專利名稱：：用單個(gè)小室破裂細(xì)胞并純化核酸的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用單個(gè)小室破裂細(xì)胞并純化核酸的方法和裝置。
背景技術(shù)：
：用具有結(jié)合DNA傾向的材料實(shí)施從細(xì)胞分離DNA的方法。用于DNA分離的材料的例子包括硅石、玻璃纖維、陰離子交換樹脂和》茲珠(Rudi，K.等，說她c/zw—es22,506-511(1997);和Deggerdal，A.等，祝o&c/w一my22，554-557(1997))。為了避免手工操作和去除操作誤差，已經(jīng)開發(fā)了幾種自動化機(jī)器用于高生產(chǎn)率的DNA提取。在分子生物學(xué)中，高純度雙鏈質(zhì)粒DNAs、單鏈?zhǔn)删wDNAs、染色體DNAs、以及瓊脂糖凝膠純化的DNA片段的生產(chǎn)是非常重要的。純化DNAs的理想方法應(yīng)當(dāng)簡單快速，并且?guī)缀醪话~外的樣品操作。用這種方法獲得的DNAs易于直接轉(zhuǎn)化、限制酶分析、連接或測序。這樣的方法在DNA樣品的自動化生產(chǎn)中非常有吸引力，其在研究和診斷實(shí)驗(yàn)室中很受喜愛。傳統(tǒng)上，用固相純化核酸的方法是已知的。例如，美國專利5，234，809披露了用結(jié)合核酸的固相純化核酸的方法，該方法包括混合起始材料、高滲(chaotropic)材料、和結(jié)合核酸的固相；從液體中將結(jié)合有核酸的固相分離并沖洗固相核酸復(fù)合物。然而，該方法是費(fèi)時(shí)且復(fù)雜的，因此不適合于芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-On-a-Chip，LOC)。同時(shí)，該方法存在問題，因?yàn)樾枰酶邼B材料。美國專利6,291,166披露了用固相基質(zhì)獲取核酸的方法。由于核酸不可逆地結(jié)合于固相基質(zhì)，因而存儲后對核酸固相基質(zhì)復(fù)合物的延遲分析或重復(fù)分析是可能的，因此該方法具有優(yōu)勢。然而，根據(jù)該方法，具有正電荷表面的礬土(八1203)需要用堿性材料如NaOH親水化處理，核酸不可逆地結(jié)合于親水化處理的夙土，因此不能從礬土分離。美國專利6,936,414^L露了從試樣分離核酸的方法，該方法包括使試樣與金屬氧化物支持材料和結(jié)合緩沖液接觸以形成核酸/金屬氧化物支持材料復(fù)合物；從試樣分離該復(fù)合物；并從金屬氧化物支持材料洗脫核酸。然而，盡管美國專利6,936,414中公開的發(fā)明在使用金屬氧化物與核酸的結(jié)合方面同本發(fā)明類似，但美國專利6,936,414所公開的發(fā)明不同于本發(fā)明，因?yàn)楹怂峤Y(jié)合于金屬氧化物支持物時(shí)，美國專利6,936,414所公開的發(fā)明使用高滲鹽和去垢劑作為結(jié)合材料，但本發(fā)明不是。本發(fā)明的發(fā)明人研究了基于上述傳統(tǒng)技術(shù)的破裂細(xì)胞和純化核酸的方法，并證實(shí)通過開發(fā)進(jìn)行細(xì)胞富集、細(xì)胞裂解的技術(shù)、以及芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)在單個(gè)小室中所需的純化核酸方法，可以實(shí)現(xiàn)芯片實(shí)驗(yàn)室的集成化，并因此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供在單個(gè)芯片中破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸的方法，該方法包括向芯片照射激光束，在所述芯片中，增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上。本發(fā)明還提供用單個(gè)小室破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸的方法，該方法包括將增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上；將含細(xì)胞或含病毒的溶液加到固體支持物上，以用結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的沉積的金屬氧化物結(jié)合細(xì)胞或病毒，其中增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物沉積在所述固體支持物上；通過照射激光束破裂結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的細(xì)胞或病毒，以用結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物結(jié)合核酸；用沖洗緩沖液沖洗未結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的試樣；和通過添加核酸洗脫緩沖液洗脫結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的核酸。本發(fā)明還提供芯片，其中將增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上。本發(fā)明還提供用單個(gè)小室破裂細(xì)胞并純化核酸的裝置，該裝置包括芯片，其中將增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上；和產(chǎn)生激光的部件。