專利名稱：根據(jù)人類hiv病毒株的表型藥物敏感性控制hiv陽性病人化療的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制HIV陽性病人化療的方法，以及醫(yī)生根據(jù)人類HIV病毒株對HIV pol基因的一種或多種酶的抑制劑的表型藥物敏感性用于治療該病人的臨床控制儀器，以及同時確定HIV pol基因的二種或多種酶對其抑制劑的表型藥物敏感性的方法。
背景技術(shù)：
迄今，已形成了一些化療方案用于治療HIV感染的病人。其中某些方案已獲批準(zhǔn)用于臨床，其余的則是不斷進(jìn)行的臨床試驗的主題?？梢栽O(shè)想將被批準(zhǔn)的化療方案的數(shù)目在不久的將來將穩(wěn)定地增加。而且，由于在治療期間形成了藥物抗性HIV變異體而使用組合治療或多種藥物治療的方案持續(xù)增加。盡管已顯示這些化療方案對HIV疾病的病毒學(xué)(病毒負(fù)荷)，免疫學(xué)及臨床參數(shù)產(chǎn)生影響，但是實(shí)踐經(jīng)驗告訴我們這些影響是短暫的。特別是，發(fā)現(xiàn)了感染某個病人的HIV病毒株在很短的時間后開始表現(xiàn)出對治療所述病人的藥物和藥物組合的敏感性降低。化療的效力喪失情況隨病人，藥物或藥物組合的不同而變化。已公認(rèn)對特定類型的化療的效力喪失與感染病人的HIV病毒株的基因組中氨基酸改變的基因型相關(guān)。這可能使得這些HIV病毒株對化療的敏感性降低。由于HIV感染的病人在較長的時間內(nèi)接受一些化療方案，在感染的HIV病毒株基因組中出現(xiàn)更復(fù)雜的氨基酸改變形式，這導(dǎo)致目前對感染的病人的進(jìn)一步治療的理性探索失敗。正如以前的解釋所暗示的，可按常規(guī)確定涉及單個或多個抗HIV藥物的不同化療方案的HIV病毒株中出現(xiàn)的基因型改變，但因此更證實(shí)了從這些數(shù)據(jù)信息很難使負(fù)責(zé)安排化療的醫(yī)生確定開始或持續(xù)特定的化療方案是否合理。換句話說，在有限規(guī)模上獲得的基因型信息不能按常規(guī)翻譯成使負(fù)責(zé)醫(yī)生能對病人應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行何種化療作出關(guān)鍵的決定的表型信息。對于被抗藥性HIV病毒株感染的未用藥的病人也存在該問題。
病毒負(fù)荷監(jiān)測已變成HIV治療的一個常規(guī)方面。然而，僅病毒負(fù)荷數(shù)不能用作決定單獨(dú)或者結(jié)合使用何種藥物的基礎(chǔ)。
結(jié)合化療越來越多地成為化療方案的選擇。當(dāng)使用結(jié)合藥物的病人開始經(jīng)歷藥物失敗時，不可能確切的知道哪一種藥物在結(jié)合中不再有活性。人們不可能簡單地替代所有的藥物，因為目前可使用的藥物數(shù)有限。而且如果替換全部化療方案，可能會失去一種或多種對特定病人有活性的藥物。另外，對于對特定抑制劑表現(xiàn)出抗性的病毒也可能表現(xiàn)出對其它抑制劑不同程度的交叉抗性。
因此，理想的是，每次進(jìn)行病毒負(fù)荷試驗并檢測到病毒負(fù)荷增加時，也應(yīng)進(jìn)行藥物敏感/抗性試驗。除非形成了有療效的治療方案，HIV疾病的處理將仍需要這種試驗。
目前確實(shí)存在確定表型方法，它基于從存在供體外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的血漿的病毒分離和在所說細(xì)胞中的隨后表型(Japour，A.J.等，(1993)抗微生物試劑和化療；Vol.37，No.5，p1095-1101)。由AIDS臨床試驗組(ACTG)提倡的這種共同培養(yǎng)方法，特別是對于確定AZT(本文與疊氮胸苷/Retrovir同義(Retrovir是商標(biāo)))抗性的表型，對于在常規(guī)基礎(chǔ)上使用則是費(fèi)時，昂貴且太復(fù)雜。
Kellam，P.和Larder，B.A.(抗微生物試劑和化療，(1994)Vol.38，No.1，p23-30)已建立了表型重組病毒試驗以評價HIV 1型分離株對逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)抑制劑的藥物敏感性。該方法允許經(jīng)過將PCR產(chǎn)生的RT編碼序列庫同源重組進(jìn)RT缺失的非感染性原病毒克隆，pHIVΔRTBstEII中來增殖活病毒。對兩個在疊氮胸苷療程期間的病人的分析表明該方案產(chǎn)生與原始感染的PBL DNA表現(xiàn)出完全相同的基因型和表型的病毒。然而，該方法涉及經(jīng)過共同培養(yǎng)病人血漿或病人PBMCs與供體PBMCs分離病人病毒。這種以前的病毒培養(yǎng)可能改變了原始的病毒組成。而且，該方法盡管允許確定分離株對各種抑制劑的敏感性，但是不能給醫(yī)生提供是繼續(xù)目前的化療方案還是改變療法的信息。
另外，當(dāng)僅研究pol基因的一種酶時，該方法不容易使其產(chǎn)生按常規(guī)涉及使用一種蛋白酶和兩種RT抑制劑的組合療法的常規(guī)表型評價。
在重組病毒試驗中使用的嵌套式PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法可產(chǎn)生的情況是重組病毒不能真實(shí)地反應(yīng)所研究的感染病人的HIV病毒株的情況。該問題起因于DNA序列的同源性和在哺乳動物細(xì)胞中同源重組所需的最小同源量(C.Rubnitz，J.和Subramini，S.(1984)分子和細(xì)胞生物學(xué)Vol.4，No.11，p2253-2258)。因此，以重組病毒研究為基礎(chǔ)的任何表型試驗應(yīng)努力保證盡可能多地擴(kuò)增病人的物質(zhì)且有最大的重組。
