專(zhuān)利名稱(chēng)：預(yù)防和治療阿爾茲海默癥的g蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease)或相關(guān)的神經(jīng)疾病，尤其是涉及篩選預(yù)防或治療阿爾茲海默癥的藥物的方法及β-腎上腺素受體或阿片受體的拮抗劑在治療阿爾茲海默癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茲海默癥的特點(diǎn)為漸進(jìn)性的癡呆和性格變化，是最常見(jiàn)的與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性病變。阿爾茲海默癥影響5-11％的65歲以上年齡人群，30％的85歲以上年齡人群。阿爾茲海默癥是由退化的神經(jīng)元和活性的星型膠質(zhì)細(xì)胞附近的淀粉樣蛋白斑異常積累引起的。
淀粉樣蛋白斑主要由淀粉樣蛋白β(Aβ)組成。它是阿爾茲海默癥的神經(jīng)病理學(xué)標(biāo)志，其形成被認(rèn)為是阿爾茲海默癥的主要病因。此外，最近的研究揭示了可彌散的寡聚化的Aβ也可以是具有神經(jīng)毒性而且和阿爾茲海默癥相關(guān)(Nature 416，535-9，2002)。
Aβ由Aβ前體蛋白(APP)依次通過(guò)β-和γ-分泌酶的順序剪切形成的。如圖1所示，β-分泌酶剪切Aβ前體蛋白后產(chǎn)生可溶的APPs-β片斷和C99片斷，后者隨后被γ-分泌酶剪切后產(chǎn)生Aβ和C60片斷。
Aβ至少有兩種形式，即40個(gè)氨基酸形式的Aβ40和42個(gè)氨基酸形式的Aβ42。42個(gè)氨基酸形式的Aβ42更容易形成淀粉樣蛋白斑，被認(rèn)為和阿爾茲海默癥的病因更相關(guān)。γ-分泌酶因?yàn)闆Q定兩種主要Aβ形式(Aβ40和Aβ42)的比例而在阿爾茲海默癥中起著關(guān)鍵作用。
如圖2所示，γ-分泌酶復(fù)合物包括至少四種必需組分早老蛋白-1(PS1)，nicastrin(NCSTN)，APH-1，和PEN-2。其中一般認(rèn)定的催化組分早老蛋白-1的突變是引起大多數(shù)家族型阿爾茲海默癥的原因，由此推斷γ-分泌酶在阿爾茲海默癥的病理發(fā)生中起重要作用(至少在家族型阿爾茲海默癥的病理發(fā)生中)。
盡管早老蛋白-1的突變和家族型阿爾茲海默癥之間的關(guān)聯(lián)為阿爾茲海默癥的遺傳病因提供了線(xiàn)索，家族型阿爾茲海默癥僅僅占所有阿爾茲海默癥病例的不足10％。相比之下，大多數(shù)阿爾茲海默癥是散發(fā)型的，說(shuō)明早老蛋白-1的突變以外的因素在阿爾茲海默癥的病理發(fā)生中更重要。因此，研究各種因素或環(huán)境作用如何對(duì)阿爾茲海默癥的病理發(fā)生起作用是非常重要的。
以前的研究已經(jīng)顯示了體外細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的Aβ能夠通過(guò)激活胞內(nèi)信號(hào)通路或膜受體如毒蕈堿型乙酰膽堿受體被降低。最近的證據(jù)也顯示了Aβ水平和淀粉樣蛋白斑的形成受生長(zhǎng)抑素(somatostatin)或環(huán)境因素影響。
APP的剪切也能夠被神經(jīng)遞質(zhì)和突觸活性調(diào)控。例如，激活與磷脂酰肌醇水解或激活蛋白激酶C相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)受體能夠提高APP的代謝并降低Aβ產(chǎn)生(Ulus andWurtman，J.Pharm.Exp.Ther.，281，149(1997))。另一方面，激活與cAMP的產(chǎn)生相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)受體能夠抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和原代星型膠質(zhì)細(xì)胞中的組成型的和蛋白激酶C/磷脂酰肌醇激活的分泌型APP的產(chǎn)生(Lee et al.，J.Neurochem.，68，1830(1997))。cAMP對(duì)分泌型APP的產(chǎn)生的作用可能是星型膠質(zhì)細(xì)胞特異的，因?yàn)閏AMP和蛋白激酶A激活分泌型APP的產(chǎn)生是在嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞和人胚胎腎細(xì)胞中報(bào)導(dǎo)的(Xu et al.，PNASUSA，93，4081(1996)；Marambaud et al.，J.Neurochem.，67，2616(1996))。任何情況下，以上結(jié)果提示了阿爾茲海默癥中由于神經(jīng)元退化和神經(jīng)元突觸丟失而引起的神經(jīng)遞質(zhì)水平或第二信使信號(hào)轉(zhuǎn)遞的改變能夠破壞APP的剪切并且導(dǎo)致產(chǎn)生淀粉樣的或具有神經(jīng)毒性的APP片斷的積累。
進(jìn)一步，調(diào)控β-腎上腺素受體，引起cAMP升高的同時(shí)能夠增加星型膠質(zhì)細(xì)胞中APP的合成?；诖税l(fā)現(xiàn)，美國(guó)專(zhuān)利6,187,756和6,043,224報(bào)道了利用β-腎上腺素受體拮抗劑調(diào)控cAMP水平來(lái)緩解APP異常表達(dá)導(dǎo)致的神經(jīng)性病變的方法。此方法中，β-腎上腺素受體拮抗劑被用來(lái)通過(guò)調(diào)控cAMP水平抑制APP合成。
除了抑制APP合成，調(diào)控APP代謝也可以被用來(lái)緩解APP相關(guān)的淀粉樣蛋白斑形成引起的神經(jīng)性病變。例如，美國(guó)專(zhuān)利5,385,915報(bào)道了利用調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化的試劑(即影響激酶或磷酸酶的試劑)改變APP剪切的方法和組合方式。對(duì)APP剪切的調(diào)控進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)淀粉樣蛋白斑中積累的Aβ的產(chǎn)生的調(diào)控。類(lèi)似的，在美國(guó)專(zhuān)利5,242,932報(bào)道了利用chloroquine和primaquine等化合物調(diào)控和影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(包括APP)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和剪切的方法。
雖然上述報(bào)道看來(lái)對(duì)調(diào)控APP的產(chǎn)生和代謝以及對(duì)淀粉樣蛋白斑形成是有效的，但是還是有必要發(fā)展更多的治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的方法和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于篩選治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變?cè)噭┑姆椒ǎM(jìn)而提供一種試劑在治療阿爾茲海默癥中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的第一方面，提供篩選治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變?cè)噭┑姆椒?，并提供兩種技術(shù)方案。技術(shù)方案1包括以下步驟(a)激活受體并確定其初始內(nèi)吞程度，所述受體為與早老蛋白-1結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體；(b)在一種候選試劑存在下，如(a)所述激活受體，再次確定受體的內(nèi)吞程度；(c)確定(a)和(b)中的內(nèi)吞程度的差異；(d)如果差異小于閾值則重復(fù)步驟(a)至(c)；或如果差異大于閾值，則確認(rèn)所述候選試劑為治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變的試劑。技術(shù)方案2包括以下步驟(a)測(cè)量受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶的初始結(jié)合程度，所述受體為與早老蛋白-1結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體；(b)在一種候選試劑存在下，如(a)所述再次測(cè)量受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶的結(jié)合程度；(c)確定(a)和(b)中的結(jié)合程度的差異；(d)如果差異小于一定閾值則重復(fù)步驟(a)至(c)，或如果差異大于閾值，則確認(rèn)所述候選試劑為治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變的試劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述受體中至少一種選自β腎上腺素受體和δ-阿片受體。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，所述β腎上腺素受體可以為β2腎上腺素受體(β2AR)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，所述受體被表達(dá)于已經(jīng)轉(zhuǎn)染了編碼此受體基因的細(xì)胞上。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)吞小泡的數(shù)量、內(nèi)吞小泡中的早老蛋白-1、晚內(nèi)吞小泡和溶酶體(LEL)中γ-分泌酶的活性或淀粉樣蛋白β(Aβ)的形成而確定所述的初始內(nèi)吞程度和再次內(nèi)吞程度。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，通過(guò)檢測(cè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移而確定所述的初始結(jié)合程度和再次結(jié)合程度。
在本發(fā)明的第二方面，提供在內(nèi)吞過(guò)程中抑制與早老蛋白-1結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞的受體拮抗劑，用于制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種干擾G蛋白偶聯(lián)受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶的結(jié)合的試劑，用于制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供β-腎上腺素受體或阿片受體的拮抗劑，用于制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，提供β2腎上腺素受體(β2AR)拮抗劑，用于制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，提供的拮抗劑為ICI 118，551、普萘洛爾(propranolol)、布他沙明(butoxamine)或納曲吲哚(naltrindole)中的至少一種，用于制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，提供的拮抗劑為ICI 118，551或butoxamine，用于制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1顯示了β-分泌酶和γ-分泌酶順序作用于A(yíng)PP而產(chǎn)生Aβ的過(guò)程。APP首先被β-分泌酶剪切產(chǎn)生可溶的APPs-β和C99。C99然后被γ-分泌酶剪切產(chǎn)生Aβ和C60。
圖2顯示了γ-分泌酶的四個(gè)主要組分早老蛋白(Presenilin)，nicastrin(NCSTN)，APH-1和PEN-2。
圖3顯示了受體激活后內(nèi)吞過(guò)程和內(nèi)吞小泡向晚內(nèi)吞小體和溶酶體(late endosomesand lysosomes，LEL)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程。
圖4顯示了本發(fā)明涉及的一種篩選治療或預(yù)防阿爾茲海默癥的受體拮抗劑的方法的流程圖。