通過參考附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，本發(fā)明上述的以及其他的特征和優(yōu)勢將更為明顯，其中圖1圖示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在單個(gè)小室中濃縮細(xì)胞并純化核酸的方法；圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的固體支持物即具有柱狀結(jié)構(gòu)的芯片的視圖，金屬氧化物沉積在所述固體支持物上；圖3A圖示芯片的上部、中部和下部，其中用作細(xì)胞裂解增強(qiáng)層的金屬氧化物沉積在芯片上；圖3B為在上述各個(gè)位置拍攝的圖3A芯片的一系列場致發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)圖像；圖4為FE-SEM圖像，其顯示根據(jù)不同類型芯片的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞的結(jié)合效率；圖5為FE-SEM圖像，其顯示根據(jù)不同類型芯片的大腸桿菌細(xì)胞裂解；圖6為顯示大腸桿菌基因組DNA(gDNA)的洗脫效率相對于沖洗緩沖液和核酸洗脫緩沖液的圖表；圖7為顯示洗脫DNA相對于輸入大腸桿菌細(xì)胞濃度的定量曲線圖；和圖8為顯示PCR產(chǎn)物相對于輸入大腸桿菌細(xì)胞濃度的定量曲線圖。具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將參考附圖更為詳細(xì)地描述本發(fā)明，附圖中顯示本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。本發(fā)明提供在單個(gè)芯片中破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸的方法，該方法包括向芯片照射激光束，在所述芯片中，增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的方法中，細(xì)胞或病毒破裂和核酸純化在單個(gè)芯片中進(jìn)行。在芯片中，增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物首先沉積，然后能夠與細(xì)胞或病毒和核酸結(jié)合的金屬氧化物沉積，當(dāng)激光照射到芯片時(shí)，細(xì)胞或病毒裂解，隨后可以在單個(gè)芯片中從裂解的細(xì)胞或病毒純化核酸。本發(fā)明還提供用單個(gè)小室破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸的方法，該方法包括將增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上；向沉積增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的固體支持物添加含細(xì)胞或含病毒的溶液，以用沉積的結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物結(jié)合細(xì)胞或病毒；通過照射激光束破裂結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的細(xì)胞或病毒，以用結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物結(jié)合核酸；用沖洗緩沖液沖洗未結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的試樣；和通過添加核酸洗脫緩沖液洗脫結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的核酸。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的方法中，可以在單個(gè)小室中進(jìn)行細(xì)胞濃縮、細(xì)胞裂解和核酸純化。在傳統(tǒng)方法中，從細(xì)胞濃縮到核酸純化需要許多步驟，每個(gè)步驟都需要小室，并且需要許多閥和泵。因此，所述方法不能在單個(gè)小室中進(jìn)行。圖1示例根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在單個(gè)小室中濃縮并破裂細(xì)胞，并由此純化核酸的方法。參見圖1，用具有疏水特性的金屬氧化物對柱狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表面處理，并因此濃縮細(xì)胞。隨后，通過吸收具有激光波長的光，向柱狀結(jié)構(gòu)施加細(xì)胞裂解增強(qiáng)層以裂解濃縮的細(xì)胞。用沖洗緩沖液和洗脫緩沖液處理裂解的細(xì)胞以進(jìn)行核酸純化。上述所有過程均在單個(gè)小室中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，使金屬氧化物沉積在固體支持物上，然后向固體支持物添加含細(xì)胞或含病毒的溶液，由此細(xì)胞或病毒結(jié)合到所述固體支持物。然后，向結(jié)合的細(xì)胞或病毒照射激光束，由此破裂結(jié)合到固體支持物的細(xì)胞或病毒，且通過細(xì)胞或病毒的破裂而釋放的核酸結(jié)合到固體支持物。隨后，用沖洗緩沖液沖洗未結(jié)合到固體支持物的雜質(zhì)如細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)。然后通過添加核酸洗脫緩沖液洗脫結(jié)合到固體支持物的核酸。最后，洗脫的核酸可用于隨后的進(jìn)程。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，通過首先沉積增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物，然后沉積在其上可以結(jié)合細(xì)胞的金屬氧化物，完成金屬氧化物在固體支持物上的沉積。