專利名稱：岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)發(fā)明是關(guān)于一種細(xì)胞系的建立及其培養(yǎng)的方法，即利用岷縣黑裘皮羊的耳緣組織進(jìn)行了細(xì)胞分離、初代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)獲得了高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系。本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
畜禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，也是同人類關(guān)系最為密切、最為直接的部分，在全球，畜禽遺傳資源為人類提供食物和農(nóng)產(chǎn)品達(dá)30％以上。根據(jù)發(fā)達(dá)國(guó)家政府和世界糧農(nóng)組織的預(yù)測(cè)，本世紀(jì)全球農(nóng)業(yè)90％的品種都將通過(guò)分子育種提供而品種對(duì)整個(gè)動(dòng)物生產(chǎn)的貢獻(xiàn)率亦將達(dá)到50％以上。隨著生產(chǎn)條件不斷改變和人民生活水平的提高，人們對(duì)畜產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量增加，要求培育出適應(yīng)性更強(qiáng)的、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、具有獨(dú)特性狀的畜禽品種(系)，而這些必須依靠現(xiàn)存的畜禽遺傳資源。因此加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有畜禽遺傳資源的評(píng)價(jià)、保存和有效、合理、可持續(xù)利用具有重要意義。
世界聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)將動(dòng)物遺傳資源定義為所棲居在地球上已經(jīng)改變或尚未改變的環(huán)境條件下，動(dòng)物的繁殖、品種、類型和種群數(shù)量。生物遺傳資源是生物科學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，是人類生存和社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源。國(guó)際上已將對(duì)生物遺傳資源的占有情況作為衡量一個(gè)國(guó)家國(guó)力的重要指標(biāo)之一。畜禽遺傳資源是重要的生物資源，是人類食物與健康的直接來(lái)源，是基因工程與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必需原材料。在多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家里，隨著畜牧生產(chǎn)體系的集約化，大量飼養(yǎng)的只是少數(shù)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的品種和雜交種，品種數(shù)目在迅速減少；在一些發(fā)展中國(guó)家里，雖然有較豐富的遺傳資源，但由于保種不當(dāng)和盲目引進(jìn)外來(lái)品種雜交，使原有的地方品種的數(shù)量大大減少。從而導(dǎo)致世界性的遺傳資源危機(jī)。
因此，畜禽遺傳資源保護(hù)是關(guān)系到養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展和生物多樣性的重大問(wèn)題。保護(hù)畜禽遺傳資源對(duì)我國(guó)乃至世界畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，動(dòng)物資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義。因此，近年來(lái)世界各國(guó)越來(lái)越認(rèn)識(shí)到遺傳資源的重要性。1992年6月，包括中國(guó)在內(nèi)的150多個(gè)國(guó)家共同簽署了《生物多樣性公約》，其3個(gè)主要目標(biāo)為保護(hù)生物多樣性，生物多樣性組成成分的可持續(xù)利用，以公平合理的方式共享遺傳資源的商業(yè)利益和其它形式的利用。此后生物多樣性公約又陸續(xù)通過(guò)了《波恩準(zhǔn)則》和《吉隆坡部長(zhǎng)宣言》，以對(duì)全球的生物遺傳資源進(jìn)行保護(hù)與管理。
據(jù)最近統(tǒng)計(jì)，全球6165個(gè)畜禽品種中，有740(占12％)個(gè)已經(jīng)滅絕、531個(gè)瀕臨滅絕(占8.16％)、1092個(gè)處于瀕危(占17.71％)，狀況不清楚的有1407個(gè)(占22.8％)，非危機(jī)的只有2395個(gè)(占38.8％)。1999年已經(jīng)滅絕、瀕臨滅絕及瀕危的品種占品種總數(shù)的比例較1995年所占比例分別增加82.09％、37.54％、19.02％，世界范圍內(nèi)的畜禽種質(zhì)資源危機(jī)程度日益加劇。在國(guó)外，一些政府部門(mén)、組織機(jī)構(gòu)，如聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)對(duì)畜禽遺傳資源的保存和管理相當(dāng)重視。
我國(guó)是世界上畜禽地方品種資源最為豐富的國(guó)家之一。地方品種的優(yōu)異種質(zhì)特性是幾千年來(lái)多樣化的自然生態(tài)環(huán)境所選擇的結(jié)果。許多優(yōu)良地方畜禽品種具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、繁殖率高和產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)。通過(guò)相關(guān)調(diào)查和審核，我國(guó)畜禽遺傳資源有576個(gè)品種(類群)，其中地方品種(類群)426個(gè)，占品種資源總數(shù)的74％；培育品種73個(gè)，占品種資源總數(shù)的12.7％；引進(jìn)品種77個(gè)，占品種資源總數(shù)的13.3％。這些遺傳資源特性各異，但由于受到大量外來(lái)高產(chǎn)品種引進(jìn)等多種因素的影響，某些地方品種逐漸被雜交種取代，具有豐富遺傳基因的地方品種由于不斷被改良，數(shù)量急劇減少甚至消亡，這種趨勢(shì)隨著畜禽集約程度的提高正在進(jìn)一步加劇。主要的576個(gè)畜品種中有158個(gè)由于規(guī)模減少已很大程度上喪失原有的育種潛力，占我國(guó)畜品種總數(shù)的36.6％，其中有32個(gè)不可挽救或已經(jīng)絕種。在20世紀(jì)70年代末80年代初，在占品種總數(shù)的77％的地方品種中，畜禽品種資源普查結(jié)果證實(shí)，我國(guó)已滅絕的品種有10個(gè)，瀕臨滅絕的品種8個(gè)，數(shù)量減少的有20個(gè)。1996～1998年對(duì)全國(guó)17個(gè)省331個(gè)地方畜禽品種動(dòng)態(tài)信息資源調(diào)查顯示，有50個(gè)畜禽品種(或類群)瀕危，9個(gè)品種(或類群)瀕臨滅絕，7個(gè)品種(或類群)已經(jīng)滅絕。這種趨勢(shì)隨著近年大量引種和集約化程度的提高而進(jìn)一步加劇，估計(jì)至少有30％的畜禽遺傳資源處于滅絕的高度危險(xiǎn)之中。
因此，從我國(guó)畜禽種質(zhì)資源保存的實(shí)際出發(fā)，通過(guò)構(gòu)建重要、瀕危畜禽品種群體細(xì)胞系的方式來(lái)保存其基因資源，具有重要意義。
