專利名稱：制備可溶高活性重組納豆激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，包括它的表達載體的構(gòu)建、原核表達和純化工藝。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病之一，全世界每天超過一千萬人死于心腦血管疾病，我國每年大約有二百六十萬人死于心腦血管疾病，而且一般集中在大城市。血栓性的疾病是中老年人的高發(fā)病，今后我國將進入老齡化社會，必須對心腦血管疾病的防治提起足夠的重視。全世界所需的溶栓藥物的潛在市場約為20億美元。我國國內(nèi)市場上使用的溶栓藥物如鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、組織性纖維溶酶原激活劑(tPA)等都存在明顯不足，例如臨床中會產(chǎn)生抗再灌注，再次出現(xiàn)栓塞、出血、過敏等反應(yīng)。
納豆是日本的傳統(tǒng)食品，食用已經(jīng)超過千年。納豆激酶(Nattokinase，簡稱NK)是1987年日本學(xué)者須見洋行博士首先從納豆中分離純化出來的。納豆激酶是納豆菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，等電點為8.7，由275個氨基酸組成，單鏈、不含二硫鍵，分子量為27kD。納豆激酶在腸道中活性相當(dāng)穩(wěn)定，與其它溶栓藥相比，除具有較強的溶栓作用外，還具有體內(nèi)作用時間長、無毒副作用等優(yōu)點，已經(jīng)被用作溶栓藥物。納豆激酶能夠?qū)Ｒ蝗芙庋?，對纖維蛋白原沒有降解活性，大量使用不會引起出血，可以預(yù)防和輔助治療以下病癥腦血栓、腦梗塞、心肌梗塞、血栓后遺癥、血栓靜脈炎、脈管炎等。服用納豆激酶后，血中優(yōu)球蛋白溶解時間(ELT)顯著延長，纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)和組織型纖溶酶原激活因子(TPA)明顯增加。在急性心肌梗塞患者搶救過程中，采用靜脈滴注納豆激酶，可以迅速溶解血栓，基本沒有出血危險性。
目前以納豆激酶為主要成分作為藥品、功能性食品和食品添加劑或者保健品的研發(fā)工作進展的非常迅速。但是國際上主要的已經(jīng)投入生產(chǎn)的納豆激酶相關(guān)產(chǎn)品(日本大和制藥“NKCP”，過敏癥研究集團“納豆激酶”，韓國維壽酶公司“維壽酶”等)都是從野生菌或者改良的野生菌發(fā)酵液中提取純化而來的，但是其中天然NK含量非常低(一般小于10％)，使得純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)量不高，活性也很低，而且野生菌發(fā)酵過程中也容易發(fā)生突變，難以持續(xù)生產(chǎn)。而利用一般的基因工程的方法重組表達NK基因，會導(dǎo)致NK以包涵體的形式出現(xiàn)在表達產(chǎn)物當(dāng)中，變性復(fù)性又會大幅度提高成本和降低NK的酶活性。所以這類生產(chǎn)工藝導(dǎo)致納豆激酶產(chǎn)品很難大幅度推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，包括構(gòu)建含有前導(dǎo)肽序列的納豆激酶基因(proNK)克隆，加入GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)蛋白標(biāo)簽和PDI(蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶)的分子伴侶(包括人與鼠等各種來源的同源蛋白)，從而幫助目的基因在大腸桿菌中高效表達，在序列中內(nèi)嵌入HIS標(biāo)簽(六個連續(xù)的組氨酸，HIS6)和蛋白酶切位點幫助目的蛋白高效提純。
本發(fā)明的納豆激酶可溶性重組表達工藝是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的1)以Bacillus Subtilis Natto(納豆枯草桿菌)菌體為模板，根據(jù)納豆激酶全長序列設(shè)計引物，通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的方法獲得包含前導(dǎo)肽的全長納豆激酶基因，稱為proNK；在proNK基因的3`末端增加HIS標(biāo)簽序列(六個連續(xù)的組氨酸，HIS6)，再將proNK加HIS標(biāo)簽的基因克隆進入pGEX-6P載體(已商業(yè)化的原核表達載體)；接著利用PCR將分子伴侶PDI的全長基因克隆出來接到proNK基因的3`末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease蛋白酶(一種序列特異性的蛋白酶，簡稱PPase)的酶切位點序列(序列為Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，用pp表示)；這樣組裝成為高效表達載體pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI，簡稱6pNHP；相應(yīng)表達出的重組蛋白為GST-pp-proNK-HIS6-pp-PDI；2)6pNHP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta(一種表達菌種)，用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)重組基因的表達；同時將含有PPase的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，一起誘導(dǎo)表達；然后將兩種菌體按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整PH值，低溫振蕩使PPase將重組蛋白酶切完全，釋放出proNK蛋白，從而得到高濃度的含有納豆激酶的溶液；進行蛋白定量分析和活性測定；4)將含有納豆激酶的溶液進行純化處理。
