專(zhuān)利名稱(chēng)：酰基CoA:乙醇O－?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因及其用途，特別涉及制造香味良好的酒類(lèi)的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類(lèi)、其制造方法等。更加具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的?；鵆oA乙醇0-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶Ehtlp的基因EHT1，特別涉及通過(guò)控制啤酒酵母的特征nonScEHT1基因的表達(dá)量，來(lái)控制賦予產(chǎn)品香味的酯的生成能力的酵母、使用該酵母的酒類(lèi)的制造方法等。
背景技術(shù)：
酒類(lèi)中酯是重要的香味成分之一，已知清酒、葡萄酒、威士忌等中酯的增加會(huì)使酒香濃郁，提高感官評(píng)價(jià)。另一方面，對(duì)于啤酒來(lái)說(shuō)，酯雖然是重要的香氣成分，但過(guò)剩的酯會(huì)因酯臭而不受歡迎。因此，根據(jù)酒的種類(lèi)的不同而適度控制酯生成量是重要的。
到目前為止，以提高酒的酯含量為目的，對(duì)高產(chǎn)酯酵母進(jìn)行育種。已報(bào)道有下述方法，即，為了有效分離對(duì)酵母實(shí)施突變處理(或不實(shí)施突變處理)的高產(chǎn)酯酵母，利用含有阻斷淺藍(lán)菌素等脂肪酸合成酶的藥劑的培養(yǎng)基，取得具有己酸高產(chǎn)能力的菌株的方法，以及利用含有5，5，5-三氟-DL-亮氨酸等亮氨酸類(lèi)似物的培養(yǎng)基，取得異戊醇、乙酸異戊酯高產(chǎn)菌株的方法(日本國(guó)特開(kāi)2002-253211號(hào)公報(bào))；利用含有具有3位羥基化的孕烷骨架的類(lèi)固醇的培養(yǎng)基，取得繁殖的菌株的方法(日本國(guó)特開(kāi)2002-191355號(hào)公報(bào))等。
另一方面，利用基因操作技術(shù)的酵母育種方法有如下報(bào)道如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醇乙酰轉(zhuǎn)移酶基因ATF1在釀造用酵母中的高表達(dá)例子(日本國(guó)特開(kāi)平06-062849號(hào)公報(bào))、抑制ATF1表達(dá)的例子(日本國(guó)特開(kāi)平06-253826號(hào)公報(bào))、破壞釀造用酵母的酯酶基因EST2從而增加酯量的例子(日本國(guó)特開(kāi)平09-234077號(hào)公報(bào))。另外，有報(bào)告指出通過(guò)破壞?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因EHT1，中鏈脂肪酸酯減少(J.Biol.Chem.2814446-4456，2006)。另一方面，有報(bào)告指出通過(guò)破壞EHT1，乙酸酯增加(ASBC2002 meeting AbstractP-6[online]intemet<URLhttp://www.asbcnet.org/Meetings/2002/Abstracts/P-6.htm>)。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，為了增加產(chǎn)品中的酯含量，實(shí)施各種措施而取得突變株，但其結(jié)果有時(shí)會(huì)出現(xiàn)無(wú)法預(yù)料的發(fā)酵遲緩、不期望要的香味成分增加等情況，使其成為實(shí)用酵母還存在問(wèn)題。因此，期望得到不影響發(fā)酵速度、不損壞產(chǎn)品質(zhì)量、能夠生產(chǎn)期望量的酯的酵母的育種方法。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題進(jìn)行了積極研究，結(jié)果從啤酒酵母中成功分離、鑒定出編碼比已知蛋白質(zhì)更有效的?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶的基因。另外，確認(rèn)將得到的基因?qū)虢湍钢兄谱魇蛊浔磉_(dá)的轉(zhuǎn)化酵母，乙酸酯生成量減少；另外，確認(rèn)制作抑制得到的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化酵母，乙酸酯的生成量增加，中鏈脂肪酸酯的生成量減少，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的表達(dá)受到調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化酵母、通過(guò)使用該基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)的酵母來(lái)控制產(chǎn)品中酯生成量的控制方法等。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供下述所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母的酒類(lèi)制造方法等。
(1)一種多核苷酸，其是從具有下述(a)～(f)的組中選擇的多核苷酸(a)一種多核苷酸，其中含有具有序列號(hào)1的堿基序列的多核苷酸；(b)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2的氨基酸序列；(c)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性；(d)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性；(e)一種多核苷酸，其中含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)格條件下，與具有與序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)；以及(f)一種多核苷酸，其中含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)格條件下，與具有與編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。
(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其從具有下述(g)～(i)的組中選擇(g)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2的氨基酸序列或在序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性；(h)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性；以及(i)一種多核苷酸，其中含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴(yán)格條件下，與具有序列號(hào)1的堿基序列的多核苷酸或與具有與序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。
(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其中含有具有序列號(hào)1的堿基序列的多核苷酸。
(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其中含有編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(5)如上述(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。
(6)一種多核苷酸，其是從具有下述(j)～(m)的組中選擇的多核苷酸(j)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列；(k)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過(guò)RNAi效應(yīng)抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)；
(1)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對(duì)上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性；以及，(m)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過(guò)共抑制效應(yīng)抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。
(7)一種蛋白質(zhì)，其是被上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
(8)一種載體，其中含有上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
(8a)上述(8)所述的載體，其中包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括下述構(gòu)成要素(x)～(z)(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；(y)上述(1)～(3)所述的多核苷酸，其連接在該啟動(dòng)子的有義或反義方向；以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多腺苷化作用，并在酵母內(nèi)起作用的信號(hào)。
(9)一種載體，其中含有上述(6)所述的多核苷酸。
(10)一種酵母，其是導(dǎo)入上述(8)或(9)所述的載體的酵母。
(11)如上述(10)所述的酵母，其中，通過(guò)導(dǎo)入上述(8)所述的載體，酯生成能力降低。