岷縣黑裘皮羊是我國(guó)甘肅省裘皮用綿羊的地方品種，屬山谷型藏羊，是我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)中一個(gè)珍貴的地方品種資源。由于岷縣黑裘皮羊所產(chǎn)的毛裘皮具有吸熱保暖、毛穗美觀、烏黑光滑、經(jīng)穿耐用、不脫毛、不氈結(jié)、皮板輕柔細(xì)密等特點(diǎn)因而用其加工制作的皮衣深受廣大消費(fèi)者歡迎。岷縣黑裘皮羊被列入2006年公布的《國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》，對(duì)岷縣黑裘皮羊的遺傳資源的保存具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供高活率、高純度的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系，其保藏號(hào)為CGMCC No.1880。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案高活率、高純度的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存(CGMCC，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)；郵編100080；電話010-62542758)，保藏日2006年12月1日，保藏號(hào)CGMCCNo.1880，建議的分類命名為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系。該岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系具有以下特征岷縣黑裘皮羊組織塊接種6h后即有細(xì)胞長(zhǎng)出，1～2d即可貼滿瓶壁在倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞透明，胞質(zhì)突起豐滿，呈長(zhǎng)梭形，胞核橢圓形、居中，核仁清晰，立體感強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)成片后細(xì)胞形態(tài)為典型的成纖維狀，為梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、火焰狀或旋渦狀走形。細(xì)胞生長(zhǎng)速度快、成活率高、外源基因表達(dá)率高、應(yīng)用范圍廣。
一種高活率、高純度耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)將采到的岷縣黑裘皮羊耳緣組織用加1％雙抗的PBS清洗6～8次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養(yǎng)瓶并平鋪在瓶底，倒置放在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4h；待組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)基8～10ml，培養(yǎng)液成分DMEM+10％特級(jí)胎牛血清(FBS)。
(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；消化后的細(xì)胞懸液平均分裝入2個(gè)培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)細(xì)胞凍存A、換液凍存前24h，棄除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；
B、消化用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，然后加入培養(yǎng)液6～10ml終止反應(yīng)；C、計(jì)數(shù)用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算凍存前細(xì)胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心8min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細(xì)胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、分裝將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中封口；F、預(yù)凍將凍存管裝入程序降溫盒中，置于4℃20～30min，然后轉(zhuǎn)入-70℃預(yù)凍4～6h；G、凍存提出凍存管迅速投入液氮柜中，即完成細(xì)胞凍存。
上述高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法方法中，步驟(1)所取的岷縣黑裘皮羊材料以耳緣組織塊為最佳。
上述高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其中，步驟(2)及步驟(3)中所述胰酶消化法的具體步驟是向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后，翻轉(zhuǎn)消化30～60s。
上述高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其中，根據(jù)實(shí)際需要可以將步驟(3)凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出迅速放入42℃水浴中，并不停地晃動(dòng)使其均勻解凍，解凍完全后，將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，1000rpm離心8min以洗去DMSO，離心后的細(xì)胞再用培養(yǎng)液重懸，放置含37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益本發(fā)明對(duì)貼壁培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液成分的進(jìn)行了調(diào)整和改進(jìn)，可以使培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞無(wú)上皮細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞純度比現(xiàn)有技術(shù)有大幅提高；對(duì)凍存條件的改進(jìn)使復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前相比，細(xì)胞類型仍為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度沒(méi)有發(fā)生變化，凍存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定，且細(xì)胞凍存后的細(xì)胞活率可達(dá)到92.4％～98.6％，且細(xì)胞傳代生長(zhǎng)穩(wěn)定，與現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞相比有明顯優(yōu)勢(shì)，適合大規(guī)模培養(yǎng)。以上對(duì)培養(yǎng)液的調(diào)整及培養(yǎng)方法的改進(jìn)，大幅降低了成本。此外，本發(fā)明也在方法等各方面彌補(bǔ)了現(xiàn)有畜體細(xì)胞保存的不足，而且岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系活率及純度的提升也使重要、瀕危岷縣黑裘皮羊品種的基因資源以體外培養(yǎng)細(xì)胞的形式得以長(zhǎng)期保存。
本發(fā)明所述的高活率及高純度的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系可以為醫(yī)學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)等生命科學(xué)研究提供大量的高品質(zhì)材料；并可以作為體細(xì)胞克隆育種的供體細(xì)胞；在農(nóng)業(yè)上可以豐富、改良地方品種；還可以作為疫苗生產(chǎn)的主要原材料及干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層；同時(shí)可用于細(xì)胞凋亡及細(xì)胞融合研究。
下面結(jié)合附圖及最佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，以使公眾對(duì)發(fā)明內(nèi)容有整體和充分的了解，而并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開(kāi)了本發(fā)明可以實(shí)施的保護(hù)范圍，因此凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對(duì)本發(fā)明的侵犯。
