加葡萄糖，添加量為0.1-25g/L。優(yōu)選的，所述不對(duì)稱還原反應(yīng)在0.1M,pH8.0的磷酸緩沖液中進(jìn)行。所述的發(fā)酵產(chǎn)物按如下方法制得在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種膜醭畢赤酵母菌種，接種量體積比5~10%，溫度2040。C，培養(yǎng)15天后，得發(fā)酵液、或?qū)l(fā)酵液過(guò)濾得所述濕菌體。本發(fā)明中所用發(fā)酵培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽糖550g/L,酵母膏100~500g/L，NH4C11~10g/L、KH2P040.5~5g/L，K2HP040.5~5g/L,異于K+的金屬離子0.11g/L,pH值49。所述異于K+的金屬離子是指通常可應(yīng)用于培養(yǎng)基的微量金屬離子，如A1"、Ba2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Li+、Mn2+、Na+、Sn2+、Zn2+等，通常選用A1C13.6H20、BaCl2.2H20、CuCl22H20、CoCl2.6H20、Fe2(S04)3-6H20、Li2S04.H20、MnS04.7H20、NaMo04.2H20、MgS04.7H20、SnCl2'2H20、ZnS04.7H20等，優(yōu)選為CoCl2.6H20、MnS04.7H20、NaMo04.2H20，最優(yōu)選為MnS04'7H20。所述的轉(zhuǎn)化液分離純化步驟為用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層脫水、脫色后，回收溶劑，得到得所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。具體的，所述的方法按如下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)接種膜醭畢赤酵母菌株，斜面于28。C培養(yǎng)17天，作為斜面活化種子；(2)種子培養(yǎng)接入斜面活化種子，20~40°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min,培養(yǎng)1~5天，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)接種種子液，接種量5~10%體積比，20~40°C，搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min,培養(yǎng)1~5天，得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液或發(fā)酵液離心收集的濕菌體，用O.lM，pH8.0的磷酸鹽緩沖液清洗后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時(shí)加入底物乙酰乙酸乙酯使底物質(zhì)量濃度為1~50%,濕菌體用量為0.3~6g/g底物，并添加終濃度0.125g/L的葡萄糖，2050°C、100250r/min反應(yīng)1~40小時(shí),反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，再脫水、脫色，蒸發(fā)回收溶劑，得所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。所用斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均可采用適合于酵母菌生長(zhǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基。優(yōu)選的，所述方法按如下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽汁10g/L,酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,pH6.5，121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種膜醭畢赤酵母菌抹，20~40°C培養(yǎng)17天，作為斜面活化種子；(2)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4Cl5g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MnS04.7H200.5g/L,pH6.5，120。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接入斜面活化種子，20~40°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min,培養(yǎng)1~5天，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4C15g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MnS04.7H200.5g/L，pH6.5，120。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接種種子液，接種量5~10%體積比，20~40°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min，培養(yǎng)15天，得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液離心、收集菌體，用0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液清洗后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時(shí)加入底物乙酰乙酸乙酯使底物質(zhì)量濃度為150%，濕菌體用量為0.3~6g/g底物，并添加終濃度0.125g/L的葡萄糖，2050°C、100~250r/min反應(yīng)1~40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，再脫水、脫色，蒸發(fā)回收溶劑，得所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。底物EOB與產(chǎn)物EHB的氣相色i普(GC)測(cè)定反應(yīng)結(jié)束后，用適量的乙酸乙酯萃取，用GC112A氣相色譜分析。