專利名稱：一種提高植物抗逆性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高植物抗逆性的方法。
背景技術(shù)：
土壤的鹽堿化問題已經(jīng)影響到世界上的100多個(gè)國家，是限制所有半干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界的鹽土約占陸地面積的1/4到1/3，全世界大約有20％的可耕地受到鹽漬化的影響。在我國從濱海到內(nèi)陸，從低地到高原都分布著不同類型的鹽堿土壤。鹽堿土不僅在世界上其它國家，而且在我國也是一個(gè)重要的土地資源。我國鹽堿土的總面積約有5億多畝，其中已開墾的有1億多畝，還有3億多畝鹽荒地(約占80％)等待開發(fā)利用。由于氣候條件和人類不合理耕作方式的影響，土壤鹽堿化的程度和面積且還有逐年增加的趨勢(shì)。我國約有1億多畝這種次生鹽堿地，約占耕地總面積的10％。國內(nèi)外對(duì)鹽漬土地的改良和利用已經(jīng)展開了廣泛的研究，并投入了大量的人力、物力和財(cái)力。過去多利用工程措施進(jìn)行改良，雖取得一定成績，但這些措施中存在一些不可克服的缺點(diǎn)，如費(fèi)用昂貴、效果不能持久等。淡水排鹽還會(huì)排走土壤中的其他養(yǎng)分，可謂得不償失。而且我國淡水資源也不足，因此這個(gè)方法的應(yīng)用受到很大限制。改良鹽堿地的困難使得研究人員開始從另外的角度進(jìn)行嘗試，即對(duì)植物本身進(jìn)行耐鹽堿改造，以提高現(xiàn)有植物的耐鹽性。
植物在鹽脅迫下常常會(huì)合成和積累一些高濃度的平衡滲透物質(zhì)，用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)，以緩解大量鹽離子而引起的滲透壓力。這些滲透物質(zhì)具有分子量小、水溶性好；生理pH范圍內(nèi)呈電中性；不改變酶結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)。這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括氨基酸、多元醇和糖三大類。其中較重要、研究最多的是脯氨酸和甜菜堿。
甜菜堿是目前研究較為深入、廣泛存在于許多高等植物、動(dòng)物和細(xì)菌中的一種細(xì)胞質(zhì)相溶性物質(zhì)，以往的研究表明甜菜堿主要參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用，保持細(xì)胞與外界環(huán)境的滲透平衡；同時(shí)還有穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的作用。一些重要的植物如番茄、煙草和擬南芥并不積累甜菜堿，而甜菜堿的合成途經(jīng)又相對(duì)簡單，這自然讓人們考慮到把甜菜堿合成途經(jīng)中的關(guān)鍵基因?qū)胍恍┎环e累甜菜堿的植物中，使得這些植物也積累甜菜堿，以提高其抗逆性。
近幾年，植物耐鹽生物技術(shù)研究取得了可喜進(jìn)展，特別是通過低分子量無毒有機(jī)溶質(zhì)及滲透保護(hù)性蛋白等在轉(zhuǎn)基因植物中的超量表達(dá)和積累，賦予了轉(zhuǎn)基因植物一定的耐鹽性。一般認(rèn)為，植物耐鹽性是受多基因控制的復(fù)合遺傳性狀，依賴于多個(gè)基因之間的相互作用，是多種耐鹽生理性狀的綜合體現(xiàn)。因此，只是將單個(gè)基因?qū)胫参铽@得的抗逆性還是遠(yuǎn)不能達(dá)到滿意的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高植物抗逆性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物抗逆性的方法，是將SeNHX1的編碼基因和BADH的編碼基因通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到抗逆性提高的植物。
所述方法中，所述SeNHX1基因的編碼序列是具有自GENBANK號(hào)為AY131235的5′端第5′端第492-2174位的核苷酸序列；所述BADH基因的編碼序列是具有自GENBANK號(hào)為X69770的5′端第4-1512位的核苷酸序列。
所述SeNHX1基因可通過表達(dá)載體pBI121-Se導(dǎo)入植物中。所述BADH基因可通過表達(dá)載體pBin438導(dǎo)入植物中。所述SeNHX1的編碼基因和BADH的編碼基因可通過雙價(jià)表達(dá)載體pBinBS共同轉(zhuǎn)入植物中。
所述抗逆性為抗鹽性和/或抗氧化性。
本發(fā)明的方法既可提高單子葉植物，也可提高雙子葉植物的抗逆性，如煙草、番茄、水稻、小麥、玉米、黃瓜、楊樹、草坪草或苜宿等。攜帶有SeNHX1的編碼基因和/或BADH的編碼基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培育成植株，獲得抗逆性提高的植株。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法獲得的含有SeNHX1的編碼基因和BADH的編碼基因的轉(zhuǎn)基因煙草，在逆境條件下，均比野生型煙草具有較強(qiáng)的抗逆性，表現(xiàn)為具有較強(qiáng)的抗鹽性和抗氧化性。SeNHX1和BADH功能在轉(zhuǎn)SeNHX1基因和BADH基因煙草中有了較大的累加效應(yīng)，而且其后代中SeNHX1和BADH可以穩(wěn)定的連鎖遺傳。
本發(fā)明方法獲得的含有SeNHX1的編碼基因和BADH的編碼基因的轉(zhuǎn)基因煙草，不但抗逆性增強(qiáng)，而且在逆境(特別是在鹽和/或氧化脅迫)下的單株產(chǎn)量也比野生型植株明顯提高。


圖1為含有BADH的pBin438質(zhì)粒圖譜圖2為含有SeNHX1的pBI121-Se質(zhì)粒圖譜。
圖3為雙價(jià)表達(dá)載體pBinBS的構(gòu)建流程示意4為Xho I酶切鑒定pRTL2-Se電泳5為HindIII酶切鑒定pRTL2-Se的電泳6為質(zhì)粒pBinBS的PCR鑒定結(jié)果圖7為轉(zhuǎn)BADH基因T0代煙草的Southern雜交鑒定結(jié)果圖8為轉(zhuǎn)BADH基因T0代煙草的Northern雜交鑒定結(jié)果圖9為轉(zhuǎn)SeNHX1基因T0代煙草的Southern雜交鑒定結(jié)果圖10為轉(zhuǎn)SeNHX1基因T0代煙草的Northern雜交鑒定結(jié)果圖11為轉(zhuǎn)BADH和SeNHX1基因T0代煙草的Southern雜交鑒定結(jié)果圖12為轉(zhuǎn)BADH和SeNHX1基因T0代煙草的Northern雜交鑒定結(jié)果圖13為轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草T0代株系煙草葉盤百草枯(MV)處理24后的照片圖14為轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草T0代株系煙草葉盤在10μM百草枯處理16h的電導(dǎo)率變化圖15為轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草T0代株系煙草葉盤在20μM百草枯處理16h的電導(dǎo)率變化圖16為轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草T0代株系在200mM NaCl脅迫下超氧化物歧化酶(SOD)活性變化。
圖17為轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草T0代株系在200mM NaCl脅迫下谷胱甘肽還原酶(GR)活性變化。
圖18為轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草T0代株系在200mM NaCl脅迫下過氧化氫酶(CAT)活性變化。
圖19為轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草T1代種子對(duì)卡那霉素抗性鑒定圖20為轉(zhuǎn)SeNHX1基因和轉(zhuǎn)BADH基因T1代植株P(guān)CR檢測(cè)圖21為SeNHX1和BADH基因共轉(zhuǎn)化T1代植株P(guān)CR檢測(cè)圖22為T1代轉(zhuǎn)BADH和SeNHX1雙基因煙草種子BS15在200mM培養(yǎng)基上播種3周的情況圖23為T1代煙草BS23在200mM甘露醇脅迫1周后的生長情況具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、轉(zhuǎn)SeNHX1和/或BADH植物的獲得及其功能驗(yàn)證抗生素Timentin的商品名為“特美汀”(注射用替卡西林鈉-克拉維酸鉀)，制造商SmithKline Beecham Pharmaceuticals，UK，購自北京大學(xué)第三附屬醫(yī)院。