本發(fā)明的納豆激酶的粗純化的工藝是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的在高濃度的含有納豆激酶的溶液中，逐滴加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為30％，靜置鹽析4小時或過夜，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取沉淀，用10倍沉淀體積的含有10％甘油的Tris緩沖液將沉淀溶解；12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清。透析過夜，即得到高濃度的納豆激酶粗品，可進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉變性聚丙烯酰氨凝膠電泳)分析后進行活性測定。
本發(fā)明的納豆激酶的精純化的工藝是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的在高濃度的含有納豆激酶的溶液中，直接調(diào)整PH值到10，上鎳離子親和柱(Ni-NTAHis-Bind Resin)，用10％甘油的緩沖溶液上柱，25mM咪唑洗脫雜蛋白，100mM咪唑洗脫目的蛋白。透析過夜，即得到高純度高活性納豆激酶的精品。進行SDS-PAGE分析和活性測定。
本發(fā)明的納豆激酶的簡化重組表達載體的制備工藝是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的1)以Bacillus Subtilis Natto菌體為模板，根據(jù)納豆激酶全長序列設(shè)計引物，通過PCR的方法獲得包含前導(dǎo)肽的全長納豆激酶基因，稱為proNK；將proNK的基因克隆進入pGEX-6P載體；接著利用PCR將分子伴侶PDI的全長基因克隆出來接到proNK基因的3`末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease蛋白酶切位點序列，這樣組裝成為高效表達載體pGEX-6p-proNK-pp-PDI，簡稱6pNP；相應(yīng)表達出的重組蛋白為GST-pp-proNK-pp-PDI；2)6pNP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達；同時將含有PPase的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，一起誘導(dǎo)表達；然后將兩種菌體按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris緩沖液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整PH值，低溫振蕩使PPase將重組蛋白酶切完全，釋放出proNK蛋白，從而得到高濃度的含有納豆激酶的溶液；進行蛋白定量分析和活性測定；4)在高濃度的含有納豆激酶的溶液中，逐滴加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為30％，靜置鹽析4小時或過夜，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取沉淀，用10倍沉淀體積的含有10％甘油的Tris緩沖液將沉淀溶解；12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清；透析過夜，即得到高濃度的納豆激酶粗品，可進行SDS-PAGE分析后進行活性測定。
PDI伴侶分子對于納豆激酶的可溶性表達具有關(guān)鍵的輔助作用，而它們和proNK的相對位置是可變的；最終的重組蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，HIS6-proNK-PDI，HIS6-PDI-proNK，以及非重組蛋白的狀態(tài)(PDI與proNK或NK同時混合于溶液中)均可以提高納豆激酶的可溶性表達。
GST與PDI伴侶分子的同時存在對于納豆激酶的可溶性表達具有關(guān)鍵的輔助作用，而它們和proNK的相對位置是可變的；最終的重組蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，proNK-GST-PDI，proNK-PDI-GST，PDI-GST-proNK，PDI-proNK-GST以及非重組蛋白的狀態(tài)(GST以及PDI與proNK或NK三者同時混合于溶液中)均可以提高納豆激酶的可溶性表達。