圖1為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞顯微鏡下圖；圖2為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞繼代I細(xì)胞顯微鏡下圖；圖3為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞繼代II細(xì)胞顯微鏡下圖；圖4為被支原體污染的成纖維細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D；圖5為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞支原體檢測(cè)陰性結(jié)果圖示；圖6為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；圖7為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞核型圖示；圖8為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞乳酸脫氫同功酶電泳圖示；圖9為岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞蘋(píng)果酸脫氫酶電泳圖示；圖10為pEYFP-N1基因在岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞中表達(dá)48h 100倍圖示；圖11為基因在岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞中表達(dá)72h 100倍圖示；圖12為pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株400倍圖示；具體實(shí)施方式
實(shí)施例中所用的主要儀器及試劑來(lái)源岷縣黑裘皮羊來(lái)源甘肅省岷縣(一)主要儀器設(shè)備1、激光掃描共聚焦顯微鏡尼康TE-2000-E；2、浮雕相差顯微鏡，Olympus IX-71；3、生物顯微鏡，Olympus CX31；
4、倒置相差熒光顯微鏡Olympus IX-71；5、-70℃超低溫冰箱美國(guó)kelvinator；6、電動(dòng)移液器德國(guó)Accu-jet；7、頗爾超純水器Pall-pruelab_plus；8、CO2培養(yǎng)箱Heraeus BB16UV；9、液氮貯存器四川東亞YES-50B-125F；10、電泳儀北京六一廠DYY-6C；11、電泳槽北京六一廠DYC-24A12、高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)哈爾濱DL-CJ-2N；13、低速離心機(jī)CENTERIGUGETDL-40B；(二)主要試劑1、DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)；2、Plasmid Midi Kit質(zhì)粒提取盒，Trizol試劑，cDNA合成試劑盒，cDNA PCR文庫(kù)試劑盒，G418，pEGEP-N3質(zhì)粒載體Clontech；3、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)，吉姆薩(Giemsa)Amresco；4、特級(jí)胎牛血清(Defined FBS)Hyclone；5、臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉雙丙烯酰胺)98％，過(guò)硫酸銨(Ammonium Persulfate)，PMS，NAD，噻唑藍(lán)(Thiazolyl Blue)，細(xì)胞松弛素B，Hoechst33342，離子霉素，6-DMAPSigma；6、甘油分析純?nèi)A綠淵；7、TrisPromega；8、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)NOVON；9、脂質(zhì)體LipofectinGibco公司；成纖維細(xì)胞培養(yǎng)所用液體配制10、DMEM培養(yǎng)液DMEM 9.6g，溶于超純水中，用NaHCO3約3.2g調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，加水定容至1L，用磁力攪拌器攪拌混勻，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，500ml/瓶分裝，貯存于4℃。
11、培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液中加入終濃度為10％(體積比)的FBS，0.22μm濾膜過(guò)濾500ml/瓶分裝，4℃貯存。
12、雙抗貯存液100萬(wàn)IU的鏈霉素4支，80萬(wàn)IU的青霉素5支溶于400ml滅菌去離子水中。
13、1×PBS緩沖液NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KH2PO40.10g，加超純水定容至500ml，pH為7.2，高壓滅菌密封后4℃貯存。
14、0.25％(質(zhì)量體積比)胰蛋白酶溶液1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH為7.2～7.4，0.22μm濾膜過(guò)濾分裝，-20℃貯存。
15、0.9％(質(zhì)量比)生理鹽水0.45g NaCl溶于500ml超純水，高壓滅菌30min。
16、細(xì)胞凍存液將50ml DMSO加入450ml全培養(yǎng)液(含體積比15％FBS的全培養(yǎng)液)中，用0.22μm濾膜過(guò)濾100ml/瓶分裝，貯存于-20℃冰箱。微生物檢測(cè)所用試劑17、大豆胰蛋白胨3g大豆胰蛋白胨，加100ml超純水，調(diào)pH至7.3，高壓滅菌15～20min，分裝到15×150mm的玻璃管中。
18、麥芽汁2g麥芽汁加100ml超純水，調(diào)pH至3～4，高壓滅菌15～20min，分裝到15×150mm的玻璃管中。
19、DAPI染液超純水配制1mg/ml DAPI儲(chǔ)存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
20、封片液22.2ml 0.1M的檸檬酸，27.8ml 0.2M的Na2HPO4溶于50ml甘油中，NaOH調(diào)節(jié)pH至5.5，貯存于4℃。
21、固定液冰醋酸與甲醇以體積比1∶3的比例(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
染色體標(biāo)本制備所用試劑22、秋水仙素貯存液10mg秋水仙素溶于10ml超純水中。
23、稀釋液超純水將貯存液稀釋10倍至終濃度為100μg/ml。
24、低滲KCl溶液0.5g的KCl溶于100ml超純水。
25、固定液冰醋酸與甲醇按體積比1∶3的比例配制。
26、Giemsa染色液原液將1g Giemsa染粉倒入研缽，加幾滴甘油，在研缽內(nèi)研磨至無(wú)顆粒為止，然后加甘油至33ml，放在56℃保溫箱2h后，加入45ml甲醇攪拌均勻，棕色瓶中貯存?zhèn)溆谩?br>
工作液磷酸緩沖液將Giemsa原液稀釋10倍至終濃度為10ml。
27、磷酸緩沖液的配制KH2PO40.34g加入100ml去離子水(用NaOH調(diào)pH 6.8)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用試劑28、質(zhì)粒DNA(EGFP-N3)，脂質(zhì)體Lipofectamine，不含血清的DMEM培養(yǎng)液，含血清的DMEM培養(yǎng)液，pH 7.4的PBS。
同工酶分析所用試劑29、0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液分別稱取0.9g NaCl和0.0223g EDTA溶于100ml超純水中即可。
30、蛋白提取液將5ml TritonX-100加入75ml 0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液中即得蛋白提取液，將其貯于4℃冰箱保存。TritonX-100∶0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液＝1∶15。
31、40％(質(zhì)量體積比)蔗糖溶液將40g蔗糖溶于100ml水中。