一、轉(zhuǎn)基因用重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、含有山菠菜的甜菜堿合成關(guān)鍵基因BADH的重組載體的構(gòu)建提取山菠菜的總RNA，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(購自Takara公司)對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA作為模板，用引物15′TTACCAAGCTTATGGCGTTCCCAATTCCT 3′和引物25′TTACCGAGCTCTCAAGGAGACTTGTACCA 3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50μl，含10mmol/LTri-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L Mg2Cl，200μmmol/L的各種dNTP，每種引物25pmol，200-500ng的cDNA，以及1.25U的Taq聚合酶，擴(kuò)增條件是預(yù)變性95℃，10min后進(jìn)入93.5℃，1min，55℃，1min，72℃，1.5min的30個(gè)循環(huán)，之后于72℃保溫10min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳，回收目的基因片段，經(jīng)測(cè)序表明該片段具有自EMBL號(hào)為X69770的5′端第1位至第1513的核苷酸序列，為BADH基因的序列。將該P(yáng)CR獲得的BADH基因片段，進(jìn)行HindIII和SacI雙酶切。將此片段插入pUC19(購自鑫佑公司)HindIII和SacI酶切位點(diǎn)之間，將經(jīng)測(cè)序表明含有BADH基因的編碼序列的重組pUC19載體命名為pUC19B。將pUC19B再用BamI和KpnI酶切，得到含有目的基因BADH的片段，將此片段插入pBin19(購自Clonetech公司)的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)之間，進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，將經(jīng)測(cè)序表明含有BADH的重組表達(dá)載體命名為pBin438。BADH基因在EMBL數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)是X69770；BADH基因的序列是具有自EMBL登陸號(hào)為X69770的5′端第1位至第1513的核苷酸序列。
2、含有鹽角草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(anitiporter)基因SeNHX1重組載體的構(gòu)建提取鹽角草地上部分的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA作為模板，通過加入帶有Xba I酶切位點(diǎn)的引物(引物35′GAGTCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC 3′和引物45′TCTTCTAGACTGCCTAACTGCCTCGGATT 3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50μl分別為10×buffer，5μl；10×dNTP(2.5mmol/L each)，5μl；引物3和引物4(10pmol/μl)各5μl；Taq聚合酶(1U/μl)，3μl；cDNA模板5μl；雙蒸水22μl，擴(kuò)增體系為95℃預(yù)變性4min；95℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min；35個(gè)循環(huán)，最后是72℃，10min。擴(kuò)增得到的片段經(jīng)測(cè)序表明具有自GENBANK號(hào)為AY131235的5′端第298至2201位核苷酸序列，此序列含有SeNHX1的完整表達(dá)框。將上述擴(kuò)增的片段用Xba I酶切后，插入到pBI121(購自Clonetech公司)的XbaI酶識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)測(cè)序后，將測(cè)序檢測(cè)表明含有SeNHX1的完整表達(dá)框的重組載體命名為pBI121-Se(圖2)。
3、含有BADH和SeNHX1雙價(jià)表達(dá)載體pBinBS的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖如圖3所示)用XbaI酶切質(zhì)粒pBI121-Se后回收1.9kb的目的基因條帶，用CIAP處理后與插入到pRTL2(購自Clonetech公司)的XbaI酶切位點(diǎn)。由于在連接過程中載體和目的基因片斷都進(jìn)行了相同的單酶切，連接容易出現(xiàn)正反向情況，為了挑出正向連接的克隆，用載體上的XhoI和目的基因上的XhoI進(jìn)行酶切鑒定。若是正向連接會(huì)切出486bp的片段，若是反向連接會(huì)切出1741bp的片段。將鑒定為正向插入的載體命名為pRTL2-Se，酶切結(jié)果如圖4所示，圖4中泳道1為pRTL2-Se質(zhì)粒；泳道2為pRTL2-Se Xho I酶切結(jié)果，泳道3為Maker D2000(購自Takara公司)。
將pRTL2-Se用HindIII酶切后得到3342bp和2461bp的兩個(gè)片段，結(jié)果如圖5所示，圖5中泳道1為pRTL2-Se，泳道2為HindIII酶切后的pRTL2-Se，泳道3為Maker III(購自北京天為時(shí)代公司)(圖5中的箭頭為從電泳圖上面的第2條帶)。其中3342bp片段含有SeNHX1的編碼序列和其表達(dá)調(diào)控序列，回收此片段，與Hind III酶切的pBin438相連接。
挑選部分克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)連接得到的重組載體。
PCR擴(kuò)增的引物檢測(cè)SeNHX1的引物引物55’TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC3’，引物65’GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT3’；檢測(cè)BADH的引物引物75’AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC 3’，引物85’TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA 3’。
結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，引物5和引物6擴(kuò)增得到1904bp的SeNHX1全長cDNA，引物7和引物8擴(kuò)增得到1513bp的BADH全長cDNA，表明目的基因SeNHX1已經(jīng)連接到質(zhì)粒pBin438上。對(duì)檢測(cè)正確的克隆進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果表明基因SeNHX1讀碼框正確無誤，目的基因序列也是正確的，將鑒定正確的重組載體命名為pBinBS。圖6中泳道1-7分別為重組載體pBinBS克隆1-7 SeNHX1的PCR結(jié)果；泳道M為MakerIII(購自北京天為時(shí)代公司)；泳道8-14分別為重組載體pBinBS克隆1-7 BADH的PCR結(jié)果。
二、轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草的獲得及鑒定1、轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草的獲得將pBI121-Se、pBin438、pBinBS通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA 4404的介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草品種W38中。具體方法如下所述煙草無菌苗的制備煙草品種W38種子用70％乙醇浸泡30s，然后用10％次氯酸鈉(加兩滴Tween 20)消毒15min，期間不斷搖動(dòng)，隨后用無菌水沖洗3遍，接種于MS培養(yǎng)基上。置于培養(yǎng)間發(fā)芽(溫度26±2℃，濕度60-80％)，待種子發(fā)芽后，培養(yǎng)25-30天。
為了確定煙草W38野生型葉片在卡那霉素選擇培養(yǎng)基上的最低致死濃度，提高轉(zhuǎn)化效率，對(duì)W38的卡那霉素敏感性進(jìn)行了檢測(cè)，以確定其能夠耐受的臨界濃度。在4個(gè)含不同濃度卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上(50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L)，發(fā)現(xiàn)卡那霉素濃度為50mg/L時(shí)候，煙草葉盤的分化和生長幾乎不受到任何影響。在100mg/L的濃度時(shí)候受到一定的抑制，但大部分仍然能存活下來。而在150mg/L培養(yǎng)基上2周后，煙草葉盤外植體全部死亡。因此用含150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的篩選。