因此，采用的RNA提取和嵌套式PCR方法應(yīng)確保病毒的遺傳物質(zhì)被擴(kuò)增，使擴(kuò)增的物質(zhì)最大地反應(yīng)在調(diào)查中病人的病毒遺傳多樣性。
因此，在目前的臨床實(shí)踐中迫切需要(a)迅速且按常規(guī)確定感染特定病人的HIV病毒株的表型藥物敏感性，(b)把由此獲得的數(shù)據(jù)處理成容易理解的信息，及(c)根據(jù)所述信息開始，繼續(xù)或調(diào)整對所述病人實(shí)施的化療。
本發(fā)明的公開內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種控制HIV陽性病人HIV化療的方法，包括用一個經(jīng)過從病人的生物學(xué)材料的樣品分離病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄所述pol基因的所需區(qū)域獲得的HIV pol基因的序列和已缺失該序列的HIV-DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染對HIV感染敏感的細(xì)胞系，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以創(chuàng)造提供循環(huán)病毒抗性情況的指示的嵌合病毒的原種，評價所述嵌合病毒對HIV pol基因編碼的所述酶的抑制劑的表型敏感性并對其指定一個值，構(gòu)建含有所述嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相應(yīng)值的數(shù)據(jù)組，重復(fù)至少二個其它的抑制劑的敏感性評價從而構(gòu)建總共至少三個該數(shù)據(jù)組，以二維或三維圖解形式表示該數(shù)據(jù)組使各數(shù)據(jù)組中嵌合型和野生型敏感性之間的區(qū)別提供嵌合原種對所述抑制劑處理的抗性的肉眼測量值，以及根據(jù)所測量的抗性圖示選擇最佳抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的方法經(jīng)濟(jì)而快捷地得到大量不同的HIV感染的病人的表型信息。該方法可應(yīng)用于所有目前可用的化療方案且預(yù)期同樣可應(yīng)用于將來的化療方案。
根據(jù)本發(fā)明的方法給醫(yī)生提供了病人HIV病毒株的表型數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可立即用于確定是否應(yīng)開始，繼續(xù)或調(diào)整特定的化療方案。
優(yōu)選的是，數(shù)據(jù)組在多邊形或準(zhǔn)圓形圖上表示，該圖含有(a)多個從原點(diǎn)放射延生的標(biāo)準(zhǔn)化軸，每個軸相應(yīng)于一個數(shù)據(jù)組或抑制劑或其組合；(b)軸被標(biāo)準(zhǔn)化使野生型HIV對各種抑制劑的敏感性值在各軸上相等，任選表示野生型HIV的數(shù)據(jù)點(diǎn)并連接起來形成規(guī)則多邊形，其頂點(diǎn)在軸上，其中心由原點(diǎn)限定；(c)在各軸上描繪出相應(yīng)于所述軸的表示嵌合HIV原種對抑制劑敏感性值的數(shù)據(jù)點(diǎn)，任意連接嵌合數(shù)據(jù)點(diǎn)以形成規(guī)則或不規(guī)則的多邊形，其形狀表示嵌合原種對抑制劑范圍的抗性。
多邊形或準(zhǔn)園形圖提供的優(yōu)點(diǎn)是根據(jù)表示病人嵌合HIV原種的多邊形與表示野生型病毒株的多邊形之間差異程度確定病人對許多藥物的抗性。多邊形的面積一般在某些區(qū)域比在其它區(qū)域差別更大，表明在每種情況下對其軸通過所述區(qū)域的抑制劑的抗性程度更大或更小。
因此，根據(jù)本發(fā)明的方法獲得了嵌合HIV原種并提供了該原種對一定范圍的抑制劑的抗性圖譜。以這種方式該圖譜或圖形提供了以常規(guī)測量不能獲得的該嵌合原種的一個方面的技術(shù)特征。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)化軸互相間等角。
另外，優(yōu)選的是，各軸具有對數(shù)刻度。
進(jìn)而，優(yōu)選的是，在嵌合多邊形中如果表示了偏心數(shù)據(jù)點(diǎn)，則鑒定的抑制劑可假定其對病人具有很小或沒有用處，而位于野生型多邊形內(nèi)，其上或靠近其外側(cè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)鑒定的抑制劑可假定其對病人具有很大的用處。
當(dāng)最壞情況值與嵌合和野生型HIV一起表示時，通常不規(guī)則多邊形包圍嵌合和野生型多邊形。上文使用的術(shù)語“偏心”的意義是指數(shù)據(jù)點(diǎn)位于離最壞邊界相當(dāng)近且離野生型多邊形相當(dāng)遠(yuǎn)。同樣術(shù)語“靠近野生型多邊形外側(cè)”指與離最壞邊界的距離相比離野生型多邊形相當(dāng)近。
上文所限定的方法限制的意義在于可測量的對抑制劑的抗性依賴于所用的抑制劑濃度的具體范圍。還必須努力減小生物學(xué)可變性的影響。因此，需要獲得最大抗性值或假定給定的抑制劑無效時最壞情況可測量的抗性值。該濃度，例如，100μM，一般是實(shí)踐上可試驗的最大濃度，但是也可從，例如，藥理學(xué)，毒理學(xué)或藥物動力學(xué)研究獲得。對研究中病人的抗性水平與最大可測量的抗性的比較決定什么是研究中病人的明顯抗性水平。在下文所述的線段圖中可適當(dāng)?shù)仫@示最大可測量抗性和實(shí)際抗性。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的三個或更多個數(shù)據(jù)組中的每一個還含有對所述抑制劑最壞情況可測量抗性的值，在所述的圖示中表示所述的最壞情況值使嵌合原種的數(shù)據(jù)點(diǎn)可與野生型和最壞情況HIV相比，從而提供對特定情況中抑制劑相對值的評價。