圖5顯示了刺激G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)增加細(xì)胞系和原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞中Aβ的產(chǎn)生。(a-d)用ELISA方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌型的Aβ(Aβ40和Aβ42)的水平。圖中顯示的是由至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得出的平均數(shù)±均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差與基本值之比(*P＜0.01)。(a)顯示了Iso對(duì)共表達(dá)了β2腎上腺素受體和APPswe的HEK293細(xì)胞的分泌A(yíng)β水平的作用。(b，c)Iso(b)或DADLE(c)對(duì)共表達(dá)了C99和β2腎上腺素受體(b)或δ-阿片受體(c)的HEK293細(xì)胞的分泌A(yíng)β水平的作用。(d)Iso或DADLE對(duì)表達(dá)了C99的原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞的分泌A(yíng)β水平的作用。(e)脈沖跟蹤實(shí)驗(yàn)分析刺激δ-阿片受體對(duì)C99剪切的作用。Pro，propranolol；DADLE，[D-Ala2，D-Leu5]-enkephalin；NALT，naltrindole。
圖6顯示了刺激β2腎上腺素受體增強(qiáng)γ-分泌酶活性。(a)表達(dá)底物方法檢測(cè)不同時(shí)間的Iso處理對(duì)HEK293細(xì)胞中的C99剪切和C60產(chǎn)生作用。(b-d)熒光底物方法檢測(cè)Iso對(duì)C6膠質(zhì)細(xì)胞(b)，大鼠海馬切片(c)和β2腎上腺素受體轉(zhuǎn)染的野生型小鼠和早老蛋白-1-2雙缺失小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(d)中的γ-分泌酶活性的作用。
圖7顯示了δ-阿片受體激活導(dǎo)致的γ-分泌酶活性增強(qiáng)，和增強(qiáng)的時(shí)程。SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(a)和海馬切片(b)顯示用DADLE或NALT處理30分鐘后分離的細(xì)胞膜組分通過(guò)熒光底物方法檢測(cè)γ-分泌酶活性。(c)顯示了β2腎上腺素受體激活增強(qiáng)γ-分泌酶活性的時(shí)程。C6膠質(zhì)細(xì)胞用Iso按所示時(shí)間處理。細(xì)胞膜組分用熒光底物方法檢測(cè)γ-分泌酶活性。
圖8顯示了受體內(nèi)吞和γ-分泌酶活性增強(qiáng)的相關(guān)性。(a-e)用熒光底物方法檢測(cè)γ-分泌酶活性。(a)表達(dá)了β2腎上腺素受體和β2腎上腺素受體T68F，Y132G，Y219A突變體的HEK293細(xì)胞在Iso處理后的γ-分泌酶活性。(b)C6膠質(zhì)細(xì)胞用霍亂毒素，forskolin或dybutylcAMP處理后的γ-分泌酶活性。(c)把C6膠質(zhì)細(xì)胞用刀豆蛋白A，蔗糖溶液或去鉀溶液預(yù)處理后，因Iso處理而增強(qiáng)的γ-分泌酶活性消失。(d)表達(dá)Dyn K44A消除了C6膠質(zhì)細(xì)胞中增強(qiáng)的γ-分泌酶活性。(e)用clathrin RNAi抑制HEK293細(xì)胞中的clathrin表達(dá)消除了增強(qiáng)的γ-分泌酶活性。胞質(zhì)組分用clathrin和actin的抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)。(f，g)β2腎上腺素受體L339，340A突變體(β2ARLL)和β3腎上腺素受體在Iso處理后不能內(nèi)吞(f)或增強(qiáng)γ-分泌酶活性(g)。CTX，霍亂毒素；Fsk，forskolin；db-cAMP，dybutyl cyclic adenosinemonophosphate；PTX，百日咳毒素；Dyn K44A，dynamin II K44A；Con A，刀豆蛋白A；Suc，蔗糖溶液；K+dpl，去鉀溶液；NS RNAi，非特異性RNA干擾；β2ARm，β2AR；Iso，異丙腎上腺素(isoproterenol)。
圖9顯示了δ-阿片受體激活導(dǎo)致的γ-分泌酶活性增強(qiáng)不能夠被百日咳毒素(PTX)消除。SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞用200ng/ml百日咳毒素預(yù)處理12小時(shí)后再用1μMDADLE刺激1小時(shí)。細(xì)胞膜組分用熒光底物方法檢測(cè)。
圖10顯示了HEK293細(xì)胞用transferrin如所標(biāo)記的時(shí)間處理后，細(xì)胞膜組分用熒光底物方法檢測(cè)γ-分泌酶活性。
圖11顯示了內(nèi)吞小體內(nèi)的γ-分泌酶活性和Aβ增加。(a，b)共轉(zhuǎn)染了β2腎上腺素受體和圖中所標(biāo)記的質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞用Iso處理后，用于熒光底物方法(a)，或Aβ特異的免疫沉淀和western blot實(shí)驗(yàn)(b)。胞質(zhì)組分用GFP抗體檢測(cè)。(c)免疫分離晚內(nèi)吞小體和溶酶體實(shí)驗(yàn)顯示了Iso處理增加了共轉(zhuǎn)染β2腎上腺素受體，C99和Flag-Rab7的HEK293細(xì)胞中的Aβ產(chǎn)生。(d)免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析PS1(紅)和GFP-Rab7(綠)在Iso處理后30分鐘的共定位。箭頭所指為包含PS1和GFP-Rab7的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。
圖12顯示了DALDE激活δ-阿片受體后晚內(nèi)吞小體和溶酶體內(nèi)的γ-分泌酶活性增加。
圖13顯示了富集γ-分泌酶需要內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)。(a，b)免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析PS1在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中的定位。(a)對(duì)轉(zhuǎn)染了β2腎上腺素受體和所標(biāo)記的質(zhì)粒Dyn K44A或Rab5S34N的HEK293細(xì)胞中PS1-NTF(紅)和Flag-Rab7(綠)的共定位的分析。(b)檢測(cè)DADLE處理3分鐘后的PS1-NTF(紅)，HA-DOR(綠)和β-adaptin(藍(lán))的共定位。箭頭所指為包含PS1-NTF，HA-DOR和β-adaptin的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。(c)Flag-β2腎上腺素受體和Flag-δ-阿片受體能夠和內(nèi)源的γ-分泌酶的組分相互作用。(d)轉(zhuǎn)染了B2PB2 brandykinin受體的HEK293細(xì)胞在用bradykinin處理后用熒光底物方法分析γ-分泌酶活性。Con，對(duì)照；Dyn K44A，dynamin II K44A突變體；IB，immuno-blot免疫印記法.BK，bradykinin。
圖14顯示了γ-分泌酶活性，Aβ產(chǎn)生和淀粉樣蛋白斑形成在活體實(shí)驗(yàn)中被增強(qiáng)，而β2腎上腺素受體選擇性拮抗劑ICI 118，551有效的抑制了淀粉樣蛋白斑的形成。(a，b)大鼠用去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)或clenbuterol(Cle)急性處理后，海馬的γ-分泌酶活性(a)和分泌型Aβ40和Aβ42水平(b)被增強(qiáng)(*P＜0.01)。(c～-g)APPswe/PS1ΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦內(nèi)淀粉樣蛋白斑在用Iso(c)，clenbuterol(d)或ICI 118，551(f)慢性處理后被增強(qiáng)。圖c，d和f為雌性(左)和雄性(右)小鼠的代表性的淀粉樣蛋白斑。圖e為圖c和d的小鼠淀粉樣蛋白斑的統(tǒng)計(jì)分析。圖g為圖f的小鼠淀粉樣蛋白斑的統(tǒng)計(jì)分析。
圖15顯示了動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因型或物對(duì)本實(shí)驗(yàn)的作用(F＝2.145，P＝0.096)。(b)不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠和野生型組小鼠表現(xiàn)出明顯的差別(F＝28.754，P＜0.001)。而且，propranolol處理組小鼠與對(duì)照組小鼠相比表現(xiàn)出認(rèn)知障礙被部分緩解(F＝4.571，P＝0.034)。nadolol(納多洛爾)處理組小鼠與對(duì)照組小鼠相比沒(méi)有差異(F＝1.192，P＝0.277)。(c)測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中小鼠處于平臺(tái)象限中的時(shí)間百分比。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠和野生型小鼠表現(xiàn)出明顯的差異(P＝0.002)。propranolol處理部分緩解認(rèn)知障礙(P＝0.048)。nadolol處理無(wú)效果(P＝0.969)。
圖16顯示了受體亞型選擇性拮抗劑在動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Betaxolol為能夠通過(guò)血腦屏障的β1腎上腺素受體選擇性的拮抗劑。ICI 118，551為能夠通過(guò)血腦屏障的β2腎上腺素受體選擇性的拮抗劑。(a)在可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)藥物作用(F＝0.0310，P＝0.969)。(b)在不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，ICI 118，551處理明顯的緩解了認(rèn)知障礙(F＝24.164，P＜0.001)。Betaxolol處理則表現(xiàn)了部分緩解作用，但是效果不顯著(F＝3.698，P＝0.057)。(c)在測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中，ICI 118，551的作用非常顯著(P＝0.005)。Betaxolol處理則無(wú)效果(P＝0.552)。
圖17顯示了受體亞型選擇性拮抗劑在動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Metoprolol為能夠通過(guò)血腦屏障的β1腎上腺素受體選擇性的拮抗劑。(a)在可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)藥物作用(F＝2.017，P＝0.139)。(b)在不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，Butoxamine處理明顯的緩解了認(rèn)知障礙(F＝15.581，P＜0.001)。Metoprolol則無(wú)效果(F＝0.104，P＝0.748)。(c)在測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中，Butoxamine的作用顯著(P＝0.020)。Metoprolol處理則無(wú)效果(P＝0.768)。
圖18顯示了非轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果。β腎上腺素受體的拮抗劑對(duì)非轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)作用，表明轉(zhuǎn)基因是必需的。(a)可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中無(wú)藥物作用(F＝2.327，P＝0.077)。(b)不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中無(wú)藥物作用(F＝0.264，P＝0.851)。(c)測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中無(wú)藥物作用(P＝0.817)。