將pBI121-Se、pBin438和pBinBS分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA 4404中，分別得到含有pBI121-Se、pBin438和pBinBS的農(nóng)桿菌工程菌。取煙草品種W38無菌苗葉片作為轉(zhuǎn)化外植體，分別置于含有pBI121-Se、pBin438和pBinBS的農(nóng)桿菌工程菌液中，感染5-10min。取出葉片，置于無菌干燥Whatman濾紙上，吸干殘留菌液。將感染過的煙草葉片置于MS0培養(yǎng)基(不含任何激素的MS培養(yǎng)基)上，黑暗中共培養(yǎng)48h。將材料轉(zhuǎn)移至SIM培養(yǎng)基(含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、150mg/L卡那霉素(km)和150mg/L Timentin的MS培養(yǎng)基)中于25±2℃，每天光照12h。每2周換一次培養(yǎng)基。3-4周后有綠芽長出。待芽長到3-4cm時(shí)，將其切下移入SMS0培養(yǎng)基(含有150mg/L卡那霉素和150mg/L Timentin的MS培養(yǎng)基)中誘導(dǎo)生根，10天左右可看到幼根長出。待植株根系較發(fā)達(dá)后，于室溫將容器口敞開煉苗3-5天。之后取出植株，洗凈瓊脂，移栽于溫室或大田土壤中。即得到分別轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代轉(zhuǎn)基因植株。共得到轉(zhuǎn)BADH基因植株(轉(zhuǎn)pBin438植株)23株T0代轉(zhuǎn)基因植株；轉(zhuǎn)SeNHX1植株(轉(zhuǎn)pBI121-Se植株)11株T0代植株；BADH和SeNHX1共轉(zhuǎn)化植株(轉(zhuǎn)pBinBS植株)32株T0代轉(zhuǎn)基因植株。
2、轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草的T0代轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)1)的PCR檢測(cè)提取上述得到的轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代植株幼嫩葉片中的DNA，分別進(jìn)行下述的PCR檢測(cè)A、BADH基因的PCR擴(kuò)增分別以轉(zhuǎn)pBin438和pBinBS的T0代植株幼嫩葉片中的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)BADH cDNA，以野生型煙草W38為對(duì)照，檢測(cè)的引物為引物95′AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC 3′，引物105′TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA 3′。
反應(yīng)體系為共50μl，10×buffer 5μl，10×dNTP(2.5mmol/L each)5μl，引物9(10pmol/μl)5μl，引物10(10pmol/μl)5μl，模板DNA(0.1μg/μl)，5μl，Taq polymerase(1U/μl)3μl，無菌水22μl。
PCR反應(yīng)程序先95℃ 4min；然后95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，共35循環(huán)；最后72℃ 10min。
結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBin438和pBinBS T0代植株均全部擴(kuò)增出1513bp(自GENBANK號(hào)為X69770的5′端第1位核苷酸序列至第1513的BADHcDNA全長，而野生型沒有擴(kuò)增出任何片段。
B、SeNHX1基因的PCR擴(kuò)增分別以轉(zhuǎn)pBI121-Se和pBinBS的T0代植株幼嫩葉片中的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)SeNHX1 cDNA，以野生型煙草W38為對(duì)照，檢測(cè)的引物為引物115’TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC3’，引物125’GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT3’。
PCR反應(yīng)程序和反應(yīng)體系同步驟A。
結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBI121-Se T0代植株和轉(zhuǎn)pBinBS T0代植株均全部擴(kuò)增出1904bp(自GENBANK號(hào)為AY131235的5′端第304位到第2208位)SeNHX1 cDNA全長)，而野生型植株沒有擴(kuò)增出任何片段。
2)Southern雜交分析對(duì)部分PCR檢測(cè)陽性的植株進(jìn)行了Southern雜交分析。
A、轉(zhuǎn)BADH基因植株的檢測(cè)對(duì)獲得的23株轉(zhuǎn)pBin438的T0代植株中的6株進(jìn)行了進(jìn)一步的Southern檢測(cè)。用KpnI和EcoRI雙酶切各轉(zhuǎn)pBin438株系以及野生型煙草W38對(duì)照的基因組DNA后，以α-32P標(biāo)記的BADH cDNA為探針，進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBin438的T0代株系B1為雙拷貝；其T0代株系B8、B15、B19、B23為單拷貝，其T0代株系B5沒有相應(yīng)的雜交信號(hào)。圖7中泳道1為pBin438質(zhì)粒對(duì)照；泳道2為野生型煙草W38對(duì)照；泳道3-8分別為轉(zhuǎn)pBin438的T0代株系B1、B5、B8、B15、B19和B23。
同時(shí)對(duì)Southern檢測(cè)陽性的株系進(jìn)行了Northern檢測(cè)，提取轉(zhuǎn)pBin438的T0代株系RNA，以α-32P標(biāo)記的BADHcDNA為探針，進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明株系B1、B8和B23的表達(dá)較高，由于B1是雙拷貝，在以后的功能分析中選擇了單拷貝的B8和B23進(jìn)行研究。圖8中，泳道1為野生型煙草W38對(duì)照；泳道2-6分別為轉(zhuǎn)pBin438 T0代株系B1，B8，B15，B19和B23；rRNA作為上樣量對(duì)照。
B、轉(zhuǎn)SeNHX1基因植株的檢測(cè)對(duì)得到的11株轉(zhuǎn)SeNHX1基因植株中的5株Southern檢測(cè)，用BamHI/EcoRI完全酶切轉(zhuǎn)pBI121-Se T0代5株植株以及野生型煙草W38對(duì)照的基因組DNA后，以α-32P標(biāo)記的SeNHX1 cDNA為探針進(jìn)行了Southern雜交。結(jié)果如圖9所示，結(jié)果表明在這5個(gè)植株中，目的基因均整合到了煙草基因組中，且均為單拷貝插入。圖9中，泳道1為質(zhì)粒對(duì)照；泳道2為野生型對(duì)照；泳道3-7分別為轉(zhuǎn)pBI121-Se T0代植株S1、S8、S11、S15和S21。
提取轉(zhuǎn)pBI121-Se T0代植株的總RNA，進(jìn)行Northern檢測(cè)，結(jié)果如圖10所示，結(jié)果表明目的基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄水平得到了正確的表達(dá)，但是各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)量是不同的。圖10中，1為野生型煙草W38對(duì)照；2-6分別為轉(zhuǎn)基因株系S1、S8、S11、S15和S21；rRNA作為上樣對(duì)照。
C、BADH和SeNHX1雙基因共轉(zhuǎn)化植株(轉(zhuǎn)pBinBS植株)的檢測(cè)對(duì)BADH和SeNHX1共轉(zhuǎn)化得到的32株陽性苗中的5株進(jìn)行了Southern檢測(cè)。將5株P(guān)CR檢測(cè)為陽性轉(zhuǎn)pBinBS的T0植株以及野生型煙草W38對(duì)照的基因組DNA分別用KpnI/EcoRI(圖11中A)或BamHI/EcoRI(圖11中B)酶切，分別以α-32P-dCTP標(biāo)記SeNHX1 cDNA(圖11中B)或BADH cDNA(圖11中A)為探針進(jìn)行雜交。結(jié)果如圖11所示，結(jié)果表明，目的基因BADH和SeNHX1已經(jīng)整合到了煙草基因組中。其中株系BS1(圖11中A和B的泳道3)的兩個(gè)基因均是兩個(gè)拷貝，表明有可能是多位點(diǎn)插入，其余株系兩個(gè)基因均為單拷貝。在同一株系中目的基因BADH和SeNHX1的拷貝數(shù)相同說明在轉(zhuǎn)化過程中T-DNA上的目的基因沒有發(fā)生重組或丟失，是作為一個(gè)整體整合到煙草基因組中的。圖11中A和B的泳道1分別為pBinBS質(zhì)粒對(duì)照；泳道2分別為野生型對(duì)照；泳道3-7分別為轉(zhuǎn)pBinBS T0代植株BS1、BS5、BS15、BS21和BS23。