增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物是具有下述層的材料，所述層能夠通過照射激光束而增強(qiáng)細(xì)胞裂解，行使與磁珠實(shí)施細(xì)胞裂解類似的功能，其可以是金屬氧化物如Fe203。其中可以結(jié)合細(xì)胞的金屬氧化物具有結(jié)合細(xì)胞的傾向，該金屬氧化物可以是A1203。其中可以結(jié)合細(xì)胞的金屬氧化物也應(yīng)當(dāng)是透明的，以使激光束可以透過，然后到達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物，并且能夠與由激光束破裂的細(xì)胞或病毒的核酸結(jié)合。圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的固體支持物即具有柱狀結(jié)構(gòu)的芯片的視圖，其中，金屬氧化物沉積于固體支持物上；在圖2中，F(xiàn)e203用作增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物，Al203用作可以結(jié)合細(xì)胞的金屬氧化物。Fe203吸收具有808nm波長的激光束，因此增強(qiáng)細(xì)胞裂解。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物，或者增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物可以是但不限于A1203、Ti02、Ta203、Fe203、Fe304、或HfG2。優(yōu)選結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物是A1203,增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物是Fe203。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，固體支持物可以是玻璃載片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜(membrane)、金屬板，等等，但不限于這些。所述固體支持物可以是其上能夠沉積金屬氧化物的任何不溶于水的支持材料。當(dāng)固體支持物可溶于水時(shí)，核酸純化后很難從固體支持物分離核酸溶液。此外，希望所用的固體支持物具有大的表面積，因?yàn)榭梢栽谄渖铣练e更多的金屬氧化物。因此，對于平面支持材料如玻璃或薄片，對平面支持材料進(jìn)行表面處理使其具有柱狀(pillar)結(jié)構(gòu)以增加其表面積。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，含細(xì)胞或含病毒的溶液可以具有3-10的pH。當(dāng)含細(xì)胞或含病毒溶液的pH超出該范圍時(shí)，結(jié)合于固體支持物的細(xì)胞或核酸的結(jié)合效率下降，DNA可能物理和化學(xué)變性，其中固體支持物上沉積有結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物。因此，可能影響隨后的進(jìn)程。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，沖洗緩沖液可以具有3-10的pH。當(dāng)沖洗緩沖液的pH超出該范圍時(shí)，核酸結(jié)合于固體支持物的結(jié)合效率下降，DNA可能物理和化學(xué)變性，其中金屬氧化物沉積于固體支持物上。因此，可能影響隨后的進(jìn)程。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，含細(xì)胞或含病毒的溶液、沖洗緩沖液和核酸洗脫緩沖液可以是磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、硫酸鹽等，但不限于這些。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，含細(xì)胞或含病毒溶液的濃度可以在10-1,000mM范圍內(nèi)。當(dāng)含細(xì)胞或含病毒溶液的濃度小于10mM時(shí)，結(jié)合于固體支持物的細(xì)胞或病毒的結(jié)合效率下降，其中在固體支持物上沉積有結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物。當(dāng)含細(xì)胞或含病毒溶液的濃度大于1,000mM時(shí)，4艮難制備溶液。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，沖洗緩沖液的濃度可以為10-l，000mM。當(dāng)沖洗緩沖液的濃度小于10mM時(shí)，雜質(zhì)例如細(xì)胞碎片或蛋白質(zhì)的沖洗效率下降。當(dāng)沖洗緩沖液的濃度大于1,000mM時(shí)，很難制備溶液0在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，核酸洗脫緩沖液可以具有8-10的pH。當(dāng)核酸洗脫緩沖液的pH小于8時(shí)，核酸的洗脫效率下降。當(dāng)核酸洗脫緩沖液的pH大于10時(shí)，可能影響隨后的進(jìn)程。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，核酸洗脫緩沖液的濃度可以為10-100mM。當(dāng)核酸洗脫緩沖液的濃度超出該范圍時(shí)，結(jié)合于固體支持物的核酸的洗脫效率下降，也可能影響隨后的進(jìn)程，其中在固體支持物上沉積有金屬氧化物。