專(zhuān)利名稱(chēng)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)血清或血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性濃度的測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒，屬于體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AlanineAminotransferase，ALT)活性升高，是病毒性肝炎早期最早出現(xiàn)的異常性指標(biāo)，被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的一種檢測(cè)指標(biāo)。在疾病普查及獻(xiàn)血員篩查時(shí)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測(cè)是必檢項(xiàng)目。
目前ALT酶活性的檢測(cè)從方法學(xué)上主要分為賴氏法、速率法和丙酮酸氧化酶法。中國(guó)90年代初出現(xiàn)丙酮酸氧化酶法，其原理為ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸反應(yīng)生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸氧化酶的催化下氧化反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫與色原劑和4-氨基安替比林在過(guò)氧化物酶的催化下反應(yīng)生成紅色的化合物，根據(jù)生成的紅色化合物線性反應(yīng)吸光度的變化計(jì)算ALT的酶活濃度。反應(yīng)式如下
因?yàn)槊复俜磻?yīng)的線性范圍比較寬，酶和底物反應(yīng)的特異性好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高；由于生成的紅色化合物可以用酶標(biāo)儀檢測(cè)，并可用全自動(dòng)加樣儀加樣品、試劑，可自動(dòng)讀取血樣本條碼，很大程度減少了人為誤差，檢測(cè)的精確性好；操作簡(jiǎn)便，一次可以檢測(cè)上百份樣本；數(shù)據(jù)可保留與打印，利于標(biāo)準(zhǔn)化管理和網(wǎng)絡(luò)化管理。因此，測(cè)定ALT活性的丙酮酸氧化酶法特別適用于血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員篩查和城鎮(zhèn)、社區(qū)醫(yī)院和基層醫(yī)療單位病毒性肝炎相關(guān)疾病的普查。
目前市場(chǎng)上丙酮酸氧化酶法的谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性濃度時(shí)均采用一步法檢測(cè)模式，即由含有丙酮酸氧化酶、L-丙氨酸、α-酮戊二酸和過(guò)氧化物酶等物質(zhì)共同組成的工作液，與樣本反應(yīng)后加入終止液終止反應(yīng)，測(cè)定生成的紅色化合物的吸光度，根據(jù)生成物線性反應(yīng)吸光度的變化計(jì)算ALT的酶活濃度。這種檢測(cè)方法均存在一個(gè)共同的問(wèn)題當(dāng)樣本未及時(shí)分離時(shí)，由于血液樣本中的紅、白細(xì)胞糖酵解作用產(chǎn)生的內(nèi)源性丙酮酸也可參與反應(yīng)，導(dǎo)致使用一步法測(cè)定ALT活性時(shí)結(jié)果假性偏高，檢測(cè)結(jié)果并不能真正地反映血清ALT的活性濃度。致使檢驗(yàn)血清ALT項(xiàng)目準(zhǔn)確度低，對(duì)我國(guó)無(wú)償獻(xiàn)血工作的開(kāi)展產(chǎn)生負(fù)面影響，也可能因不準(zhǔn)確的ALT測(cè)定結(jié)果導(dǎo)致對(duì)臨床疾病的誤診。

發(fā)明內(nèi)容
為解決內(nèi)源性丙酮酸對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定的干擾，本發(fā)明提供丙酮酸氧化酶法的谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒。采用兩步法檢測(cè)模式，樣本與含有丙酮酸氧化酶和過(guò)氧化氫酶的試劑1先反應(yīng)后，消耗了樣本中的內(nèi)源性丙酮酸，再與含有L-丙氨酸和α-酮戊二酸的試劑2反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果更真實(shí)地反映血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，檢測(cè)準(zhǔn)確度高，因此有效消除內(nèi)源性丙酮酸干擾的谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定方法和谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒可以得到切實(shí)的推廣使用。
為實(shí)現(xiàn)消除內(nèi)源性丙酮酸干擾的發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案測(cè)定血清ALT活性時(shí)，使用兩步法檢測(cè)，即第一步試劑1與樣本先反應(yīng)后，第二步再加入試劑2反應(yīng)。具體過(guò)程如下第一步利用試劑1中丙酮酸氧化酶的催化作用使樣本中的內(nèi)源性丙酮酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下生成水和氧。第一步所包含的反應(yīng)式為