提取轉(zhuǎn)pBinBS的T0植株以及野生型煙草W38對(duì)照葉片總mRNA進(jìn)行Northern檢測(cè)，分別以α-32P-dCTP標(biāo)記SeNHX1 cDNA(圖11中B)或BADH cDNA(圖11中A)為探針進(jìn)行雜交，結(jié)果如圖12所示，結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBinBS T0代植株BS1、BS5、BS15、BS21和BS23均能夠檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)，說明這幾個(gè)植株中的外源基因BADH和SeNHX1能夠正常表達(dá)，但表達(dá)水平有較大的差異，且與拷貝數(shù)不成正比，選擇兩個(gè)基因均表達(dá)量高的株系BS5和BS15進(jìn)行以后的功能分析。圖12的A和B中，泳道1分別為野生型煙草W38對(duì)照；泳道2-6分別為轉(zhuǎn)pBinBST0代植株BS1，BS5，BS15，BS21和BS23；rRNA為上樣量對(duì)照。
通過Southern和Northern檢測(cè)表明已經(jīng)得到3種類型的轉(zhuǎn)基因煙草，分別是轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草(轉(zhuǎn)pBI121-Se煙草)、轉(zhuǎn)BADH基因煙草(轉(zhuǎn)pBin438煙草)以及SeNHX1和BADH基因共轉(zhuǎn)化煙草(轉(zhuǎn)pBinBS煙草)。目的基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，并得到了正確的表達(dá)。
三、轉(zhuǎn)BADH和/或SeNHX1煙草的功能鑒定1、BADH活性和甜菜堿含量的檢測(cè)為了檢測(cè)外源BADH基因插入煙草基因組的表達(dá)情況，對(duì)轉(zhuǎn)pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代植株或野生型煙草(WT)在無鹽脅迫及200mmol/L鹽脅迫條件下葉片內(nèi)的BADH酶活性和甜菜堿含量進(jìn)行了測(cè)定。
1)BADH酶活性測(cè)定A.酶液的提取取2g上述轉(zhuǎn)pBin438(B8、B23)、轉(zhuǎn)pBin438BS(BS5、S15)的T0代植株和野生型煙草(WT)植物葉片在液氮中速凍研磨后，分別在室溫下加入蛋白抽提緩沖液(含有50mmol/L Hepes/KOH(pH 8.0)、1.0mmol/L EDTA(pH8.0)和5.0mmol/L DTT的溶液)抽提5min。4℃，12000rpm離心10min，取上清保存于4℃。酶液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，于紫外分光光度計(jì)280nm處測(cè)定酶蛋白濃度B.酶活性測(cè)定反應(yīng)體系(1ml)抽提緩沖液(Extraction buffer)0.85ml，20×甜菜堿醛母液(20mmol/L)0.05ml，20×NAD+母液(20 mmol/L)0.05ml，步驟A得到的酶提取液0.05ml。
將分光光度計(jì)波長調(diào)至340nm反應(yīng)從加入酶液開始計(jì)時(shí)，記錄初始OD340及5min(或10min)時(shí)的OD340。
酶的比活(nmol·min-1·mg-1protein)=ΔOD×10-3ϵmax×C×109]]>式中ΔOD為340nm下吸光值每min增加的平均值；εmax為NADH摩爾消光系數(shù)，等于6.22×103；C為測(cè)定所加入的酶蛋白的量，單位為mg；10-3為1ml反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化為升的系數(shù)；109為mol轉(zhuǎn)化為nmol的系數(shù)。
2)甜菜堿含量的檢測(cè)參照陳少良等(2000)的方法(陳少良，畢望富，李金克等.2000.反相HPLC離子對(duì)色譜法測(cè)定植物組織中的甜菜堿.植物學(xué)報(bào)，42；1014-1018)對(duì)轉(zhuǎn)pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代植株或野生型煙草(WT)進(jìn)行甜菜堿的提取和純化以及測(cè)定。
液相色譜測(cè)定條件美國TSP公司液相色譜系統(tǒng)P4000泵，SCM1000真空儀，SN4000控制儀，UV3000紫外檢測(cè)器。用C18反相色譜柱(10μm，4.6mm×250mm，Irregular-H添料)，流動(dòng)相為50mmol/L的K2HPO4(pH 4.45)和0.1％PIC-8(辛烷磺酸，Waters公司)，流速0.7ml/min。
結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明，不論NaCl脅迫存在與否，野生型煙草的BADH活性都很低，幾乎檢測(cè)不到。而4個(gè)帶有BADH外源基因的植株(B8、B23、BS5、BS15)在鹽脅迫下都可以檢測(cè)到明顯的BADH活性(5.63-8.87U)，與野生型對(duì)照相比達(dá)極顯著水平。但在正常條件下只有植株B8和B23表現(xiàn)出了相對(duì)較高的BADH活性；株系BS5和BS15與野生型的BADH活性沒有顯著性差別。甜菜堿含量也表現(xiàn)出了與BADH活性類似的趨勢(shì)。不管鹽脅迫與否，野生型植株中甜菜堿含量均很低，幾乎檢測(cè)不到，在正常灌溉條件下野生型植株甜菜堿含量與各轉(zhuǎn)基因株系含量差別未達(dá)顯著水平，但在鹽分脅迫下B8、B23、BS5、BS15的甜菜堿含量均極顯著的高于野生型。
上述實(shí)驗(yàn)表明，帶有BADH外源基因的植株在鹽分脅迫下BADH活性和甜菜堿含量比野生型植株要明顯提高。
表1.T0代各轉(zhuǎn)基因株系在鹽分脅迫下的BADH活性和甜菜堿含量

表中數(shù)值3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每行中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.01水平上差異顯著。
2、T0代的耐鹽性和抗氧化性鑒定通過扦插的方法對(duì)Southern和Northern檢測(cè)得到的一部分陽性轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代苗進(jìn)行擴(kuò)繁，建立克隆群體。
1)光合效率和熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定鹽分脅迫對(duì)植物造成的傷害之一就是光合效率的降低，從而降低了植物同化物質(zhì)的積累，不利于植物的生長。除此之外，鹽分脅迫還會(huì)導(dǎo)致光合器官的破壞，反應(yīng)在PSII活性的下降，具體表現(xiàn)為Fv/Fm的下降。將上述陽性轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系移栽到溫室的花盆中，在移栽4周后，對(duì)擴(kuò)繁株系或野性型煙草W38對(duì)照(WT)分別進(jìn)行正常灌溉或灌溉200mM NaCl溶液脅迫，6周后，測(cè)定光合速度和PSII活性，結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明在正常條件下轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系與野生型(WT)對(duì)照的光合速度沒有達(dá)到顯著性差異，鹽分脅迫降低了所有株系的光合速度。相對(duì)野生型(WT)對(duì)照而言，轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系光合速度受鹽脅迫的影響要小，在200mM鹽分脅迫下各轉(zhuǎn)基因株系的光合速度均顯著高于野生型對(duì)照(WT)。其中BS5株系的光合速度最高為8.5μmol CO2m-2S-1，而野生型僅為4.9μmol CO2m-2S-1。轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系鹽分脅迫下較高的光合速度，保證了其同化物的積累，從而使其能持續(xù)的生長。
在正常灌溉條件下轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438或pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系及野生型對(duì)照的Fv/Fm在0.86左右，且各轉(zhuǎn)基因株系之間以及它們與對(duì)照之間沒有顯著差異；在鹽分脅迫下轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系材料的Fv/Fm均顯著高于野生型對(duì)照，相同類型轉(zhuǎn)基因株系間的Fv/Fm沒有達(dá)顯著差異。野生型在200mM NaCl下的Fv/Fm為0.71，僅為正常條件下的83％，各轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系雖在鹽分脅迫下都較正常條件有下降，但都高于0.8，株系S15的Fv/Fm最高為0.84。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系在鹽分脅迫下光合器官受到的破壞要低于野生型，PSII有相對(duì)較高的活性。
其中，表2中WT為野生型；S1，S15為轉(zhuǎn)pBI121-Se T0代的擴(kuò)繁株系；B8，B23為轉(zhuǎn)pBin438 T0代的擴(kuò)繁株系；BS5，BS15為轉(zhuǎn)pBinBS T0代的擴(kuò)繁株系。