3會(huì)測(cè)條件檢測(cè)器為FID,色譜柱(HP-19091Z-233)大小30mx0.25mmxl.Onm,填料為二曱基聚硅氧烷，載氣為氮?dú)?，載氣流量、空氣流量和氫氣流量分別為4.0(11.21ml/min)，6.5(304ml/min)和4.5(29.25ml/min)，色譜柱、進(jìn)樣器和檢測(cè)器的溫度分別為70°C、220。C和250°C。以正十二烷為內(nèi)標(biāo)。進(jìn)樣0.2(il，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為8.90min。產(chǎn)物EHB對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值)測(cè)定方法如下反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)液20ml,加入5ml乙酸乙酯萃耳又兩次，再離心(4500r/min)10min使兩相分層;將有機(jī)相小心移入i走光管充滿，測(cè)定旋光度A值。從已測(cè)定旋光值的有機(jī)相中取樣1ml，加2(il十二烷(內(nèi)標(biāo)物)，混勻后取liil進(jìn)行氣相色i昝分析。根椐3-EHB、十二烷的出峰峰高和事先測(cè)出的相對(duì)校正因子計(jì)算出旋光管中3-EHB的濃度C。3-EHB的比旋光度由下式計(jì)算I|=X100式中，1為旋光管的長(zhǎng)度(dm),C為3-EHB的濃度(每100毫升中所含的克數(shù))。3-EHB的ee值按下式計(jì)算本發(fā)明方法相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)不對(duì)稱合成法、面包酵母氧化還原方法或用添加輔酶NADH/NAD+的酶催化不對(duì)稱還原方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①生成的(/)-EHB對(duì)映體過(guò)量值高，達(dá)到99。/。e.e.以上；②生物催化劑為微生物菌體，可以自行發(fā)酵制備，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低廉；③在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中不需要外加輔酶；④反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。本發(fā)明通過(guò)自行篩選，采用膜醭畢赤酵母CP/c/z/amew6ra"ae///a"w")作為產(chǎn)酶菌抹，在單一水相體系中催化不對(duì)稱還原EOB生成的("-EHB對(duì)映體過(guò)量值達(dá)到99。/。e.e.,且獲得產(chǎn)物光學(xué)純度高、濃度高，具有重大應(yīng)用前景。(四)圖1為不同的菌體量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響；圖2為不同的葡萄糖加量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響；圖3為轉(zhuǎn)化時(shí)間曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例l:產(chǎn)羰基還原酶微生物菌林的篩選取膜醭畢赤酵母-218(由浙江工業(yè)大學(xué)提供)、紅酵母-2.102(由浙江工業(yè)大學(xué)提供)、產(chǎn)朊假絲酵母1257-2.12(由浙江工業(yè)大學(xué)提供)、活性干酵母(哈爾濱馬利酵母有限公司提供)、熱帶假絲酵母104(由浙江工業(yè)大學(xué)提供)菌種，分別按如下方法進(jìn)行培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化反應(yīng)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L,葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L，pH6.5,12rC滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為表1所示的各種微生物菌林，28。C培養(yǎng)2天，作為斜面活化種子。種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4C15g/L,KH2P04lg/L，K2HP04lg/L，MgS04.7H200.4g/L,pH6.5,裝液量為250ml三角并瓦裝液75ml,120。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，置旋轉(zhuǎn)式搖床，200rpm,30。C培養(yǎng)1天，作為種子液；發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4C15g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MgS04.7H200.4g/L,pH6.5，裝液量為250mL三角瓶裝液75mL,120。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種種子液(接種量10%體積比)，置旋轉(zhuǎn)式搖床，200rpm,3(TC培養(yǎng)1天，得發(fā)酵液；發(fā)酵液中濕菌體量約為10g/100mL,離心10分鐘(5000轉(zhuǎn)/分鐘)收集菌體，用磷酸鈉緩沖液(0.1M,pH8.0)洗滌兩次，將菌體轉(zhuǎn)入20ml相同組成的緩沖液中，同時(shí)加入0.6g底物(EOB),于30。C，200轉(zhuǎn)/分鐘下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，過(guò)濾后進(jìn)行氣相色諳分析(i)-EHB含量與對(duì)映體過(guò)量值。結(jié)果如表1:表l:產(chǎn)羰基還原酶微生物菌抹的篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用月莫醭畢赤酵母-218(P/c/H'flwewZ)ra""e/ac^"s//a"化"-218),4要實(shí)例1方法進(jìn)行培養(yǎng)，20mL反應(yīng)體系中含底物EOB量為0.6g,將種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中MgS(V7H20置換為其他金屬離子，舍量分別為0.05g/L和0.5g/L，其他轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件同實(shí)施例1,反應(yīng)2h后取樣，進(jìn)行分析，結(jié)果如表2。