32、膠溶液的配制A液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 36.6g，TEMED 0.23ml，用濃鹽酸調(diào)至pH 8.9B液Acr 40.0g，Bis 2gC液過(guò)硫酸銨0.14g(現(xiàn)配現(xiàn)用)D液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用濃鹽酸調(diào)至pH 6.7E液Acr 10.0g，Bis 2.5gF液核黃素4.0mgG液蔗糖40.0g33、聚丙稀酰胺凝膠溶液濃度，見(jiàn)表1表1
34、電極緩沖液的配置6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸餾水，pH調(diào)至8.735、電泳指示劑分別秤稱取0.25g溴酚藍(lán)和40g蔗糖溶于100ml水中。
36、LDH染色液配制(染色前1h配制)乳酸鈣100mg+0.05M Tris-HCl(pH8.0)20ml噻唑藍(lán)5mg+超純水1.0mlPMS 2.5mg+超純水1.0ml輔酶I(NAD)10mg染色前，將以上保溫試劑混合后，倒入20ml 2％(體積比)瓊脂溶液中，混勻。
37、MDH染色液配制(染色前1h配制)DL-蘋(píng)果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH8.0)中噻唑藍(lán)15mg+超純水1.5mlPMS 5mg+超純水1.0ml輔酶I(NAD)10mg將以上混合后，倒入25ml 2％(體積比)瓊脂溶液中。
38、固定液的配制乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。
39、溴酚藍(lán)溶液得配制分別稱取0.25g溴酚藍(lán)和40g蔗糖溶于100ml水中。
40、固定液冰醋酸與無(wú)水甲醇以體積比1∶3的比例混合，4℃貯存?zhèn)溆?現(xiàn)用現(xiàn)配)。
41、DAPI染液超純水配制1mg/ml DAPI儲(chǔ)存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
42、封片液的配制將22.2ml 0.1mol/L檸檬酸與27.8ml 0.2mol/L Na2HPO4加入到50ml甘油中，用NaOH調(diào)pH至5.5，4℃貯存?zhèn)溆谩?br>
實(shí)施例1高細(xì)胞活率高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建(1)初代培養(yǎng)無(wú)菌條件下，將岷縣黑裘皮羊耳緣組織樣品用眼科剪刮去表面的毛，放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中漂洗6～8次，以去除表面血污及毛發(fā)；將組織剪切成1mm3左右的組織塊；用移樣器將組織塊分別移入培養(yǎng)瓶中分散均勻，倒置培養(yǎng)瓶，并在37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)基8ml～10ml，培養(yǎng)基成分DMEM+8％特級(jí)胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)10～12h；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留物2次后，以除去殘余的血清和脫落的組織塊及死細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30～60s后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)，加入全培養(yǎng)液(10％FBS的DMEM)15ml～20ml終止消化；消化后的細(xì)胞平均分裝入2個(gè)培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)細(xì)胞凍存A、凍存前24h，棄除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液8～10ml，培養(yǎng)液成分DMEM+10％特級(jí)胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30～60s后，加入全培養(yǎng)液8ml～10ml終止反應(yīng)；C、用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算凍存前細(xì)胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心8min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細(xì)胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中嚴(yán)密封口，標(biāo)明日期、品種、細(xì)胞名稱、培養(yǎng)代數(shù)；F、預(yù)凍將凍存管裝入程序降溫盒中，放于4℃20～30min，然后在-70℃冰箱中預(yù)凍4h以上；G、凍存提出凍存管放入液氮罐中，即完成細(xì)胞凍存。
(4)細(xì)胞復(fù)蘇將凍存管從液氮中取出，迅速置入42℃水浴中，連續(xù)晃動(dòng)1min后，見(jiàn)余有小冰團(tuán)成黃豆粒大小時(shí)放入超凈工作臺(tái)內(nèi)；將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液(DMEM+8％特級(jí)胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中輕輕吹打均勻，放置含37℃5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
實(shí)施例2 岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系生物學(xué)特性的檢測(cè)對(duì)實(shí)施例1 培養(yǎng)的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)特性檢查，方法及結(jié)論如下。一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方法細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)檢查，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)液顏色變化情況以及細(xì)胞是否發(fā)生污染。
結(jié)論如圖1(岷縣黑裘皮羊原代細(xì)胞)、圖2(岷縣黑裘皮羊傳代前細(xì)胞)、圖3(岷縣黑裘皮羊繼代1細(xì)胞)、圖4(岷縣黑裘皮羊胚繼代II細(xì)胞)所示，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，其形態(tài)為典型的成纖維狀，呈現(xiàn)梭形或不規(guī)則三角形。對(duì)細(xì)胞群體的全貌觀察，所培養(yǎng)的細(xì)胞均呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走勢(shì)，證明細(xì)胞生長(zhǎng)健康旺盛。
二、微生物檢測(cè)1、細(xì)菌、真菌檢測(cè)方法(1)取凍存細(xì)胞量0.5％的凍存細(xì)胞，于8ml無(wú)抗培養(yǎng)液中混勻，細(xì)胞懸液以1000rpm離心20min，并重復(fù)兩次，以消除抗生素的影響。再重懸于2ml無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中。
(2)將細(xì)胞以0.5ml接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
(3)設(shè)對(duì)照為A.陽(yáng)性對(duì)照枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
B.陰性對(duì)照胰蛋白豆胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
結(jié)論肉眼觀察接種有岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞的大豆胰蛋白胨培養(yǎng)液和麥芽汁培養(yǎng)液，均呈現(xiàn)清亮透明狀，將試管置于顯微鏡下觀察，除動(dòng)物細(xì)胞呈圓形的透明狀亮點(diǎn)漂浮在培養(yǎng)液中，無(wú)其它異物。證明在細(xì)胞培養(yǎng)凍存及細(xì)胞復(fù)蘇的整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞未被細(xì)菌、真菌污染。