表2.轉(zhuǎn)基因煙草在200mM NaCl下的光合速度和Fv/Fm

表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每列中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.05水平上差異顯著2)百草枯抗性檢測(cè)百草枯(paraquat)又名甲基紫精(methyl viologen，MV)，是一種雙吡啶化合物。對(duì)轉(zhuǎn)pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代的擴(kuò)繁株系材料或野生型煙草W38對(duì)照(WT)，用百草枯(10μM或20μM)或水處理葉片24小時(shí)，測(cè)定處理后的電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)含量，以確定不同材料抗氧化脅迫的能力。結(jié)果表明在10μM MV脅迫24h后，野生型葉盤邊緣已經(jīng)出現(xiàn)萎黃，并開始變白；各個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草雖然較對(duì)照顏色出現(xiàn)褐化，但受到的脅迫程度明顯低于野生型。20μM MV脅迫24h后，野生型幾乎全部變白，完全壞死；而各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系僅葉盤的邊緣部分出現(xiàn)了較嚴(yán)重的褐化(圖13)。
各材料的MDA含量隨著MV濃度的加大呈現(xiàn)出明顯的上升的趨勢(shì)，野生型上升的幅度最大，在0μM、10μM、20μM MV下的MDA含量分別為98.50nmol/g，522.83nmol/g和840.70nmol/g。轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的擴(kuò)繁株系雖然也有較大程度的上升，但是無論在上升的幅度還是在MDA絕對(duì)含量上均要小于野生型。但是不同類型的轉(zhuǎn)基因材料有較大的差異，轉(zhuǎn)SeNHX1和BADH雙基因(轉(zhuǎn)pBinBS株系)株系的MDA含量要低于單基因轉(zhuǎn)化株系(轉(zhuǎn)pBI121-Se和pBin438株系)；轉(zhuǎn)SeNHX1基因株系要低于轉(zhuǎn)BADH基因株系。說明了轉(zhuǎn)雙基因株系(轉(zhuǎn)pBinBS株系)受到的氧化脅迫程度最低，其次為轉(zhuǎn)BADH基因株系和轉(zhuǎn)SeNHX1基因株系，野生型對(duì)照受到的氧化脅迫程度最嚴(yán)重(具體結(jié)果如表3所示)。
表3.轉(zhuǎn)基因煙草葉盤百草枯處理24h后丙二醛的含量

表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每列中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.05水平上差異顯著。
百草枯處理后，轉(zhuǎn)pBI121-Se(S1)、pBin438(B8)、pBinBS(BS15)的T0代的擴(kuò)繁株系以及野生型對(duì)照的電導(dǎo)率與在MV中浸泡時(shí)間的關(guān)系如圖14、15所示，各株系的電導(dǎo)率均隨著MV脅迫的延長呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，但野生型上升的速度要高于轉(zhuǎn)基因株系。在10μM MV處理下(圖14)，在開始的4h內(nèi)各材料的電導(dǎo)率沒有大的差異，從8h開始野生型要高于各轉(zhuǎn)基因株系。在20μM MV處理下(圖15)，第12h是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。12h以前，各材料的電導(dǎo)率沒有大的差異，在12h以后，野生型的電導(dǎo)率明顯的高于各轉(zhuǎn)基因株系。
BADH在提高轉(zhuǎn)基因植物抗鹽性，很可能是通過穩(wěn)定一些酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和保持膜的完整性起作用的，在10μM和20μM的MV均導(dǎo)致MDA含量的急劇上升，但是在轉(zhuǎn)BADH的轉(zhuǎn)基因煙草中，MDA含量要顯著低于野生型對(duì)照，且轉(zhuǎn)BADH煙草電導(dǎo)率的上升也要低于野生型，說明BADH在降低過氧化和保持膜的完整性方面的確起到了顯著的作用。
3)抗氧化酶活性檢測(cè)將上述陽性轉(zhuǎn)pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代的擴(kuò)繁株系移栽到溫室的花盆中，在移栽4周后，對(duì)擴(kuò)繁株系和野性型煙草W38對(duì)照(WT)分別進(jìn)行正常灌溉或灌溉200mM NaCl溶液脅迫，處理6周后，測(cè)定與氧化有關(guān)的酶(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)和過氧化氫酶(CAT))在高鹽脅迫下的活性。超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)結(jié)果如圖16所示，結(jié)果表明，正常條件下植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)活性比較低，都低于6U，但是在200mM NaCl下各轉(zhuǎn)基因株系SOD酶活性有大幅度的上升，各轉(zhuǎn)基因株系均顯著高于野生型對(duì)照，其中SeNHX1基因和BADH基因共轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)pBinBS株系)的BS5和BS15株系的酶活最高，分別為28.2U和28.5U，較其正常處理對(duì)照上升了4.9倍和4倍。轉(zhuǎn)BADH基因株系B8和B23的SOD酶活要顯著高于轉(zhuǎn)SeNHX1基因株系S1和S15。
谷胱甘肽還原酶(GR)的活性檢測(cè)如圖17所示，結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代的擴(kuò)繁株系以及野生型對(duì)照(WT)在正常灌溉條件下的谷胱甘肽還原酶(GR)的活性均沒有達(dá)到顯著水平；在鹽分脅迫下轉(zhuǎn)pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代的擴(kuò)繁株系均顯著高于野生型對(duì)照。但是不同的轉(zhuǎn)基因株系間GR酶活有大的差別，轉(zhuǎn)SeNHX1和BADH雙基因株系BS5和BS15要顯著高于各轉(zhuǎn)單基因株系；BADH基因株系顯著高于轉(zhuǎn)SeNHX1基因株系。過氧化氫酶(CAT)活性檢測(cè)結(jié)果如圖18所示，結(jié)果表明，雖然野生型煙草的過氧化氫酶(CAT)在鹽分脅迫下的酶活要高于正常條件，但是仍顯著低于各轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)SeNHX1和BADH雙基因株系BS5的CAT酶活最高，但轉(zhuǎn)BADH基因株系B8和B23的酶活顯著高于單轉(zhuǎn)SeNHX1基因株系S1和S15。
圖16-18中，圖中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，圖中相同處理中標(biāo)有不同字母的株系在P≤0.05水平上差異顯著。
從鹽分脅迫下與氧化密切相關(guān)的3種酶的酶活來看，轉(zhuǎn)雙基因株系(轉(zhuǎn)pBinBS株系)的酶活要顯著高于轉(zhuǎn)單基因(BADH基因和SeNHX1基因)株系，轉(zhuǎn)BADH基因株系(轉(zhuǎn)pBin438株系)顯著高于轉(zhuǎn)SeNHX1基因株系(轉(zhuǎn)pBI121-Se株系)。說明SeNHX1和BADH基因均能提高抗氧化酶的活性，兩個(gè)基因有累加效應(yīng)，但是BADH基因起的作用要顯著高于SeNHX1基因。
在200mMNaCl脅迫下BADH積累顯著提高了CAT、SOD、GR的酶活，說明轉(zhuǎn)BADH基因煙草在清除活性氧類物質(zhì)的效率上要高于野生型。由此看來，BADH在方面很可能是通過提高一些抗氧化酶的活性有效的保持了細(xì)胞中的還原態(tài)，從而降低質(zhì)膜的過氧化，而要行使這一功能只需要少量的甜菜堿就可以了。
4)ATPase和PPase活性測(cè)定