(12)一種酵母，其是通過(guò)導(dǎo)入上述(9)所述的載體或者通過(guò)破壞上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的基因，上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)受到抑制的酵母。
(13)上述(11)所述的酵母，其中，通過(guò)增加上述(7)所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量，酯生成能力降低。
(14)一種酒類(lèi)的制造方法，其中，使用上述(10)～(13)中任一項(xiàng)所述的酵母。
(15)上述(14)所述的酒類(lèi)的制造方法，其中，釀造的酒類(lèi)是麥芽飲料。
(16)上述(14)所述的酒類(lèi)的制造方法，其中，釀造的酒類(lèi)是葡萄酒。
(17)一種酒類(lèi)，其是采用上述(14)～(16)中任一項(xiàng)所述的方法制造的酒類(lèi)。
(18)一種評(píng)價(jià)方法，其是使用根據(jù)具有序列號(hào)1的堿基序列的?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，對(duì)被檢酵母的酯生成能力進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。
(18a)根據(jù)上述(18)所述的方法，選擇出酯生成能力高或低的酵母的方法。
(18b)使用根據(jù)上述(18a)所述的方法選擇的酵母，制造酒類(lèi)(如啤酒)的方法。
(19)一種評(píng)價(jià)方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，通過(guò)測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的表達(dá)量，評(píng)價(jià)被檢酵母的酯生成能力的方法。
(20)一種酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，對(duì)上述(7)所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量或者測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的表達(dá)量，選擇與目標(biāo)酯生成能力相應(yīng)的所述蛋白質(zhì)的量或所述基因表達(dá)量的被檢酵母的方法。
(20a)一種酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定酯生成能力或?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶的活性，選擇目標(biāo)酯生成能力或酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的被檢酵母的方法。
(21)上述(20)所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因?yàn)楦弑磉_(dá)或低表達(dá)的被檢酵母的方法。
(22)上述(20)所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母，對(duì)各酵母中的上述(7)所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比，該蛋白質(zhì)的量多或少的被檢酵母的選擇方法，即，培養(yǎng)多種酵母，對(duì)各酵母中的上述(7)所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，選擇其中該蛋白質(zhì)的量多或少的被檢酵母的上述(20)所述的酵母的方法。
(23)一種酒類(lèi)的制造方法，其特征在于，使用上述(10)～(13)所述的酵母和根據(jù)上述(20)～(22)所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進(jìn)行制造酒類(lèi)的發(fā)酵，調(diào)節(jié)酯生成量。


圖1表示啤酒釀造試驗(yàn)中酵母增殖量的經(jīng)時(shí)變化圖，橫軸表示發(fā)酵時(shí)間，縱軸表示OD660值。
圖2表示啤酒釀造試驗(yàn)中浸出物消耗量的經(jīng)時(shí)變化圖，橫軸表示發(fā)酵時(shí)間，縱軸表示浸出物的表觀濃度(w/w％)。
圖3表示啤酒釀造試驗(yàn)中的酵母中nonScEHT1基因的表達(dá)行為圖，橫軸表示發(fā)酵時(shí)間，縱軸表示檢出的信號(hào)亮度。
圖4表示啤酒釀造試驗(yàn)中酵母增殖量的經(jīng)時(shí)變化圖，橫軸表示發(fā)酵時(shí)間，縱軸表示OD660值，EHT1表示nonScEHT1高表達(dá)株。
圖5表示啤酒釀造試驗(yàn)中浸出物消耗量的經(jīng)時(shí)變化圖，橫軸表示發(fā)酵時(shí)間，縱軸表示浸出物的表觀濃度(w/w％)，EHT1表示nonScEHT1高表達(dá)株。
圖6表示啤酒釀造試驗(yàn)中酵母增殖量的經(jīng)時(shí)變化，橫軸表示發(fā)酵時(shí)間，縱軸表示OD660值，eht1表示nonScEHT1破壞株。
圖7表示啤酒釀造試驗(yàn)中浸出物消耗量的經(jīng)時(shí)變化圖，橫軸表示發(fā)酵時(shí)間，縱軸表示浸出物的表觀濃度(w/w％)，eht1表示nonScEHT1破壞株。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明者們認(rèn)為，通過(guò)增大或減小酵母的?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶的活性，可以控制酯的量。本發(fā)明者們?cè)谶@種構(gòu)思基礎(chǔ)上進(jìn)行反復(fù)研究，根據(jù)日本國(guó)特開(kāi)2004-283169號(hào)公報(bào)公開(kāi)的方法中解讀的啤酒酵母基因組的信息，分離、鑒定出啤酒酵母特有的編碼酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶的nonScEHT1基因。該堿基序列用序列號(hào)1表示。此外，由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列用序列號(hào)2表示。
1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)一種多核苷酸，其是含有具有序列號(hào)1的堿基序列的多核苷酸；以及(b)一種多核苷酸，其是含有編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作為本發(fā)明對(duì)象的多核苷酸，并不限定于上述編碼來(lái)源于啤酒酵母的?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶基因的多核苷酸，而且還包括編碼與該蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。作為具有同等功能的蛋白質(zhì)，例如可以為(c)蛋白質(zhì)，其具有在序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性。
此類(lèi)蛋白質(zhì)可以為具有在序列號(hào)2的氨基酸序列中如缺失、取代、插入及/或添加1～100個(gè)、1～90個(gè)、1～80個(gè)、1～70個(gè)、1～60個(gè)、1～50個(gè)、1～40個(gè)、1～39個(gè)、1～38個(gè)、1～37個(gè)、1～36個(gè)、1～35個(gè)、1～34個(gè)、1～33個(gè)、1～32個(gè)、1～31個(gè)、1～30個(gè)、1～29個(gè)、1～28個(gè)、1～27個(gè)、1～26個(gè)、1～25個(gè)、1～24個(gè)、1～23個(gè)、1～22個(gè)、1～21個(gè)、1～20個(gè)、1～19個(gè)、1～18個(gè)、1～17個(gè)、1～16個(gè)、1～15個(gè)、1～14個(gè)、1～13個(gè)、1～12個(gè)、1～11個(gè)、1～10個(gè)、1～9個(gè)、1～8個(gè)、1～7個(gè)、1～6個(gè)、1～5個(gè)、1～4個(gè)、1～3個(gè)、1～2個(gè)、1個(gè)氨基酸殘基后的氨基酸序列，且具有酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸殘基的個(gè)數(shù)，一般優(yōu)選小的數(shù)目。另外，此類(lèi)蛋白質(zhì)還可以為(d)蛋白質(zhì)，其具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上的同一性的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶活性。上述同源性的數(shù)值一般優(yōu)選大的數(shù)值。
酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性，例如可根據(jù)Saerens等的方法(J.Biol.Chem.2814446-4456，2006)進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明還包括(e)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)格條件下，與具有與序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)；以及(f)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)格條件下，與具有與編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。
