專利名稱：一種截短的抑癌基因p53增加人肺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種缺失C-末端的p53基因及其重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞能夠增強(qiáng)腫瘤對(duì)抗腫瘤藥物的藥物敏感性。
背景技術(shù)：
肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。從全球范圍看，肺癌死亡率居惡性腫瘤第一位(2003年WTO國(guó)際癌癥中心統(tǒng)計(jì))，每年新增病例120萬(wàn)人。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示肺癌死亡率急劇上升，肺癌居城鎮(zhèn)居民惡性腫瘤死亡率第一(2003年全國(guó)惡性腫瘤調(diào)查資料)。
手術(shù)切除，化學(xué)藥物及放射是肺癌的三種主要治療方法。由于大約2/3肺癌病人在診斷時(shí)已為晚期，沒有施行手術(shù)的條件，可采用化學(xué)藥物及放射治療。近年來(lái)，盡管新藥不斷問(wèn)世，但治療效果仍未得到根本改善，目前仍採(cǎi)用以細(xì)胞毒藥物—鉑類化合物為主的治療方案，其治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)有效率僅為20-30％，中位生存期僅6-8個(gè)月。以細(xì)胞毒藥物為主的藥物治療存在的主要問(wèn)題是腫瘤對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致治療失敗。因此，研究克服腫瘤耐藥性，增加藥物敏感性的方法和機(jī)理是十分必要的。
人癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的耐受(或不敏感)機(jī)理十分復(fù)雜，目前尚不完全清楚。細(xì)胞毒藥物通過(guò)干擾細(xì)胞DNA合成及復(fù)制，產(chǎn)生自由基，改變細(xì)胞膜通透性，影響細(xì)胞代謝等多種途徑和機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。事實(shí)上，癌細(xì)胞的分子異常及機(jī)體的遺傳背景也導(dǎo)致了細(xì)胞產(chǎn)生多種因素對(duì)抗藥物的作用，如藥物靶點(diǎn)的異常改變，存活和生長(zhǎng)信號(hào)的擴(kuò)增，藥物誘發(fā)DNA破壞的修復(fù)，細(xì)胞膜運(yùn)輸藥物出入的障礙等以及機(jī)體對(duì)藥物的活化和減毒所引起的藥物殺傷作用和機(jī)體的對(duì)抗作用之間的不平衡導(dǎo)致細(xì)胞存活或死亡的優(yōu)勢(shì)，決定了細(xì)胞對(duì)藥物的耐受或敏感性.因此判斷藥物效果的關(guān)鍵是腫瘤細(xì)胞死亡的數(shù)量和受抑制程度。細(xì)胞程序性死亡(Apoptosis)是細(xì)胞重要的死亡途徑。Apoptosis的外源和內(nèi)源性兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路分子的異常，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性(或不敏感)的重要分子基礎(chǔ)。
抑癌基因p53在細(xì)胞誘導(dǎo)Apoptosis兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路上起著重要作用。p53蛋白作為特殊序列轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)刺激的應(yīng)急反應(yīng)，可轉(zhuǎn)錄活化Apoptosis信號(hào)傳導(dǎo)通路的分子。P53表現(xiàn)為在多個(gè)水平上和以多種機(jī)制調(diào)節(jié)Apoptosis.P53異常所導(dǎo)致的Apoptosis信號(hào)傳通路的異常，在腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性(或不敏感)中起重要作用。在肺癌中p53基因異常率較其它腫瘤高。在NSCLC中，突變率約在50％以上。基礎(chǔ)和臨床的研究報(bào)告均證明了不同p53基因狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物具有不同的敏感性。P53突變的瘤細(xì)胞明顯耐受抗腫瘤藥物。將外源重組P53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到缺失P53的癌細(xì)胞可以增加細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感和經(jīng)腺病毒界導(dǎo)p53到荷瘤裸鼠也可以增加腫瘤對(duì)抗腫瘤藥物敏感，顯示了p53在克服腫瘤細(xì)胞耐藥性，增加抗腫瘤藥物敏感性中起重要作用。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)p53去除C-末端后比全長(zhǎng)-p53在增加肺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感性的作用更有意義。