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，可以通過物理氣相沉積(PVD)、原子層沉積(ALD)、溶膠-凝膠法等等沉積金屬氧化物。通常，可以用已知的技術(shù)例如PVD、ALD、溶膠-凝膠法等等將金屬氧化物沉積在固體支持物上。PVD是用于形成薄膜的方法，最近作為表面固化(surfacecuring)的手段而倍受喜愛，因?yàn)楸∧た梢酝ㄟ^低溫處理相對簡單地獲得，而不能用其它方法實(shí)施。PVD方法的例子包括不使用離子的蒸發(fā)沉積法、使用離子的濺射法、離子電鍍法、離子植入法、離子束混合法等等。近來，離子電鍍法、離子植入法、離子束混合法等等的使用受到歡迎，因?yàn)榭梢栽诘蜏叵掠行У厥褂秒x子能量形成優(yōu)異的薄膜。在真空中加熱時(shí)金屬將蒸發(fā)，將這個(gè)原理應(yīng)用在蒸發(fā)沉積法中。該方法在小于10-STorr的高真空條件下進(jìn)行，使用金屬或多種化合物中的一種作為覆層材料。該方法應(yīng)用于光學(xué)元件如透鏡、鏡子等、各種各樣的電氣元件和塑料元件中，但僅僅用于表面固化。當(dāng)高能粒子與目標(biāo)材料碰撞時(shí)，原子或分子從目標(biāo)材料彈射出來，這個(gè)現(xiàn)象稱為濺射。在濺射中，目標(biāo)材料和基底分別形成陽極和陰極，然后在氬氣氛中將約10々Torr的高壓施加在陽極和陰極之間，結(jié)果，陽極周圍的氬氣電離為Ar+，然后Ar+與陽極碰撞。通過離子轟擊彈射出來的分子或原子結(jié)合于基底即陰極，形成薄膜。濺射的例子包括DC濺射、RF濺射、偏置濺射(biassputtering)、磁控濺射等等，并且特別地，》茲控濺射為高速濺射方法，在多個(gè)領(lǐng)域均受到偏愛。通過PVD離子電鍍法，可以獲得具有最佳粘著力和微米(閛)以上厚度的硬膜，這樣該方法也可應(yīng)用于例如工具或模型(mold)等領(lǐng)域。在ALD方法中，利用化學(xué)粘附特性將分子吸收到薄片表面中然后取代。由于吸收和取代是交替進(jìn)行的，因而一層層的超細(xì)層沉積是可能的，氧化物和金屬薄膜可以盡可能薄地堆疊。同時(shí)，與利用化學(xué)氣相淀積(CVD)法相比，可以在更低溫度(小于500。C)下形成良好的薄膜，因此ALD法適合于芯片系統(tǒng)(System-on-Chip,SoC)的制造。在溶膠-凝膠法中，通過金屬卣化物或醇鹽的水解反應(yīng)制備具有膠體形式的金屬氧化物。溶膠-凝膠法是制備二氧化鈦(Ti02)涂層溶液的代表性方法。所制備的二氧化鈦的物理特性如顆粒大小、晶體特性等受所使用的醇鹽種類、反應(yīng)條件(溫度、pH、反應(yīng)物之間的摩爾比)等的影響。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，細(xì)胞或病毒結(jié)合于固體支持物的工藝和核酸洗脫工藝可以在靜態(tài)或流體條件下進(jìn)行?？梢栽陟o態(tài)條件下，也可以在流體條件下將細(xì)胞或病毒與固體支持物接觸。也就是說，通過在流體控制系統(tǒng)中使含細(xì)胞或病毒的溶液流動而將細(xì)胞或病毒與固體支持物接觸。在流體控制系統(tǒng)中，固體支持物可以具有平面形式，但也可以具有與更多的細(xì)胞或病毒結(jié)合的柱狀結(jié)構(gòu)，此柱狀結(jié)構(gòu)增加了固體支持物與細(xì)胞或病毒接觸的4幾會。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，可以額外包括從固體支持物洗脫核酸，然后檢測洗脫的核酸的工藝。可以用電泳法、核苷酸測序、限制酶分析等檢測洗脫的核酸。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，可以額外包括從固體支持物洗脫核酸，然后擴(kuò)增洗脫的核酸的工藝。當(dāng)洗脫的核酸的量太少而不可能直接檢測時(shí)，用PCR法擴(kuò)增洗脫的核酸，以使核酸可以很容易檢測。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，核酸擴(kuò)增工藝可以無需去除核酸洗脫緩沖液而進(jìn)行。核酸洗脫緩沖液具有非常類似于用于核酸擴(kuò)增的緩沖液的組成，因此在洗脫緩沖液中洗脫的核酸可以直接擴(kuò)增而無需去除洗脫緩沖液。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，激光可以是脈沖激光或連續(xù)波激光。脈沖激光應(yīng)當(dāng)具有大于1mJ/脈沖的輸出，連續(xù)波激光應(yīng)當(dāng)具有大于10mW的輸出。優(yōu)選脈沖激光的輸出大于3mJ/脈沖，連續(xù)波激光的輸出大于100mW。當(dāng)脈沖激光的輸出小于lmJ/脈沖和連續(xù)波激光的輸出小于10mW時(shí)，激光不能傳輸足夠的能量以破裂細(xì)胞，這可能是個(gè)問題。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的方法中，可以產(chǎn)生大于400nm波長范圍內(nèi)的激光，優(yōu)選在750nm-l，300nm范圍內(nèi)。當(dāng)激光具有小于400nm的波長范圍時(shí)，DNA可能變性或被破壞，同時(shí)也可以產(chǎn)生至少一種波長范圍內(nèi)的激光，即激光可以具有上述波長范圍內(nèi)的一種波長，也可以具有超過兩種的不同波長。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了以下芯片，其中增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前的實(shí)施方案，設(shè)置所述芯片以在所述芯片中實(shí)施細(xì)胞或病毒裂解和核酸純化工藝。