這里所述的“嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸”，是指將具有與序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸、或?qū)⒕幋a序列號(hào)2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作為探針，使用菌落雜交法、空斑雜交法(plaquehybridizatio法)、Southem雜交法等得到的多核苷酸(如DNA)。雜交方法可以利用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons 1987-1997等所述的方法。
本說(shuō)明書(shū)所述的“嚴(yán)格條件”，可以為低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件中的任一種?！暗蛧?yán)格條件”，如為5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件；此外，“中嚴(yán)格條件”，如為5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件；“高嚴(yán)格條件”，如為5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在這些條件中，認(rèn)為溫度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸(如DNA)。當(dāng)然，一般認(rèn)為影響雜交的嚴(yán)格度的因素有溫度、探針濃度、探針長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、鹽濃度等多種因素，同領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)適當(dāng)選擇這些要素，實(shí)現(xiàn)相同的嚴(yán)格度。
使用市售的試劑盒進(jìn)行雜交時(shí)，如可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。這種情況下，按照試劑盒中附帶的說(shuō)明書(shū)，對(duì)標(biāo)記探針過(guò)夜培養(yǎng)，在55℃的條件下用含有0.1％(w/v)SDS的第1次洗滌緩沖液將膜洗滌后，能夠檢出雜交的多核苷酸(如DNA)。
除此之外，可能雜交的多核苷酸還可以為，通過(guò)FASTA、BLAST等同源性檢索軟件用系統(tǒng)設(shè)定的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算時(shí)，與編碼序列號(hào)2的氨基酸序列的多核苷酸有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1以上％、99.2以上％、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。
氨基酸序列、堿基序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的BLASTAlgorithm(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)來(lái)確定。以BLAST Algorithm為基礎(chǔ)的稱(chēng)為BLASTN、BLASTX的程序已在開(kāi)發(fā)(Altschul SF，et alJ Mol Biol 215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時(shí)，如使參數(shù)為score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，如使參數(shù)為score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，采用各程序的系統(tǒng)設(shè)定的默認(rèn)參數(shù)值。
本發(fā)明的多核苷酸還包括(i)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列；(k)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過(guò)RNAi效應(yīng)抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)；(1)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對(duì)上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性；以及(m)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過(guò)共抑制效應(yīng)抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。將這些多核苷酸整合到載體內(nèi)，進(jìn)而在導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)能夠抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。因此，能夠在期望抑制上述多核苷酸(DNA)表達(dá)時(shí)優(yōu)選使用。
本說(shuō)明書(shū)中所述的“編碼具有與DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列的RNA的多核苷酸”，指的是反義DNA。反義技術(shù)是公知的抑制特定的內(nèi)源基因表達(dá)的方法，在各種文獻(xiàn)中都有記載(如參照平島及井上新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2核酸IV基因的復(fù)制和表達(dá)(日本生化學(xué)會(huì)主編，東京化學(xué)同人)pp.319-347，1993等)(平島おょび井上新生化學(xué)実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現(xiàn)(日本生化學(xué)會(huì)編，東京化學(xué)同人)pp.319-347，1993)。反義DNA的序列，優(yōu)選為與內(nèi)源基因或其中一部分互補(bǔ)的序列，但只要能夠有效抑制基因表達(dá)，不完全互補(bǔ)也可以。被轉(zhuǎn)錄的RNA，優(yōu)選其與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有90％以上的互補(bǔ)性，更優(yōu)選有95％以上的互補(bǔ)性。反義DNA的長(zhǎng)度至少為15個(gè)堿基以上，優(yōu)選為100個(gè)堿基以上，更優(yōu)選為500個(gè)堿基以上。
本說(shuō)明書(shū)中所述的“編碼通過(guò)RNAi效應(yīng)抑制DNA表達(dá)的RNA的多核苷酸”，指的是通過(guò)RNA interference(RNAi)來(lái)抑制內(nèi)源基因表達(dá)的多核苷酸。“RNAi”是指將具有與靶基因序列相同或類(lèi)似的序列的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)入的外源基因及內(nèi)源靶基因的表達(dá)均被抑制的現(xiàn)象。這里使用的RNA，例如可以是21～25堿基長(zhǎng)的產(chǎn)生RNA干擾的雙鏈RNA，如dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(shorthairpin RNA)。此類(lèi)RNA可以通過(guò)脂質(zhì)體等輸送系統(tǒng)局部輸送到所需的部位，并且使用可生成上述雙鏈RNA的載體能夠使其局部表達(dá)。這種雙鏈RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制備方法、使用方法等，在多種文獻(xiàn)中是公知的(參照日本國(guó)特表2002-516062號(hào)公報(bào)；美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利第2002/086356A號(hào)；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000April；Nature，4076802，319-20，2002Sep.21；Genes&Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，999，6047-6052，2002 Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002 May；Nucleic Acids Res.，3010，e46，2002 May 15等)。
本說(shuō)明書(shū)中所述的“編碼對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性的RNA的多核苷酸”，一般是指酶性核酸(Ribozyme)。酶性核酸是指具有催化活性的RNA分子，通過(guò)切割靶DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來(lái)阻斷其基因功能。關(guān)于酶性核酸的設(shè)計(jì)可以參照各種公知文獻(xiàn)(如參照FEBS Lett.228228，1988；FEBSLett.239285，1988；Nucl.Acids.Res.177059，1989；Nature323349，1986；Nucl.Acids.Res.196751，1991；Protein Eng3733，1990；Nucl.Acids Res.193875，1991；Nucl.Acids Res.195125，1991；BiochemBiophys Res Commun1861271，1992等)。此外，“編碼通過(guò)共抑制效應(yīng)抑制DNA表達(dá)的RNA的多核苷酸”，是指通過(guò)“共抑制”來(lái)阻斷靶DNA功能的核苷酸。