圖19顯示了δ-阿片受體選擇性的拮抗劑naltrindole的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Naltrindole為能夠通過(guò)血腦屏障的δ-阿片受體選擇性的拮抗劑。(a)在可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)藥物作用(F＝0.754，P＝0.391)。(b)在不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，Naltrindole處理明顯的緩解了認(rèn)知障礙(F＝4.945，P＜0.030)。(c)在測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中，Naltrindole的作用顯著(P＝0.006)。Metoprolol處理則無(wú)效果(P＝0.768)。
圖20顯示了對(duì)照組(control)、clenbuterol處理和ICI 118，551處理的雙轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的逃逸時(shí)間。各組小鼠之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的藥物或轉(zhuǎn)基因作用(F＝2.714，P＝0.052)。
圖21顯示了對(duì)照組(control)、clenbuterol處理和ICI 118，551處理的雙轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTg)在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的逃逸時(shí)間。非轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組小鼠之間存在明顯的轉(zhuǎn)基因作用(F＝7.625，P＝0.010)。ICI 118，551處理組的小鼠比對(duì)照組小鼠表現(xiàn)出了更快的學(xué)習(xí)曲線(xiàn)(F＝16.075，P＜0.001)。然而clenbuterol處理沒(méi)有作用(F＝1.713，P＝0.198)。
圖22顯示了最后一次不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)24小時(shí)后的測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中小鼠在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比。相比之下，非轉(zhuǎn)基因小鼠(P＝0.026)和ICI 118，551(P＝0.041)處理組小鼠在平臺(tái)象限中停留了更長(zhǎng)的時(shí)間。
圖23顯示了細(xì)胞表面DOR和PS1的相互作用。圖23A共轉(zhuǎn)染了供體(donor)GFP-DOR和受體(acceptor)HA-PS1(Cy3熒光素)的HEK293細(xì)胞中，用561nm激光進(jìn)行熒光漂白前(紅線(xiàn))和后(藍(lán)線(xiàn))的混合發(fā)射譜(激發(fā)波長(zhǎng)488nm)。發(fā)射譜顯示的是同一個(gè)細(xì)胞中的經(jīng)過(guò)熒光漂白(左)和沒(méi)有漂白(右)的兩個(gè)區(qū)域。只有在經(jīng)過(guò)熒光漂白的區(qū)域里供體GFP的發(fā)射光才會(huì)增加。圖23BHEK293細(xì)胞中受體熒光漂白前后非混合的GFP-DOR和PS1-Cy3圖像。熒光漂白區(qū)域用白色線(xiàn)框顯示。底部放大的偽彩顯示了細(xì)胞表面在熒光漂白前后GFP發(fā)射光的強(qiáng)度。細(xì)胞表面的供體GFP-DOR發(fā)射光在受體PS1-Cy3熒光漂白后增強(qiáng)。標(biāo)尺為10μm。圖23C顯示了細(xì)胞表面GFP-DOR和PS1-Cy3平均能量轉(zhuǎn)移效率。數(shù)字為實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立試驗(yàn)所得。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及用于篩選預(yù)防或治療阿爾茲海默癥或其他相關(guān)神經(jīng)性病變的藥物的方法。
本發(fā)明還涉及腎上腺素受體或阿片受體的拮抗劑在治療阿爾茲海默癥中的應(yīng)用，特別是β-腎上腺素受體和δ-阿片受體的拮抗劑。具體為，關(guān)于β-腎上腺素受體的拮抗劑在阿爾茲海默癥治療中的新用途，和δ-阿片受體的拮抗劑在阿爾茲海默癥治療中的新用途。本發(fā)明也涉及用于篩選可能被用來(lái)治療阿爾茲海默癥或其他相關(guān)神經(jīng)性病變的試劑的方法。
如前所述，家族型阿爾茲海默癥僅占所有阿爾茲海默癥的10％。所以，遺傳因素以外的因素可能在阿爾茲海默癥的病因中起重要作用。環(huán)境因素，如應(yīng)激，可能通過(guò)激活受體施加作用，包括G蛋白偶聯(lián)受體中的β-腎上腺素受體和δ-阿片受體。中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)幾種G蛋白偶聯(lián)受體，尤其是β2-腎上腺素受體，表達(dá)在海馬和皮層，即阿爾茲海默癥病理發(fā)生過(guò)程中主要涉及的區(qū)域。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，這些受體作用于腎上腺素、多巴胺和阿片肽的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起多種神經(jīng)功能的調(diào)控，如刺激響應(yīng)、學(xué)習(xí)、記憶和痛覺(jué)。
一旦被激活，這些受體偶聯(lián)鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合蛋白(G蛋白)異源三聚體并且通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)第二信使水平(如cAMP)誘導(dǎo)下游信號(hào)。此外，激活的受體也會(huì)發(fā)生clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞，這種內(nèi)吞不僅在受體脫敏中也在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。內(nèi)吞后的G蛋白偶聯(lián)受體通過(guò)早內(nèi)吞小泡、晚內(nèi)吞小泡和溶酶體(LEL)循環(huán)。不同內(nèi)吞小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)受Rab GTPase介導(dǎo)，其本身也可以作為各種小泡的標(biāo)記。
本發(fā)明基于發(fā)明者的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)，即激活β-腎上腺素受體(尤其是β2-腎上腺素受體)或δ-阿片受體導(dǎo)致γ-分泌酶在晚期內(nèi)吞小體和溶酶體中的積累增加。γ-分泌酶作為一種天冬氨酸蛋白酶，酸性pH的反應(yīng)環(huán)境是其最佳條件。因此γ-分泌酶在酸性的晚期內(nèi)吞小體和溶酶體中的積累增加，導(dǎo)致其活性增強(qiáng)，并且使得Aβ的產(chǎn)生也增加。
圖3顯示了從激活β-腎上腺素受體或δ-阿片受體至增加Aβ產(chǎn)生的途徑。如圖3所示，激活β-腎上腺素受體和δ-阿片受體伴隨著clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞，包括形成clathrin包被的凹陷(clathrin-coated pits，CCP)以及CCP的脫離。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶的活性組分，早老蛋白-1(PS1)組成型的結(jié)合這些受體。此內(nèi)吞的結(jié)果為，早老蛋白-1或γ-分泌酶被帶入內(nèi)吞小泡。接著，通過(guò)Rab5和Rab7介導(dǎo)的小泡運(yùn)輸，這些內(nèi)吞小泡被轉(zhuǎn)化為晚內(nèi)吞小體和溶酶體(LEL)，于是γ-分泌酶活性在這里被增強(qiáng)。增強(qiáng)的γ-分泌酶活性之后引起Aβ產(chǎn)生的增加。
這些發(fā)現(xiàn)提示了用拮抗劑抑制β-腎上腺素受體和δ-阿片受體能夠防止γ-分泌酶的活性增加。相應(yīng)的，這些受體的拮抗劑可以用來(lái)降低Aβ產(chǎn)生，因此可以用來(lái)預(yù)防或治療阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變。本發(fā)明中，“拮抗劑”包括防止、降低或抑制受體激活的化合物。這類(lèi)化合物可以和受體激活劑競(jìng)爭(zhēng)相同的受體結(jié)合位點(diǎn)，或結(jié)合受體上的不同位點(diǎn)并降低受體激活劑的作用。
此外，這些發(fā)現(xiàn)提示可以通過(guò)檢測(cè)相關(guān)受體的內(nèi)吞來(lái)篩選潛在的可用于預(yù)防或治療阿爾茲海默癥或相關(guān)的神經(jīng)性病變的拮抗劑。測(cè)定這些受體的內(nèi)吞可以通過(guò)檢測(cè)早老蛋白-1或γ-分泌酶的內(nèi)吞，晚內(nèi)吞小體和溶酶體內(nèi)早老蛋白-1或γ-分泌酶的積累，γ-分泌酶的活性增強(qiáng)，或Aβ產(chǎn)生增加來(lái)實(shí)現(xiàn)。
相應(yīng)的，本發(fā)明具體的涉及關(guān)于篩選治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)的神經(jīng)性病變的試劑的方法。篩選方法可能是基于候選試劑抑制與早老蛋白-1或γ-分泌酶結(jié)合的受體的內(nèi)吞的能力，或者基于其減弱或消除受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶結(jié)合的能力。如圖4所示，本發(fā)明的方法(方法40)包括測(cè)量候選試劑存在或不存在的情況下與早老蛋白-1或γ-分泌酶結(jié)合的受體的內(nèi)吞的程度，或者檢測(cè)受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶結(jié)合的程度(步驟41)。這些受體包括內(nèi)源或載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入的G蛋白偶聯(lián)受體。
然后，確定存在或不存在候選試劑情況下的內(nèi)吞或結(jié)合程度的差異(步驟42)。如上所述，內(nèi)吞程度可以用計(jì)量?jī)?nèi)吞小泡、內(nèi)吞的早老蛋白-1或γ-分泌酶、LEL中早老蛋白-1或γ-分泌酶的增加、LEL中γ-分泌酶活性的增強(qiáng)或Aβ產(chǎn)量的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)。受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶結(jié)合的程度可用任意適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定，例如下面將詳細(xì)描述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)。
如果內(nèi)吞或結(jié)合的差異(經(jīng)步驟42測(cè)定)是顯著的或者超過(guò)了某個(gè)閾值，則候選試劑可能被用來(lái)治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)的神經(jīng)性病變(如步驟43所示)。如果差異不顯著，則可以用另一候選試劑重復(fù)前一步驟(如步驟44所示)。注意圖4所示的方法是順序顯示的，每次試驗(yàn)一個(gè)候選試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)愿意同時(shí)試驗(yàn)多種試劑，例如通過(guò)使用多孔板或其它高通量方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)所熟知的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲得該閾值，即如果細(xì)胞中G蛋白偶聯(lián)受體與早老蛋白1的再次內(nèi)吞程度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于初始內(nèi)吞程度(優(yōu)選顯著低于，比如G蛋白偶聯(lián)受體與早老蛋白1的再次內(nèi)吞程度是初始內(nèi)吞程度的60％或更低)，就表明差異顯著。所述初始內(nèi)吞程度指使用候選試劑前激活受體并確定的內(nèi)吞程度，再次內(nèi)吞程度是指于同一試驗(yàn)體系中使用候選試劑后激活受體并確定的內(nèi)吞程度。