2、病毒檢測(cè)方法(1)接種待檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)至致密單層。
(2)采集新鮮的肝素抗凝全血(雞血、豚鼠血)，1000rpm離心10min，棄上清。沉積的紅細(xì)胞用PBS洗滌3次，用0.9％NaCl溶液懸浮，制成0.5％(V/V)的紅細(xì)胞懸液。
(3)待檢細(xì)胞棄除培養(yǎng)液，用0.9％NaCl溶液沖洗單層細(xì)胞2～3次。
(4)分別加0.5ml新鮮配制的雞、豚鼠紅細(xì)胞懸液于待檢細(xì)胞瓶中，于4℃放置20min。
(5)觀察紅細(xì)胞凝集和吸附現(xiàn)象，不呈現(xiàn)紅細(xì)胞吸附的細(xì)胞，需重復(fù)進(jìn)行(2)～(4)的操作。
結(jié)論由于病毒表面有血凝素，能結(jié)合某些物種的紅細(xì)胞，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。被這些病毒感染的細(xì)胞能夠?qū)㈦u、豚鼠的紅細(xì)胞吸附在其表面上。檢測(cè)結(jié)果在無(wú)抗生素的條件下常規(guī)培養(yǎng)岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞，在相差顯微鏡觀察，雞的紅細(xì)胞呈橢圓狀懸浮在成纖維細(xì)胞上方，未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；豚鼠的紅細(xì)胞呈圓形懸浮在上方，也未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。檢測(cè)結(jié)果為陰性，證明該培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有因?yàn)椴《径斐杉?xì)胞損傷。
3、支原體檢測(cè)方法(1)標(biāo)本將成纖維細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。
(2)培養(yǎng)被檢細(xì)胞在不含抗生素的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)3次以上(不低于3次)，在最后一次傳代培養(yǎng)增殖期中換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d。
(3)接種陰性對(duì)照皿加細(xì)胞培養(yǎng)液2ml；待檢皿內(nèi)加入待檢樣品2ml，在蓋片上培養(yǎng)的細(xì)胞匯合之前，從瓶中取出(如細(xì)胞完全匯合，影響對(duì)支原體的觀察)。
(4)漂洗將細(xì)胞蓋片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷風(fēng)吹干。
(5)固定用固定液浸泡蓋玻片，固定細(xì)胞10min后，重復(fù)步驟(4)。
(6)染色將配制好Hoechst 33258染液滴加到固定好的細(xì)胞上，室溫下染色30min。
(7)漂洗用PBS浸洗染色后的蓋玻片3次，每次3～5min，冷風(fēng)吹干。
(8)制片將一滴含1％甘油的PBS加到染色后的細(xì)胞表面，將有細(xì)胞的蓋玻片面朝下覆蓋在載玻片上。
(9)觀察以100×～400×熒光顯微鏡觀察，打開(kāi)光源10min后，以330～380nm紫色熒光激發(fā)，觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)的熒光物產(chǎn)生。
結(jié)論Hoechst 33258熒光染料能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，嵌入DNA中，使之發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。支原體內(nèi)也含有DNA，亦能著色，在熒光顯微電鏡下觀察可看到藍(lán)色熒光。因此，在陽(yáng)性對(duì)照中，除細(xì)胞核部位有藍(lán)色熒光外，在細(xì)胞表面及周圍也能看到藍(lán)色點(diǎn)狀或絲狀熒光。而且在細(xì)胞表面同時(shí)有支原體DNA熒光染色顆粒和絲狀小點(diǎn)，如圖5所示。檢測(cè)結(jié)果顯示如圖6所示，體外培養(yǎng)岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞制片后，在倒置熒光顯微鏡下，用380nm的紫色熒光激發(fā)，可以發(fā)現(xiàn)整個(gè)視野內(nèi)可見(jiàn)的細(xì)胞表面均為光滑樣，細(xì)胞核呈圓狀或橢圓狀，細(xì)胞核中的DNA發(fā)出藍(lán)色熒光，且細(xì)胞周圍無(wú)絲狀或顆粒狀小點(diǎn)。證明本細(xì)胞沒(méi)有支原體污染。
三、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制方法(1)懸液制備取待測(cè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，增至接近匯合時(shí)，用常規(guī)方法消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。
(2)接種向24孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞，一般1～2×104個(gè)/ml，于37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)計(jì)數(shù)檢測(cè)從接種時(shí)間算起，每隔24h計(jì)數(shù)3孔內(nèi)的細(xì)胞密度，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8組結(jié)束。
(4)繪圖以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
結(jié)論通過(guò)對(duì)所培養(yǎng)的岷縣黑裘皮羊體外培養(yǎng)細(xì)胞用常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種24孔培養(yǎng)板，每孔1ml細(xì)胞懸液，對(duì)接種于24孔培養(yǎng)板的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)7d定時(shí)記數(shù)，記錄各次細(xì)胞密度，繪制而成培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖7所示，接種后第2d細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加，第3d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞生長(zhǎng)期總體趨勢(shì)均呈S型，細(xì)胞接種后均有24h的潛伏期，此期為細(xì)胞的適應(yīng)階段，是細(xì)胞由于接種時(shí)胰酶消化而致的損傷后的修復(fù)時(shí)期，此后細(xì)胞呈指數(shù)增殖，即指數(shù)生長(zhǎng)期，最后進(jìn)入停滯期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，幾乎停止，可見(jiàn)有細(xì)胞漂浮。而細(xì)胞分裂指數(shù)(MI)最高值(培養(yǎng)第2d)在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前出現(xiàn)，并在培養(yǎng)第2～4d時(shí)維持于一個(gè)較高的水平，隨后下降到初始水平。本發(fā)明方法培養(yǎng)的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的純度98.9％與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞平均純度91％相比有顯著提高；且細(xì)胞群體倍增時(shí)間(PDT)為24h，與現(xiàn)有技術(shù)膠原酶消化技術(shù)和現(xiàn)有貼壁培養(yǎng)法獲得的PDT-35.9h和48h相比具有顯著的提高，證明細(xì)胞純度高、生命力旺盛。