SeNHX1基因是定位在液胞膜上的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，其主要功能是逆著Na+濃度梯度，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+區(qū)隔化到液泡中，減少鹽離子對(duì)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器膜系統(tǒng)和酶類的毒害，同時(shí)還降低了細(xì)胞的滲透勢(shì)，減輕細(xì)胞的滲透脅迫。主要以液泡上的H+-ATPase(V-ATPase)及其產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度為驅(qū)動(dòng)力。液胞膜焦磷酸化酶PPase普遍存在于高等植物的液胞膜上，水解PPi，將細(xì)胞質(zhì)中的H+運(yùn)送到液胞內(nèi)；質(zhì)膜上的H+-ATPase(P-ATPase)起著與V-ATPase類似的功能。以上3種酶提供了細(xì)胞跨膜運(yùn)輸?shù)哪芰?，而跨膜質(zhì)子梯度是維持Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白正常的功能所必需的，外源Na+/H+基因的導(dǎo)入很可能要影響到這些酶的活性，為此，測(cè)定了V-ATPase、P-ATPase和PPase的活性。細(xì)胞膜的提取和3種相關(guān)酶活性的測(cè)定參照Vera-Estrella等(2005)的方法進(jìn)行(Vera-Estrella R，Barkla B J，García-RamírezLa.et al.2005.Salt stress in Thellungiella halophila activates Na+transport mechanismsrequired for salinity tolerance.Plant Physiol，91507-1517)。
按照上述方法對(duì)轉(zhuǎn)pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代的擴(kuò)繁株系或野性型煙草W38對(duì)照(WT)分別進(jìn)行正常灌溉或灌溉200mM NaCl溶液脅迫，處理6周后，測(cè)定V-ATPase、P-ATPase和PPase的活性，結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明，在200mM NaCl下，各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和野生型對(duì)照液胞膜PPase活性比正常灌溉條件有所上升，各轉(zhuǎn)基因株系上升的幅度要大一些。但是，無論在鹽分脅迫還是在正常灌溉條件下各轉(zhuǎn)基因株系和野生型的PPase酶活性沒有顯著的差異。在正常灌溉條件下轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的P-ATPase酶活性的差異沒有達(dá)顯著水平；在200mM NaCl下所有轉(zhuǎn)基因株系的P-ATPase酶活均顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，且所有株系的P-ATPase酶活性在較正常灌溉有所提高。
在各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，V-ATPase強(qiáng)烈地受到了鹽分的誘導(dǎo)，其中株系BS15(轉(zhuǎn)pBinBS株系)在正常灌溉條件下的酶活性是14.13U，鹽分脅迫下的酶活性是33.07U，上升了1.34倍，其余各轉(zhuǎn)基因株系酶活均上升了1倍多，但在野生型煙草中鹽脅迫下的酶活性較正常灌溉條件僅略有上升。在沒有鹽脅迫的條件下各轉(zhuǎn)基因株系的V-ATPase酶活性和野生型相比沒有任何差異，但在鹽脅迫下，均顯著高于野生型。以上結(jié)果表明SeNHX1基因的導(dǎo)入強(qiáng)烈的增強(qiáng)了各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在鹽分脅迫下的V-ATPase酶活性。
表4.T0代轉(zhuǎn)基因煙草在200mM NaCl脅迫下ATPase和PPase的酶活性


表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每行中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.05水平上差異顯著。
5)離子含量測(cè)定對(duì)于大多數(shù)植物來說，鹽分脅迫的主要傷害之一就是大量Na+離子積累在細(xì)胞質(zhì)中，造成對(duì)植物膜系統(tǒng)的破壞和胞質(zhì)中酶的毒害作用。由于根和嫩葉的液胞化程度比較低，而且根是首先接觸鹽的器官，而莖起到把地下部分鹽向地上部分運(yùn)輸?shù)墓δ?，老葉的液胞化程度比較高，初步估計(jì)在這四種器官中其鹽分含量可能具有很大的差異，而過量鹽分的積累往往又會(huì)影響到K+的積累。因此測(cè)定了鹽脅迫下(200mM NaCl)轉(zhuǎn)BADH基因(B8、B23)和SeNHX1基因(S1、S15)煙草根、莖、嫩葉、老葉中Na+和K+離子的含量(表5、表6)。
鹽脅迫下Na+離子的含量測(cè)定結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明煙草幼葉中在正常情況下僅積累微量的Na+，但在鹽分脅迫下Na+含量急劇上升，在野生型中上升了38.6倍，各轉(zhuǎn)基因株系也表現(xiàn)出了相同的趨勢(shì)。在正常情況下，各株系的Na+含量的差異沒有達(dá)顯著水平；但在鹽分脅迫下轉(zhuǎn)SeNHX1的兩個(gè)株系S1和S15的Na+含量顯著高于野生型，其中株系S1的Na+含量達(dá)17.85mg/g，轉(zhuǎn)BADH基因的兩個(gè)株系B8和B23的Na+含量顯著低于野生型。
在正常情況下，煙草老葉中的Na+含量比嫩葉中要高的多，說明老葉可能作為Na+庫的作用。鹽分脅迫下轉(zhuǎn)SeNHX1株系和BADH株系老葉Na+含量要高于嫩葉，與嫩葉中鈉的含量趨勢(shì)相同，轉(zhuǎn)SeNHX1株系Na+含量顯著高于野生型，轉(zhuǎn)BADH基因株系顯著低于野生型。
所有株系在正常灌溉條件下根中的Na+含量差異沒有達(dá)顯著水平；但在200mMNaCl脅迫下各轉(zhuǎn)基因株系均顯著低于野生型對(duì)照，且轉(zhuǎn)SeNHX1株系和BADH株系的Na+含量沒有達(dá)顯著水平。在轉(zhuǎn)SeNHX1株系中根中的鈉離子有可能運(yùn)輸?shù)降厣喜康娜~子，進(jìn)而區(qū)隔到液胞中，引起了根中Na+含量的下降。各株系在正常灌溉條件下莖中的Na+含量差異也沒有達(dá)顯著水平；但在鹽分脅迫下轉(zhuǎn)SeNHX1株系Na+含量要顯著高于野生型對(duì)照，轉(zhuǎn)BADH株系與野生型的差異沒有達(dá)顯著水平。說明外源BADH基因的轉(zhuǎn)入能降低植物鹽分脅迫下的Na+含量，減少了Na+的毒害作用，從而提高了耐鹽性。而在轉(zhuǎn)入SeNHX1煙草T0世代葉和莖中的Na+含量卻顯著高于對(duì)照，這似乎與分別轉(zhuǎn)入這兩個(gè)基因的株系的耐鹽性的提高是相矛盾的。但是，在本試驗(yàn)中所測(cè)定的Na+含量是植物細(xì)胞各個(gè)亞細(xì)胞器中的總含量，對(duì)于植物細(xì)胞來說，只有在細(xì)胞質(zhì)中的Na+對(duì)植物遭成的傷害最大。BADH很可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的Na+離子運(yùn)輸方面起著積極的作用，降低了細(xì)胞膜對(duì)Na+離子的通透性，從而降低了植物總的Na+含量。而在轉(zhuǎn)入SeNHX1煙草中，定位在液胞膜上的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，可以把細(xì)胞質(zhì)中的Na+運(yùn)輸?shù)揭喊校档土思?xì)胞質(zhì)中的Na+含量，使植物能夠耐受較高的鹽分脅迫，由于過量Na+在液胞中的積累導(dǎo)致了總的Na+含量的升高。
表5.T0代轉(zhuǎn)基因煙草不同部位中的Na+含量(mg/g DW)

表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每行中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.05水平上差異顯著。
K+含量測(cè)定結(jié)果如表6所示，結(jié)果表明，各轉(zhuǎn)基因株系嫩葉中的K+含量在正常灌溉條件下的差異沒有達(dá)顯著水平；在鹽分脅迫下各轉(zhuǎn)基因株系K+含量比無鹽略有降低，但都顯著高于野生型。鹽分脅迫對(duì)煙草嫩葉中K+含量影響不大，可能與嫩葉是植物的生長中心有關(guān)，植物要維持鹽分脅迫下的持續(xù)生長必需要保證幼嫩組織營養(yǎng)的供應(yīng)。與嫩葉相比，老葉中的K+含量較大程度的受到了鹽分脅迫的影響。野生型的下降最大，由正常灌溉條件下的24.60mg/g下降到11.17mg/g，下降了54.6％，鹽脅迫下株系S15的K+含量最高，為20.23mg/g.鹽分脅迫下老葉中K+含量的下降可能與K+的重復(fù)利用有關(guān)，老葉中的K+轉(zhuǎn)運(yùn)到嫩葉中，使得老葉中的K+含量變化較大，而嫩葉中的變化較小。這可能是植物在鹽分脅迫下所形成的一種適應(yīng)機(jī)制。
鹽分脅迫也降低了根中的K+含量，但是與老葉相比，根中K+的含量變化不是很大。但是各轉(zhuǎn)基因株系K+的含量同樣顯著高于野生型對(duì)照，轉(zhuǎn)SeNHX1基因株系的K+含量要高于轉(zhuǎn)BADH基因株系。
表6.T0代轉(zhuǎn)基因煙草不同部位中的K+含量(mg/g DW)

表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每行中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.05水平上差異顯著。