本發(fā)明具體的涉及通過(guò)給人體服用有效量的結(jié)合β-腎上腺素受體(尤其是β2-腎上腺素受體)和/或δ-阿片受體的拮抗劑用以治療或防治阿爾茲海默癥或其他相關(guān)神經(jīng)性病變的方法。有效劑量的拮抗劑足以減少導(dǎo)致γ-分泌酶向晚期內(nèi)吞小體和溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)的受體內(nèi)吞。本發(fā)明還涉及將結(jié)合β-腎上腺素受體(尤其是β2-腎上腺素受體)和δ-阿片受體的拮抗劑應(yīng)用于生產(chǎn)治療或防治阿爾茲海默癥和其他神經(jīng)性病變的藥物。
結(jié)合β-腎上腺素受體和/或δ-阿片受體的拮抗劑的有效劑量將依賴(lài)于向病人輸送藥物的服藥方式，服藥頻率，和藥劑組分，以及病人的體重，性別，年齡和身體狀況。典型的，有效劑量的范圍可以為從每天1μg/Kg體重至10mg/Kg體重。雖然存在個(gè)體差異，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力確定每種成分的最佳有效劑量。向病人給藥可以通過(guò)任何合適的類(lèi)似藥劑的給藥途徑，包括口服，注射，透皮貼劑等。
本發(fā)明涉及的化合物或組分可以用于治療哺乳動(dòng)物(人或其他哺乳動(dòng)物)的阿爾茲海默癥或其他相關(guān)神經(jīng)性病變。這些化合物或組分包括藥劑學(xué)上可以接受的載體和/或賦形劑，例如生理鹽水，緩沖液，葡萄糖，甘油、乙醇，淀粉等。此外，這些化合物或組分可以制備成類(lèi)似藥劑常用的劑量劑型，包括針劑，片劑，膠囊，貼劑等。這些劑量劑型的制備方法為已知技術(shù)。
盡管有不同降低Aβ產(chǎn)生的方法已被報(bào)導(dǎo)，包括調(diào)控APP的產(chǎn)生(如美國(guó)專(zhuān)利6,187,756和6,043,224)和抑制APP的剪切(如美國(guó)專(zhuān)利5,242,932)，但本發(fā)明的內(nèi)容是基于一種不同的機(jī)制，即抑制導(dǎo)致γ-分泌酶向晚期內(nèi)吞小體和溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)的受體內(nèi)吞。以下的實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例清楚地闡述了將β-腎上腺素受體(尤其是β2-腎上腺素受體)和/或δ-阿片受體的拮抗劑或抑制劑用于治療或防治阿爾茲海默癥的基本原理。
實(shí)施例1激活β2-腎上腺素受體增加Aβ產(chǎn)生首先在HEK293細(xì)胞中檢驗(yàn)激活β2-腎上腺素受體對(duì)Aβ產(chǎn)生的作用。HEK293細(xì)胞具有有功能的G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)通路，并且能正常分泌A(yíng)β。本實(shí)驗(yàn)中使用的HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染了β2-腎上腺素受體和APP的突變體(APPswe)。突變體APPswe是家族型阿爾茲海默癥的“Swedish”突變，即在第670和671個(gè)密碼子的突變。如圖5a所示，用激動(dòng)劑isoproterenol(Iso)激活β2-腎上腺素受體，增加了兩種Aβ亞型(Aβ40和Aβ42)的分泌水平。另一方面，加入了β2-腎上腺素受體的拮抗劑propranolo1(Pro)則消除了Iso對(duì)Aβ分泌水平的增加作用，而其本身并無(wú)作用。Aβ產(chǎn)生的增加需要γ-分泌酶，因?yàn)橛忙?分泌酶的特異性抑制劑L685，458預(yù)處理消除了Aβ產(chǎn)生的增加。
將HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了γ-分泌酶的底物(C99)和β2-腎上腺素受體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了γ-分泌酶參與了β2-腎上腺素受體引起的Aβ產(chǎn)生的增加。C99是β-分泌酶介導(dǎo)的APP剪切的產(chǎn)物(見(jiàn)圖1)。C99是γ-分泌酶的直接底物和Aβ的直接前體。圖5b顯示了在共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中用Iso刺激β2-腎上腺素受體導(dǎo)致了Aβ產(chǎn)生的增加，并且和此前描述的共轉(zhuǎn)染了APPswe和β2-腎上腺素受體的細(xì)胞相當(dāng)。同樣的，這個(gè)增加也能被Pro消除，而其本身并無(wú)作用。因此，分泌的Aβ產(chǎn)生增加是由于γ-分泌酶的活性增加導(dǎo)致的。
除了β2-腎上腺素受體，激活δ-阿片受體也能夠?qū)е路置诘腁β水平的增加。如圖5c所示，DADLE(D-Ala2-D-Leu5-enkephalin，δ-阿片受體的激動(dòng)劑)處理轉(zhuǎn)染了C99的HEK293細(xì)胞導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生的增加。使用δ-阿片受體的拮抗劑NALT(naltrindole)則消除了DADLE的作用。盡管以上實(shí)驗(yàn)使用的是經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染受體的細(xì)胞，但在內(nèi)源受體上也得到了同樣的結(jié)果。圖5d顯示了在轉(zhuǎn)染了C99的原代海馬細(xì)胞中，激活內(nèi)源的β-腎上腺素受體或δ-阿片受體同樣引起Aβ的分泌增加。
以上實(shí)驗(yàn)清楚地證明了激活β-腎上腺素受體或δ-阿片受體會(huì)引起Aβ的分泌增加。脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)顯示了分泌的Aβ是由轉(zhuǎn)染的C99剪切產(chǎn)生的。如圖5e所示，C99的代謝速度在DADLE刺激的共轉(zhuǎn)染了δ-阿片受體和C99的HEK293細(xì)胞中比對(duì)照細(xì)胞更快。此結(jié)果提示了受體的激活促進(jìn)了C99的剪切。因此，激活β-腎上腺素受體(尤其是β2-腎上腺素受體)和/或δ-阿片受體加強(qiáng)了Aβ的產(chǎn)生和分泌，是由于γ-分泌酶對(duì)C99(或類(lèi)似底物)的剪切增強(qiáng)導(dǎo)致的。
實(shí)施例2激活β2-腎上腺素受體增加γ-分泌酶的活性以上所述的激活β-腎上腺素受體或δ-阿片受體引起的Aβ的產(chǎn)生增加可能是因γ-分泌酶的表達(dá)水平或活性增加而導(dǎo)致的。為了回答這個(gè)問(wèn)題，發(fā)明人檢驗(yàn)了β2-腎上腺素受體激活對(duì)γ-分泌酶的表達(dá)水平和活性的作用。如圖6a所示，在Iso處理的轉(zhuǎn)染了C99的HEK293細(xì)胞中，C60的產(chǎn)生增加了。C60是C99被γ-分泌酶介導(dǎo)的剪切產(chǎn)生的。但是，相同的處理沒(méi)有對(duì)PS1的表達(dá)水平產(chǎn)生任何改變。PS1是γ-分泌酶的活性位點(diǎn)亞基，以氨基和碳基末段片段的異源二聚體形式存在(即PS1-NTF和PS1-CTF)。此結(jié)果提示了激活β2-腎上腺素受體后，γ-分泌酶的活性增加而γ-分泌酶的表達(dá)沒(méi)有改變。
為直接測(cè)量γ-分泌酶的酶活性，使用了熒光底物。此熒光底物基于連接了熒光報(bào)告分子的γ-分泌酶特異的底物序列。C6膠質(zhì)細(xì)胞瘤的內(nèi)源β-腎上腺素受體被刺激30分鐘后γ-分泌酶的活性增強(qiáng)(圖6b)。此效果在海馬切片中被驗(yàn)證(圖6c)。小鼠胚胎纖維組織母細(xì)胞缺失了presenilin后Iso引起的γ-分泌酶活性增強(qiáng)被消除，驗(yàn)證了此方法對(duì)γ-分泌酶活性的特異性(圖6d)。綜上所述，這些結(jié)果顯示了激活β2-腎上腺素受體刺激了γ-分泌酶活性，導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生增加。
激活受體而增強(qiáng)γ-分泌酶活性并不僅限于β-腎上腺素受體。刺激SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤(圖7a)或培養(yǎng)的原代海馬細(xì)胞(圖7b)的內(nèi)源δ-阿片受體也能夠獲得類(lèi)似結(jié)果。進(jìn)一步，檢測(cè)γ-分泌酶的活性顯示了γ-分泌酶的活性在刺激β2-腎上腺素受體30分鐘左右達(dá)到最大值，約60分鐘時(shí)恢復(fù)到本底水平(圖7c)。
實(shí)施例3增強(qiáng)的γ-分泌酶活性不依賴(lài)于cAMP信號(hào)如上所述，G蛋白偶聯(lián)受體(包括β2-腎上腺素受體)一旦被激活，會(huì)誘導(dǎo)Gs蛋白依賴(lài)的腺苷酸環(huán)化酶的激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。為了描述β2-腎上腺素受體激活導(dǎo)致γ-分泌酶活性增強(qiáng)的分子機(jī)制，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用了一個(gè)無(wú)法激活Gs蛋白的β2-腎上腺素受體的突變體(β2AR T68F，Y132G，Y219A，或β2AR TYY)。這個(gè)突變體無(wú)法消除γ-分泌酶活性的增強(qiáng)(圖8a)。這個(gè)結(jié)果排除了Gs蛋白信號(hào)通路參與β2-腎上腺素受體對(duì)于γ-分泌酶的作用。進(jìn)一步，用諸如霍亂毒素(cholera toxin，CTX)，forskolin，和dybutyl-cAMP等能夠模擬Gs蛋白激活和cAMP水平升高的試劑處理細(xì)胞，無(wú)法導(dǎo)致γ-分泌酶活性的增強(qiáng)(圖8b)。因此，激活β-腎上腺素受體而增強(qiáng)的γ-分泌酶活性并沒(méi)有cAMP信號(hào)通路的參與。
事實(shí)上cAMP信號(hào)通路并沒(méi)有參與增強(qiáng)γ-分泌酶的活性可能對(duì)于δ-阿片受體也成立。已知δ-阿片受體激活百日咳毒素(PTX)敏感的Gi/o蛋白并且通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶降低cAMP水平。用百日咳毒素對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)處理不能改變DADLE刺激引起的γ-分泌酶活性增強(qiáng)(圖9)。此結(jié)果顯示了激活δ-阿片受體引起的γ-分泌酶活性不由cAMP調(diào)控。因此，β2-腎上腺素受體或δ-阿片受體對(duì)γ-分泌酶的調(diào)控不依賴(lài)于G蛋白信號(hào)通路或經(jīng)典的cAMP通路。
實(shí)施例4受體內(nèi)吞與γ-分泌酶的活性增強(qiáng)相關(guān)如果G蛋白信號(hào)通路或cAMP通路不參與增強(qiáng)γ-分泌酶的活性，那么其機(jī)制是什么？如前針對(duì)圖3的討論，GPCR(包括β-腎上腺素受體和阿片受體)激活通常伴隨著受體內(nèi)吞，及其引起特異性的信號(hào)通路。受體內(nèi)吞及其相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是否參與了γ-分泌酶活性的提高可以用不同的內(nèi)吞通路抑制劑來(lái)檢測(cè)。
圖8c顯示了Iso對(duì)γ-分泌酶活性的作用可以被內(nèi)吞抑制劑如刀豆蛋白(Con A)，高滲透壓溶液(Suc)和無(wú)鉀溶液(K+dpl)的預(yù)處理消除。圖8d顯示了Iso引起的γ-分泌酶活性增強(qiáng)可以被dynamin的顯性負(fù)突變體Dyn K44A(能夠抑制clathrin或caveolin介導(dǎo)的內(nèi)吞)消除。因?yàn)棣?-腎上腺素受體主要通過(guò)clathrin介導(dǎo)的機(jī)制內(nèi)吞，所以針對(duì)clathrin重鏈的小干擾RNA(small interfering RNA)可以被用來(lái)去除細(xì)胞內(nèi)的clathrin表達(dá)。圖8e顯示了Iso引起的γ-分泌酶活性增強(qiáng)可以被RNA干擾(RNA interference，RNAi)消除。這些結(jié)果顯示了β2-腎上腺素受體引起的γ-分泌酶活性增強(qiáng)是通過(guò)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用調(diào)控的。