四、細(xì)胞活率測(cè)定方法檢測(cè)凍存細(xì)胞的存活率可采用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)，將待檢細(xì)胞復(fù)蘇后制成細(xì)胞懸液，取10μl細(xì)胞懸液加入10μl 1％臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，健康活細(xì)胞胞體完整，細(xì)胞透明，不著色，凡著色呈藍(lán)色者為死細(xì)胞。計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率。統(tǒng)計(jì)二種細(xì)胞總數(shù)，以活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比反映細(xì)胞活力。
結(jié)論細(xì)胞凍存前后對(duì)岷縣黑裘皮羊耳緣組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活率測(cè)定。結(jié)果表明凍存前細(xì)胞活率在95.8～98.7％之間，凍存后細(xì)胞活率為93.2％～96.7％，與現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)凍存后細(xì)胞活78.6％相比有顯著的提高。且復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前相比，細(xì)胞類型仍為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度沒(méi)有發(fā)生變化，凍存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定。
五、核型的制備方法1、加秋水仙素取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，加秋水仙素到培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為0.1～0.4μg/ml。
2、在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，使大部分細(xì)胞處于分裂中期。
3、采集分裂相細(xì)胞加0.25％胰蛋白酶溶液用常規(guī)方法消化，然后加培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用。轉(zhuǎn)入15ml離心管，以1000rpm離心8min，收集細(xì)胞。
4、低滲將沉淀細(xì)胞用預(yù)熱至37℃、0.075M KCl溶液2ml，重懸，吹打均勻后，繼續(xù)加KCl溶液至10ml，放入37℃溫箱中溫育15min。
5、預(yù)固定懸液中加入新鮮固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，輕輕打勻。
6、固定將懸液以1000rpm離心8min，去掉上清夜，加入新鮮固定液5ml，打勻，室溫靜置20min。
7、重固定重復(fù)2次，離心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混勻。
8、滴片滴2～3滴細(xì)胞懸液于45°傾斜載玻片，使細(xì)胞分散均勻，室溫下干燥。
9、染色用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)稀釋10倍的Giemsa液染色10min，自來(lái)水沖洗，空氣干燥。
10、鏡檢油鏡觀察可見(jiàn)中期分裂相細(xì)胞和鋪展的染色體，細(xì)胞質(zhì)被染成藍(lán)色，細(xì)胞核被染成淡紫色。
11、染色體照片及數(shù)據(jù)處理每個(gè)品種統(tǒng)計(jì)100個(gè)分裂相以確定染色體數(shù)目，按Denver(1960)會(huì)議和Leven標(biāo)準(zhǔn)(1964)測(cè)量并計(jì)算染色體的三個(gè)參數(shù)即相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值和著絲點(diǎn)指數(shù)，并確定染色體著絲點(diǎn)類型。三個(gè)參數(shù)的計(jì)算公式如下 12、封片過(guò)二甲苯兩次后，用中性樹(shù)膠蓋玻片封片。
結(jié)論細(xì)胞系質(zhì)量的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)之一是二倍體細(xì)胞的出現(xiàn)率達(dá)到85％以上，在本試驗(yàn)中，對(duì)100個(gè)岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞的染色體數(shù)目計(jì)數(shù)，只對(duì)其是否為整二倍體進(jìn)行計(jì)算，分別以第1～3代的細(xì)胞為研究對(duì)象。統(tǒng)計(jì)結(jié)果為二倍體細(xì)胞占主體，為95％以上，說(shuō)明所建岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系達(dá)到優(yōu)質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定。
具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，M代表中部著絲點(diǎn)染色體，SM代表亞中部著絲點(diǎn)染色體，ST代表亞端部著絲點(diǎn)染色體，T代表端部著絲點(diǎn)染色體。
岷縣黑裘皮羊二倍體染色體數(shù)目為2n＝54，包括26對(duì)常染色體和一對(duì)性染色體，性染色體為X、Y，雄性為XY型，雌性為XX型。如圖8所示，根據(jù)染色體大小順序每對(duì)特征如下1-3號(hào)為近中著絲粒染色體4-9號(hào)為最大的端著絲粒染色體；10-18號(hào)為較小的端著絲粒染色體19-26號(hào)為最小的端著絲粒染色體X染色體為最大的近端著絲粒染色體，Y染色體是最小的著絲點(diǎn)染色體。
表2岷縣黑裘皮羊染色體參數(shù)(♀)
六、同工酶分離方法采用不連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳法。
1、收集細(xì)胞，用PBS重新懸浮，記數(shù)；2、清洗。用PBS洗細(xì)胞3次，離心棄上清夜；3、用蛋白提取液重新懸浮細(xì)胞，密度達(dá)5×107個(gè)/ml，吹打均勻；4、將細(xì)胞懸液移到1.5ml離心管中，4℃下以1×104rpm離心2min收取上清液，分裝后置-70℃貯存?zhèn)溆茫?、上清液加入等量40％蔗糖溶液，混勻即為樣品液；6、用微量加液器向每個(gè)樣品槽加樣20～50μl，再用稀釋10倍的電極緩沖液把每個(gè)樣品槽補(bǔ)充滿，然后向上下槽緩緩加入電極緩沖液。在上槽中加入1～2滴溴酚藍(lán)，放入4℃冰箱；7、接通電源，上槽為負(fù)極，下槽為正極，調(diào)節(jié)電壓為120V維持1h，再調(diào)至220V，待溴酚藍(lán)遷移至下端0.5～1cm處停止電泳，約5h；8、電泳完畢，切去濃縮膠，用蒸餾水漂洗兩次后，浸入染色液中置37℃溫箱中保溫染色30～60min，膠條染色后用凝膠固定液固定后照相；9、用相對(duì)遷移率(Rf)表示，即區(qū)帶泳動(dòng)距離(d)與指示染料泳動(dòng)距離(D)之比，計(jì)算公式為Rf＝d/D×100％。區(qū)帶泳動(dòng)距離一律按區(qū)帶后緣的距離測(cè)量。
結(jié)論如圖9所示，岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞的乳酸脫氫同工酶酶譜從“陽(yáng)極”到“陰極”分別為L(zhǎng)DH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5，酶活性強(qiáng)弱依次為L(zhǎng)DH4＞LDH3＞LDH2＞LDH5＞LDH1。如圖10所示，岷縣黑裘皮羊的蘋(píng)果酸脫氫酶譜呈現(xiàn)2條區(qū)帶，即sMDH(細(xì)胞質(zhì)型)區(qū)帶組和mMDH(線粒體型)區(qū)帶組，且后者比前者泳動(dòng)速度慢。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，表4。
表3 LDH同工酶的相對(duì)遷移率
表4 蘋(píng)果酸脫氫酶的相對(duì)遷移率
上述同工酶電泳結(jié)果表明所培養(yǎng)的體細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，純度高，細(xì)胞之間未發(fā)生交叉污染。