本說(shuō)明書(shū)中所述的“共抑制”，是指通過(guò)轉(zhuǎn)化作用在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入具有與內(nèi)源靶基因相同或類(lèi)似序列的基因，導(dǎo)入的外源基因和內(nèi)源靶基因的表達(dá)均被抑制的現(xiàn)象。具有共抑制效應(yīng)的多核苷酸的設(shè)計(jì)也可以參照各種公知文獻(xiàn)(例如參照Smyth DRCurr.Biol.7R793，1997；Martienssen RCurr.Biol.6810，1996等)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供由上述(a)～(i)中任意一種多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)是具有在序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。
此類(lèi)蛋白質(zhì)可以是具有在序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述數(shù)量的氨基酸殘基后的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。此外，此類(lèi)蛋白質(zhì)還可以是具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。
此類(lèi)蛋白質(zhì)可使用《Molecular Cloning第3版》、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等記載的定點(diǎn)誘變法獲得。
本發(fā)明所述的在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個(gè)以上的氨基酸殘基，是指在同一序列中的任意且1個(gè)或多個(gè)氨基酸序列中的位置上缺失、取代、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并且缺失、取代、插入及添加中的2種以上可同時(shí)發(fā)生。
下面列舉可互相取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可互相取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、鄰-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴(lài)氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯基丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以通過(guò)Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化學(xué)合成法制造。另外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、Perkin Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、島津制作所等制造的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化酵母本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述(a)～(i)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)或上述(j)～(m)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。另外，本發(fā)明的載體通常包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括的結(jié)構(gòu)要素為(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，(y)上述(a)～(i)所述的多核苷酸，其連接在該啟動(dòng)子的有義或反義方向，以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多腺苷化作用，并在酵母內(nèi)起作用的信號(hào)。在本發(fā)明中，在下述酒類(lèi)(如啤酒)的釀造中，要使上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行高表達(dá)時(shí)，將上述(a)～(i)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)以有義方向?qū)朐搯?dòng)子，以促進(jìn)這些多核苷酸(DNA)的表達(dá)。此外，在下述酒類(lèi)(如啤酒)釀造中，要抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，將上述(a)～(i)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)以反義方向?qū)朐搯?dòng)子，以抑制這些多核苷酸(DNA)的表達(dá)。此外，要抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，也可將上述(j)～(m)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸導(dǎo)入其能夠表達(dá)的載體內(nèi)。此外，在本發(fā)明中，通過(guò)破壞作為靶基因的上述基因(DNA)，可以抑制上述多核苷酸(DNA)的表達(dá)或上述蛋白質(zhì)的表達(dá)?；蚱茐目赏ㄟ^(guò)下述方式進(jìn)行，即，通過(guò)在與靶基因的基因產(chǎn)物表達(dá)相關(guān)的區(qū)域如編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)的內(nèi)部添加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基，或使上述區(qū)域整體缺失來(lái)進(jìn)行。上述基因破壞的方法可參照公知文獻(xiàn)(例如參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods inEnzymology，101，202(1983)、日本國(guó)特開(kāi)平6-253826號(hào)公報(bào)等)。
導(dǎo)入酵母時(shí)使用的載體可以是多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任意一種。例如作為YEp型載體，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)，作為YCp型載體，已知有YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)，作為YIp型載體，已知有YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)，且容易獲得。
用于調(diào)節(jié)酵母中的基因表達(dá)的啟動(dòng)子/終止子，只要在釀造用酵母中起作用的同時(shí)不受醪液中的成分影響即可，可以任意組合。例如，可使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動(dòng)子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動(dòng)子等。這些基因都已被克隆，如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有詳細(xì)記載，通過(guò)已知的方法能夠容易地獲得。
作為轉(zhuǎn)化時(shí)使用的選擇性標(biāo)記，因釀造用酵母不能利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，可利用耐氨基糖苷類(lèi)抗生素(Geneticin)基因(G418r)、耐銅基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐淺藍(lán)菌素基因(fas2m，PDR4)(豬腰淳嗣等，生物化學(xué)，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
把上述構(gòu)建的載體導(dǎo)入宿主酵母內(nèi)。宿主酵母可以是在釀造中使用的任何酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等釀造用酵母等，具體可以為酵母屬(Saccharomyces)等酵母，在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。另外，還可使用威士忌酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等，葡萄酒酵母如協(xié)會(huì)葡萄酒用1號(hào)、葡萄酒用3號(hào)、葡萄酒用4號(hào)等，清酒酵母如協(xié)會(huì)酵母清酒用7號(hào)、清酒用9號(hào)等，但并不限于這些酵母。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用啤酒酵母例如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)。
酵母的轉(zhuǎn)化方法可利用一般使用的公知方法。如電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質(zhì)體法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)”、乙酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 EditionA ColdSpring Harbor Laboratory Course Manual等所述的方法，但并不限于這些方法。