用超過150個病人的樣品進(jìn)行的實(shí)驗揭示了抗性形成與治療史之間的密切關(guān)系，如下文在實(shí)施例中進(jìn)一步所述。已發(fā)現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)與經(jīng)典病毒分離和表型確定技術(shù)之間的密切關(guān)系。
因此根據(jù)本發(fā)明的方法可用于個體化且更理性地控制HIV化療。因此使用根據(jù)本發(fā)明的方法結(jié)合適當(dāng)施用抗HIV藥物應(yīng)最終導(dǎo)致感染HIV病毒的病人得到更好的治療并存活。
根據(jù)本發(fā)明的方法特別應(yīng)用于個別病人已接受了許多不同的藥物且護(hù)理醫(yī)生不易解釋其突變方式的情況。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種控制HIV陽性病人的HIV化療的方法，它包括如下步驟(a)以上文所述的方法定期評價病人HIV病毒株的表型敏感性；(b)用選定的抑制劑維持化療，而病人的HIV病毒株保持對選定的化療敏感；(c)如果且當(dāng)原始抑制劑的敏感性降低時，選擇不同的抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種用于控制HIV陽性病人化療的臨床控制儀器，所述儀器帶有如上文所限定的多個數(shù)據(jù)組的圖示。
我們給根據(jù)本發(fā)明的臨床控制儀器創(chuàng)造了術(shù)語“抗病毒圖”(antivirogram)，且該術(shù)語在下文的說明書中使用。該儀器給醫(yī)生提供了不同抑制劑相對變化和敏感性的清楚圖示，可用于不同HIV感染的病人的臨床控制。
優(yōu)選的是，同時評價所述的嵌合病毒對HIV pol基因所編碼的至少兩個酶的抑制劑的表型敏感性。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種測定病人中個體HIV病毒株對HIV pol基因編碼的至少兩個酶的抑制劑的表型藥物敏感性的方法，它包括用一個經(jīng)過從病人的生物學(xué)材料的樣品分離病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄所述pol基因的所需區(qū)域獲得的HIV pol基因的序列和已缺失該序列的HIV-DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染對HIV感染敏感的細(xì)胞系，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以創(chuàng)造提供循環(huán)病毒抗性情況的指示的嵌合病毒的原種，以及評價所述嵌合病毒對HIV pol基因編碼的所述酶的抑制劑的表型敏感性。
所述來自pol基因的序列從其表型藥物敏感性已被測定的病人獲得的生物材料的樣品中分離。許多種類的生物材料可用于分離所需序列。
因此，可從血漿，血清或選自精液和陰道液的無細(xì)胞體液選擇生物材料。血漿是特別優(yōu)選的且相對于上述現(xiàn)有技術(shù)所用的PBMCs的應(yīng)用而言特別具有優(yōu)勢。
或者，生物材料可以是加入了RNA穩(wěn)定劑的全血。
在另一個實(shí)施方案中，生物材料可以是選自腦組織或淋巴結(jié)組織，或活體解剖獲得的其它組織的固體組織材料。
如下文所示，當(dāng)諸如血漿的生物材料用于分離所需的序列時，可使用最小體積的血漿，典型地是大約100-250μl，更具體的是約200μl。
另外，優(yōu)選所選的兩種酶選自HIV RT，蛋白酶和整合酶。
以本來已知的方法，例如Boom，R.等的方法(臨床微生物學(xué)雜志(1990)Vol.28，No.3，p495-503)根據(jù)本發(fā)明可較方便地分離病毒RNA。
如果是血漿，血清和無細(xì)胞體液，也可以使用Qiagen集團(tuán)公司投放市場的QIAamp病毒RNA試劑盒。
優(yōu)選的是，對HIV感染敏感的細(xì)胞系是CD4+T-細(xì)胞系。
另外，優(yōu)選的是，CD4+T-細(xì)胞系是MT4細(xì)胞系或HeLa CD4+細(xì)胞系。
可使用諸如Perkin Elmer投放市場的GeneAmp逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的商用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
所需的病人pol基因的區(qū)域優(yōu)選使用特定的下游引物逆轉(zhuǎn)錄。
如果需要逆轉(zhuǎn)錄的序列是編碼逆轉(zhuǎn)錄酶或逆轉(zhuǎn)錄酶與蛋白酶的序列，則下游引物優(yōu)選OUT35’-CATTGCTCTCCAATTACTGTGATATTTCTCATG-3’(SED ID NO1)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，病人的HIV RT基因和HIV蛋白酶基因使用HIV-1特異性的OUT3引物和遺傳改造的喪失了RNA酶H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使待轉(zhuǎn)錄的總RNA轉(zhuǎn)變成cDNA而不被降解。這種遺傳改造的逆轉(zhuǎn)錄酶，Expand(Expand是商標(biāo))逆轉(zhuǎn)錄酶，可從Boehringer Mannheim GmbH獲得。