LDH及MDH基因的表達(dá)受遺傳基因和代謝物的雙重控制，電泳速度快的區(qū)帶本身分子量小。若細(xì)胞被污染，則會(huì)因?yàn)槊總€(gè)品種的遷移率不一樣，結(jié)果就可能出現(xiàn)比現(xiàn)在更多數(shù)目的區(qū)帶。利用岷縣黑裘皮羊體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞進(jìn)行乳酸脫氫同工酶(LDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)譜系分析可以得到清晰的特征譜系，表明所培養(yǎng)的體細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，純度高，沒(méi)有與其他品種的細(xì)胞發(fā)生交叉污染。
七、pEYFP-N1在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及陽(yáng)性細(xì)胞株的建立方法1、熒光蛋白報(bào)告質(zhì)粒pEYFP-N1的制備及鑒定按照Plasmid Midi Kit質(zhì)粒提取盒說(shuō)明書(shū)，提取、純化pEYFP-N1熒光蛋白基因質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒溶于TE(PH8.0)低鹽溶解液中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)粒濃度(質(zhì)粒濃度[μg/ml]＝OD260×50μg/ml×稀釋倍數(shù))，得到的pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒濃度為0.31μg/ml質(zhì)粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所提取質(zhì)粒較純，無(wú)RNA、無(wú)水乙醇和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。再用Nhe I和Xba I雙酶切后，用1％瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果，可以得到約750bp和4kb兩條譜帶。根據(jù)熒光蛋白質(zhì)粒酶切圖譜分析所獲質(zhì)粒確為所需pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒。
2、脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞(1)、于轉(zhuǎn)染前一天，用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞培養(yǎng)物，將細(xì)胞接種到6孔(或35mm)的培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1～2×105細(xì)胞，加2ml含血清培養(yǎng)液；(2)、置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70～80％的匯合程度；(3)、轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察，挑取生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)好的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染；(4)、將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不含血清的培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞兩次；(5)、合并溶液A和B，輕輕混合后于室溫下靜置45min，然后加入0.8ml不含血清的培養(yǎng)液；(6)、將DNA、脂質(zhì)體和不含血清的培養(yǎng)液的混合物滴加在培養(yǎng)版中待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～24h；(7)、倒掉轉(zhuǎn)染夜，加入含血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；(8)、在513nm激發(fā)光激發(fā)下觀察黃色熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
3、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)(1)、將細(xì)胞以4.0×105個(gè)/ml密度接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔3ml，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。
(2)、DAPI染色倒掉細(xì)胞的培養(yǎng)基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液沖洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆蓋細(xì)胞，37℃溫育15min，再倒掉染色液，用甲醇沖洗一次。
(3)、激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
4、轉(zhuǎn)染抗性細(xì)胞的篩選(1)、將岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)至25mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加5mL細(xì)胞全培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，按下列濃度加G4180、100、200、300、400、500、600、700、800g/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及死亡情況，每3天換液1次，仍以上述濃度加G418，兩周內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最小濃度即為最小致死量。確定濃度為800g/mL。
(2)、轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞按1∶4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70％-80％融合，棄培養(yǎng)液，更換濃度800g/mL的G418全培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每3天換一次培養(yǎng)液，約10d后，對(duì)照細(xì)胞大部死亡，觀察每孔中細(xì)胞克隆的形成數(shù)及熒光表達(dá)強(qiáng)度。G418培養(yǎng)液濃度換為300g/mL繼續(xù)篩選培養(yǎng)，基本得到G418抗性細(xì)胞的穩(wěn)定克隆。挑選熒光表達(dá)最強(qiáng)的單個(gè)細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)至50mL培養(yǎng)瓶進(jìn)一步培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增。
4、單克隆陽(yáng)性細(xì)胞株熒光蛋白基因整合、表達(dá)的檢測(cè)及鑒定從挑選擴(kuò)大培養(yǎng)的黃色熒光蛋白陽(yáng)性表達(dá)的岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中提取基因組DNA，黃色熒光蛋白陽(yáng)性RNA采用Trizol試劑提取，mRNA的反轉(zhuǎn)錄根據(jù)cDNA合成試劑盒，cDNA PCR文庫(kù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。設(shè)計(jì)了特異引物P1(5’-TTCTCGCCACCATGGTGAGCAA-3’)，P2(5’-TTCTCGCGGCGGCCGCTTTACTTGT-3’)擴(kuò)增6種熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞基因組DNA，用同一對(duì)引物對(duì)黃色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR，引物18S51(5’-GGCAGCGTCCGGGAAACCAAATTC-3’)和18S31(5-CCACCACAGATCAGAGAGC-3’)擴(kuò)增18sRNA作為RT-PCR內(nèi)參照。PCR反應(yīng)總體積為25μl，PCR程序95℃熱變性5min，然后以94℃，30s；57℃，30s；72℃，30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)熒光蛋白基因的整合及表達(dá)情況。