也就是說(shuō)業(yè)已證明了的癌細(xì)胞中由p53基因異常所導(dǎo)致的對(duì)抗腫瘤藥物耐受可通過(guò)外源全長(zhǎng)p53改善，而本發(fā)明人又發(fā)現(xiàn)了在p53去除C-末端后更能增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感。提示p53C-末端DNA序列與肺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感性有關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見去除C-末端p53增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性的報(bào)告。
p53蛋白由393個(gè)氨基酸構(gòu)成(N端1~99，蛋白中心區(qū)99~291，C端291~393)。中心區(qū)與特殊DNA序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄活化下游靶基因，是實(shí)現(xiàn)p53抑癌功能和誘導(dǎo)Apoptosis的最重要基礎(chǔ)。中央?yún)^(qū)連結(jié)特殊DNA序列和轉(zhuǎn)錄活化靶基因受到多個(gè)水平的調(diào)節(jié)。其中p53C-末端對(duì)中央?yún)^(qū)有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。因此干擾或去除p53C-術(shù)端負(fù)性調(diào)節(jié)，有可能增加p53活性。當(dāng)C-末端被抗體封閉，被磷酸化，或去除C-末端等都能在體外試驗(yàn)條件下增強(qiáng)中央?yún)^(qū)與特殊DNA的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄能力，增強(qiáng)p53抑癌功能。合成的C末端肽可恢復(fù)癌細(xì)胞中突變p53活性。近來(lái)，有作者報(bào)告影響Apoptosis的重要分子IGFβ-3轉(zhuǎn)錄活化的作用，證明了p53C-末端抑制p53的活化和誘導(dǎo)Apoptosis。體外試驗(yàn)證明，合成的p53C-末端多肽，與全長(zhǎng)-p53相比更能增強(qiáng)攜帶野生型p53和攜帶突變型p53癌細(xì)胞誘導(dǎo)的Apoptosis的能力。但去除C-末端p53和C末端肽作用的機(jī)理復(fù)雜，仍不清楚。但從理論上，去除C-末端后，增加p53 apoptosis功能從而增加抗腫瘤藥物敏感性是可能的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種截短的抑癌基因p53及其重組質(zhì)粒，和轉(zhuǎn)基因人肺癌細(xì)胞株。提供了該基因重組的缺陷型腺病毒質(zhì)粒及制備的腺病毒。證明了將該重組質(zhì)粒及腺病毒轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞能夠增強(qiáng)腫瘤對(duì)抗腫瘤藥物藥物的敏感性，提示了p53C-末端缺失的編碼核苷酸和終止密碼子后非編碼核苷酸序列，可能是抑制抗腫瘤藥物作用的部位，從理論上拓寬了對(duì)肺癌耐藥性(或藥物敏感性)的認(rèn)識(shí)。而且在研發(fā)增加抗腫瘤藥物敏感性的相關(guān)分子，以提高肺癌治療效果方面有很好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種截短的抑癌基因p53，相對(duì)于全長(zhǎng)p53基因，去掉了編碼C-末端的第356-393位37個(gè)氨基酸的核苷酸序列，并同時(shí)缺失終止密碼子后的非編碼序列。缺失的C-末端編碼的第356-393位氨基酸的核苷酸序列如下aaggagccaggggggag cagggctcac tccagccacc tgaagtccaa aaagggtcag tctacctccc gccataaaaa actcatgttcaagacagaag ggcctgactc agac。
本發(fā)明還提供一種重組的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有上述截短的p53基因。
本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因人肺癌單克隆細(xì)胞株，它是由上述重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系獲得。
本發(fā)明還提供一種含有上述截短的抑癌基因p53的缺陷型腺病毒重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒的制備方法包括如下步驟(1)將上述截短的抑癌基因p53與pAd-Track質(zhì)粒聯(lián)接，構(gòu)建pAd-Track-p53重組質(zhì)粒；(2)將步驟(1)中的pAd-Track-p53重組質(zhì)粒與E1、E3聯(lián)合缺失的5型腺病毒骨架Easy共轉(zhuǎn)染大腸桿菌，通過(guò)在大腸桿菌中質(zhì)粒間同源重組得到缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒Tracd-eazy-p53。