Expand逆轉(zhuǎn)錄酶是一種RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。該酶是莫洛尼鼠類白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV-RT)的遺傳改造形式。RNA酶H序列內(nèi)的點(diǎn)突變將RNA酶H活性降低到可檢測的水平之下。使用該遺傳改造的逆轉(zhuǎn)錄酶使得能夠獲得更大量的全長cDNA轉(zhuǎn)錄子。
逆轉(zhuǎn)錄后，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄的DNA。
優(yōu)選的是，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用嵌套式PCR技術(shù)擴(kuò)增。
優(yōu)選的是，如果感興趣的區(qū)域是RT區(qū)域，按Kellam，P.和Larder，B.A.(1994，出處同上)所述使用內(nèi)部和外部引物來應(yīng)用嵌套式PCR技術(shù)。當(dāng)感興趣的區(qū)域是跨越RT和蛋白酶基因的區(qū)域時，使用的特定引物優(yōu)選是OUT3/IN3(下游)和RVP5(上游)的組合。
引物RVP5(Maschera，B.等，病毒學(xué)雜志，69，5431-5436)具有序列5’-GGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGG-3’(SEQ ID NO2)。
圖3提供了擴(kuò)增的圖示且在實(shí)施例2中進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
蛋白酶cDNA的擴(kuò)增實(shí)際上涉及半嵌套式PCR方法，這從圖3可明顯地看出。
嵌套式PCR技術(shù)相對于已知的簡單PCR技術(shù)的優(yōu)勢在于它能夠獲得最特異性的PCR產(chǎn)物。
然而，為了在PCR期間獲得更高的保真性和產(chǎn)率，可利用熱穩(wěn)定性聚合酶的混合物(Barnes，W.M.(1994)美國科學(xué)院學(xué)報(Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A，)91，2216-2220)。這種聚合酶混合物可從BoehringerMannheim GmbH獲得，即Expand(Expand是商標(biāo))高保真PCR系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)我們獲得了提高的敏感性，即比單獨(dú)使用Taq聚合酶的常規(guī)PCR方法獲得的高10倍或更高的敏感性。
當(dāng)pol基因的區(qū)域是包括RT和蛋白酶基因的區(qū)域時，優(yōu)選HIV-DNA構(gòu)建體是RT和蛋白酶基因已缺失的構(gòu)建體且是以保藏號LMBP3590于1996年11月8日保藏在Belgian Coordinated Collectionsof Microorganisms-BCCM LMBP-Collection的質(zhì)粒pGEMT3ΔPRT。
然而，可采用一些研究產(chǎn)生含具有蛋白酶以及RT基因缺失的HIV-1原病毒的質(zhì)粒。一種可能性是借助于寡核苷酸介導(dǎo)的誘變導(dǎo)入所需缺失。然而，下文實(shí)施例2中采用的方法涉及利用特定限制性酶和亞克隆方法產(chǎn)生所需構(gòu)建體，如下文所述。盡管最終結(jié)果取決于可獲得的限制性位點(diǎn)，但該方法的主要優(yōu)勢在于可迅速獲得最終結(jié)果。
為了保證最有效的轉(zhuǎn)染結(jié)果，被轉(zhuǎn)染的PCR產(chǎn)物理想地應(yīng)以本身已知的方式經(jīng)陰離子交換旋轉(zhuǎn)柱純化。合適的試劑盒是Qiagen集團(tuán)公司投放市場的QIAquick PCR純化試劑盒。
轉(zhuǎn)染可經(jīng)電穿孔，或者另選經(jīng)過使用脂類，特別是陽性脂類，DEAE葡聚糖，CaHPO4等實(shí)現(xiàn)。
在脂類轉(zhuǎn)染的例子中，可利用荷蘭的Invitrogen B.V.of Leek，投放市場的PERFECT(PERFECT是商標(biāo))轉(zhuǎn)染試劑盒。
因此，為進(jìn)行轉(zhuǎn)染，已缺失了選自pol基因的一個或多個基因的HIV-DNA構(gòu)建體用于與擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物連結(jié)。
如果缺失的只是RT基因，則構(gòu)建體可以是質(zhì)粒pHIVΔRT(可從醫(yī)學(xué)研究理事會(MRC)獲得)。當(dāng)RT和蛋白酶基因都缺失時，合適的HIVDNA構(gòu)建體是本文所述的質(zhì)粒pGEMT3-ΔPRT，且它是高拷貝的載體。該質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染前根據(jù)本身已知的方法線性化。
使用編碼超過一個pol基因酶的構(gòu)建體，例如ΔPRT構(gòu)建體，的特殊優(yōu)勢在于在構(gòu)建體中包括更多的原始病人物質(zhì)的可能性比使用單個基因時更大，使擴(kuò)增的物質(zhì)更大程度地反映所研究的特定病人的病毒遺傳多樣性。
可以理解優(yōu)選所選定的用于嵌套式PCR的特異性引物位于待擴(kuò)增和研究的靶酶主體序列外側(cè)。還可預(yù)料的是RT和蛋白酶的結(jié)合很可能比單獨(dú)的RT提供更好的研究RT的結(jié)果，因為相對于僅用RT的情況病人產(chǎn)生了多出40個的氨基酸。為研究蛋白酶，應(yīng)知道蛋白酶的前9個氨基酸仍來自構(gòu)建體(pGEMT3-ΔPRT)的野生型骨架。