利用本發(fā)明的重組表達方案使得納豆激酶保持可溶解的狀態(tài)，比包涵體的形式更保持了蛋白酶的活性，也大幅度簡化了純化的步驟，而采用包含有前導(dǎo)肽的納豆激酶形式更保持了蛋白的穩(wěn)定性。這樣制得的納豆激酶純度高，產(chǎn)量高，活性高，成本低，生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。產(chǎn)物可以制作藥物或者口服保健品，利于向大眾推廣。


圖1納豆激酶基因pGEX-6p-proNK-HIS-pp-PDI的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。
圖2納豆激酶基因pGEX-6p-proNK-pp-PDI的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。
圖36pNHP酶切鑒定電泳圖(HindIII和XhoI雙酶切)。
圖4顯示粗提純產(chǎn)物中納豆激酶含量和純度的SDS-PAGE結(jié)果。
圖5顯示精提純產(chǎn)物中納豆激酶含量和純度的SDS-PAGE結(jié)果。
圖6顯示提純產(chǎn)物活性的纖維蛋白平板溶圈。
圖1、圖2中，質(zhì)粒pGEX-6p的圖譜來自商業(yè)化的試劑盒，擴增的序列插入其中。
圖3中，左邊為堿基長度對照，右邊為酶切產(chǎn)物的條帶。在構(gòu)建好的載體中間，原有的XhoI酶切位點被SalI中和掉。這樣HindIII是proNK的獨有酶切位點，XhoI是PDI的獨有酶切位點(而且有兩個)。所以用這兩個酶鑒定構(gòu)建載體時會放出三條帶。1為載體片斷，2為proNK基因位于HindIII位點之后的序列和PDI第一個XhoI位點之前的序列總長，3是PDI兩個XhoI位點之間的序列。
圖4中，從左至右依次是粗提純納豆激酶溶液；蛋白質(zhì)分子量對照。
圖5中，從左至右依次是精提純納豆激酶溶液；全菌裂解液對照；蛋白質(zhì)分子量對照。
圖6中，各個序號所加樣品和對應(yīng)溶圈面積為

*其中對照為Tris緩沖液對照
具體實施例方式
實施例一納豆激酶基因表達載體的構(gòu)建及表達1)取Bacillus Subtilis Natto的凍存菌株1ul接種于5mILB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm/min搖動培養(yǎng)基16小時(不可過長，防止形成芽孢)。菌液1∶20稀釋，然后取1ul作為PCR模板。設(shè)計合成PCR引物，用于擴增proNK基因，PCR引物的5`，3`末端含有限制性內(nèi)切酶位點；上游引物NKs5`-3` CAT AGATCT GCCGGAAAAAGCAG下游引物NKHISa5`-3`AGA GAATTC GTGATGATGATGATGATG TAATTGTG CAGCTGC引物稀釋成50pmol/ul待用。然后利用熱啟動PCR的方法將proNK-HIS6基因克隆出來PCR反應(yīng)體系50ulddH2O 40ul10*PCR BUFFER5uldNTP 1ul模板 1ul上/下游引物1ulpfu酶1ulPCR反應(yīng)條件94℃ 8min94℃ 30s65℃ 30s72℃ 2min40s20循環(huán)94℃ 30s55℃ 30s72℃ 2min40s20循環(huán)72℃ 10min反應(yīng)結(jié)束之后，取PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測為與1.1kb左右位置處的一條亮帶即為目的基因(proNK-HIS6)的大小。
2)凝膠回收目的基因，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI將其切成粘性末端，同樣處理pGEX-6p載體，加入T4DNA連接酶，4℃連接12小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，利用酶切和PCR的方法鑒定正確，然后核苷酸序序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，構(gòu)建成功pGEX-6p-proNK-HIS6載體。
設(shè)計PDI的引物，包含酶切位點上游引物PDI-PPs5`-3`TA GAATTC CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC ATGCTGCGCCGCGC下游引物PDI-PPa5`-3`CT GTCGAC CAGTTCATCTTTCACAGPCR反應(yīng)條件(Tag酶)94℃8min94℃30s65℃30s72℃1min30循環(huán)72℃10min瓊脂糖凝膠電泳檢測PDI條帶位于700bp左右，膠回收目的基因，用EcoRl和SalI將基因酶切成粘性末端，接入用EcoRI和XhoI酶切后的pGEX-6p-proNK-HIS6載體，加入T4DNA連接酶，4℃連接12小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，利用酶切和PCR的方法鑒定正確，然后核苷酸序序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，構(gòu)建成功pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI高效表達載體(簡寫為6pNHP)。