在所述芯片中，首先沉積增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物，其中通過照射激光束來增強(qiáng)細(xì)胞裂解，然后沉積可以與細(xì)胞或病毒和核酸結(jié)合的金屬氧化物。因此，在單個(gè)芯片中，細(xì)胞或病毒被裂解，隨后可以從所裂解的細(xì)胞或病毒純化核酸。所述固體支持物優(yōu)選可以具有大的表面積以便更多的金屬氧化物沉積在其上。對于平面支持物如玻璃或薄片，可以處理其表面使之具有柱狀結(jié)構(gòu)以增加表面積。因此，固體支持物可以具有平面或柱狀結(jié)構(gòu)。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的芯片中，能夠與細(xì)胞或病毒和核酸結(jié)合的金屬氧化物或增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物可以是A1203、Ti02、Ta203、Fe203、Fe304、或Hf02等等，但不限于這些。優(yōu)選能夠與細(xì)胞或病毒和核酸結(jié)合的金屬氧化物是A1203，且增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物是Fe203。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，破裂細(xì)胞并純化核酸的裝置包括包含芯片的單個(gè)小室，在所述芯片中，增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物，和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上；還包括產(chǎn)生激光的部件。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于破裂細(xì)胞和純化核酸的裝置包括與細(xì)胞或病毒和核酸結(jié)合并洗脫核酸的芯片，以及提供激光以破裂結(jié)合于芯片的細(xì)胞或病毒的產(chǎn)生激光的部件。在所述裝置中，破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸在單個(gè)小室中進(jìn)行。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的裝置中，固體支持物可以是玻璃載片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜、金屬板，等等，但不限于這些。所述固體支持物可以是其上能夠沉積金屬氧化物的任何材料，但應(yīng)當(dāng)是不溶于水的。當(dāng)所述固體支持物可溶于水時(shí)，在核酸純化后4艮難從核酸溶液分離固體支持物。同時(shí)，固體支持物可以具有大的表面積以便能夠在其上沉積大量的金屬氧化物。對于平面支持材料如玻璃或薄片，可以將其表面處理為具有柱狀結(jié)構(gòu)以增加表面積。因此，固體支持物可以具有平面或柱狀結(jié)構(gòu)。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的裝置中，能夠與細(xì)胞或病毒和核酸結(jié)合的金屬氧化物或增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物可以是但不限于A1203、Ti02、Ta203、Fe203、Fe304、或Hf02等。優(yōu)選能夠與細(xì)胞或病毒和核酸結(jié)合的金屬氧化物是Ab03,且增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物是Fe203。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的裝置中，激光可以是脈沖激光或連續(xù)波激光。脈沖激光應(yīng)當(dāng)具有大于1mJ/脈沖的輸出，連續(xù)波激光應(yīng)當(dāng)具有大于10mW的輸出。優(yōu)選脈沖激光的輸出大于3mJ/脈沖，連續(xù)波激光的輸出大于100mW。當(dāng)脈沖激光的輸出小于lmJ/脈沖和連續(xù)波激光的輸出小于10mW時(shí)，激光不能傳輸足夠的能量以破裂細(xì)胞，這可能是個(gè)問題。在才艮據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的裝置中，可以產(chǎn)生大于400nm波長范圍內(nèi)的激光，優(yōu)選在750nm-l，300nm范圍內(nèi)。當(dāng)激光在小于400nm的波長范圍時(shí)，DNA可能變性或祐7皮壞，同時(shí)也可以產(chǎn)生至少一種波長范圍內(nèi)的激光，即激光可以具有上述波長范圍內(nèi)的一種波長，也可以具有超過兩種的不同波長。以下將參考下述的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅僅用于說明性目的，而不意味著限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例i:其上沉積金屬氣化物的芯片的制造通過等離子體輔助沉積(PAD)的PVD法并通過ALD制造其上沉積金屬氧化物的芯片。首先通過光刻^t術(shù)和干蝕刻形成柱狀物?，F(xiàn)在詳細(xì)描述這些方法。采用旋涂法以4000RPM用正性光刻膠(型號AZ1512)涂覆4-英寸薄片40秒，然后95。C烘烤1.5分鐘。在光刻機(jī)(aligner)(型號EV620)中，向正性光刻膠涂覆的薄片照射I-line紫外光(波長365nm)4.5秒，然后用顯影劑(型號AZMIF300)去除暴露于紫外光的正性光刻膠，形成柱狀樣式(pillarpattem)。用干蝕刻器(型號ICP-STS)將所獲得的具有柱狀樣式的薄片干蝕刻至IOO炯的深度，最終形成長方體柱狀物，每個(gè)長方體柱狀物具有25泖x25炯x100y"m(寬x長x高)的尺寸。