當(dāng)通過電穿孔實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染時，優(yōu)化所選的參數(shù)以實(shí)現(xiàn)較好的細(xì)胞生長和病毒生產(chǎn)。以大約250μF和300V可較方便地進(jìn)行電穿孔。優(yōu)選的是，在大約10μg線型化質(zhì)粒，例如pHIVΔRTBstEII和大約5μg擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，例如RT PCR產(chǎn)物存在的條件下進(jìn)行電穿孔。當(dāng)成功地進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)同源重組時，在5至10天內(nèi)形成新嵌合HIV。在形成嵌合HIV前用已知技術(shù)的典型培養(yǎng)時間是12-14天。在-70℃或更低溫度下儲存培養(yǎng)上清等分試樣。
顯而易見的是，可使用上述方法分離和擴(kuò)增其它HIV基因，例如整合酶基因，或一個以上的其它HIV基因，例如，RT和整合酶基因，且用各自的整合酶或RT/整合酶的PCR產(chǎn)物與缺失了相關(guān)基因(或多個基因)的合適的線型化的HIV-DNA構(gòu)建體結(jié)合轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞。
滴定新形成的嵌合病毒，然后分析其對不同pol基因酶抑制劑的表型敏感性(敏感性)，優(yōu)選在自動的細(xì)胞基礎(chǔ)試驗中進(jìn)行。
優(yōu)選的是，嵌合病毒和野生型HIV病毒株(它是適當(dāng)?shù)闹亟M野生型HIV病毒株)對一種或多種RT，蛋白酶或整合酶抑制劑的表型藥物敏感性被表達(dá)為抑制劑濃度(IC值)。
嵌合病毒和野生型HIV病毒株對一種或多種RT抑制劑和/或一種或多種蛋白酶抑制劑和/或一種或多種整合酶抑制劑的敏感性表達(dá)為例如50％或90％的抑制劑濃度(IC50或IC90值)。
優(yōu)選的是，RT抑制劑選自核苷RT抑制劑，例如AZT，ddI(2’，3’-雙脫氧肌苷/Videx(Videx是商標(biāo)))，ddC(2’，3’-雙脫氧胞苷)，3TC(lamivudine)，d4T(雙脫氧胸苷)，非核苷RT抑制劑，例如delavirdine(U9051125(BMAP)/Rescriptor(Rescriptor是商標(biāo)))，loviride(α-APA)，nevirapine(B1-RG-587/Viramune(Viramune是商標(biāo))和tivirapine(8-C1-TIBO(R86183))，蛋白酶抑制劑，例如saquinavir，indinavir和ritonavir，整合酶抑制劑，例如咖啡酸苯基乙酯(CAPE)。
合適的RT和/或蛋白酶抑制劑和/或整合酶抑制劑選自核苷RT抑制劑，例如AZT，ddI，ddC，3TC，d4T，1592U89和類似物，非核苷RT抑制劑，例如loviride，nevirapine，delaviridine，ateviridine，和tivirapine(8-C1-TIBO)和類似物，蛋白酶抑制劑，例如saquinavir，indinavir和ritonavir和類似物，整合酶抑制劑，例如咖啡酸苯基乙酯(CAPE)以及在WO95/08540和GB2271566中所述類型的HIV整合酶抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的方法包括用一種或多種RT抑制劑和/或一種或多種蛋白酶抑制劑和/或一種或多種整合酶抑制劑比較病人HIV病毒株與野生型HIV病毒株的表型藥物敏感性的步驟。為便于理解所試驗的不同藥物化合物(或組合)的敏感性相對變化的表示，構(gòu)建了一種抗病毒圖。
該圖應(yīng)解釋如下抗病毒圖中的偏心數(shù)據(jù)點(diǎn)認(rèn)定為不可能再有利于HIV感染的病人的化療方案，而在參考多邊形內(nèi)或其上，或僅略微在參考多邊形外的數(shù)據(jù)點(diǎn)認(rèn)定為可能有利于HIV感染的病人的化療方案。
根據(jù)本發(fā)明的方法與施用正確的抗HIV藥物結(jié)合應(yīng)最終導(dǎo)致更好的治療，改進(jìn)生活質(zhì)量且提高HIV感染的病人的存活率；即，可防止或阻止無效治療(由于存在或出現(xiàn)抗性HIV病毒株)，以及可即時開始有效化療。
本發(fā)明還涉及醫(yī)生用于治療HIV感染的病人的臨床控制儀器，它包括以上文所述的方法可獲得的抗病毒圖。
附圖的簡要描述

圖1是質(zhì)粒pGEMT3-ΔPRT之構(gòu)建的圖示；圖2是質(zhì)粒pGEMT3-ΔPRT之構(gòu)建的進(jìn)一步和補(bǔ)充圖示；圖3是含蛋白酶和RT基因的HIV-HXB2D序列的該部分的圖示；圖4A-H是含蛋白酶和RT基因的HIV-HXB2D序列的該部分的完整序列；圖5是攜帶實(shí)施例5所述的3TC抗性HIV病毒株的病人的抗病毒圖；圖6是攜帶實(shí)施例6所述的野生型HIV病毒株的未用藥的病人的抗病毒圖；圖7A是顯示實(shí)施例7的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖7B是實(shí)施例7的受試者病人的抗病毒圖；圖8A是顯示實(shí)施例8的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖8B是實(shí)施例8的受試者病人的抗病毒圖；圖9A是顯示實(shí)施例9的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖9B是實(shí)施例9的受試者病人的抗病毒圖；圖10A是顯示實(shí)施例10的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖10B是實(shí)施例10的受試者病人的抗病毒圖；圖11A是顯示實(shí)施例11的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖11B是實(shí)施例11的受試者病人的抗病毒圖；圖12A是顯示實(shí)施例12的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；以及圖12B是實(shí)施例12的受試者病人的抗病毒圖。