為了進(jìn)一步確證激動(dòng)劑引起的β2-腎上腺素受體內(nèi)吞對(duì)于γ-分泌酶活性增強(qiáng)是必需的，在實(shí)驗(yàn)中使用了另一個(gè)β2-腎上腺素受體的突變體(β2AR L339/340A，β2AR LL)和另一個(gè)內(nèi)在的腎上腺素受體β3-腎上腺素受體，這兩個(gè)受體都不具有激動(dòng)劑引起的內(nèi)吞現(xiàn)象。在HEK293細(xì)胞內(nèi)激活這些受體確實(shí)提高cAMP水平，但是既不能引起受體內(nèi)吞(圖8f)也不能增強(qiáng)γ-分泌酶活性(圖8g)。這些結(jié)果清楚的提示了激動(dòng)劑引起的clathrin介導(dǎo)的β2-腎上腺素受體內(nèi)吞參與了調(diào)控γ-分泌酶活性增強(qiáng)的機(jī)制。
上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞是激活受體而引起的γ-分泌酶活性增強(qiáng)的必要條件。但是，clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞其本身是否足以引起γ-分泌酶活性增強(qiáng)仍不清楚。為了回答這個(gè)問(wèn)題，用transferrin處理HEK293細(xì)胞，導(dǎo)致transferrin受體的clathrin介導(dǎo)的持續(xù)內(nèi)吞。如圖10所示，transferrin處理雖然能引起持續(xù)內(nèi)吞，但不能增強(qiáng)γ-分泌酶的活性。這些結(jié)果提示了clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞對(duì)于β2-腎上腺素受體引起的γ-分泌酶的活性增強(qiáng)是必需的但不是充分的。
實(shí)施例5γ-分泌酶的活性和Aβ產(chǎn)生增強(qiáng)和內(nèi)吞途徑聯(lián)系如圖3所示，一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)吞小泡就被通過(guò)各種特異性的內(nèi)吞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至其目的地。這些內(nèi)吞途徑涉及Rab鳥(niǎo)苷三磷酸酶(Rab GTPase)調(diào)控的胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)?，F(xiàn)已知從細(xì)胞膜向早內(nèi)吞小體和繼續(xù)向晚內(nèi)吞小體和溶酶體的內(nèi)吞運(yùn)輸能夠分別被早內(nèi)吞小體標(biāo)記Rab5和溶酶體標(biāo)記Rab7的顯性負(fù)突變體Rab5 S34N和Rab7 T22N抑制。如圖11a和b所示，在HEK293細(xì)胞中表達(dá)Rab5 S34N或Rab7 T22N能夠消除激活β2-腎上腺素受體引起的γ-分泌酶的活性(圖11a)和Aβ產(chǎn)生(圖11b)的增強(qiáng)。這些結(jié)果說(shuō)明γ-分泌酶的活性和Aβ產(chǎn)生的增強(qiáng)必需有內(nèi)吞小泡向晚內(nèi)吞小體和溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此晚內(nèi)吞小體和溶酶體的參與對(duì)β2-腎上腺素受體引起的γ-分泌酶活性和Aβ產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用中。
為了進(jìn)一步顯示晚內(nèi)吞小體和溶酶體的作用，利用Flag抗體從轉(zhuǎn)染了Flag-Rab7的細(xì)胞中免疫分離晚內(nèi)吞小體和溶酶體的小泡，隨后用早內(nèi)吞小體的標(biāo)記EEA1(earlyendosome antigen 1)和晚內(nèi)吞小體和溶酶體的標(biāo)記LAMP-1(lysosome-associated membraneprotein-1)確證了組分。如圖11c所示，在β2-腎上腺素受體經(jīng)1小時(shí)刺激后發(fā)現(xiàn)晚內(nèi)吞小體和溶酶體中的Aβ含量明顯增加，而Flag-Rab7或LAMP-1無(wú)顯著變化，顯示了晚內(nèi)吞小體和溶酶體中的Aβ產(chǎn)生因β2-腎上腺素受體激活而增加，且無(wú)需增加晚內(nèi)吞小體和溶酶體的數(shù)量。
同樣，晚內(nèi)吞小體和溶酶體參與增強(qiáng)γ-分泌酶活性也不僅限于β-腎上腺素受體。圖12顯示了晚內(nèi)吞小體和溶酶體中的γ-分泌酶活性也在δ-阿片受體激活后增強(qiáng)了。圖12的實(shí)驗(yàn)是用1μM DADLE對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤刺激30分鐘后進(jìn)行亞細(xì)胞組分分離，再將各組分用于堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)和熒光底物分析。結(jié)果顯示DADLE處理只增強(qiáng)了含有堿性磷酸酶細(xì)胞組分的γ-分泌酶活性(*P＜0.01)。
綜上所述，以上圖11和圖12所示結(jié)果提示了晚內(nèi)吞小體和溶酶體在β2-腎上腺素受體或δ-阿片受體激活對(duì)Aβ產(chǎn)生的作用中起非常重要的角色。這個(gè)發(fā)現(xiàn)和以前的關(guān)于內(nèi)吞囊泡為γ-分泌酶活性提供適宜環(huán)境的報(bào)導(dǎo)相一致。
為了進(jìn)一步確證晚內(nèi)吞小體和溶酶體中的γ-分泌酶和Aβ產(chǎn)生增加相關(guān)，應(yīng)用免疫熒光顯微術(shù)檢測(cè)刺激β2-腎上腺素受體是否增加了γ-分泌酶在晚內(nèi)吞小體和溶酶體中的定位。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，晚內(nèi)吞小體和溶酶體用表達(dá)的GFP-Rab7標(biāo)記。圖11d展示在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，激活β2-腎上腺素受體30分鐘后，發(fā)生了PS1(γ-分泌酶活性位點(diǎn)亞基)和GFP-Rab7的共定位。在海馬切片的實(shí)驗(yàn)中，晚內(nèi)吞小體和溶酶體用LAMP-1的抗體標(biāo)記。圖11e展示了Iso處理后PS1或nicatrin(另一γ-分泌酶組分)和LAMP-1的共定位增強(qiáng)。綜上所述，以上結(jié)果提示了刺激β2-腎上腺素受體增強(qiáng)了γ-分泌酶在晚內(nèi)吞小體和溶酶體中定位，此作用導(dǎo)致了γ-分泌酶活性和Aβ產(chǎn)生的增加。
實(shí)施例6組成型PS1/γ-分泌酶和β2-腎上腺素受體的相互作用
Dyn K44A和Rab5 S34N有效的防止了β2-腎上腺素受體刺激后PS1在晚內(nèi)吞小體和溶酶體中定位增強(qiáng)(圖13a)，此結(jié)果提示PS1可能是被從細(xì)胞膜向晚內(nèi)吞小體和溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)。利用β-adaptin(其能夠標(biāo)記clathrin包被的凹陷和小泡)發(fā)現(xiàn)刺激HEK293細(xì)胞中的δ-阿片受體3分鐘后PS1和β-adaptin以及內(nèi)吞的受體形成共定位(圖13b)。這些發(fā)現(xiàn)提示了PS1和激活的β2-腎上腺素受體或δ-阿片受體在激動(dòng)劑刺激后形成共內(nèi)吞。而此結(jié)果并不意外，因?yàn)镻S1能夠組成型的結(jié)合膜蛋白，例如APP和Notch，而且β2-腎上腺素受體能夠通過(guò)形成異源二聚體介導(dǎo)其他跨膜蛋白的內(nèi)吞。為了證明確實(shí)如此，應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測(cè)了PS1和β2-腎上腺素受體或δ-阿片受體的結(jié)合。
如圖13c所示，四個(gè)γ-分泌酶的必須組分PS1，nicastrin，APH-1a(anterior pharynxdefective-1a)和PEN-2(presenilin enhancer-2)在含有CHAPSO的緩沖液中被β2-腎上腺素受體或δ-阿片受體共沉淀(圖13c)，在此緩沖液中γ-分泌酶保持為蛋白復(fù)合物。用TrintonX-100替換CHAPSO能夠解聚γ-分泌酶蛋白復(fù)合物，并且破壞了受體與nicastrin，APH-1a和PEN-2的共沉淀，而不影響經(jīng)PS1-NTF或PS1-CTF抗體檢測(cè)到的受體與PS1的共沉淀(圖13c)。這些結(jié)果提示了β2-腎上腺素受體或δ-阿片受體通過(guò)直接結(jié)合PS1與γ-分泌酶相互作用。但是，并非所有G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)都有這種結(jié)合，因?yàn)榱硪籊PCR成員，B2 bradykinin受體(B2R)，無(wú)法結(jié)合PS1/γ-分泌酶(圖13c)或引起γ-分泌酶的活性增強(qiáng)(圖13d)。綜上所述，這些結(jié)果提示β2-腎上腺素受體或δ-阿片受體與PS1的相互作用是特異性的，并且提供了它們調(diào)控受體激活引起的γ-分泌酶活性增強(qiáng)的機(jī)制基礎(chǔ)。此外，這些結(jié)果也提示能夠減弱或消除受體與早老蛋白1結(jié)合的試劑是潛在的治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或其他相關(guān)的神經(jīng)性病變的藥物。
實(shí)施例7篩選能夠減弱或消除受體與早老蛋白1結(jié)合的試劑通過(guò)任何合適的方法，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，可以篩選能夠消除或減弱早老蛋白1與受體結(jié)合的試劑。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是能量從近距離結(jié)合(≤10nm)的供體熒光素向受體熒光素轉(zhuǎn)移的過(guò)程。因此，這項(xiàng)技術(shù)可被用來(lái)檢測(cè)物理上結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)。在能量轉(zhuǎn)移中，非放射性的能量轉(zhuǎn)移減弱了供體的熒光發(fā)射。因此通過(guò)比較供體在同一樣品被破壞受體熒光素(如熒光漂白的方法)前后的熒光發(fā)射的強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)能量轉(zhuǎn)移。如果發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，則供體的熒光發(fā)射在熒光漂白受體后增強(qiáng)。
例如在共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中檢測(cè)有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的δ-阿片受體(GFP-DOR)和早老蛋白1-Cy3之間的能量轉(zhuǎn)移效率在熒光漂白前后的變化。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了GFP標(biāo)記的δ-阿片受體(GFP-DOR)和有HA標(biāo)記的早老蛋白1(HA-PS1)。HA-PS1的表達(dá)可以通過(guò)HA的第一抗體和連接Cy3熒光素的第二抗體(Jackson ImmunoResearch公司)檢測(cè)，GFP-DOR的表達(dá)通過(guò)GFP熒光素檢測(cè)。
圖23A-23C顯示了此類(lèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果之一。用Leica共聚焦顯微鏡獲取圖像，包括供體GFP-DOR和受體PS1-Cy3熒光素的混合發(fā)射譜(488nm激光激發(fā))。首先檢測(cè)在共表達(dá)兩個(gè)蛋白質(zhì)的HEK293細(xì)胞中供體(GFP-DOR)發(fā)射光的強(qiáng)度在受體(PS1-Cy3)熒光漂白后是否增強(qiáng)。圖23A顯示了細(xì)胞在熒光漂白前后的熒光漂白和非熒光漂白區(qū)域的圖像。選定的區(qū)域用Cy3吸收譜內(nèi)的561nm激光漂白。GFP-DOR發(fā)射光相應(yīng)的強(qiáng)度在熒光漂白的區(qū)域與相同細(xì)胞的非漂白區(qū)域相比有較大增強(qiáng)。此結(jié)果顯示了GFP和Cy3之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，且此能量轉(zhuǎn)移能夠通過(guò)熒光漂白Cy3被消除或降低。