表2:不同金屬離子對(duì)酶活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)論金屬離子CoCl2、MnS04、NaMo04對(duì)R-EHB的生物合成有促進(jìn)作用，特別是添加MnSQ4，可使酶活提高9.7%。而添加其他金屬離子反而不利于產(chǎn)酶。實(shí)施例3:用月莫醭畢赤酵母-218CP/c/z/awew6ra"ae/ac/em//araew-218),才安實(shí)例1方法發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)后，發(fā)酵酶液中濕菌體量為10g/100mL，稱取濕菌體加于250mL三角瓶裝0.1M,pH8.0磷酸鈉鹽緩沖液20mL中，使?jié)窬w濃度為10140g/L,起始底物EOB量為0.6g/瓶(濕菌體量為0.22.8g/瓶，即0.34.7g/g底物)，于30。C，200rpm下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。16小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無(wú)水MgS04干燥，過(guò)濾后進(jìn)行氣相色諳分析(R)-EHB含量與對(duì)映體過(guò)量值，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)論從圖l可以看出，產(chǎn)物得率隨著轉(zhuǎn)化液中細(xì)胞量的增加而增大，當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到100g/L(即3.3g/g底物)，產(chǎn)物得率可達(dá)94.8%,而對(duì)映體過(guò)剩量也可達(dá)到99%。當(dāng)細(xì)胞量繼續(xù)增加到140g/L(即4.7g/g底物)，產(chǎn)物得率和對(duì)映體過(guò)剩量分別為95.0%和99%,與細(xì)胞量為100g/L的轉(zhuǎn)化結(jié)果相近，因此我們選用100g/L(即3.3g/g底物)為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的細(xì)胞濃度。實(shí)施例4:用膜醭畢赤酵母-218CP/c/z/awemZ)ra"ae/ac/era//a"w"-218)，按實(shí)例1方法發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)后，發(fā)酵酶液中濕菌體量為10g/100mL,稱取濕菌體加入裝有20ml的0.1M,pH8.0磷酸鈉緩沖液的250ml三角瓶中，使?jié)窬w量為100g/L，底物EOB量為0.6g/瓶，添加終濃度025g/L的葡萄糖，于3(TC,200rpm下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。16小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無(wú)水MgS04干燥，過(guò)濾后進(jìn)行氣相色譜和旋光儀分析(R)-EHB含量與對(duì)映體過(guò)量值，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)論從圖2可以看出，葡萄糖的最佳濃度為10g/L。實(shí)施例5:用膜醭畢赤酵母-218(尸/c/z/amew6ra加e/ac/msi/a""w-218),按實(shí)例l方法發(fā)酵，20ml反應(yīng)體系中含底物EOB量為0.6g,其他轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件同實(shí)施例1。于反應(yīng)不同時(shí)間取樣，進(jìn)行氣相色譜分析(7,-EHB含量并計(jì)算轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，用旋光儀測(cè)定旋光度并計(jì)算e.e.值，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)論從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)進(jìn)行到16h左右時(shí)基本已經(jīng)完成，產(chǎn)率可達(dá)95%左右，e.e.值保持在99。/o左右。因此確定最佳反應(yīng)時(shí)間為16h。權(quán)利要求1.一種微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以膜醭畢赤酵母(PichiamembranaefaciensHansen)細(xì)胞為酶源，進(jìn)行微生物催化不對(duì)稱還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯。2.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述膜醭畢赤酵母細(xì)胞來(lái)自膜醭畢赤酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液或由發(fā)酵液過(guò)濾得到的濕菌體。3.如權(quán)利要求1或2所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述底物質(zhì)量濃度為150%，加入發(fā)酵產(chǎn)物使?jié)窬w量為0.3~6g/g底物，所述不對(duì)稱還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20~50°C,反應(yīng)時(shí)間為140小時(shí)。4.如權(quán)利要求3所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于反應(yīng)體系中添加有葡萄糖，添加量為0.125g/L。5.如權(quán)利要求4所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述不對(duì)稱還原反應(yīng)在0.1M,pH8.0的磷酸緩沖液中進(jìn)行。6.