采用等離子體輔助沉積法(PAD,型號APS1104)將用作細(xì)胞裂解增強(qiáng)層的Fe2O3金屬氧化物在長方體柱狀物表面上沉積至300nm深度。隨后，用陽極結(jié)合裝置(anodicbindingapparatus)(型號TPS-1000)在370。C同時(shí)施加700V電壓的條件下，將具有1mm直徑小孔的玻璃板偶聯(lián)到具有所述柱狀物的芯片。然后用ALD裝置(原子層沉積，型號MOOHAN)在400。C下將用作細(xì)胞結(jié)合和基因結(jié)合層的金屬氧化物八1203在芯片上沉積至IOO埃米的深度，制成所述芯片。圖3A示例芯片的上部、中部和下部，在所述芯片上沉積有用作細(xì)胞裂解增強(qiáng)層的金屬氧化物，圖3B為在上述各個(gè)位置拍攝的所述芯片的一系列場致發(fā)射-掃描電子顯孩支鏡(FE-SEM)圖像。由圖3B可以看到，形成了直至柱狀物內(nèi)部的具有100，深度的Fe203沉積膜，因此認(rèn)為增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物的沉積是令人滿意的。實(shí)施例2:用芯片進(jìn)4亍細(xì)胞結(jié)合測定在流體控制系統(tǒng)中細(xì)胞是否結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片。首先，將用濾紙(孔徑6，，Whatman)過濾的唾液和大腸桿菌BL21(StratagenCat200133)細(xì)胞的混合物用作含細(xì)胞的樣品。用注射泵(HARVARD，PHD2000)將1:1的樣品(細(xì)胞濃度006()()=0.001)和結(jié)合緩沖液(100mM磷酸鹽緩沖液，pH4)的680^/混合物以400////min的流速注射到所述芯片，然后大腸桿菌細(xì)胞結(jié)合到所述芯片。圖4為一系列FE-SEM圖像，其顯示根據(jù)不同類型芯片的大腸桿菌細(xì)胞的結(jié)合效率。圖4中，F(xiàn)e2(VAl203芯片使用Fe203作為增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物，使用Al203作為能夠與細(xì)胞結(jié)合的金屬氧化物。圖4中，八1203芯片只使用八1203作為金屬氧化物，對照使用Fe2(VAl203芯片，不含大腸桿菌細(xì)胞的結(jié)合緩沖液由其中通過。在所述芯片中，使用平板培養(yǎng)法分析大腸桿菌的結(jié)合效率，即通過將通過芯片之前和之后的溶液在包含大腸桿菌生長培養(yǎng)基的petri培養(yǎng)皿中平板接種(plating)來測定結(jié)合效率。用LIVE/DEADBacLightTM細(xì)菌生存力試劑盒(Molecularprobe制造)測定細(xì)胞是否結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明的芯片。用包括于LIVE/DEADBacLightW細(xì)菌生存力試劑盒中的Cyto⑧9核酸染料將活細(xì)胞染成綠色，用PI(碘化丙錠)染料將死亡細(xì)胞染成紅色。由圖4可以看到，在Cyto9/PI染色情況下，活的大腸桿菌與Fe203/Al203芯片和Al203芯片結(jié)合，因此顯示所期望的綠色圖像，而由于不存在細(xì)胞因而對照芯片不顯示綠色圖像。同樣，大腸桿菌與Fe203/Al203芯片和A1203芯片的結(jié)合效率約為80%，因此認(rèn)為大腸桿菌有效地結(jié)合于所述芯片。實(shí)施例3:用芯片裂解細(xì)胞通過向結(jié)合于實(shí)施例2所述芯片的細(xì)胞照射激光束來進(jìn)行細(xì)胞裂解測試。向Fe203/Al203芯片、A1203芯片和對照芯片照射2W激光束40秒以裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解后，用LIVE/DEADBacLightTM細(xì)菌生存力試劑盒進(jìn)行染色。圖5為FE-SEM圖像，其顯示根據(jù)不同類型芯片的大腸桿菌細(xì)胞裂解。由圖5可以看到，與八1203芯片的紅色相比，F(xiàn)e2(VAl203芯片具有更高的紅色強(qiáng)度，由于不存在細(xì)胞，因而對照芯片不顯示紅色圖像。因此，可以看到能夠有效地裂解結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片的細(xì)胞，同時(shí)，與不使用增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物(本實(shí)施例中為Fe203)相比，當(dāng)使用增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物(本實(shí)施例中為Fez03)時(shí)可以更為有效地進(jìn)行細(xì)胞裂解。實(shí)施例4:用芯片純化核酸實(shí)施了純化核酸的試驗(yàn)，所述核酸由實(shí)施例3中裂解的細(xì)胞所釋放。為了去除雜質(zhì)，用注射泵(HARVARD，PHD2000)以100//〃min的流速向芯片注射沖洗緩沖液(10mM磷酸鹽緩沖液，pH4),所述雜質(zhì)不包括由激光輻照裂解的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的大腸桿菌基因組DNA。隨后，為了洗脫沖洗過的核酸，用注射泵(HARVARD，PHD2000)以1000/J/min的流速向芯片注射核酸洗脫緩沖液(50mMNa2S04，pH10)。圖6是顯示依據(jù)沖洗緩沖液和核酸洗脫緩沖液的大腸桿菌基因組DNA(gDNA)洗脫效率的圖表。圖6中，Wl和W2分別表示沖洗緩沖液的25^/級分，El至E6分別表示核酸洗脫緩沖液的25/z/級分。