同時(shí)，本發(fā)明還提供一種缺陷型腺病毒，它是由上述制備方法得到的缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒Tracd-eazy-p53轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞制得。
本發(fā)明還提供一種p53的C-末端DNA序列，它是全長(zhǎng)抑癌基因p53的編碼位于C-末端的第356-393位氨基酸的核苷酸序列，具體地是aaggagc caggggggag cagggctcactccagccacc tgaagtccaa aaagggtcag tctacctccc gccataaaaa actcatgttc aagacagaagggcctgactc agac。
同時(shí)，本發(fā)明還提供一種p53蛋白的C-末端356-393位37個(gè)氨基酸多肽，它是由上述p53的C-末端DNA序列編碼，該多肽是KEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明證明了去C-末端P53與增加人肺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感性有關(guān)，拓寬了對(duì)肺癌耐藥性(或藥物敏感性)的認(rèn)識(shí)，具有重要的理論意義，而且在研發(fā)增加抗腫瘤藥物敏感性的相關(guān)分子，以提高肺癌治療效果方面有很好的應(yīng)用前景。


圖1.pEGFP-p53(del)測(cè)序結(jié)果。
圖2.pEGFP-p53(total)測(cè)序結(jié)果。
圖3.檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株pEGFP801D重組質(zhì)粒上GFP(綠色熒光蛋白)表達(dá)的結(jié)果。
圖4.檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株外源p53基因結(jié)果，圖中，1.分子標(biāo)記，2.pEGFPp53(total)，3.pEGFPp53(del)，4.pEGFP。
圖5.Adp53(del)增加了荷肺癌裸鼠對(duì)順伯(DDP)的敏感性結(jié)果。
圖6.Adp53(del)增加了荷肺癌裸鼠對(duì)諾維本(NVB)的敏感性結(jié)果。
圖7.Adp53(del)增加了荷肺癌裸鼠對(duì)泰素(TAX)的敏感性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
1、構(gòu)建重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞株(1)構(gòu)建去除C末端的p53和全長(zhǎng)p53真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。
構(gòu)建去C末端的p53重組質(zhì)粒p53來(lái)源于cDNA重組質(zhì)粒pc-p53-SN(由美國(guó)FOXChase癌中心提供)。按照所需去除p53蛋白C未端編碼堿基序列，即去除C末端終止密碼子前111個(gè)堿基和所有非編碼堿基序列。設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物引物15-aagctt(HidIII)ggcacg agc cac cgt cca ggg agc agg tag-3，引物23-ggatcc(BamH1)agt ccc agc ctgggc atc ctt gag ttc-5。用PCR方法擴(kuò)增所需的p53基因片段，定向插入到質(zhì)粒pEGFP-N1)HidIII和BamH1多克隆位點(diǎn)，測(cè)序證明p53基因?yàn)檎蜻B接于pEGFP-N1，顯示p53的C末端終止密碼子前有111個(gè)堿基缺失和終止密碼子后的所有非編碼序列缺失(圖2)，獲去除C未端的人p53基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-p53(del)。
構(gòu)建含p53全長(zhǎng)的真核表達(dá)質(zhì)粒用BamHI酶切重組質(zhì)粒PC-p53-SN，獲1.8kbp53cDNA，從pEGFP-N1質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)Baml插入，獲全長(zhǎng)p53真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-p53(total)。測(cè)序證明p53基因?yàn)檎蜻B結(jié)，pEGFPp53(total)沒有p53堿基缺失(圖1)空載質(zhì)粒為pEGFP。