更具體地說(shuō)，將宿主酵母在標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(如YEPD培養(yǎng)基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養(yǎng)至OD600nm值為1～6。將該培養(yǎng)酵母離心分離并收集，洗凈，用濃度約為1M～2M的堿金屬離子進(jìn)行前處理，優(yōu)選用鋰離子進(jìn)行前處理。上述細(xì)胞在約30℃下，靜置約60分鐘后，與導(dǎo)入的DNA(約1～20μg)同時(shí)在約30℃下，靜置約60分鐘。添加聚乙二醇，優(yōu)選添加約4,000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。約30℃下靜置約30分鐘后，將上述細(xì)胞在約42℃下加熱處理約5分鐘。優(yōu)選用標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基將上述細(xì)胞懸浮液洗凈，加入到規(guī)定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，約30℃下靜置約60分鐘。然后，將其接種于含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素等的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基上，獲得轉(zhuǎn)化體。
一般的克隆技術(shù)可參照《Molecular Cloning第3版》、“Methods in YeastGenetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor，NY)”等。
4.本發(fā)明的酒類(lèi)制造方法以及根據(jù)該方法制造的酒類(lèi)將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適于釀造目標(biāo)酒類(lèi)的酵母中，通過(guò)使用該酵母，能夠制造出所期望的且酯量增加或減少、香味良好的酒類(lèi)。此外，同樣也可以使用根據(jù)下述本發(fā)明的酵母的評(píng)價(jià)方法選擇出的酵母。目標(biāo)酒類(lèi)可以為啤酒、發(fā)泡酒等啤酒味飲料、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于這些。此外，在本發(fā)明中，可根據(jù)需要使用靶基因的表達(dá)受到抑制的釀造用酵母，由此，也能夠制造所期望的且控制酯含量的酒類(lèi)。即，使用導(dǎo)入上述本發(fā)明載體的酵母、上述本發(fā)明多核苷酸(DNA)的表達(dá)受到抑制的酵母或根據(jù)下述本發(fā)明的酵母的評(píng)價(jià)方法選擇的酵母，進(jìn)行制造酒類(lèi)的發(fā)酵，通過(guò)調(diào)節(jié)(增加或減少)酯生成量，能夠制造所期望且調(diào)節(jié)了酯含量(增加或減少)的酒類(lèi)。
制造上述酒類(lèi)時(shí)，除使用本發(fā)明得到的釀造酵母代替親株之外，可利用公知的方法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等與以往的方法完全相同，不會(huì)因制造控制了酯含量的酒類(lèi)而增加成本。即，根據(jù)本發(fā)明，使用已有的設(shè)備，就可制造香味優(yōu)良的酒類(lèi)而不增加成本。
5.本發(fā)明的酵母的評(píng)價(jià)方法本發(fā)明涉及使用根據(jù)具有序列號(hào)1堿基序列的酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評(píng)價(jià)被檢酵母的酯生成能力的評(píng)價(jià)方法。該評(píng)價(jià)方法的一般方法為公知方法，例如在WO01/040514號(hào)公報(bào)、日本國(guó)特開(kāi)平8-205900號(hào)公報(bào)等中有記載。下面，對(duì)該評(píng)價(jià)方法進(jìn)行簡(jiǎn)單說(shuō)明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可采用Hereford法或乙酸鉀法等任何一種公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990))。以得到的基因組為對(duì)象，使用根據(jù)?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計(jì)的引物或探針，檢測(cè)被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異序列。可采用公知的方法設(shè)計(jì)引物或探針。
基因或特異序列的檢出可采用公知的方法實(shí)施。例如，用含有特異序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有與其堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸作為一個(gè)引物，用含有該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有與其堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸作為另一個(gè)引物，通過(guò)PCR法擴(kuò)增酵母的核酸，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)、擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的堿基數(shù)通常為10bp以上，優(yōu)選15bp～25bp。此外，夾在兩引物間的堿基數(shù)通常以300bp～2000bp為宜。
PCR法的反應(yīng)條件無(wú)特別限定，如可采用變性溫度90℃～95℃，退火溫度40℃～60℃，延伸溫度60℃～75℃，循環(huán)數(shù)10次以上等條件。得到的反應(yīng)生成物可通過(guò)使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進(jìn)行分離，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。通過(guò)該方法，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量包含特定DNA分子的大小，預(yù)測(cè)·評(píng)價(jià)該酵母的酯生成能力。另外，通過(guò)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)·評(píng)價(jià)上述能力。
在本發(fā)明中，也可通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的表達(dá)量，評(píng)價(jià)被檢酵母的酯生成能力。此外，?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶基因表達(dá)量的測(cè)定，可通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，對(duì)?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶基因的產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行定量來(lái)進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量可采用公知的方法進(jìn)行。可采用如Northern雜交法、定量的RT-PCR對(duì)mRNA進(jìn)行定量，可采用如Western印跡法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons 1994-2003)。
培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的表達(dá)量，通過(guò)選擇與目標(biāo)酯生成能力相應(yīng)的上述基因表達(dá)量的酵母，能夠選擇出適于釀造所期望的酒類(lèi)的酵母。此外，培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測(cè)定上述基因在各酵母中的表達(dá)量，通過(guò)比較上述基因在標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母中的表達(dá)量，可以選擇所期望的酵母。具體來(lái)說(shuō)，例如培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，通過(guò)測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比，該基因?yàn)楦弑磉_(dá)或低表達(dá)的被檢酵母，能夠選擇出適于釀造所期望的酒類(lèi)的酵母。
或者，培養(yǎng)被檢酵母，通過(guò)選擇酯生成能力高或低，或酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性高或低的酵母，能夠選擇出適于釀造所期望的酒類(lèi)的被檢酵母。
所述情況下，作為被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，可以使用如導(dǎo)入上述本發(fā)明載體的酵母、上述本發(fā)明的多核苷酸(DNA)的表達(dá)受到調(diào)節(jié)的酵母、實(shí)施突變處理的酵母、發(fā)生自然突變的酵母等。酯生成能力可以根據(jù)如J.Am.Soc.Brew.Chem.49152-157，1991、J.Biol.Chem.2814446-4456，2006所述方法進(jìn)行測(cè)定。?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性，可以根據(jù)如Saerens等的方法(J.Biol.Chem.2814446-4456，2006)進(jìn)行測(cè)定。突變處理，例如可以使用紫外線照射、放射線照射等物理方法，EMS(甲磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等藥劑處理的化學(xué)方法等任何方法(如參照大嵨泰治編著，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法39酵母分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法，p67-75、學(xué)會(huì)出版センタ一等)。