同樣，洗脫效率指各個(gè)級分的大腸桿菌基因組DNA相對于大腸桿菌基因組DNA全部洗脫量的洗脫量。由圖6可以看到，就Fe2(VAl203芯片和Al203芯片來說，在沖洗緩沖液中大腸桿菌基因組DNA幾乎不被洗脫，而在核酸洗脫緩沖液中大多數(shù)大腸桿菌基因組DNAs被洗脫。因此，可以看到，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的方法時(shí)，在單個(gè)小室中裂解細(xì)胞后可以有效地純化核酸。實(shí)施例5:用芯片富集細(xì)胞用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片測定細(xì)胞富集的效果。使用根據(jù)實(shí)施例4從大腸桿菌純化大腸桿菌基因組DNA的方法，量化相對于輸入的大腸桿菌濃度的純化的大腸桿菌基因組DNAs。實(shí)施測定細(xì)胞富集的方法以便在Eppendorf試管中根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞濃度通過激光裂解大腸桿菌，然后用picogreen定量DNA。基于此，繪制了裂解后洗脫的DNA相對于細(xì)胞濃度的定量曲線，然后將從根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片得到的洗脫DNA的量轉(zhuǎn)換為細(xì)胞濃度以計(jì)算富集效率。圖7為洗脫DNA相對于輸入的大腸桿菌細(xì)胞濃度的定量曲線圖。由圖7可以看到，輸入的大腸桿菌細(xì)胞濃度幾乎與洗脫的大腸桿菌基因組DNA的量成正比。用圖7的定量曲線將大腸桿菌基因組DNA轉(zhuǎn)換為細(xì)胞濃度，結(jié)果如表1所示，其中所述大腸桿菌基因組DNA用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片純化。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表l可以看到，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片時(shí)，大腸桿菌細(xì)胞被富集高達(dá)14倍至16倍。因此，當(dāng)由具有非常低的細(xì)胞濃度的試樣檢測核酸時(shí)，可以有效地使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的方法。實(shí)施例6:用芯片純化的核酸的PCR擴(kuò)增用才艮據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片純化的核酸實(shí)施PCR。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)條件下實(shí)施PCR。用根據(jù)實(shí)施例4的從大腸桿菌細(xì)胞純化大腸桿菌基因組DNA的方法測定了相對于輸入大腸桿菌細(xì)胞濃度的純化的大腸桿菌基因組DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施測定細(xì)胞富集的方法以便在Eppendorf試管中才艮據(jù)大腸桿菌細(xì)胞濃度由激光裂解大腸桿菌細(xì)胞，然后PCR擴(kuò)增大腸桿菌基因組DNA并用Labship定量?；诖?，繪制了裂解后PCR產(chǎn)物相對于細(xì)胞濃度的定量曲線，然后將PCR產(chǎn)物的量轉(zhuǎn)換為細(xì)胞濃度以計(jì)算富集效率。圖8為PCR產(chǎn)物相對于輸入大腸桿菌細(xì)胞濃度的定量曲線圖。由圖8可以看到，輸入的大腸桿菌的細(xì)胞濃度幾乎與PCR產(chǎn)物的量成正比。用圖8的定量曲線將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)換為細(xì)胞濃度，所述PCR產(chǎn)物使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片，結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表2可以看到，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的芯片時(shí)，大腸桿菌細(xì)胞被濃縮高達(dá)3倍至5倍。上述結(jié)果顯示了與表l細(xì)胞富集結(jié)果的差異，但認(rèn)為這是量化DNA的方法的差異。根據(jù)本發(fā)明，通過開發(fā)可以在單個(gè)小室中進(jìn)行細(xì)胞富集、細(xì)胞裂解和核酸純化的芯片，可以實(shí)現(xiàn)芯片實(shí)驗(yàn)室的集成化，所述三個(gè)工藝可以在一個(gè)芯片中進(jìn)行，因此可以減少制造芯片的成本。雖然已經(jīng)詳細(xì)地展示了本發(fā)明并參考其示例性實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會了解，在不脫離權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以做出多種形式上和細(xì)節(jié)上的改變。權(quán)利要求1.在一個(gè)芯片中破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸的方法，所述方法包括向芯片照射激光束，在所述芯片中，增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上。2.