構(gòu)建去除C末端p53重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-p53(del)也可用文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的方法(汪惠等，中華腫瘤雜志，2003年11月第25卷第6期)2、建立轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞株細(xì)胞系人肺癌細(xì)胞系801D由解放軍第301醫(yī)院建立和贈(zèng)送。801D細(xì)胞的p53基因在248位密碼有雜合缺失和存在CGG→CTT顛換，有p53突變蛋白表答。轉(zhuǎn)染pEGFP、pEGFP-p53(del)和pEGFP-53(total)到801D細(xì)胞，經(jīng)G418篩選耐受集落，每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的耐受集落分別經(jīng)稀釋法于96孔板篩選單細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)，傳代后建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞株pEGFP801D、pEGFP-p53(del)801D和pEGFP-53(total)801D.pEGFP801D、pEGFP-p53(del)801D，GFP均表達(dá)，pEGFP-53(total)801D不表達(dá)，請(qǐng)參見圖3。PCR證明外源p53基因存在于pEGFP-p53(del)801D和pEGFP-53(total)801D，請(qǐng)參見圖4。
3、體外藥物敏感試驗(yàn)經(jīng)體外MTT法比較了pEGFP-p53(del)801，DEGFP-p53(total)801D，PEGFP801，801D四種細(xì)胞對(duì)五種抗腫瘤藥物(順伯(DDP)，泰素(TAX)，諾維本(NVB)，鍵擇(GEM)，五氟尿嘧啶(5FU))敏感性，發(fā)現(xiàn)pEGFP-p53(total)801D僅對(duì)三種藥物(順伯，泰素，五氟尿嘧啶)敏感。pEGFP-p53(del)對(duì)五種藥物都敏感，而且凋亡細(xì)胞比率增加，具體結(jié)果見表1至表5。
表1801D及3種細(xì)胞株對(duì)各種細(xì)胞毒藥物的IC50比較

所得數(shù)據(jù)為3-4次實(shí)驗(yàn)的平均值。其中，*為與801D相比，P＜0.05 #為與pEGFP801D相比，P＜0.05 Δ為pEGFP-p53(del)801D與801D，pEGFP801D，PEGFPp53(wtp)801D相比，P＜0.05。
表2DDP處理各轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的細(xì)胞周期改變

表3TAX處理各轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的細(xì)胞周期改變

表45FU處理的細(xì)胞周期改變

表5NVB處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株細(xì)胞周期改變

4、構(gòu)建缺陷型重組腺病毒p53采用He.T.C(1998年)建立的Ad Track-Eazy轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，傳遞外源基因。質(zhì)粒由北京腫瘤研究所提供。去C-末端p53重組質(zhì)粒Track-P53(del)和全長(zhǎng)p53(1.8kbp)Track-P53質(zhì)粒的構(gòu)建。方法用HindIII和BamH1酶切重組質(zhì)粒pEGFP-p53(del)獲得去C-末端的P53片段。經(jīng)TrackHidIII和BigII(BamH1同尾酶)多克隆位點(diǎn)定向插入，測(cè)序證明p53基因正向連接于Track，經(jīng)測(cè)序和gene bank公共數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)blast證明顯示p53的C末端終止密碼子前有111個(gè)堿基缺失和終止密碼子后的所有非編碼序列缺失，獲去除C未端的人p53基因重組質(zhì)粒，Track-P53(del)。
構(gòu)建含p53全長(zhǎng)的表達(dá)質(zhì)粒用BamHI酶切重組質(zhì)粒PEGFP-p53獲得去C-末端的P53片段，從Track質(zhì)粒BamHI多克隆位點(diǎn)插入，獲全長(zhǎng)p53真核表達(dá)質(zhì)粒Track-p53(total)。測(cè)序證明p53基因?yàn)檎蜻B結(jié)，沒有p53堿基缺失.構(gòu)建去C-末端重組質(zhì)粒Track-P53(total).Track(空載體)無(wú)p53存在。
5、制備缺陷型腺病毒將三種重組質(zhì)粒Track-P53(total)，Track-P53(del)，Track，用電轉(zhuǎn)移方法分別與5型腺病毒骨架Easy(已去除E1和E3)共轉(zhuǎn)染大腸桿菌在大腸桿菌中質(zhì)粒間同源重組，經(jīng)瓊脂電泳DNA分析得到不同構(gòu)象重組體，進(jìn)一步用BamH1和pacI酶切重組體，瓊脂電泳證明和篩選出Track-Eazy，Track-Eazy-p53(del)，Track-Eazy-p53(total)三種重組體，將其分別轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，得到三種缺陷型腺病毒Ad-，Ad-p53(del)，Ad-p53(total)。