第二步利用試劑2含有的過(guò)氧化氫酶抑制劑如疊氮鈉等物質(zhì)抑制過(guò)氧化氫酶的活性，利用試劑2含有的L-丙氨酸和α-酮戊二酸啟動(dòng)血清ALT反應(yīng)。第二步所包含的反應(yīng)式為
第二步反應(yīng)至一定時(shí)間后加入終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)生成的紅色化合物的線性反應(yīng)吸光度變化，計(jì)算血清ALT的活性。因此通過(guò)兩步法模式，檢測(cè)結(jié)果可以更真實(shí)地反映血清ALT的活性。
檢測(cè)過(guò)程中，試劑1與樣本的體積比例控制在1～5范圍內(nèi)；試劑1與試劑2的體積比例控制在0.05～20范圍內(nèi)；檢測(cè)過(guò)程中的每一步溫度控制在15℃～40℃范圍內(nèi)；每一步的反應(yīng)時(shí)間控制在6min～30min范圍內(nèi)；檢測(cè)生成物在主波長(zhǎng)為400nm～600nm的吸光度變化值計(jì)算血清ALT活性。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒，包括四種配套試劑試劑1、試劑2、終止液和校準(zhǔn)血清。為消除內(nèi)源性丙酮酸的干擾，本發(fā)明提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒中的試劑1含有1KU/L～10KU/L的丙酮酸氧化酶，2KU/L～5KU/L的過(guò)氧化氫酶；試劑2含有0.5mol/L～5mol/L L-丙氨酸和5mmol/L～50mmol/Lα-酮戊二酸，含有10mmol/L～100mmol/L疊氮鈉。
試劑1的主要組成成份如下緩沖液 50mmol/L～200mmol/L丙酮酸氧化酶 1KU/L～10KU/L過(guò)氧化氫酶 2KU/L～5KU/L過(guò)氧化物酶 1KU/L～10KU/L穩(wěn)定劑 50mmol/L～2000mmol/L試劑2的主要組成成份如下緩沖液 50mmol/L～200mmol/L疊氮鈉 10mmol/L～100mmol/LL-丙氨酸 0.5mol/L～5mol/Lα-酮戊二酸5mmol/L～50mmol/L4-氨基安替比林 10mmol/L～100mmol/L色原劑 1mmol/L～10mmol/L由于酶反應(yīng)需要合適的PH范圍和合適的離子強(qiáng)度的緩沖液，本發(fā)明提供的試劑盒由PH5.0～8.0范圍的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中的一種或一種以上組成。
為保持試劑的穩(wěn)定性，在試劑中加入了穩(wěn)定劑，可以在牛血清白蛋白、乙二醇、三乙醇胺、甘油、糖類(lèi)、鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽等物質(zhì)中進(jìn)行選擇。
色原劑為對(duì)溴苯酚、苯酚、N，N-二甲基聯(lián)苯胺、2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸(TBHBA)、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸(DHBS)、二甲基苯胺(DMA)、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(EHSPT)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(HMB)等物質(zhì)中的一種。
終止液是乙二胺四乙酸鹽、硝酸鹽、疊氮鈉和重金屬離子等物質(zhì)中的一種。
有益效果本發(fā)明提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒，采用丙酮酸氧化酶法原理，在酶標(biāo)儀上對(duì)樣本進(jìn)行兩步法模式檢測(cè)。即在ALT測(cè)定中，首先使樣品與含有丙酮酸氧化酶和過(guò)氧化氫酶的試劑1反應(yīng)，將樣本中所含的α-酮酸(如丙酮酸)消耗，再加入含有L-丙氨酸和α-酮戊二酸的試劑2啟動(dòng)ALT的催化反應(yīng)，檢測(cè)生成物的線性反應(yīng)吸光度變化。因此使用本發(fā)明提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒，能夠有效地消除內(nèi)源性丙酮酸的干擾，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確地反映血清ALT活性。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域的常規(guī)條件進(jìn)行。
實(shí)施例一、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒的試劑1和試劑2組成如下試劑1的主要組成成份如下緩沖液 100mmol/L丙酮酸氧化酶 2KU/L過(guò)氧化氫酶 2KU/L過(guò)氧化物酶 3KU/L穩(wěn)定劑 1000mmol/L試劑2的主要組成成份如下緩沖液 100mmol/L疊氮鈉 30mmol/LL-丙氨酸 1mol/Lα-酮戊二酸 30mmol/L4-氨基安替比林 20mmol/LTBHBA2mmol/L實(shí)施例二、消除內(nèi)源性丙酮酸干擾的兩步法測(cè)定ALT活性的方法如下1、酶標(biāo)板上，設(shè)一孔試劑空白孔，兩孔標(biāo)準(zhǔn)孔，其余為測(cè)定孔。每孔加50ul試劑1。