結(jié)論如圖11、12所示，岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48h，轉(zhuǎn)染率為63.5％；轉(zhuǎn)染72h后陽(yáng)性細(xì)胞和部分陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度均逐漸減少、減弱。將細(xì)胞以1∶4的比例傳代，傳代3～4h待細(xì)胞貼壁后，開(kāi)始用G418篩選，篩選2周后，獲得的多個(gè)克隆中，有些仍能看到熒光表達(dá)，有些看不到，挑選表達(dá)強(qiáng)烈的克隆進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)，目前傳了8～13代，這些細(xì)胞仍然表達(dá)熒光，而且熒光強(qiáng)度仍然強(qiáng)烈。利用設(shè)計(jì)熒光蛋白基因特異引物，對(duì)提取的pEYFP-N1熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一條750bp左右的片段，與設(shè)計(jì)的引物預(yù)期擴(kuò)增的片段大小正好相符，說(shuō)明熒光蛋白基因都已經(jīng)整合到細(xì)胞的基因組染色體上。用同一對(duì)引物，對(duì)提取的pEYFP-N1熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，也獲得了750bp左右的片段，RNA水平上證實(shí)了熒光蛋白基因在岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞中能夠正常的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。成功獲得了已經(jīng)整合到細(xì)胞核染色體上的pEYFP-N1熒光蛋白基因陽(yáng)性細(xì)胞株。如圖12。
實(shí)驗(yàn)證明pEYFP-N1報(bào)告基因在本岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系細(xì)胞表達(dá)率遠(yuǎn)高于其它細(xì)胞系的30～40％，表達(dá)率均在60％以上。本研究結(jié)果對(duì)于標(biāo)記基因、核移植及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆等研究具有重要的參考價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系，其特征在于，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1880。
2.一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)將岷縣黑裘皮羊耳緣組織用PBS漂洗6～8次后用眼科剪剪成1mm3左右的組織塊；將組織塊移入倒置培養(yǎng)瓶中，并在37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h；待組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)液8～10ml，培養(yǎng)液成分DMEM+10％特級(jí)胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)10～12h；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)液6～10ml終止消化；消化后的細(xì)胞懸液平均分裝入2個(gè)培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。(3)細(xì)胞凍存A、換液凍存前24h，棄除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、消化用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，然后加入培養(yǎng)液6～10ml終止反應(yīng)；C、計(jì)數(shù)用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算凍存前細(xì)胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心8min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細(xì)胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、分裝將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中封口；F、預(yù)凍將凍存管裝入程序降溫盒中，置于4℃20～30min，然后轉(zhuǎn)入-70℃預(yù)凍4～6h；G、凍存提出凍存管迅速投入液氮柜中，即完成細(xì)胞凍存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的岷縣黑裘皮羊組織材料以幼齡為最佳。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)及步驟(3)中所述的胰酶消化具體步驟是向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30～60s。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高活率、高純度岷縣黑裘皮羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，將步驟(3)凍存的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，連續(xù)晃動(dòng)1min后，將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。
全文摘要
本發(fā)明利用岷縣黑裘皮羊耳緣組織進(jìn)行細(xì)胞初代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及細(xì)胞凍存，并最終獲得了高活率、高純度的岷縣黑裘皮羊成纖維細(xì)胞系，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.1880，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞無(wú)上皮細(xì)胞等雜細(xì)胞污染，細(xì)胞純度高；凍存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定，經(jīng)凍存復(fù)蘇后的活率仍可達(dá)到并維持在92.4％～98.6％之間；傳代生長(zhǎng)穩(wěn)定，適合大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明涉及的岷縣黑裘皮羊成纖維細(xì)胞系可以為基因工程、細(xì)胞工程、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等生命科學(xué)研究提供大量高品質(zhì)材料；也可作為家畜體細(xì)胞克隆育種的供體細(xì)胞；在農(nóng)業(yè)上能豐富并改良地方品種，同時(shí)可作為地方優(yōu)良品種的保種手段之一；還可作為疫苗生產(chǎn)的主要原材料。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101020897SQ20061016194
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者馬月輝, 關(guān)偉軍, 張艷艷, 馬忠仁, 陳莉娜, 劉長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所