圖23B顯示了轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中GFP-DOR和PS1-Cy3在受體經(jīng)561nm激光熒光漂白前后代表性的圖像。GFP-DOR的圖像顯示了受體的熒光發(fā)射(偽彩強(qiáng)度圖像)在熒光漂白后增強(qiáng)，且此增強(qiáng)只在細(xì)胞內(nèi)熒光漂白的區(qū)域發(fā)生。
如圖23C所示，細(xì)胞表面附近的GFP-DOR和PS1-Cy3的平均相對(duì)能量轉(zhuǎn)移效率大約為22.8±3.9％，顯示了兩者的相互作用。在陽(yáng)性對(duì)照中，表達(dá)了GFP-DOR的細(xì)胞用GFP第一抗體以及連接了Cy3的第二抗體孵育。此陽(yáng)性對(duì)照的能量轉(zhuǎn)移效率為27.9±5.3％。將表達(dá)了GFP-DOR的細(xì)胞用針對(duì)非特異性蛋白actin的第一抗體以及連接了Cy3的第二抗體孵育作為陰性對(duì)照。此陰性對(duì)照的能量轉(zhuǎn)移效率為7.8±4.7％。這些結(jié)果都顯示了δ-阿片受體和早老蛋白1之間的相互作用。
實(shí)施例8動(dòng)物體內(nèi)γ-分泌酶活性的增強(qiáng)，Aβ產(chǎn)生和淀粉樣蛋白斑的形成進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)β2-腎上腺素受體與這些阿爾茲海默癥相關(guān)分子的作用進(jìn)行研究。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示急性注射了腎上腺素受體內(nèi)源配體去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)或β2-腎上腺素受體選擇性的激動(dòng)劑clenbutera1(Cle)后，大鼠海馬的γ-分泌酶活性(圖14a)和Aβ水平(圖14b)都顯著升高了。基于這些結(jié)果，可以預(yù)料對(duì)動(dòng)物模型長(zhǎng)期給予這些受體激動(dòng)劑處理可能加劇阿爾茲海默癥的病理變化。在阿爾茲海默癥的小鼠模型(APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠)中的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。這種小鼠在給予Iso或Cle慢性處理30天后顯示出了增多的大腦淀粉樣蛋白斑(圖14c-14e)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)說(shuō)明激活β2-腎上腺素受體能夠增進(jìn)γ-分泌酶活性，Aβ產(chǎn)生和淀粉樣蛋白斑形成。所以，這些受體的拮抗劑應(yīng)可以被用來(lái)降低Aβ產(chǎn)生或淀粉樣蛋白斑形成。圖14f和14g中的結(jié)果驗(yàn)證了這一點(diǎn)，因?yàn)棣?-腎上腺素受體特異性的拮抗劑ICI 118，551顯著的降低了淀粉樣蛋白斑的數(shù)量。
實(shí)施例9動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為了衡量β-腎上腺素受體的拮抗劑的體內(nèi)有效性，對(duì)阿爾茲海默癥的轉(zhuǎn)基因模型小鼠(APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠)給予了這些化合物。在大約6個(gè)月齡時(shí)，這種小鼠已產(chǎn)生進(jìn)行性的空間記憶缺陷，并且伴隨著大腦內(nèi)Aβ水平升高和淀粉樣蛋白斑增多。
在以下實(shí)驗(yàn)中，APPswe/PS1ΔE9小鼠和非轉(zhuǎn)基因(NTg)的同窩小鼠被按照性別和年齡匹配的方式分組。實(shí)驗(yàn)化合物通過(guò)口服給藥，從4個(gè)月的年齡開(kāi)始并持續(xù)1個(gè)或2個(gè)月。利用Morris水迷宮的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各種化合物對(duì)APPswe/PS1ΔE9小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠的作用。
Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)由神經(jīng)科學(xué)家Richard G.Morris于1984研制，現(xiàn)今為常用的研究海馬在空間記憶形成中作用的方法。實(shí)驗(yàn)中的迷宮為一注入了24-25℃水的圓形水池(直徑1.2米)，并加入奶粉使水不透明。水池周?chē)胖霉潭ǖ目臻g指示，包括印有醒目圖案的簾布和置有明顯物體的架子。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠被小心的面對(duì)池壁至于水中。小鼠首先接受一定數(shù)量的可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練(即連續(xù)兩天，每天八次)，學(xué)習(xí)游至一有桿標(biāo)記的升高的圓形平臺(tái)(直徑10厘米)上?？梢?jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練被分為每天兩組(即每組四次訓(xùn)練)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析?？梢?jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練期間，每次訓(xùn)練的平臺(tái)位置(東北，東南，西南或西北)和起始位置(東、南、西或北)為偽隨機(jī)決定。
不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練也進(jìn)行一定天數(shù)(即連續(xù)6天，每天四次)，其間小鼠被允許尋找置于水面以下1.5厘米處的平臺(tái)。小鼠如無(wú)法在60秒內(nèi)找到平臺(tái)則被指引到平臺(tái)。不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)期間，平臺(tái)的位置保持不變，小鼠則按照從四個(gè)方向(東、南、西或北)中偽隨機(jī)選擇的一個(gè)方向進(jìn)入水池。每一次訓(xùn)練結(jié)束后，小鼠在平臺(tái)上停留30秒后再被從平臺(tái)上轉(zhuǎn)移到籠內(nèi)。
最后一次不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練的二十四小時(shí)后，進(jìn)行一次測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。這時(shí)平臺(tái)被移走，小鼠則允許游泳60秒鐘試圖尋找平臺(tái)。所有實(shí)驗(yàn)被固定于水池正上方的的攝像機(jī)檢測(cè)并記錄，記錄用計(jì)算機(jī)跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行分析。
動(dòng)物模型試驗(yàn)1在這一組實(shí)驗(yàn)中，APPswe/PS1ΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠被給予propranolol和nadolol以評(píng)價(jià)β-腎上腺素受體的拮抗劑對(duì)淀粉樣蛋白斑形成的作用。APPswe/PS1ΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠被按照性別和年齡匹配的方式分組?；衔锿ㄟ^(guò)口服給藥，從4個(gè)月年齡開(kāi)始持續(xù)直至6個(gè)月。Propranolol能夠容易的通過(guò)血腦屏障，因此，它能夠拮抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)的β-腎上腺素受體。另一方面，nadolol也是一種β-腎上腺素受體的拮抗劑，但是不能通過(guò)血腦屏障。小鼠然后用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行空間學(xué)習(xí)和記憶檢測(cè)。
在Morris水迷宮任務(wù)中，小鼠首先進(jìn)行兩天的可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練，每天進(jìn)行兩組訓(xùn)練。在每組訓(xùn)練中，記錄小鼠找到并且爬上平臺(tái)所耗費(fèi)的時(shí)間(逃逸時(shí)間)。此訓(xùn)練中沒(méi)有顯示基因型或藥物作用(F＝2.145，P＝0.096，圖15a)。
接著，小鼠進(jìn)行了六天不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練，每天進(jìn)行一組訓(xùn)練。對(duì)照組小鼠相比非轉(zhuǎn)基因組小鼠表現(xiàn)出明顯的障礙(F＝28.754，P＜0.001，圖15b)。propanolol處理與對(duì)照組相比能夠部分緩解小鼠的障礙(F＝4.571，P＝0.034)，但是nadolol處理則表現(xiàn)為無(wú)效(F＝1.192，P＝0.277)。
最后，小鼠在最后一次不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練后24小時(shí)進(jìn)行一次測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。在此實(shí)驗(yàn)中，小鼠被允許自由游泳1分鐘以尋找平臺(tái)。對(duì)小鼠耗費(fèi)在平臺(tái)象限的時(shí)間比例進(jìn)行分析(圖15c)。同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出顯著的基因型作用(P＝0.002)。Propranolol處理部分地緩解了轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶障礙(P＝0.048)，而nadolol則表現(xiàn)為無(wú)效(P＝0.969)。Propranolol在平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中顯示的效果并非是由游泳速度差異造成的(圖15d)。
以上研究清楚地顯示了propranolol能夠拮抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)的β-腎上腺素受體。因?yàn)閜ropranolol是一種非選擇性的β-腎上腺素受體拮抗劑，所以進(jìn)一步利用亞型選擇性的β-腎上腺素受體拮抗劑研究體內(nèi)哪一種亞型能夠引起上述效果。使用的亞型選擇性的β-腎上腺素受體拮抗劑包括Betaxolol(倍他洛爾)和ICI 118，511。Betaxolol是一種能夠通過(guò)血腦屏障的β1-腎上腺素受體。ICI 118，511是一種能夠通過(guò)血腦屏障的β2-腎上腺素受體。
在可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中，沒(méi)有顯示出藥物作用(圖16a，F(xiàn)＝0.0310，P＝0.969)。然而，在不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中(圖16b)，ICI 118，551處理顯著的緩解了認(rèn)知障礙(F＝24.164，P＜0.001)。Betaxolol表現(xiàn)出一定效果。但是，這個(gè)效果(F＝3.698，P＝0.057)和ICI 118，551相比不顯著。在測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中(圖16c)，ICI 118，551的作用很顯著(P＝0.005)。同樣，Betaxolol的效果(P＝0.552)和ICI 118，551相比則表現(xiàn)不顯著。Propranolol在實(shí)驗(yàn)中顯示的效果并非是由游泳速度差異造成的(圖16d)。