本發(fā)明將以下列實(shí)施例進(jìn)一步說明。
實(shí)施本發(fā)明的方式實(shí)施例1方案1.病毒RNA的提取和擴(kuò)增。
RNA根據(jù)Boom，R.(1990，出處同上)所述的方法從100μl血漿中分離并按制造商所述用GeneAmp逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Perkin Elmer)及使用HIV-1特異性下游引物OUT35’-CATTGCTCTCCAATTACTGTGATATTTCTCATC-3’(SED ID NO1)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按Kellam，P.和Larder，B.A.(1994，出處同上)所述用內(nèi)部和外部引物對逆轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行PCR。氯仿提取并在Centricon 100柱上離心或在陰離子交換旋轉(zhuǎn)柱(Quiagen)上離心后，分離的PCR產(chǎn)物準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染反應(yīng)。
2.質(zhì)粒的生產(chǎn)和分離。
在大腸桿菌中進(jìn)行pHIVΔRT(MRC)質(zhì)粒的生產(chǎn)。按制造商所述利用Qiagen柱從過夜培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。經(jīng)過A260/280測量(在λ＝260和280nm時的光密度測量)以分光光度法測定分離的質(zhì)粒產(chǎn)率。從500ml細(xì)菌培養(yǎng)物中獲得了大約250μg超純的質(zhì)粒DNA。以限制性分析證實(shí)分離的質(zhì)粒的同一性。隨后用BstEII使分離的質(zhì)粒線型化并再用經(jīng)典的酚/氯仿提取純化。
3.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染前以250,000個細(xì)胞/ml的密度傳代培養(yǎng)MT4細(xì)胞(指數(shù)生長期)。沉淀細(xì)胞并以3.1 10E6個細(xì)胞/ml的濃度重懸于磷酸鹽緩沖溶液中。每次轉(zhuǎn)染使用0.8ml的部分(2.510E6個細(xì)胞/ml)。用Bio-Rad Gene脈沖儀，利用0.4cm的電極杯進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在10μg線型化的pHIVΔRT質(zhì)粒和大約5μgRT PCR產(chǎn)物存在的條件下以250μF和300V電穿孔細(xì)胞，隨后在室溫下培養(yǎng)30分鐘。隨后向細(xì)胞懸液中加入10ml新鮮培養(yǎng)基并在37℃下在5％CO2的加濕空氣中進(jìn)行培養(yǎng)。
4.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)和跟蹤。
轉(zhuǎn)染后7至10天期間，監(jiān)測細(xì)胞的細(xì)胞致病作用(CPE)的表現(xiàn)。如果不存在，在不同燒瓶中傳代培養(yǎng)細(xì)胞。隨后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液用于產(chǎn)生重組病毒的原種并以1.5ml的等分試樣儲存于-70℃。
5.來自病人病毒RNA的重組病毒的分析。
滴定新病毒后，在系列稀釋的不同HIV抑制劑存在下將原種用于抗病毒實(shí)驗。以MT4細(xì)胞中病毒的有限系列稀釋滴定測定收獲的上清液滴定度。
具有有用滴定度的病毒用于抗病毒實(shí)驗。為達(dá)到該目的，用100μl完全培養(yǎng)基充滿96-孔微滴定板。隨后以25μl的體積將化合物儲液加入系列重復(fù)孔中。每種藥物(或藥物組合)包括HIV-和偽-感染的細(xì)胞樣品。然后將指數(shù)生長的MT4細(xì)胞以150,000個細(xì)胞/ml的密度轉(zhuǎn)移到微滴定板上。然后將細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃下在5％CO2的加濕空氣中培養(yǎng)。感染5天后，以在下文第6部分所述的MTT方法(Pauwels，R.等，病毒學(xué)方法雜志(1988)，20309-321)經(jīng)分光光度法測定偽感染和HIV感染的細(xì)胞的存活。
6.MTT測定。
向微滴定板的每孔中加入20μl的MTT溶液(以7.5mg/ml溶于PBS中)。平板在37℃再培養(yǎng)1小時。然后取出150μl培養(yǎng)基而不擾亂含甲晶體的MT4細(xì)胞簇。經(jīng)過加入100μl在酸化異丙醇(每升溶劑5ml濃HCL)中的5％Triton X-100實(shí)現(xiàn)甲晶體的溶解。將平板在平板搖床上放置10分鐘后獲得甲晶體的完全溶解。最后在兩個波長(540和690nm)下讀取吸光率。從這些光密度(OD)數(shù)據(jù)產(chǎn)生50％抑制(IC50)和50％細(xì)胞毒性(CC50)濃度。