能夠作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可以是在釀造中使用的任意酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等釀造用酵母等。具體地可以為酵母屬(Saccharomyces)酵母(例如巴氏酵母、釀酒酵母及卡氏酵母)，在本發(fā)明中可以使用啤酒酵母，如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。另外，也可以使用葡萄酒酵母如協(xié)會(huì)葡萄酒用1號(hào)、葡萄酒用3號(hào)、葡萄酒用4號(hào)等，清酒酵母如協(xié)會(huì)酵母清酒用7號(hào)、清酒用9號(hào)等，但并不限于這些酵母。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用啤酒酵母如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母可以從上述酵母中任意組合選擇。
實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1新型?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因(nonScEHT1)的克隆使用日本國(guó)特開(kāi)2004-283169號(hào)公報(bào)中所述的比較數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啤酒酵母中特有的新型?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因nonScEHT1(序列號(hào)1)。根據(jù)獲得的堿基序列信息，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增全長(zhǎng)基因的引物nonScEHT1_for(序列號(hào)3)/nonScEHT1_rv(序列號(hào)4)，通過(guò)以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstepan34/70株(簡(jiǎn)稱(chēng)“W34/70株”)的染色體DNA為模板的PCR，取得包括nonScEHT1的全長(zhǎng)基因的DNA片段(約1.4kb)。
將上述方法得到的nonScEHT1基因片段，通過(guò)TA克隆插入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并確定nonScEHT1基因的堿基序列。
實(shí)施例2啤酒試釀中nonScEHT1基因表達(dá)分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行試釀造，從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體提取的mRNA通過(guò)啤酒酵母DNA微陣列檢測(cè)。
麥汁浸出物濃度 12.69％麥汁體積70L麥汁中溶解氧濃度8.6ppm發(fā)酵溫度15℃酵母添加量 12.8×106cells/mL對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行經(jīng)時(shí)采樣，觀察酵母增殖量(圖1)、浸出物表觀濃度(圖2)的經(jīng)時(shí)變化。與此同時(shí)，對(duì)酵母菌體進(jìn)行采樣，制備的mRNA用生物素進(jìn)行標(biāo)記，使其與啤酒酵母DNA微陣列雜交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software1.0，Affymetrix公司制造)進(jìn)行信號(hào)檢出，nonScEHT1基因的表達(dá)模式如圖3所示。根據(jù)該結(jié)果確認(rèn)在通常的啤酒發(fā)酵中nonScEHT1基因表達(dá)。
實(shí)施例3nonScEHT1高表達(dá)株的制作將實(shí)施例1所述的nonScEHT1/pCR2.1-TOPO用限制酶SacI及NotI酶解，制備包括蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長(zhǎng)的DNA片段。將該片段連接于經(jīng)限制酶SacI及NotI處理的pYCGPYNot上，構(gòu)建nonScEHT1高表達(dá)載體nonScEHT1/pYCGPYNot。pYCGPYNot為YCp型酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過(guò)丙酮酸激酶基因PYK1的啟動(dòng)子進(jìn)行高表達(dá)。酵母的選擇性標(biāo)記包括耐氨基糖苷類(lèi)抗生素(Geneticin)基因G418r，大腸菌的選擇性標(biāo)記包括氨芐青霉素抗性基因Ampr。使用上述方法制作的高表達(dá)載體，使用日本國(guó)特開(kāi)平07-303475號(hào)公報(bào)所述的方法，對(duì)Saccharomyces pastorianusWeihenstepan34/70株進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用含有氨基糖苷類(lèi)抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸膏，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例4啤酒釀造試驗(yàn)中酯生成量的分析使用親株(W34/70株)及實(shí)施例3得到的nonScEHT1高表達(dá)株的發(fā)酵試驗(yàn)在下述條件下進(jìn)行。
麥汁浸出物濃度13％麥汁體積 2L麥汁中溶解氧濃度 約8ppm發(fā)酵溫度 15℃酵母添加量5g/L對(duì)發(fā)酵醪液進(jìn)行經(jīng)時(shí)采樣，分析酵母增殖量(OD660)(圖4)、浸出物消耗量(圖5)的經(jīng)時(shí)變化。發(fā)酵結(jié)束時(shí)乙酸酯濃度的定量，采用頂空氣相色譜法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49152-157，1991)進(jìn)行。
如表1所示，發(fā)酵結(jié)束時(shí)親株的乙酸乙酯生成量為34.4ppm，而nonScEHT1高表達(dá)株為27.3ppm。此外，親株的乙酸異戊酯生成量為2.1ppm，而nonScEHT1高表達(dá)株為1.6ppm。上述結(jié)果表明nonScEHT1高表達(dá)使乙酸酯生成量約減少20％。此時(shí)同時(shí)，在親株與高表達(dá)株之間，增殖速度及浸出物消耗速度幾乎沒(méi)有差別。


單位ppm()內(nèi)的值表示與親株的相對(duì)值實(shí)施例5nonScEHT1基因破壞按照文獻(xiàn)(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，通過(guò)以含有抗藥性標(biāo)記的質(zhì)粒(pFA6a(G418r)，pAG25(nat1)，pAG32(hph))為模板的PCR，制作用于破壞基因的片段。作為PCR用的引物，使用nonScEHT1_delta_for(序列號(hào)5)、nonScEHT1_delta_rv(序列號(hào)6)。
使用上述方法制作的用于破壞基因的片段，對(duì)從啤酒酵母Saccharomycespastorianus W34/70株分離的孢子克隆株(W34/70-2)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化采用日本國(guó)特開(kāi)平07-303475號(hào)公報(bào)所述的方法，采用含有氨基糖苷類(lèi)抗生素(Geneticin)300mg/L、或Nourseothricin50mg/L、或Hygromycin B200mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸膏，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例6啤酒釀造試驗(yàn)中酯生成量的分析使用親株(W34/70-2株)及實(shí)施例5得到的nonScEHT1破壞株的發(fā)酵試驗(yàn)在下述條件下進(jìn)行。
麥汁浸出物濃度13％麥汁體積 1L麥汁中溶解氧濃度 8ppm發(fā)酵溫度 15℃酵母添加量5g/L對(duì)發(fā)酵醪液進(jìn)行經(jīng)時(shí)采樣，分析酵母增殖量(OD660)(圖6)、浸出物消耗量(圖7)的經(jīng)時(shí)變化。發(fā)酵結(jié)束時(shí)乙酸酯濃度的定量采用頂空氣相色譜法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49152-157，1991)進(jìn)行。發(fā)酵結(jié)束時(shí)的中鏈脂肪酸酯濃度，通過(guò)在20g發(fā)酵醪液上清中加入60g乙酸乙酯，快速滲透除去水層濃縮到200μl后，采用氣相色譜法(nipponn jozo kyouaishi，90919-22，1995)進(jìn)行定量。
如表2所示，發(fā)酵結(jié)束時(shí)親株的乙酸乙酯生成量為26.2ppm，而nonScEHT1破壞株為41.1ppm。此外，親株的乙酸異戊酯生成量為2.3ppm，而nonScEHT1破壞株為4.2ppm。上述結(jié)果表明通過(guò)nonScEHT1破壞，使乙酸酯生成量約增加50～80％。此外，對(duì)于中鏈脂肪酸酯，親株的丁酸乙酯的生成量是0.061ppm，而nonScEHT1破壞株為0.046 ppm；親株的己酸乙酯的生成量是0.092ppm，而nonScEHT1破壞株為0.077ppm；親株的辛酸乙酯的生成量是0.28ppm，而nonScEHT1破壞株為0.205ppm，約減少15～25％。此時(shí)同時(shí)，在親株和破壞株之間，增殖速度和浸出物消耗速度幾乎沒(méi)有差別。