3)將正確的6pNHP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選出單斑克隆，在5mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按照1∶100轉(zhuǎn)接，在搖瓶中37℃培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6，按照1∶5000加入IPTG儲液，30℃培養(yǎng)4-6小時(時間延長會顯著提高產(chǎn)量)，離心收集菌體，保存于-20℃或者立即進入下步純化。
同時將含有PPase的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，同樣操作挑選單斑克隆，在5mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，然后1∶100轉(zhuǎn)接，搖瓶培養(yǎng)37℃至OD為0.6，按照1∶1000加入IPTG儲液，30℃培養(yǎng)6小時，離心收集菌體，取適當(dāng)與6pNHP菌體混合(菌體質(zhì)量比值約為1∶50)。
4)配制適合保存酶活的緩沖體系Tris6.057g/LNaCl2.925g/LEDTA0.186g/L甘油50ml/L用緩沖液洗滌混合后的菌體沉淀，用20-40ml體積重懸約500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100幫助裂解細菌(可選)，用冰水混合物環(huán)境下超聲破菌(2s超聲，5s間歇，全長45min，保護溫度44℃)，12000rpm/min離心20min，收集上清液。再次調(diào)整PH為7.0左右，振蕩反應(yīng)約4h(冰上操作有助于提高產(chǎn)物活性，需要延長作用時間至10h左右，加入DTT有助于優(yōu)化反應(yīng))。這樣重組蛋白基本被PPase酶切完全，釋放出proNK蛋白。ProNK蛋白自剪切釋放出高活性的NK蛋白。此時所得溶液為高濃度的含有納豆激酶的溶液。
5)表達產(chǎn)物的鑒定首先利用SDS-PAGE鑒定表達產(chǎn)物的濃度樣品處理液SDS 1g，Glycerol 5mL，溴酚藍(BPB)固體痕量，二硫蘇糖醇(DDT)2.5mL，B液25mL，加去離子水至50mL取酶切后納豆激酶溶液10ul，加入2ul樣品處理液，至沸水浴5分鐘。點樣量為5ul/孔。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量同樣處理。用考馬氏亮藍R-250染色。
表達產(chǎn)物的纖溶活性鑒定配制含有纖維蛋白原和凝血酶原的側(cè)活平板，以及用作參比的尿激酶活性梯度溶液(100u，200u，300u，400u，500u)。通過測量溶圈直徑可知表達產(chǎn)物活性。
實施例二納豆激酶原液制備納豆激酶粗品在含有高濃度納豆激酶的溶液中，在攪拌的過程中逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為30％，靜置鹽析4小時或冰浴中過夜，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取沉淀，用10倍沉淀體積的含有10％甘油的Tris緩沖液將沉淀溶解；12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清。在Tris緩沖液中透析過夜，即得到高濃度的納豆激酶粗品，可進行SDS-PAGE分析后進行活性測定，活性約為62000u/ml。
實施例三納豆激酶原液制備納豆溶液精品在高濃度的含有納豆激酶的溶液中，迅速調(diào)整其PH值到10(注意防止納豆激酶在其等電點8.7附近聚沉)。配制上柱緩沖液MCAC-0 MCAC-100020mM Tris鹽酸PH10.020mM Tris鹽酸PH10.00.5M NaCl 0.5M NaCl
10％(v/v)甘油(可調(diào)整至20％)10％(v/v)甘油1M咪唑用MCAC-0溶液清洗鎳離子親和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)柱材，然后把柱材和納豆激酶溶液共育，室溫(冰上更佳)輕搖30min。然后上柱，分別用MCAC-0和MCAC-50洗脫雜蛋白，最后用MCAC150洗脫目的蛋白。將所得產(chǎn)物透析過夜，即得到高純度的納豆激酶精品。進行SDS-PAGE分析和活性檢測，活性約為39000u/ml。產(chǎn)物可以用于進一步制作成成品。
實施例四簡化重組表達載體制備納豆激酶粗品按照實施例一和例二的方法制備納豆激酶粗品，區(qū)別在于設(shè)計proNK的引物時，在下游引物末端去掉HIS標(biāo)簽序列，具體流程為1)取Bacillus Subtilis Natto的凍存菌株1ul接種于5mlLB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm/min搖動培養(yǎng)基16小時(不可過長，防止形成芽孢)。菌液1∶20稀釋，然后取1ul作為PCR模板。設(shè)計合成PCR引物，用于擴增proNK基因，PCR引物的5`、3`末端含有限制性內(nèi)切酶位點上游引物NKs5`-3`CAT AGATCT GCCGGAAAAAGCAG下游引物NKa5`-3`TGA GAATTC TAATTGTGCAGCTGCTTGTAC引物稀釋成50pmol/ul待用。然后利用熱啟動PCR的方法將proNK基因克隆出來PCR反應(yīng)體系50ulddH2O 40ul10*PCR BUFFER 5uldNTP1ul模板 1ul上/下游引物 1ulpfu酶 1ulPCR反應(yīng)條件94℃8min94℃30s65℃30s72℃2min40s20循環(huán)94℃30s55℃30s