實(shí)施例2具有HIV-1蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因缺失的pHIVΔRTBstEII變異體的構(gòu)建重復(fù)實(shí)施例1所述的方案，除了感興趣的HIVpol基因的序列是編碼RT和蛋白酶的序列且制備的構(gòu)建體是下文所述的pGEMT3-ΔPRT。相對于實(shí)施例1所述程序的其它修改在下文列出。
為了擴(kuò)增病毒RNA，用OUT3引物再進(jìn)行從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA。然而，為了進(jìn)行嵌套式PCR程序，所用的引物如圖3所示。因此，該嵌套式程序在效果上是半嵌套式PCR程序。
pGEMT3-ΔPRT的生產(chǎn)和分離最終的pGEMT3-ΔPRT構(gòu)建體是pGEM9-Zf(-)(Promega)的衍生物。
簡單地說，經(jīng)過將所需的插入片斷HIV-HXB2(蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺失的原病毒HIV-1克隆，包括側(cè)翼的人序列)導(dǎo)入載體pGEM9-Zf(-)的Xbal限制性位點(diǎn)來構(gòu)建pGEMT3-ΔPRT構(gòu)建體。原病毒基因組從蛋白酶基因內(nèi)的AhdI位點(diǎn)(圍繞9號氨基酸)到pHIVΔRT BstEII構(gòu)建體(MRC保藏參考ADB231)的BstEII位點(diǎn)已缺失。SmaI和BstEII位點(diǎn)位于ΔProRT缺失的接頭處，它們可用于在轉(zhuǎn)染前將原病毒構(gòu)建體線型化。pGEMT3-ΔPRT的構(gòu)建在圖1和圖2中圖示。在500ml細(xì)菌培養(yǎng)物中，pGEMT3-ΔPRT的產(chǎn)率是大約1mg。
如上文所述，質(zhì)粒pGEMT3-ΔPRT以保藏號LMBP3590于1996年11月8日保藏在Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms-BCCM LMBP-Collection。
意想不到的是將原病毒基因組導(dǎo)入另一載體(pGEM9-Zf(-)代替pIB120)會引起主要問題。pIB120是pEMBL8(-)的衍生物(根據(jù)柯達(dá)科學(xué)成相系統(tǒng)提供的信息)，且pGEM9-Zf(-)是相似載體。然而原病毒載體pIB120HIV在recA+大腸桿菌宿主細(xì)胞中可能不穩(wěn)定(Maschera，B.等，病毒學(xué)雜志，(1995)，69，5431-5436)。因此每次新制備質(zhì)粒后應(yīng)證實(shí)pGEMT3-ΔPRT構(gòu)建體的穩(wěn)定性。
HIV-HXIB2序列HIV-HXB2D序列內(nèi)感興趣的區(qū)域(核苷酸1800-4400)在圖3(示意圖)和圖4(完全序列)中表示。還顯示了一些基因，限制性位點(diǎn)，引物和缺失(ΔPro，ΔRT，ΔProRT)的位置。
HIV-1的序列(分離株HXB2，參考基因組，9718bp)從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，國家醫(yī)學(xué)實(shí)驗室，國家衛(wèi)生所經(jīng)ENTREZ文件檢索系統(tǒng)獲得。
Genbank名稱HIVHXB2CGGenbank登記號3455NCBI Seq.ID No327742重組區(qū)域與RVP5和OUT3/IN3引物產(chǎn)生的RT-PCR片斷組合，pGEMT3-ΔPRT載體可用于按實(shí)施例1，第3部分所述轉(zhuǎn)染MT4細(xì)胞。ΔProRT 5’-端的重組區(qū)域含188個核苷酸。ΔProRT 3’-端的重組區(qū)域與以前所述(Kellam，P.和Larder，B.A.(1994)，出處同上)相似且含有130個核苷酸。
這些重組區(qū)域的長度并不是不重要的。以前的資料(Bandyopadhyay，P.K.等，美國科學(xué)院學(xué)報，(1984)81，3476-3480；Rubnitz，J.和Subramani，S.(1984)出處同上)證實(shí)當(dāng)序列同源性從214減少到163個堿基對時，重組頻率減少10倍。而且在電穿孔的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)發(fā)生足夠的重組事件以保證產(chǎn)生的病毒表型可靠地反映所治療的HIV陽性病人中存在的類似種類?？山?jīng)過調(diào)節(jié)用于電穿孔靶細(xì)胞的線型化原病毒載體與RT-PCR片斷的比率首先實(shí)現(xiàn)重組事件的最優(yōu)化。因此具有典型結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)方法以前由Kellam，P.和Larder，B.A.(1994出處同上)描述。結(jié)果確定將大約2μg的PCR產(chǎn)物(與10μg載體)的起始輸入量增加到大約5μg或更多。其結(jié)果是在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中反映出更快的可見病毒生長表現(xiàn)(細(xì)胞致病作用)。
重組事件最優(yōu)化的另一選擇是設(shè)計產(chǎn)生更長重組序列的引物。