單位ppm()內(nèi)的值表示與親株的相對(duì)值由上述結(jié)果可知，如果使用本發(fā)明公開(kāi)的啤酒酵母特有的?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶的表達(dá)量受到抑制的酵母，不用改變發(fā)酵工序、發(fā)酵期間，就可以控制酯的生成量，因此可以制造香味良好的酒類(lèi)。
根據(jù)本發(fā)明的酒類(lèi)制造方法，增加了賦予產(chǎn)品濃郁香味的酯含量，所以，可制造香味良好的酒類(lèi)。另外，對(duì)于不期望含有過(guò)剩酯的啤酒等麥芽飲料因酯含量減少，可制造香味更加良好的酒類(lèi)。
SEQUENCE LISTING<110>三得利株式會(huì)社(Suntory Limited)<120>酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因及其用途(Acyl-CoAethanol O-acyltransferase/esterase gene and use thereof)<130>G06-0087CN<150>JP2006-49048<151>2006-02-24<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1362<212>DNA<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>1atgtcagaag tttcaaagtg gccagctatt aacccacttc attgggggta caacggtaca60gtttcacatg tcgttggtga aaatggttct gcgaagttga gtttgaagaa cgataagcag120caagtcgaat ttaatacgtt tgttaatgaa tacgtcccga ttttgagaaa cggggcccac180tataaactaa gtccttactt gttcacaggt attttacaaa ctctatactt gaacgctgct240gatttatcga agaagtttcc tgtcttttat ggtagggaaa tcgtcgagtt ctcggatggc300ggtgtctgta ctgctgattg ggtcatgaat tcctgggaaa aggaatataa tttcgaccaa360aacactatga aatttgatac gaagaagttt ggtctcgacg agaaggcgac gcacccagag420ggatggcctc gtttacaacc acgtacgagg tacctgagag acgaagagtt gaaagagcaa480
aggaaagtag atcttcccct agttgttgtc ctccatggtc ttgccggagg cagtcatgaa 540ccaatcataa gatctctaac tgagaacttg tctcgtatca gtaacgggaa attccaagtc 600gtggtgctaa acacgagggg ctgcgcgcgt tctaaaatca ccactaaaaa cttattcaca 660gcttaccaca ctatggatat tcgtgagttc ttgcaaagag aaaaagaaag atatccaaac 720agaaaattat acaccgtagg atgctctttc ggggctacca tgttagcaaa ctatttgggt 780gaggaaggtg acaaatcgcc tttatctgct gctgttacat tatgtaatcc atgggatctt 840cttctttcgg cacttagaat gactgaagac tggtggtcaa aaaccttgtt ctctagaaat 900attgcccaat ttttaactag aactgttcaa gttaacatgg gcgaattagg tgttccaaac 960ggttctagcc ctgaccatac acctacgact caaaatccat cttactataa attcacaccc1020gagaatttgg aaaaggcgaa acgctttaag tcgagtcttg aattcgatga gctgtacact1080gcaccagctt tgggattccc aaatgctatg gaatattata gagcagccag ttcaattaac1140agggctgata aaatcaaagt tcctacttta gtaatcaatt ccagagatga tcctgttgta1200ggccccgacc aaccttattc atttgtggaa aagaaoccta atattctatt ctgtagaact1260gacctaggtg gccatttagc ttacctagat agcaacaacg attcgtgggt tacgaaggcg1320atttccgaat tcttgaataa gttcgaggaa ttagttttat ga 1362<210>2<211>453<212>PRT<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>2Met Ser Glu Val Ser Lys Trp Pro Ala Ile Asn Pro Leu His Trp Gly1 5 10 15Tyr Asn Gly Thr Val Ser His Val Val Gly Glu Ash Gly Ser Ala Lys20 25 30Leu Ser Leu Lys Asn Asp Lys Gln Gln Val Glu Phe Asn Thr Phe Val35 40 45Asn Glu Tyr Val Pro Ile Leu Arg Asn Gly Ala His Tyr Lys Leu Ser50 55 60
Pro Tyr Leu Phe Thr Gly Ile Leu Gln Thr Leu Tyr Leu Asn Ala Ala65 70 75 80Asp Leu Ser Lys Lys Phe Pro Val Phe Tyr Gly Arg Glu Ile Val Glu85 90 95Phe Ser Asp Gly Gly Val Cys Thr Ala Asp Trp Val Met Asn Ser Trp100 105 110Glu Lys Glu Tyr Asn Phe Asp Gln Asn Thr Met Lys Phe Asp Thr Lys115 120 125Lys Phe Gly Leu Asp Glu Lys Ala Thr His Pro Glu Gly Trp Pro Arg130 135 140Leu Gln Pro Arg Thr Arg Tyr Leu Arg Asp Glu Glu Leu Lys Glu Gln145 150 155 160Arg Lys Val Asp Leu Pro Leu Val Val Val Leu His Gly Leu Ala Gly165 170 175Gly Ser His Glu Pro Ile Ile Arg Ser Leu Thr Glu Asn Leu Ser Arg180 185 190Ile Ser Asn Gly Lys Phe Gln Val Val Val Leu Asn Thr Arg Gly Cys195 200 205Ala Arg Ser Lys Ile Thr Thr Lys Asn Leu Phe Thr Ala Tyr His Thr210 215 220Met Asp Ile Arg Glu Phe Leu Gln Arg Glu Lys Glu Arg Tyr Pro Asn225 230 235 240Arg Lys Leu Tyr Thr Val Gly Cys Ser Phe Gly Ala Thr Met Leu Ala245 250 255Asn Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Asp Lys Ser Pro Leu Ser Ala Ala Val260 265 270Thr Leu Cys Asn Pro Trp Asp Leu Leu Leu Ser Ala Leu Arg Met Thr275 280 285Glu Asp Trp Trp Ser Lys Thr Leu Phe Ser Arg Asn Ile Ala Gln Phe290 295 300Leu Thr Arg Thr Val Gln Val Asn Met Gly Glu Leu Gly Val Pro Asn305 310 315 320
Gly Ser Ser Pro Asp His Thr Pro Thr Thr Gln Asn Pro Ser Tyr Tyr325 330 335Lys Phe Thr Pro Glu Asn Leu Glu Lys Ala Lys Arg Phe Lys Ser Ser340 345 350Leu Glu Phe Asp Glu Leu Tyr Thr Ala Pro Ala Leu Gly Phe Pro Asn355 360 365Ala Met Glu Tyr Tyr Arg Ala Ala Ser Ser Ile Asn Arg Ala Asp Lys370 375 380Ile Lys Val Pro Thr Leu Val Ile Asn Ser Arg Asp Asp Pro Val Val385 390 395 400Gly Pro Asp Gln Pro Tyr Ser Phe Val Glu Lys Asn Pro Asn Ile Leu405 410 415Phe Cys Arg Thr Asp Leu Gly Gly His Leu Ala Tyr Leu Asp Ser Asn420 425 430Asn Asp Ser Trp Val Thr Lys Ala Ile Ser Glu Phe Leu Asn Lys Phe435 440 445Glu Glu Leu Val Leu450<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>3gagctcatag cggccatgag acgtgtctcg aaagtcgaac 40