72℃2min40s20循環(huán)72℃10min反應(yīng)結(jié)束之后，取PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測為與1.1kb左右位置處的一條亮帶即為目的基因(proNK)的大小。
2)凝膠回收目的基因，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI將其切成粘性末端，同樣處理pGEX-6p載體，加入T4DNA連接酶，4℃連接12小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，利用酶切和PCR的方法鑒定正確，然后核苷酸序序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，構(gòu)建成功pGEX-6p-proNK載體。
設(shè)計PDI的引物，包含酶切位點上游引物PDI-PPs5`-3`TA GAATTC CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC ATGCTGCGCCGCGC下游引物PDI-PPa5`-3`CT GTCGAC CAGTTCATCTTTCACAGPCR反應(yīng)條件(Tag酶)94℃8min94℃30s65℃30s72℃1min30循環(huán)72℃10min瓊脂糖凝膠電泳檢測PDI條帶位于700bp左右，膠回收目的基因，用EcoRI和SalI將基因酶切成粘性末端，接入用EcoRI和XhoI酶切后的pGEX-6p-proNK載體，加入T4DNA連接酶，4℃連接12小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，利用酶切和PCR的方法鑒定正確，然后核苷酸序序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，構(gòu)建成功pGEX-6p-proNK-pp-PDI高效表達載體(簡寫為6pNP)。
3)將正確的6pNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選出單斑克隆，在5mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按照1∶100轉(zhuǎn)接，在搖瓶中37℃培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6，按照1∶5000加入IPTG儲液，30℃培養(yǎng)4-6小時(時間延長會顯著提高產(chǎn)量)，離心收集菌體，保存于-20℃或者立即進入下步純化。
同時將含有PPase的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，同樣操作挑選單斑克隆，在5mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，然后1∶100轉(zhuǎn)接，搖瓶培養(yǎng)37℃至OD為0.6，按照1∶1000加入IPTG儲液，30℃培養(yǎng)6小時，離心收集菌體，取適當(dāng)與6pNP菌體混合(菌體質(zhì)量比值約為1∶50)。
4)配制適合保存酶活的緩沖體系Tris6.057g/LNaCl2.925g/LEDTA0.186g/L甘油50ml/L用緩沖液洗滌混合后的菌體沉淀，用20-40ml體積重懸約500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100幫助裂解細菌(可選)，用冰水混合物環(huán)境下超聲破菌(2s超聲，5s間歇，全長45min，保護溫度44℃)，12000rpm/min離心20min，收集上清液。再次調(diào)整PH為7.0左右，振蕩反應(yīng)約4h(冰上操作有助于提高產(chǎn)物活性，需要延長作用時間至10h左右，加入DTT有助于優(yōu)化反應(yīng))。這樣重組蛋白基本被PPase酶切完全，釋放出proNK蛋白。ProNK蛋白自剪切釋放出高活性的NK蛋白。此時所得溶液為高濃度的含有納豆激酶的溶液。
5)在含有高濃度納豆激酶的溶液中，在攪拌的過程中逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為30％，靜置鹽析4小時或冰浴中過夜，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取沉淀，用10倍沉淀體積的含有10％甘油的Tris緩沖液將沉淀溶解；12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清。在Tris緩沖液中透析過夜，即得到高濃度的納豆激酶粗品，可進行SDS-PAGE分析后進行活性測定，活性約為60000u/ml。