與嫩葉、老葉和根相比，莖中K+含量的絕對(duì)值最高，正常灌溉條件下各株系K+的平均含量為61.27mg/g，分別為嫩葉、老葉和根中平均含量的2.26倍、2.44倍和2.51倍。即使在200mM NaCl脅迫下煙草莖中K+的含量也維持在較高的水平，其平均含量為43.76mg/g DW，遠(yuǎn)高于其它部位的平均含量。鹽分脅迫下莖中較高的K+含量在維持植株莖桿的韌性和硬度方面可能起著重要的作用。鹽脅迫下各株系莖中的K+含量都顯著高于野生型對(duì)照，在正常條件下各株系K+含量的差異并沒有達(dá)顯著水平。說明外源基因SeNHX1和BADH的導(dǎo)入顯著的提高了鹽分脅迫下煙草植株內(nèi)的K+含量，在所測(cè)定的4個(gè)部位中轉(zhuǎn)SeNHX1基因煙草K+的平均含量要比相應(yīng)的轉(zhuǎn)BADH基因煙草要高一些，表明在改善鹽分脅迫下K+的營養(yǎng)狀況方面SeNHX1比BADH起的作用更大一些，這似乎與SeNHX1直接參與離子的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。
6)T0代轉(zhuǎn)基因單株產(chǎn)量的測(cè)定對(duì)在200mM NaCl下脅迫6周后不同轉(zhuǎn)基因類型煙草(轉(zhuǎn)pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代的擴(kuò)繁株系)的生物量進(jìn)行了測(cè)量，以野生型煙草W38為對(duì)照，結(jié)果如表7所示，結(jié)果表明，在正常灌溉條件下所有株系間的單株干重的差異均沒有達(dá)顯著水平；鹽分脅迫下3種不同轉(zhuǎn)基因類型植株的單株干重均顯著高于野生型對(duì)照，但是單基因轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)pBI121-Se株系和轉(zhuǎn)pBin438株系)和雙基因共轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)pBinBS株系)以及不同的單基因轉(zhuǎn)化之間又有較大的差別。雙基因轉(zhuǎn)化植株的單株產(chǎn)量最高，其次為SeNHX1單基因轉(zhuǎn)化植株(轉(zhuǎn)pBI121-Se株系)。SeNHX1和BADH雙基因轉(zhuǎn)化株系(轉(zhuǎn)pBinBS株系)BS5的單株干重最高達(dá)13.91g，為野生型的1.51倍，而在正常灌溉條件下兩者間僅有微小的差別。
表7.T0轉(zhuǎn)基因煙草在200mMNaCl脅迫下的生物量(g/株干重)

表中數(shù)值為6個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每列中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.05水平上差異顯著。
同時(shí)對(duì)各類型轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)于其各自正常灌溉下的相對(duì)減產(chǎn)率和對(duì)200mMNaCl脅迫的敏感性進(jìn)行了比較(表8)。單株的相對(duì)減產(chǎn)率(％)＝[1-(鹽分脅迫下產(chǎn)量/該株系正常灌溉下產(chǎn)量)]×100.用多重比較的(LSD)方法在P＝0.05水平上對(duì)各處理和株系差異的顯著性進(jìn)行了比較，比較前先進(jìn)行了整個(gè)試驗(yàn)的方差分析。所用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS10.0。結(jié)果表明轉(zhuǎn)SeNHX1和BADH雙基因株系BS5相對(duì)于其正常灌溉對(duì)照的減產(chǎn)率僅為8.4％，而野生型減產(chǎn)率達(dá)到了38.6％，單基因轉(zhuǎn)化植株的減產(chǎn)率居中，但是同一種類型轉(zhuǎn)基因煙草的不同株系間減產(chǎn)率也有較大的差別。參照J(rèn)ain等(1990)的方法(Jain R K，Sunita J，Nainawatee H S.et al.1990.Salt-tolerance in Brassicajuncea L.I.In vitro selection，agronomic evaluation and geneticstability.Euphytica，48141-152)對(duì)煙草的單株干重進(jìn)行了數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，計(jì)算其各自的鹽脅迫敏感指數(shù)(Salinity stress susceptibility index，S)。具體計(jì)算公式為S＝(1-YD/YP)/D。公式中各項(xiàng)的具體意義YD＝某性狀鹽脅迫下的平均表現(xiàn)值，YP＝該性狀對(duì)照下的平均表現(xiàn)值，D＝1-(所有參試基因型該性狀的平均YD)/(所有參試基因型該性狀的平均YP)。
S的大小反映了某一基因型某性狀對(duì)鹽脅迫的敏感程度，D的大小反映了某一實(shí)驗(yàn)處理的脅迫強(qiáng)度。該計(jì)算法考慮了某一實(shí)驗(yàn)處理的脅迫強(qiáng)度，能較為客觀的反映不同材料間對(duì)同一處理的敏感程度。若某個(gè)性狀在鹽分脅迫下和對(duì)照情況下具有相同的表現(xiàn)，則該性狀的鹽脅迫敏感指數(shù)S為0，否則為大于0的某一數(shù)值。由表8的結(jié)果表明野生型煙草的鹽脅迫敏感指數(shù)S為2.04，各轉(zhuǎn)基因植株除了B8為1.27外，其余的鹽脅迫敏感指數(shù)均小于1，進(jìn)一步表明野生型煙草對(duì)200mM的NaCl更為敏感，此脅迫強(qiáng)度已經(jīng)強(qiáng)烈的影響到了其正常的生長。從鹽脅迫敏感指數(shù)和減產(chǎn)率反應(yīng)的各株系的耐鹽性強(qiáng)弱是一致的，株系BS5的耐鹽性最強(qiáng)，依次為BS15、S1、S15、B23、B8、WT。
表8.T0代轉(zhuǎn)基因煙草在200mM NaCl脅迫下的減產(chǎn)率和鹽脅迫敏感指數(shù)(S)

3、T1代的轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)及的抗逆性初步鑒定轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株移栽入花盆和室外大田中，充分保證水肥供應(yīng)，并做好病蟲害的防治。雖然煙草是嚴(yán)格自交物種，但仍需采取一定的隔離措施。待種子成熟后，收集種子進(jìn)行子代(T1代)分析。由于試驗(yàn)規(guī)模所限，故僅對(duì)其中部分株系進(jìn)行了分析。
1)T1代的篩選和分子檢測(cè)將收獲的轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS T0代的種子，即T1代種子，充分曬干后，按照常規(guī)的種子消毒方法種在MS0+100mg/L Km(卡那霉素)的培養(yǎng)基中，進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBST1種子和野生型種子在加Km的培養(yǎng)基上在第5天同時(shí)開始發(fā)芽，到第8天基本上都達(dá)到100％的發(fā)芽率。此時(shí)，轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS種子和野生型種子，在芽勢(shì)和生長狀況上都看不出任何差別。更換了不同批次的卡那霉素，都得到了類似的結(jié)果，排除了卡那霉素失效的原因。但是隨著不同類型種子在加卡那霉素培養(yǎng)基上生長時(shí)間的延長，我們發(fā)現(xiàn)卡那霉素強(qiáng)烈的抑制了野生型幼苗的生長，而轉(zhuǎn)基因幼苗似乎沒有受到任何的影響，其生長3周后的情況如圖19。圖19中A為轉(zhuǎn)pBinBS T1代種子在100mg/L卡那霉素培養(yǎng)上播種后3周的狀況；B為野生型種子在100mg/L卡那霉素培養(yǎng)基上播種后3周的狀況；C為轉(zhuǎn)pBinBS T1代種子在無卡那霉素培養(yǎng)基上播種后3周的狀況；D為野生型種子發(fā)在無卡那霉素培養(yǎng)基上播種后3周的狀況。
為了進(jìn)一步檢測(cè)外源基因在T1代中存在的可靠性，分別對(duì)3種轉(zhuǎn)基因類型(轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS煙草)煙草的部分植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)，部分結(jié)果如圖20中A，B和圖21所示。結(jié)果表明，在檢測(cè)的S15、B23和BS15的T1代株系中，大部分植株均擴(kuò)出了1.5Kb的BADH基因或/和1.9Kb的SeNHX1，而另一部分植株檢測(cè)不到目的條帶。其中在BADH基因和SeNHX1基因共轉(zhuǎn)化植株BS15的T1代株系中，兩目的基因表現(xiàn)出相同的分離趨勢(shì)，說明這兩個(gè)基因共同插入了煙草基因組上的同一位點(diǎn)，這也與轉(zhuǎn)化時(shí)候此兩個(gè)基因在同一載體上是相符的。其中圖20中A的泳道1-7為轉(zhuǎn)SeNHX1基因S15的T1代株系，泳道8為MarkerIII；圖20中B的泳道1-8轉(zhuǎn)BADH基因B23的T1代株系，泳道9為MarkerIII。圖21中泳道1和11；2和12；3和13；4和14；5和15；6和16；7和17；8和18；分別對(duì)應(yīng)同一BADH基因和SeNHX1基因共轉(zhuǎn)化植株BS15的T1代株系單株，泳道1-9，為SeNHX1基因PCR結(jié)果；泳道10為MarkerIII；泳道11-19為BADH基因PCR結(jié)果。