另一比較亞型選擇性的β-腎上腺素受體拮抗劑的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了β2-腎上腺素受體拮抗劑的效果更強(qiáng)。圖17a-17d顯示了與圖16相似的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Metoprolol(美托洛爾)是一種能夠通過(guò)血腦屏障的β1-腎上腺素受體拮抗劑。Butoxamine是一種能夠通過(guò)血腦屏障的β2-腎上腺素受體拮抗劑。如圖17a所示，在可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中，沒(méi)有顯示出藥物作用(F＝2.017，P＝0.139)。但是，在圖17b顯示的不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中，Butoxamine處理顯著的緩解了認(rèn)知障礙(F＝15.581，P＜0.001)。相反，Metoprolol處理則表現(xiàn)為無(wú)效(F＝0.104，P＝0.748)。圖17c顯示了在測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中butoxamine的作用很顯著(P＝0.020)，而metoprolol則無(wú)效(P＝0.768)。同樣，實(shí)驗(yàn)中顯示的效果并非是由游泳速度差異造成的(圖17d)。
綜上所述，以上結(jié)果提示β-腎上腺素受體拮抗劑主要靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的β-腎上腺素受體以實(shí)現(xiàn)降低γ-分泌酶活性和Aβ產(chǎn)生。進(jìn)一步，大部分所需要的緩解空間記憶缺陷的作用可以通過(guò)抑制β2-腎上腺素受體實(shí)現(xiàn)，而抑制β1-腎上腺素受體沒(méi)有作用。因此，根據(jù)本發(fā)明的目的，用來(lái)防治或治療阿爾茲海默癥的β-腎上腺素受體拮抗劑應(yīng)更傾向于作用于β2-腎上腺素受體。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，這些β-腎上腺素受體拮抗劑對(duì)非轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為無(wú)效。如圖18所示，可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練(圖18a，F(xiàn)＝2.327，P＝0.077)，不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練(圖18b，F(xiàn)＝0.264，P＝0.851)以及測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(圖18c，P＝0.817)都沒(méi)有表現(xiàn)出藥物作用。這些結(jié)果提示了盡管這些β-腎上腺素受體拮抗劑在緩解記憶缺陷中有效，但是對(duì)于沒(méi)有記憶缺陷的正常個(gè)體則沒(méi)有明顯效果。
圖19a-19c顯示了與圖15相似的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但這里使用的是δ-阿片受體拮抗劑Naltrindole。Naltrindole是一種能夠通過(guò)血腦屏障的δ-阿片受體拮抗劑。如圖19a所示，在可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中，沒(méi)有顯示出藥物作用(F＝0.754，P＝0.391)。在圖19b顯示的不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中，Naltrindole處理顯著的緩解了認(rèn)知障礙(F＝4.945，P＜0.030)。圖19c顯示了Naltrindole在測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中的顯著作用(P＝0.006)。
動(dòng)物模型試驗(yàn)2在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，4月齡的APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠口服生理鹽水(Sal)，2mg/kg clenbuterol(β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑)或1mg/kg ICI 118，551(β2-腎上腺素受體拮抗劑)30天后用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(如上所述)檢測(cè)空間學(xué)習(xí)和記憶。
實(shí)驗(yàn)中的迷宮為一注入了24-25℃水的圓形水池(直徑1.2米)，并加入奶粉使水不透明。水池周?chē)胖霉潭ǖ目臻g指示，包括印有醒目圖案的簾布和置有明顯物體的架子。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠被小心的面對(duì)池壁至于水中。小鼠首先接受一定數(shù)量的可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練(即連續(xù)兩天，每天八次)，學(xué)習(xí)游至一有桿標(biāo)記的升高的圓形平臺(tái)(直徑10厘米)上?？梢?jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練被分為每天兩組(即每組四次訓(xùn)練)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練期間，每次訓(xùn)練的平臺(tái)位置(東北，東南，西南或西北)和起始位置(東、南、西或北)為偽隨機(jī)決定。
圖20顯示了對(duì)照組、clenbuterol(克倫特羅)處理和ICI 118，551處理的雙轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的逃逸時(shí)間。各組小鼠之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的藥物或轉(zhuǎn)基因作用(F＝2.714，P＝0.052)。
不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練連續(xù)進(jìn)行6天(每天4次訓(xùn)練)，小鼠尋找水面以下1.5cm處的一平臺(tái)。如果在60秒內(nèi)無(wú)法找到平臺(tái)，小鼠則被引領(lǐng)到平臺(tái)處。在不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中，平臺(tái)的位置保持不變，小鼠則從四個(gè)方向(東、南、西或北)中偽隨機(jī)選擇的一個(gè)方向進(jìn)入水池。在每次不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練后，小鼠在平臺(tái)上停留30秒后再被從平臺(tái)上轉(zhuǎn)移到籠內(nèi)。
圖21顯示了對(duì)照組、clenbuterol處理和ICI 118，551處理的雙轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的逃逸時(shí)間。非轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組小鼠之間存在明顯的轉(zhuǎn)基因作用(F＝7.625，P＝0.010)。ICI 118，551處理組的小鼠比對(duì)照組小鼠表現(xiàn)出了更快的學(xué)習(xí)曲線(xiàn)(F＝16.075，P＜0.001)。然而clenbuterol處理沒(méi)有作用(F＝1.713，P＝0.198)。這些結(jié)果提示ICI 118，551可以有效的緩解轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶障礙。
最后一次不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練的二十四小時(shí)后，進(jìn)行一次測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。這時(shí)平臺(tái)被移走，小鼠則允許游泳60秒鐘試圖尋找平臺(tái)。所有實(shí)驗(yàn)被固定于水池正上方的的攝像機(jī)檢測(cè)并記錄，記錄用計(jì)算機(jī)跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行分析。
圖22顯示了最后一次不可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)24小時(shí)后的測(cè)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中小鼠在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比。相比之下，非轉(zhuǎn)基因小鼠(P＝0.026)和ICI 118，551(P＝0.041)處理組小鼠在平臺(tái)象限中停留了更長(zhǎng)的時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)方法和試劑下面對(duì)上述的實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例中一些特殊的步驟進(jìn)行描述。對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來(lái)說(shuō)熟知的一般性生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，在此不再贅述。
質(zhì)粒和試劑所有試劑除非特別標(biāo)明都是購(gòu)自于Sigma。人全長(zhǎng)APP克隆入pcDNA3載體，通過(guò)PCR突變?yōu)锳PPswe。帶有APP信號(hào)肽的C99克隆入pcDNA3載體。DNA序列的準(zhǔn)確性通過(guò)測(cè)序確定。人clathrin重鏈的RNAi質(zhì)粒按以下序列設(shè)計(jì)5’-GCTGGGAAAACTCTTCAGATT-3’。對(duì)照(NS)RNAi質(zhì)粒為5’-GGCCGCAAAGACCTTGTCCTTA-3’。
動(dòng)物和藥物處理所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都嚴(yán)格遵照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理與使用的規(guī)定。急性處理實(shí)驗(yàn)中，Sprague-Dawly(SD)大鼠(購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)被側(cè)腦室注射2微克去甲腎上腺素。坐標(biāo)為前-后(anterior-posterior)， 左-右(left-right)， 背-腹(dorsal-ventral)， 大鼠腹腔急性注射0.5mg/kg clenbuterol。30天慢性處理實(shí)驗(yàn)中，5個(gè)月齡的APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠(購(gòu)自The Jackson Laboratory)安裝插管(前-后，～0.9mm；左-右，～1.5mm；背-腹，～3.8mm)后每天注射生理鹽水(n＝4，2個(gè)雌性和2個(gè)雄性)或3nM Iso(n＝6，4個(gè)雌性和2個(gè)雄性)。APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠每天給予口服生理鹽水(n＝6，3個(gè)雌性和3個(gè)雄性)，2mg/kg clenbuterol(n＝7，4個(gè)雌性和3個(gè)雄性)，和1mg/kg ICI 118，551(n＝6，3個(gè)雌性和3個(gè)雄性)。
免疫組織化學(xué)和計(jì)數(shù)淀粉樣蛋白斑小鼠麻醉后通過(guò)心臟生理鹽水灌流。分離大腦，半腦用4％多聚甲醛在4℃固定5小時(shí)。半腦冠狀切片成10微米。切片經(jīng)Aβ抗體6E10孵育，再用TRITC連接的二抗孵育。切片然后用激光共聚焦顯微鏡(Leica公司TCS SP2)觀(guān)察。淀粉樣蛋白斑的面積用Image-Pro Plus 5.1軟件(Media Cybernetic公司)統(tǒng)計(jì)。