2、空白孔內(nèi)加入蒸餾水20ul，標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)分別加校準(zhǔn)血清20ul，測(cè)定孔分別加入待檢血清20ul，混勻后置37℃溫育10分鐘。
3、每孔加50ul試劑2，混勻后置37℃溫育10分鐘。
4、每孔加100ul終止液，混勻后于酶標(biāo)儀比色。主波長(zhǎng)為492nm，副波長(zhǎng)為620nm，輸入試劑空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔及測(cè)定孔位置，輸入校準(zhǔn)血清ALT活性濃度，以試劑空白孔調(diào)零，進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果按以下公式計(jì)算ALT活性血清ALT活性(U/L)＝測(cè)定孔吸光度/標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度×校準(zhǔn)血清ALT活性濃度實(shí)施例三、內(nèi)源性丙酮酸對(duì)一步法檢測(cè)樣本的干擾由于血液標(biāo)本采集后未及時(shí)分離血清/血漿時(shí)，標(biāo)本中的紅、白細(xì)胞糖酵解作用產(chǎn)生內(nèi)源性丙酮酸，用一步法檢測(cè)模式測(cè)定ALT活性濃度時(shí)，內(nèi)源性丙酮酸對(duì)ALT酶活性濃度測(cè)定產(chǎn)生干擾。具體試驗(yàn)如下1、于酶標(biāo)板上，分別加入樣本為0.125mg/ml丙酮酸鈉、0.0625mg/ml丙酮酸鈉、0.0313mg/ml丙酮酸鈉、44.5U/LALT、0.125mg/ml丙酮酸鈉+44.5U/LALT、0.0625mg/ml丙酮酸鈉+44.5U/LALT、0.0313mg/ml丙酮酸鈉+44.5U/LALT。
2、將試劑1與試劑2按1∶1比例配成工作液。
3、每孔加入100ul工作液，與樣本混勻后于37℃反應(yīng)15分鐘。
4、每孔加入100ul終止液，于酶標(biāo)儀比色。主波長(zhǎng)492nm，副波長(zhǎng)620nm，測(cè)定OD值。
5、結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 內(nèi)源性丙酮酸對(duì)一步法檢測(cè)樣本的干擾

表1說(shuō)明在含有44.5U/LALT的血清中加入不同濃度的丙酮酸鈉，使用一步法模式檢測(cè)時(shí)，丙酮酸鈉對(duì)血清中ALT活性測(cè)定產(chǎn)生了干擾，使檢測(cè)ALT的結(jié)果假性偏高，并且隨著丙酮酸鈉濃度的增高，干擾作用越顯著。
實(shí)施例四、使用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行兩步法測(cè)定，分析對(duì)內(nèi)源性丙酮酸的消除效果本試劑盒的特征是，試劑1含有丙酮酸氧化酶和過(guò)氧化氫酶，試劑2含有L-丙氨酸和α-酮戊二酸底物，測(cè)定血清ALT活性時(shí)，采用兩步法測(cè)定模式，第一步利用丙酮酸氧化酶的催化作用使內(nèi)源性丙酮酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下生成水和氧，從而消耗內(nèi)源性丙酮酸，達(dá)到消除內(nèi)源性丙酮酸對(duì)血清ALT活性測(cè)定的干擾。第二步啟動(dòng)血清ALT的催化反應(yīng)。具體試驗(yàn)如下1、于酶標(biāo)板上，分別加入樣本為0.125mg/ml丙酮酸鈉、0.0625mg/ml丙酮酸鈉、0.0313mg/ml丙酮酸鈉、44.5U/LALT、0.125mg/ml丙酮酸鈉+44.5U/LALT、0.0625mg/ml丙酮酸鈉+44.5U/LALT、0.0313mg/ml丙酮酸鈉+44.5U/LALT。
2、每孔加入50ul試劑1，混勻后置37℃溫育10分鐘。
3、每孔加入50ul試劑2，混勻后置37℃溫育10分鐘。
4、每孔加入100ul終止液，混勻后于酶標(biāo)儀比色。主波長(zhǎng)492nm，副波長(zhǎng)620nm，測(cè)定OD值。
5、結(jié)果見(jiàn)表2。
表2兩步法檢測(cè)模式對(duì)內(nèi)源性丙酮酸消除效果的測(cè)定

將表1與表2進(jìn)行比較，可以看出使用本發(fā)明提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒，樣本所含的內(nèi)源性丙酮酸鈉對(duì)ALT活性測(cè)定的干擾作用被有效地降低了。
因此與一步法檢測(cè)模式相比，使用本發(fā)明提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒可以有效地消除內(nèi)源性丙酮酸的干擾作用。
權(quán)利要求