2)芽期耐鹽性鑒定將轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代種子經(jīng)消毒后播于含0或200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，觀察種子發(fā)芽和幼苗的生長情況，以野生型煙草W38為對(duì)照。結(jié)果如圖22所示，結(jié)果表明，200mM NaCl已經(jīng)強(qiáng)烈的抑制了野生型煙草種子的發(fā)芽，幾乎所有的種子在露白后即停止生長，直到腐爛死亡。相比之下，有少量的轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代幼苗能存活下來，并長出細(xì)長的根。對(duì)這部分存活下來的幼苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，均能擴(kuò)增出目的基因，說明轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代植株能夠在200mM NaCl培養(yǎng)基上生長的確是由外源基因的導(dǎo)入引起的。而在無NaCl的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因幼苗和野生型幼苗并看不出任何差別。對(duì)單轉(zhuǎn)SeNHX1(轉(zhuǎn)pBI121-Se株系)、BADH基因(轉(zhuǎn)pBin438株系)以及SeNHX1和BADH基因共轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)pBinBS株系)的T1代種子進(jìn)行了相同的發(fā)芽試驗(yàn)，均得到了類似的結(jié)果，但是雙基因轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)pBinBS株系)的幼苗在200mM NaCl培養(yǎng)基上生長狀況要比單基因轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)pBI121-Se和轉(zhuǎn)pBin438株系)要好些。由于幼苗有限并沒有進(jìn)行相關(guān)生長指標(biāo)的測(cè)定和比較。其中圖22中，A為野生型(左)和轉(zhuǎn)BADH和SeNHX1雙基因種子BS15(右)在無NaCl培養(yǎng)上的播種生長情況；B為野生型(左)和轉(zhuǎn)BADH和SeNHX1雙基因種子BS15(右)含在200mM NaCl培養(yǎng)基上的播種生長情況。
3)T1代的滲透脅迫試驗(yàn)甘露醇作為一種多元糖醇，具有很高的水溶性，是一種常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑。為了進(jìn)一步驗(yàn)證各轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，對(duì)3種轉(zhuǎn)基因類型的植株進(jìn)行了甘露醇的脅迫試驗(yàn)。
對(duì)PCR檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代陽性苗或野生型煙草W38，利用水培的方法在1/2Hoagland營養(yǎng)液中水培2周。待植株長到4cm左右后，挑選大小和生長狀況一致的幼苗，進(jìn)行甘露醇脅迫，脅迫處理時(shí)向營養(yǎng)液中加入200mM的甘露醇，在此濃度下脅迫1周后再轉(zhuǎn)移到1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)1周看其恢復(fù)情況，對(duì)照一直培養(yǎng)在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中。結(jié)果如圖23所示，結(jié)果表明，200mM的甘露醇已經(jīng)對(duì)煙草遭成了嚴(yán)重的傷害，所有材料均因滲透脅迫失水出現(xiàn)了干枯的葉子，在一些葉子的邊緣還有一些白色物質(zhì)析出，是植株體內(nèi)過量甘露醇隨蒸騰作用運(yùn)到了葉子表面引起的。但是轉(zhuǎn)到1/2 Hoagland營養(yǎng)液中生長1周后，各轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438或pBinBS的T1代苗恢復(fù)情況明顯好于野生型對(duì)照，均有新的葉子長出，并且在根基部長出了有少量白色的根，而野生型的大部分根都腐爛，而且也沒有新的根長出。說明了轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代株系在滲透脅迫消除后能較快的恢復(fù)生長，而野生型卻不能。圖23中A為野生型(左)和轉(zhuǎn)BADH和SeNHX1雙基因種子BS23(右)在甘露醇脅迫前的生長情況；B為野生型(左)和轉(zhuǎn)BADH和SeNHX1雙基因種子BS23(右)在200mM甘露醇脅迫1周后，又轉(zhuǎn)移到1/2 Hoagland營養(yǎng)液中生長1周后的情況。
檢測(cè)各株系在滲透脅迫消除后在營養(yǎng)液中生長1周后的生物量，結(jié)果如表9所示，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代株系均顯著高于野生型。但是不同類型的轉(zhuǎn)基因材料間差別較大，雙基因轉(zhuǎn)化顯著高于單基因轉(zhuǎn)化，SeNHX1單基因轉(zhuǎn)化顯著高于BADH單基因轉(zhuǎn)化。如雙基因轉(zhuǎn)化株系BS5(轉(zhuǎn)pBinBS的T1代株系)的單株鮮重是5.63g，分別是SeNHX1單基因轉(zhuǎn)化株系S15(轉(zhuǎn)pBI121-Se的T1代株系)、BADH單基因轉(zhuǎn)化B23(轉(zhuǎn)pBin438的T1代株系)和野生型的1.33倍、1.55倍和2.01倍。但是在對(duì)照情況下，各株系間的生物量并沒有顯著的差異，說明了外源抗鹽基因的導(dǎo)入的確提高了煙草的抗?jié)B透脅迫的能力。
表9.T1代轉(zhuǎn)基因株系在200mM甘露醇脅迫1周后的生物量

表中數(shù)值6個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，每列中標(biāo)有不同字母者為LSD檢驗(yàn)在P≤0.05水平上差異顯著。
權(quán)利要求
1.一種提高植物抗逆性的方法，是將SeNHX1基因和BADH基因通過植物表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到抗逆性提高的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述SeNHX1基因的編碼序列是自GENBANK號(hào)為AY131235的5′端第492位至2174位的核苷酸序列；所述BADH基因的編碼序列是自GENBANK號(hào)為X69770的5′端第4位至第1512的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述SeNHX1基因和BADH基因通過一個(gè)植物表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入植物中的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述SeNHX1基因和BADH基因是通過pBinBS共同轉(zhuǎn)入植物中的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗鹽性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗氧化性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗鹽性和抗氧化性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述植物為煙草。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物抗逆性的方法。該方法是將SeNHX1基因和BADH基因通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到抗逆性提高的植物。本發(fā)明方法獲得的含有SeNHX1的編碼基因和BADH的編碼基因的轉(zhuǎn)基因煙草，不但抗逆性增強(qiáng)，而且在逆境(特別是在鹽和/或氧化脅迫)下的單株產(chǎn)量也比野生型植株明顯提高。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1970768SQ20061016498
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者李銀心, 周樹峰 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所