用單個(gè)小室破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸的方法，所述方法包括將增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上；將含細(xì)胞或含病毒的溶液加到固體支持物上，以用結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的沉積的金屬氧化物結(jié)合細(xì)胞或病毒，其中增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物沉積在所述固體支持物上；通過照射激光束破裂結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的細(xì)胞或病毒，以用結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物結(jié)合核酸；用沖洗緩沖液沖洗未結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的試樣；以及通過添加核酸洗脫緩沖液洗脫結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物的核酸。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物選自A1203、Ti02、Ta203、Fe203、Fe304和Hf02。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物是Fe203,所述結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物是A1203。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述固體支持物選自玻璃載片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜和金屬板。6.權(quán)利要求2的方法，其中含細(xì)胞或含病毒的溶液和沖洗緩沖液具有3-10的pH。7.權(quán)利要求2的方法，其中所述含細(xì)胞或含病毒的溶液、沖洗緩沖液和核酸洗脫緩沖液選自磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽和Tris。8.權(quán)利要求2的方法，其中所述含細(xì)胞或含病毒的溶液和沖洗緩沖液具有10-1,000mM的濃度。9.權(quán)利要求2的方法，其中核酸洗脫緩沖液具有8-10的pH。10.權(quán)利要求2的方法，其中核酸洗脫緩沖液具有10-100mM的濃度。11.權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括從固體支持物洗脫核酸后，檢測或擴(kuò)增洗脫的核酸。12.權(quán)利要求11的方法，其中核酸的擴(kuò)增在不去除核酸洗脫緩沖液的情況下進(jìn)行。13.權(quán)利要求2的方法，其中所述激光是脈沖激光或連續(xù)波激光。14.權(quán)利要求13的方法，其中脈沖激光具有超過lmJ/脈沖的輸出，且連續(xù)波激光具有超過10mW的輸出。15.芯片，其中增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上。16.權(quán)利要求15的芯片，其中所述固體支持物具有平面或柱狀結(jié)構(gòu)。17.權(quán)利要求15的芯片，其中所述增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物選自A1203、Ti02、Ta203、Fe203、Fe304和Hf02。18.權(quán)利要求17的芯片，其中所述增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物是Fe203,所述結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物是A1203。19.用單個(gè)小室破裂細(xì)胞并純化核酸的裝置，所述裝置包括芯片，其中增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上；和產(chǎn)生激光的部件。20.權(quán)利要求19的裝置，其中所述固體支持物具有平面或柱狀結(jié)構(gòu)。21.權(quán)利要求19的裝置，其中所述增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物選自A1203、Ti02、Ta203、Fe203、Fe304和HfG2。22.權(quán)利要求20的裝置，其中所述增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物是Fe203,所述結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物是A1203。23.權(quán)利要求19的裝置，其中所述激光是脈沖激光或連續(xù)波激光。24.權(quán)利要求23的裝置，其中脈沖激光具有大于1mJ/脈沖的輸出，連續(xù)波激光具有大于10mW的輸出。全文摘要提供了在單一芯片中破裂細(xì)胞或病毒并純化核酸的方法，該方法包括向芯片照射激光束，在芯片中，增強(qiáng)細(xì)胞裂解的金屬氧化物、和結(jié)合細(xì)胞或病毒和核酸的金屬氧化物順序沉積在固體支持物上。通過開發(fā)可以在單個(gè)小室中進(jìn)行細(xì)胞富集、細(xì)胞裂解、和核酸純化的芯片，可以實(shí)現(xiàn)芯片實(shí)驗(yàn)室的集成化，所述三個(gè)工藝可以在一個(gè)芯片中進(jìn)行，因此可以減少制造芯片的成本。文檔編號C12N15/10GK101191128SQ20061016363公開日2008年6月4日申請日期2006年12月1日優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日發(fā)明者劉在鎬,劉昌恩,李仁鎬,李廷健,金榮錄,閔畯泓,韓基雄申請人:三星電子株式會社