1.有效地消除內(nèi)源性丙酮酸干擾的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性濃度的測(cè)定方法測(cè)定血清ALT活性時(shí)，使用兩步法檢測(cè)，第一步試劑1與樣本先反應(yīng)，試劑1中的丙酮酸氧化酶可使樣本中內(nèi)源性丙酮酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下生成水和氧，從而消耗樣本中的內(nèi)源性丙酮酸。第二步再與試劑2反應(yīng)，試劑2含有的過(guò)氧化氫酶抑制劑如疊氮鈉等物質(zhì)抑制過(guò)氧化氫酶的活性，含有的L-丙氨酸和α-酮戊二酸啟動(dòng)血清ALT反應(yīng)，檢測(cè)生成物的線性反應(yīng)吸光度變化計(jì)算血清ALT的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性濃度的測(cè)定方法，其特征在于檢測(cè)過(guò)程中，試劑1與樣本的體積比例控制在1～5范圍內(nèi)；試劑1與試劑2的體積比例控制在0.05～20范圍內(nèi)；檢測(cè)過(guò)程中的每一步溫度控制在15℃～40℃范圍內(nèi)；每一步的反應(yīng)時(shí)間控制在6min～30min范圍內(nèi)；檢測(cè)生成物在主波長(zhǎng)為400nm～600nm的吸光度變化值計(jì)算血清ALT活性。
3.本發(fā)明提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒，包括四種配套試劑試劑1、試劑2、終止液和校準(zhǔn)血清。試劑1主要由以下成份組成緩沖液 50mmol/L～200mmol/L丙酮酸氧化酶1KU/L～10KU/L過(guò)氧化氫酶 2KU/L～5KU/L過(guò)氧化物酶 1KU/L～10KU/L穩(wěn)定劑 50mmol/L～2000mmol/L試劑2主要由以下成份組成緩沖液 50mmol/L～200mmol/L疊氮鈉 10mmol/L～100mmol/LL-丙氨酸0.5mol/L～5mol/Lα-酮戊二酸 5mmol/L～50mmol/L4-氨基安替比林 10mmol/L～100mmol/L色原劑 1mmol/L～10mmol/L
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所用緩沖液由PH5.0～8.0范圍內(nèi)的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中的一種或一種以上組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于穩(wěn)定劑可以在牛血清白蛋白、乙二醇、三乙醇胺、甘油、糖類(lèi)、鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽等物質(zhì)中進(jìn)行選擇。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于色原劑為對(duì)溴苯酚、苯酚、N，N-二甲基聯(lián)苯胺、2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸(TBHBA)、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸(DHBS)、二甲基苯胺(DMA)、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(EHSPT)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(HMB)等物質(zhì)中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于終止液為乙二胺四乙酸鹽、硝酸鹽、疊氮鈉和重金屬離子等物質(zhì)中的一種。
全文摘要
谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定方法及谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒，屬于體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明目的是提供有效消除內(nèi)源性丙酮酸干擾的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Aminotransferase，ALT)測(cè)定方法及其測(cè)定試劑盒，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。采用的技術(shù)方案是使用兩步法檢測(cè)，第一步試劑1與樣本先反應(yīng)，丙酮酸氧化酶使樣本中內(nèi)源性丙酮酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下生成水和氧，以消耗樣本中的內(nèi)源性丙酮酸。第二步再與試劑2反應(yīng)，利用L－丙氨酸和α－酮戊二酸啟動(dòng)血清ALT反應(yīng)，檢測(cè)生成物的線性反應(yīng)吸光度變化計(jì)算血清ALT的活性。因此本發(fā)明提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定方法及其測(cè)定試劑盒，檢測(cè)更準(zhǔn)確，便于推廣使用。
文檔編號(hào)C12Q1/30GK1995378SQ20061016770
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者余燕, 文潔, 尹燁 申請(qǐng)人:北京華大吉比愛(ài)生物技術(shù)有限公司