proNK基因的核苷酸序列g(shù)ccggaaaaagcagtacagaaaagaaatacattgtcggatttaagcagacaatgagtgccatgagttccgccaagaaaaaggatgttatttctgaaaaaggcggaaaggttcaaaagcaatttaagtatgttaacgcggccgcagcaacattggatgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagatccgagcgttgcatatgtggaagaagatcatattgcacatgaatatgcgcaatctgttccttatggcatttctcaaattaaagcgccggctcttcactctcaaggctacacaggctctaacgtaaaagtagctgttatcgacagcggaattgactcttctcatcctgacttaaacgtcagaggcggagcaagcttcgttccttctgaaacaaacccataccaggacggcagttctcacggtacgcatgtcgccggtacgattgccgctcttaataactcaatcggtgttctgggcgtagcgccaagcgcatcattatatgcagtaaaagtgcttgattcaacaggaagcggccaatatagctggattattaacggcattgagtgggccatttccaacaatatggatgttatcaacatgagccttggcggacctactggttctacagcgctgaaaacagtagttgataaagcggtttccagcggtatcgtcgttgctgccgcagccggaaacgaaggttcatccggaagcacaagcacagtcggctaccctgcaaaatatccttctactattgcagtaggtgcggtaaacagcagcgaccaaagagcttcattctccagcgtaggttctgagcttgatgtaatggcccctggcgtgtccatccaaagcacacttcctggaggcacttacggcgcttataacggaacgtccatggcgactcctcacgttgccggagcagcagcgctaattctttctaagcacccgacttggacaaacgcgcaagtccgtgatcgtttagaaagcactgcaacatatcttggaaactctttctactatggaaaagggttaatcaacgtacaagcagctgcacaataaproNK蛋白的氨基酸序列AGKSSTEKKYIVGFKQTMSAMSSAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVNAAAATLDEKAVKELKKDPSVAYVEEDHIAHEYAQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLGGPTGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSTSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSDQRASFSSVGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAAULSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAHPDI基因的核苷酸序列atgctgcgccgcgctctgctgtgcctgccgtggcccgccctggtgcgcgccgacgcccccgaggaggaggaccacgtcttggtgctgcggaaaagcaacttcgcggaggcgctggcggcccacaagtacccgccggtggagttccatgccccctggtgtggccactgcaaggctctggcccctgagtatgccaaagccgctgggaagctgaaggcagaaggttccgagatcaggttggccaaggtggacgccacggaggagtctgacctagcccagcagtacggcgtgcgcggctatcccaccatcaagttcttcaggaatggagacacggcttcccccaaggaatatacagctggcagagaggctgatgacatcgtgaactggctgaagaagcgcacgggcccggctgccaccaccctgcctgacggcgcagctgcagagtccttggtggagtccagcgaggtggccgtcatcggcttcttcaaggacgtggagtcggactctgccaagcagtttttgcaggcagcagaggccatcgatgacataccatttgggatcacttccaacagtgacgtgttctccaaataccagctcgacaaagatggggttgtcctctttaagaagtttgatgaaggccggaacaactttgaaggggaggtcaccaaggagaacctgctggactttatcaaacacaaccagctgccccttgtcatcgagttcaccgagcagacagccccgaagatttttggaggtgaaatcaagactcacatcctgctgttcttgcccaagagtgtgtctgactatgacggcaaactgagcaacttcaaaacagcagccgagagcttcaagggcaagatcctgttcatcttcatcgacagcgaccacaccgacaaccagcgcatcctcgagttctttggcctgaagaaggaagagtgcccggccgtgcgcctcatcaccttggaggaggagatgaccaagtacaagcccgaatcggaggagctgacggcagagaggatcacagagttctgccaccgcttcctggagggcaaaatcaagccccacctgatgagccaggagctgccggaggactgggacaagcagcctgtcaaggtgcttgttgggaagaactttgaagacgtggcttttgatgagaaaaaaaacgtctttgtggagttctatgccccatggtgtggtcactgcaaacagttggctcccatttgggataaactgggagagacgtacaaggaccatgagaacatcgtcatcgccaagatggactcgactgccaacgaggtggaggccgtcaaagtgcacggcttccccacactcgggttctttcctgccagtgccgacaggacggtcattgattacaacggggaacgcacgctggatggttttaagaaattcctagagagcggtggccaagatggggcaggggatgttgacgacctcgaggacctcgaagaagcagaggagccagacatggaggaagacgatgaccagaaagctgtgaaagatgaactgtaaPDI蛋白的氨基酸序列MLRRALLCLPWXALVRADAPEEEDHVLVLRKSNFAEALAAHKYPPVEFHAPWCGHCKALAPEYAKAAGKLKAEGSEIRLAKVDATEESDLAQQYGVRGYPTIKFFRNGDTASPKEYTAGREADDIVNWLKKRTGPAATTLPDGAAAESLVESSEVAVIGFFKDVESDSAKQFLQAAEAIDDIPFGITSNSDVFSKYQLDKDGVVLFKKFDEGRNNFEGEVTKENLLDFIKHNQLPLVIEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQELPEDWDKQPVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVFVEFYAPWCGHCKQLAPIWDKLGETYKDHENIVIAKMDSTANEVEAVKVHGFPTLGFFPASADRTTVIDYNGERTLDGFKKFLESGGQDGAGDVDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAVKDEL
權(quán)利要求
1.一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于構(gòu)建含有前導(dǎo)肽序列的納豆激酶基因克隆，加入GST蛋白標(biāo)簽和PDI的分子伴侶幫助目的基因在大腸桿菌中高效表達，在序列中內(nèi)嵌入HIS標(biāo)簽和蛋白酶切位點幫助目的蛋白高效提純，以及生物活性的鑒定，具體方法為1)以Bacillus Subtilis Natto菌體為模板，根據(jù)納豆激酶(Nattokinase，簡稱NK)全長序列設(shè)計引物，通過PCR的方法獲得包含前導(dǎo)肽的全長納豆激酶基因，稱為proNK；在proNK基因的3′末端增加HIS標(biāo)簽序列(六個連續(xù)的組氨酸，HIS6)，再將proNK加HIS標(biāo)簽的基因克隆進入pGEX-6P載體；接著利用PCR將分子伴侶PDI的全長基因克隆出來接到proNK基因的3′末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease(簡稱PPase)蛋白酶切位點序列(序列用pp表示)，這樣組裝成為高效表達載體pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI，簡稱6pNHP；相應(yīng)表達出的重組蛋白為GST-pp-proNK-HIS6-pp-PDI；2)6pNHP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達；同時將含有PPase的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，一起誘導(dǎo)表達；然后將兩種菌體按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris緩沖液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整PH值，低溫振蕩使PPase將重組蛋白酶切完全，釋放出proNK蛋白，從而得到高濃度的含有納豆激酶的溶液；進行蛋白定量分析和活性測定；4)將含有納豆激酶的溶液進行純化處理。
2.如權(quán)利要求1所述的制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于在高濃度的含有納豆激酶的溶液中，逐滴加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為30％，靜置鹽析4小時或過夜，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取沉淀，用10倍沉淀體積的含有10％甘油的Tris緩沖液將沉淀溶解；12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清；透析過夜，即得到高濃度的納豆激酶粗品，可進行SDS-PAGE分析后進行活性測定。