用MOI(Multiplicity of infection)方法測(cè)定病毒濃度。
6、進(jìn)行體外病毒感染人肺癌801D細(xì)胞實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明50倍于細(xì)胞數(shù)量的三種病毒，48小時(shí)后50％以上細(xì)胞被感染。集落形成試驗(yàn)證明，與Ad-P53(tota)l，Ad-感染的細(xì)胞相比，Ad-P53(del)集落形成降低。
7、荷瘤裸鼠體內(nèi)藥物敏感性初步試驗(yàn)每次試驗(yàn)一種藥物，方法為體外分別以50倍于細(xì)胞數(shù)量的三種病毒Ad-，Ad-53(del)，Ad-P53(total)感染801D細(xì)胞。行裸鼠移植，共分6組，三組分別為已行裸鼠移植的三種病毒感染細(xì)胞，同時(shí)腹腔注射同一種藥物為試驗(yàn)組，另三組為僅行三種病毒感染細(xì)胞裸鼠移植，而無(wú)注射藥物對(duì)照組。以成瘤率，平均瘤重，抑瘤率為藥物敏感指標(biāo)。荷瘤裸鼠體內(nèi)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表6、表7和圖5至圖7。
表6Ad-p53(DEL)與Ad-p53感染801D細(xì)胞與藥物合并腫瘤移植率的比較

表7Ad-p53(DEL)與Ad-p53腫瘤重量和抑瘤率的比較

+加入藥物組 -不加藥物組
權(quán)利要求
1.一種截短的抑癌基因p53，其特征為相對(duì)于全長(zhǎng)p53基因，缺失編碼C-末端的第356-393位氨基酸的核苷酸序列及同時(shí)缺失終止密碼子后的非編碼序列。
2.一種真核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒，其特征為含有權(quán)利要求1所述的基因。
3.一種轉(zhuǎn)基因人肺癌單克隆細(xì)胞株，其特征為它由權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系獲得。
4.一種缺陷型腺病毒重組質(zhì)粒，其特征為含有權(quán)利要求1的基因。
5.如權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒的制備方法，包括如下步驟(1)將權(quán)利要求1所述的基因與Track質(zhì)粒聯(lián)接，構(gòu)建Track-P53重組質(zhì)粒；(2)將步驟(1)中的Track-P53重組質(zhì)粒與E1、E3聯(lián)合缺失的5型腺病毒骨架Easy共轉(zhuǎn)染大腸桿菌，通過(guò)在大腸桿菌中質(zhì)粒間同源重組得到缺陷型腺病毒重組質(zhì)粒Tracd-eazy-p53。
6.一種缺陷型腺病毒，其特征為它是由權(quán)利要求5得到的重組缺陷型腺病毒質(zhì)粒Tracd-eazy-p53轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞獲得。
7.一種截短的p53蛋白，其特征為由權(quán)利要求1的基因所編碼。
8.p53基因的C-末端DNA序列，其特征為它是全長(zhǎng)抑癌基因p53的編碼位于C-末端的第356-393位氨基酸的核苷酸序列。
9.一種p53蛋白C-末端多肽，其特征在于是由權(quán)利要求8所述的DNA序列編碼的p53蛋白C-末端第356-393位37個(gè)氨基酸組成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種截短的抑癌基因p53及其重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因人肺癌細(xì)胞株。提供了該基因重組的缺陷型腺病毒質(zhì)粒及制備的腺病毒。相對(duì)于全長(zhǎng)p53基因，截短的p53基因缺失編碼C－末端的第356－393位氨基酸的核苷酸序列及終止密碼子后的非編碼序列。本發(fā)明證明了將其p53轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞，能夠增強(qiáng)腫瘤對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，提示出p53C－末端缺失的核苷酸序列可能是抑制抗腫瘤藥物作用的部位。從理論上拓寬了對(duì)肺癌耐藥性(或藥物敏感性)的認(rèn)識(shí)，而且在研發(fā)增加抗腫瘤藥物敏感性的生物藥物，以提高肺癌治療效果方面有著潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1970763SQ200610168190
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月18日
發(fā)明者汪惠, 賴百塘, 李金照 申請(qǐng)人:北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所