<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>4ggatcctatg cggccgccat tcttttcgag aaaaaactat at42<210>5<211>70<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>5ggccggggaa gtaatagtcc cttcgaagat tttccttact atttaacagt ccttgacagt 60cttgacgtgc70<210>6<211>70<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>引物(Primer)
<400>6cttctgttgt atacatacat aagaatggct aggaaaagaa ccatataaca cgcacttaac60ttcgcatctg70
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，其為從具有下述(a)～(f)的組中選擇的多核苷酸(a)一種多核苷酸，其中含有具有序列號(hào)1的堿基序列的多核苷酸；(b)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2的氨基酸序列；(c)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性；(d)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶活性；(e)一種多核苷酸，其中含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)格條件下，與具有與序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)；以及(f)一種多核苷酸，其中含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)格條件下，與具有與編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其從具有下述(g)～(i)的組中選擇(g)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2的氨基酸序列或在序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性；(h)一種多核苷酸，其中含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶活性；以及(i)一種多核苷酸，其中含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴(yán)格條件下，與具有序列號(hào)1的堿基序列的多核苷酸或具有與序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交，且編碼具有?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶活性的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中含有具有序列號(hào)1的堿基序列的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中含有編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。
6.一種多核苷酸，其是從具有下述(j)～(m)的組中選擇的多核苷酸(j)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列；(k)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過(guò)RNAi效應(yīng)抑制權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)；(1)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對(duì)權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性；以及，(m)一種多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過(guò)共抑制效應(yīng)抑制權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。
7.一種蛋白質(zhì)，其是被權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
8.一種載體，其中含有權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
9.一種載體，其中含有權(quán)利要求6所述的多核苷酸。
10.一種酵母，其是導(dǎo)入權(quán)利要求8或9所述的載體的酵母。
11.如權(quán)利要求10所述的酵母，其中，通過(guò)導(dǎo)入權(quán)利要求8所述的載體，降低酯生成能力。
12.一種酵母，其是通過(guò)導(dǎo)入權(quán)利要求9所述的載體，或者通過(guò)破壞權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的基因，抑制權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)的酵母。
13.如權(quán)利要求11所述的酵母，其中，通過(guò)增加權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量，降低酯生成能力。
14.一種酒類(lèi)的制造方法，其中使用權(quán)利要求10～13中任一項(xiàng)所述的酵母。
15.如權(quán)利要求14所述的酒類(lèi)的制造方法，其中，釀造的酒類(lèi)是麥芽飲料。
16.如權(quán)利要求14所述的酒類(lèi)的制造方法，其中，釀造的酒類(lèi)是葡萄酒。
17.一種酒類(lèi)，其為采用權(quán)利要求14～16中任一項(xiàng)所述的方法制造的酒類(lèi)。
18.一種評(píng)價(jià)方法，其為使用根據(jù)具有序列號(hào)1的堿基序列的酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，對(duì)被檢酵母的酯生成能力進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。
19.一種評(píng)價(jià)方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，通過(guò)測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的酰基CoA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因的表達(dá)量，評(píng)價(jià)被檢酵母的酯生成能力的方法。
20.一種酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，對(duì)權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量或測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的?；鵆oA乙醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶基因的表達(dá)量，選擇與目標(biāo)酯生成能力相應(yīng)的所述蛋白質(zhì)的量或所述基因表達(dá)量的被檢酵母的方法。
21.如權(quán)利要求20所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1的堿基序列的?；鵆oA乙醇O-?；D(zhuǎn)移酶/酯酶基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因?yàn)楦弑磉_(dá)或低表達(dá)的被檢酵母的方法。
22.如權(quán)利要求20所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母，對(duì)各酵母中的權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比，該蛋白質(zhì)的量多或少的被檢酵母的方法。
23.一種酒類(lèi)的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求10～13所述的酵母和根據(jù)權(quán)利要求20～22所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進(jìn)行制造酒類(lèi)的發(fā)酵，調(diào)節(jié)酯生成量。
全文摘要
本發(fā)明涉及?；鵆oA乙醇O－酰基轉(zhuǎn)移酶/酯酶基因及其用途，特別涉及制造香味良好的酒類(lèi)的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類(lèi)、其制造方法等。更加具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的?；鵆oA乙醇O－?；D(zhuǎn)移酶/酯酶Ehtlp的基因EHT1，特別涉及通過(guò)控制啤酒酵母的特征基因nonScEHT1的表達(dá)量來(lái)控制賦予產(chǎn)品香味的酯的生成能力的酵母、使用該酵母的酒類(lèi)的制造方法等。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101024837SQ20061016351
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2006年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日
發(fā)明者中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子, 下永朋子 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社