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的發(fā)酵產(chǎn)物按如下方法制得在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種膜醭畢赤酵母菌種，接種量體積比5~10%，溫度2040。C,培養(yǎng)15天后，得發(fā)酵液、或?qū)l(fā)酵液過(guò)濾得所述濕菌體。7.如權(quán)利要求6所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽糖5~50g/L，酵母膏100~500g/L，NH4C11~10g/L、KH2P040.5-5g/L，K2HPO40.5~5g/L,異于K+的金屬離子0.1lg/L，pH值49。8.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化液分離純化步驟為用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層脫水、脫色后，回收溶劑，得到所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。9.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)接種膜醭畢赤酵母菌抹，斜面于28t:培養(yǎng)1~7天，作為斜面活化種子；(2)種子培養(yǎng)接入斜面活化種子，20~40°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min,培養(yǎng)15天，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)接種種子液，接種量5~10%體積比，20~40°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min,培養(yǎng)1~5天，得發(fā)酵液或濕菌體；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液或發(fā)酵液離心收集的濕菌體，用0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液清洗后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時(shí)加入底物乙酰乙酸乙酯使底物質(zhì)量濃度為1~50%,濕菌體用量為0.36g/g底物，并添加終濃度0.125g/L的葡萄糖，20~50°C、100~250r/min反應(yīng)1~40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，再脫水、脫色，蒸發(fā)回收溶劑，得所述(R)-3-羥基丁酸乙酉旨。10.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L,葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,pH6.5,121°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種膜醭畢赤酵母菌抹，2040。C培養(yǎng)l7天，作為斜面活化種子；(2)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽糖30g/L，酵母膏2g/L,NH4C15g/L，KH2P04lg/L，K2HP04lg/L，MnS047H200.5g/L,pH6.5,120。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接入斜面活化種子，20~40°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min，培養(yǎng)1~5天，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為麥芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH4CI5g/L,KH2P04lg/L,K2HP04lg/L,MnS04,00.5g/L,pH6.5,12(TC滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接種種子液，接種量5~10%體積比，20~40°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min,培養(yǎng)15天，得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液離心、收集菌體，用0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液清洗后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時(shí)加入底物乙酰乙酸乙酯使底物質(zhì)量濃度為150%,濕菌體用量為0.36g/g底物，并添加終濃度0.125g/L的葡萄糖，2050。C、100~250r/min反應(yīng)1~40小時(shí),反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，再脫水、脫色，蒸發(fā)回收溶劑，得所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。全文摘要本發(fā)明提供了一種微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以膜醭畢赤酵母(PichiamembranaefaciensHansen)的發(fā)酵產(chǎn)物為酶源，進(jìn)行微生物催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯。本發(fā)明通過(guò)自行篩選采用膜醭畢赤酵母作為產(chǎn)酶菌株，在單一水相體系中催化不對(duì)稱還原EOB生成(R)-EHB的產(chǎn)率達(dá)到95％，對(duì)映體過(guò)量值(e.e.)達(dá)到99％，即獲得產(chǎn)物光學(xué)純度高、濃度高，具有重大應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12P7/62GK101210258SQ200610155720公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月31日優(yōu)先權(quán)日2006年12月31日發(fā)明者何軍邀,鶯周,歐志敏,普王申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)