3.如權(quán)利要求1所述的制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于在高濃度的含有納豆激酶的溶液中，調(diào)整PH值到10，然后上鎳離子親和柱(Ni-NTAHis-Bind Resin)，用10％甘油的緩沖溶液上柱，25mM咪唑洗脫雜蛋白，100mM咪唑洗脫目的蛋白；透析過夜，即得到高純度高活性納豆激酶的精品；進行SDS-PAGE分析和活性測定。
4.如權(quán)利要求1或2所述的制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于構(gòu)建含有前導(dǎo)肽序列的納豆激酶基因克隆，加入GST蛋白標(biāo)簽和PDI的分子伴侶幫助目的基因在大腸桿菌中高效表達，在序列中內(nèi)嵌入蛋白酶切位點幫助目的蛋白提純，以及生物活性的鑒定；HIS標(biāo)簽對于粗純化納豆激酶溶液不是必須的，這樣就可以簡化序列構(gòu)建方案，具體方法為1)以Bacillus Subtilis Natto菌體為模板，根據(jù)納豆激酶全長序列設(shè)計引物，通過PCR的方法獲得包含前導(dǎo)肽的全長納豆激酶基因，稱為proNK；將proNK的基因克隆進入pGEX-6P載體；接著利用PCR將分子伴侶PDI的全長基因克隆出來接到proNK基因的3′末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease(簡稱PPase)蛋白酶切位點序列(序列用pp表示)，這樣組裝成為高效表達載體pGEX-6p-proNK-pp-PDI，簡稱6pNP；相應(yīng)表達出的重組蛋白為GST-pp-proNK-pp-PDI；2)6pNP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達；同時將含有PPase的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，一起誘導(dǎo)表達；然后將兩種菌體按比例收集在一起；3)用含有10％甘油的Tris緩沖液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整PH值，低溫振蕩使PPase將重組蛋白酶切完全，釋放出proNK蛋白，從而得到高濃度的含有納豆激酶的溶液；進行蛋白定量分析和活性測定；4)在高濃度的含有納豆激酶的溶液中，逐滴加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為30％，靜置鹽析4小時或過夜，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取沉淀，用10倍沉淀體積的含有10％甘油的Tris緩沖液將沉淀溶解；12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；取上清；透析過夜，即得到高濃度的納豆激酶粗品，可進行SDS-PAGE分析后進行活性測定。
5.如權(quán)利要求1所述的制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于PDI伴侶分子對于納豆激酶的可溶性表達具有關(guān)鍵的輔助作用，而它們和proNK的相對位置是可變的；最終的重組蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，HIS6-proNK-PDI，HIS6-PDI-proNK，以及非重組蛋白的狀態(tài)(PDI與proNK或NK同時混合于溶液中)均可以提高納豆激酶的可溶性表達。
6.如權(quán)利要求1所述的制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于GST與PDI伴侶分子的同時存在對于納豆激酶的可溶性表達具有關(guān)鍵的輔助作用，而它們和proNK的相對位置是可變的；最終的重組蛋白包含GST-proNK-PDI，GST-PDI-proNK，proNK-GST-PDI，proNK-PDI-GST，PDI-GST-proNK，PDI-proNK-GST以及非重組蛋白的狀態(tài)(GST以及PDI與proNK或NK三者同時混合于溶液中)均可以提高納豆激酶的可溶性表達。
全文摘要
一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，特別是涉及納豆激酶表達載體的構(gòu)建、表達和純化工藝，解決了一般的基因工程重組表達的方法導(dǎo)致納豆激酶以包涵體的形式出現(xiàn)在表達產(chǎn)物當(dāng)中的問題。本發(fā)明方法包括表達全長的帶有前導(dǎo)肽的納豆激酶基因以提高活性，加入重要的分子伴侶PDI幫助蛋白正確折疊、利用GST標(biāo)簽提高蛋白可溶性、利用硫酸銨沉淀法快速提純產(chǎn)品、加入HIS蛋白標(biāo)簽幫助產(chǎn)物進一步純化等等。這樣的納豆激酶產(chǎn)品純度高，產(chǎn)量高，活性高，成本低，生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。產(chǎn)物可以制作藥物或者口服保健品，利于向大眾推廣，成為新一代的溶栓產(chǎn)品。
文檔編號C12N9/12GK1995343SQ20061016805
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者李慧潔, 楊秀桃 申請人:李慧潔, 楊秀桃