海馬培養(yǎng)和急性切片制備原代海馬培養(yǎng)從新生SD大鼠制備，用Amaxa Nucleofector系統(tǒng)電轉(zhuǎn)，培養(yǎng)于B27/neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen公司)兩周后用于激動(dòng)劑處理實(shí)驗(yàn)。急性海馬切片用8周齡的SD大鼠制備。
酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)淀粉樣蛋白β細(xì)胞用Iso或DADLE處理1小時(shí)后繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)基用于酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Biosource公司)檢測(cè)Aβ40和Aβ42。大鼠海馬勻漿后于100,000×g離心1小時(shí)。上清用于酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Wako公司)檢測(cè)Aβ40和Aβ42。
免疫沉淀
HEK293細(xì)胞或大鼠海馬切片于RIPA緩沖液中裂解。Flag標(biāo)記的受體和內(nèi)源δ-阿片受體用Flag抗體連接的瓊脂糖珠或δ-阿片受體抗體(Santa Cruz生物技術(shù)公司)免疫沉淀。免疫沉淀復(fù)合物用SDS-PAGE分離后用免疫印記法檢測(cè)。
表達(dá)底物方法實(shí)驗(yàn)步驟如Journal of Biological Chemistry 276，481-7(2001)所述。HEK293細(xì)胞裂解后，分成含總蛋白50微克蛋白的等份于13,000×g離心15分鐘。細(xì)胞膜組分重懸后于50微升含有蛋白酶抑制劑1，10-菲咯啉(phenanthroline)，抑肽酶(aprotinin)和亮肽素(leupeptin)的反應(yīng)緩沖液中與37℃孵育反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完成后以免疫印記法檢測(cè)膜組分中產(chǎn)生的C60。
熒光底物方法實(shí)驗(yàn)方法如Journal of Biological Chemistry 278，24277-84(2003)所述。細(xì)胞或海馬組織裂解或勻漿。含有50微克蛋白的等份于13,000×g離心15分鐘。細(xì)胞膜組分重懸后于50微升含有12微摩爾熒光底物(Calbiochem公司)的反應(yīng)緩沖液中37℃孵育反應(yīng)2小時(shí)。之后，用分光光度計(jì)測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)為355nm和發(fā)射波長(zhǎng)為440nm的熒光強(qiáng)度。
脈沖跟蹤實(shí)驗(yàn)共轉(zhuǎn)染了HA-C99和DOR的HEK293細(xì)胞用不含有甲硫氨酸和血清的培養(yǎng)基(Invitrogen公司)饑餓2小時(shí)后，用500μCi[35S]甲硫氨酸(GE Healthcare公司)在有或無(wú)DADLE刺激的情況下脈沖標(biāo)記1小時(shí)。隨后細(xì)胞在含有過(guò)量甲硫氨酸的培養(yǎng)基中跟蹤3小時(shí)。細(xì)胞裂解液中的C99用HA抗體免疫沉淀，再用放射自顯影分析。
免疫分離晚內(nèi)吞小體和溶酶體本實(shí)驗(yàn)方法依照J(rèn)ournal of Biological Chemistry 278，11386-92(2003)所述小泡分離方法改進(jìn)。共轉(zhuǎn)染了β2AR，C99和Flag-Rab7的HEK293細(xì)胞勻漿后于500×g離心10分鐘。獲得的上清與M2抗體連接的瓊脂糖珠于4℃孵育8小時(shí)。分離的晚內(nèi)吞小體和溶酶體用LAMP-1和EEA1抗體(BD Biosciences公司)以western blot方法檢測(cè)。
免疫熒光顯微鏡術(shù)轉(zhuǎn)染了HA標(biāo)記的受體和/或GFP-Rab7或GFP-Rab7 T22N的HEK293細(xì)胞中，首先用HA抗體孵育30分鐘，然后用激動(dòng)劑處理并固定。轉(zhuǎn)染了Flag-Rab7和HA-Dyn K44A或GFP-Rab5 S34N的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用激動(dòng)劑處理并固定。急性海馬切片實(shí)驗(yàn)中，切片首先用Iso或DADLE處理然后固定并切片。后續(xù)染色用第一抗體(包括PS1-NTF，F(xiàn)lag，LAMP-1或β-adaptin抗體或FITC連接的HA抗體)和第二抗體(Cy3連接的抗兔和FITC連接的抗鼠抗體，均購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司)。用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCSSP2)獲取圖像。早老蛋白-1N端(PS1-NTF)抗體購(gòu)自Calbiochem公司。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)測(cè)量受體與早老蛋白1之間的相互作用用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的圖像由Leica TCS SP2共聚焦顯微鏡獲取并用相應(yīng)軟件分析。HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了GFP-DOR和HA-PS1。HA-PS1表達(dá)用HA的第一抗體和連接了Cy3熒光素的第二抗體檢測(cè)，GFP-DOR表達(dá)用GFP熒光檢測(cè)。細(xì)胞的GFP-DOR或PS1-Cy3的熒光譜用488nm激光在λ模式獲取。為了測(cè)量能量轉(zhuǎn)移效率，用Leica軟件實(shí)現(xiàn)受體熒光漂白。選定的細(xì)胞表面區(qū)域用561nm激光熒光漂白Cy3熒光素。共轉(zhuǎn)染了GFP-PS1和HA-PS1的HEK293細(xì)胞中Cy3信號(hào)在熒光漂白后平均下降84±5.3％(n＝50)。能量轉(zhuǎn)移表示為GFP-DOR(供體)信號(hào)在PS1-Cy3(受體)熒光漂白后的增加。相對(duì)能量效率按計(jì)算為(1-[Cy3 I漂白前/Cy3 I漂白后])×100％。細(xì)胞表面沒(méi)有熒光漂白的區(qū)域進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移分析以作為對(duì)照。
數(shù)據(jù)分析細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用t-test比較平均值。小鼠數(shù)據(jù)用方差分析和t-test分析顯著性差異。
以上結(jié)合有限數(shù)量的具體實(shí)施例闡述了本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種篩選治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變的試劑的方法，其特征在于包括以下步驟(a)激活受體并確定其初始內(nèi)吞程度，所述受體為與早老蛋白-1結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體；(b)在一種候選試劑存在下，如(a)所述激活受體，再次確定受體的內(nèi)吞程度；(c)確定(a)和(b)中的內(nèi)吞程度的差異；(d)如果差異小于閾值則重復(fù)步驟(a)至(c)，或如果差異大于閾值，則確認(rèn)所述候選試劑為治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變的試劑。
2.一種篩選治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變的試劑的方法，其特征在于包括以下步驟(a)測(cè)量受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶的初始結(jié)合程度，所述受體為與早老蛋白-1結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體；(b)在一種候選試劑存在下，如(a)所述再次測(cè)量受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶的結(jié)合程度；(c)確定(a)和(b)中的結(jié)合程度的差異；(d)如果差異小于一定閾值則重復(fù)步驟(a)至(c)，或如果差異大于閾值，則確認(rèn)所述候選試劑為治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變的試劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述受體中至少一種選自β腎上腺素受體和δ-阿片受體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述β腎上腺素受體為β2腎上腺素受體。
5.如權(quán)利要求1至4所述的任一種的方法，其特征在于，所述受體被表達(dá)于已經(jīng)轉(zhuǎn)染了編碼此受體基因的細(xì)胞上。
6.如權(quán)利要求1、3、4或5所述的任一種的方法，其特征在于通過(guò)檢測(cè)內(nèi)吞小泡的數(shù)量、內(nèi)吞小泡中的早老蛋白-1、晚內(nèi)吞小泡和溶酶體中γ-分泌酶的活性或淀粉樣蛋白β的形成而確定所述的初始內(nèi)吞程度和再次內(nèi)吞程度。
7.如權(quán)利要求2至5所述的任一種的方法，其特征在于通過(guò)檢測(cè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移而確定所述的初始結(jié)合程度和再次結(jié)合程度。
8.受體拮抗劑在制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物中的應(yīng)用，其特征在于，在內(nèi)吞過(guò)程中，所述受體拮抗劑抑制與早老蛋白-1結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞。
9.一種試劑在制備治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑干擾G蛋白偶聯(lián)受體與早老蛋白-1或γ-分泌酶的結(jié)合。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述受體中至少一種選自β腎上腺素受體和δ-阿片受體。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述β腎上腺素受體為β2腎上腺素受體。
12.如權(quán)利要求8、10或11所述的任一種的應(yīng)用，其特征在于，所述拮抗劑中至少一種選自ICI 118，551、普萘洛爾、布他沙明或納曲吲哚。
13.如權(quán)利要求8、10或11所述的任一種的應(yīng)用，其特征在于，所述拮抗劑為ICI118，551或布他沙明。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于篩選治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)神經(jīng)性病變?cè)噭┑姆椒?。本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)激活受體并確定其內(nèi)吞程度，此受體為G蛋白偶聯(lián)受體并且和早老蛋白－1結(jié)合；(b)在一種候選試劑存在下如(a)所述激活受體，再次確定受體的內(nèi)吞程度；(c)確定(a)和(b)中的內(nèi)吞程度的差異；(d)如果差異小于一定閾值則重復(fù)步驟(a)－(c)。本發(fā)明還提供了利用受體的拮抗劑制造治療或預(yù)防阿爾茲海默癥或相關(guān)的神經(jīng)性病變的藥物。這種受體拮抗劑能夠抑制和早老蛋白－1結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1991364SQ200610162480
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2006年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者裴鋼, 倪燕翔, 趙曉輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院