然而，轉(zhuǎn)染反應(yīng)中的實(shí)際輸入量常常取決于PCR后的產(chǎn)率。一些樣品具有較高的產(chǎn)率，結(jié)果在轉(zhuǎn)染反應(yīng)中具有更高的擴(kuò)增物質(zhì)輸入量(具有更好的重組效率結(jié)果)。然而，盡管重組效率更低，當(dāng)也可轉(zhuǎn)染具有較低產(chǎn)率的樣品且樣品會產(chǎn)生具有可信反映病毒群體的活病毒。
實(shí)施例3用于ProRT序列RT-PCR的選擇引物相對于實(shí)施例2中所用的引物設(shè)計了新的引物且應(yīng)在ProRT區(qū)域的5’和3’端都產(chǎn)生更長的重組序列。在各自區(qū)域的5’和3’端設(shè)計了兩個引物以允許進(jìn)行嵌套式PCR。如圖3和圖4所示，設(shè)計各自的引物時考慮到在ProRT區(qū)域的5’端存在直接重復(fù)。新的引物如下A PRTO-55’-GCCCCTAGGA-AAAAGGGCTG-TTGG(SEQID NO3)B PRTI-55’-TGAAAGATTG-TACTGAGAGA-CAGG(SEQ IDNO4)C PRTI-35’-GATATTTCTC-ATGTTCATCT-TGGG(SEQ IDNO5)D PRTO-35’-AGGTGGCAGG-TTAAAATCAC-TAGC(SEQ IDNO6)實(shí)施例4另一ΔProRT載體的構(gòu)建如上所述，以寡聚核苷酸介導(dǎo)的誘變可實(shí)現(xiàn)另一ProRT缺失的載體的構(gòu)建。然而也可將ProRT缺失從目前的3’-端擴(kuò)大到RT基因中的下一個KpnI位點(diǎn)(再向下游的40個堿基對)。Klenow處理的KpnI位點(diǎn)與Klenow處理的BstEII位點(diǎn)的連接可恢復(fù)起始BstEII識別序列。這樣，該另選的載體行為相似于實(shí)施例2所述的pGEMT3-ΔPRT載體，但具有略大的RT缺失。
實(shí)施例5從1989年12月到未提供文件記載的后期接受AZT及轉(zhuǎn)換成從1994年2月到1995年10月接受AZT+3TC(1∶1)的組合化療的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照上文實(shí)施例1所述的方案測定其對多種RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB在所述的方案中用作參考HIV病毒株。表1顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率?？共《緢D在圖5中顯示。
表1

從這些數(shù)據(jù)可確定用3TC的單一療法不可能有利于該特定病人。然而，AZT+3TC的組合療法(目前的療法)仍可能產(chǎn)生正面效果。
實(shí)施例6未用藥的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照上文實(shí)施例1所述的方案測定其對多種RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB在所述的方案中用作參考HIV病毒株。表2顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。制備了抗病毒圖并在圖6中顯示。
表2

從這些數(shù)據(jù)可確定病人被非常相似于野生型HIV的HIV病毒株感染。沒有一個藥物方案被排除，因此可用諸如AZT的具有陽性記錄的藥物開始化療。
實(shí)施例7未用藥的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實(shí)施例1所述的方案測定其對多種RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表3顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖7A中表示。還制備了抗病毒圖并在圖7B中顯示。
表3

從這些數(shù)據(jù)可確定病人被非常相似于野生型HIV的HIV病毒株感染。沒有一個藥物方案被排除，因此可用諸如AZT，3TC或其它具有陽性記錄的藥物開始化療。
實(shí)施例8具有包括AZT，3TC和loviride治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實(shí)施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表4顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖8A中表示。還制備了抗病毒圖并在圖8B中顯示。
表4

從這些數(shù)據(jù)可確定病人被表現(xiàn)出對大多數(shù)所檢查的核苷和非核苷抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物的敏感性降低的HIV病毒株感染。仍可用D4T或DDC開始治療。可考慮在治療中包括蛋白酶抑制劑的可能性。
實(shí)施例9具有包括多種核苷類似物RT-抑制劑治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實(shí)施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表5顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖9A中表示。還制備了抗病毒圖并在圖9B中顯示。
表5

從這些數(shù)據(jù)可確定病人被表現(xiàn)出對所有核苷類似物抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物的敏感性降低的HIV病毒株感染。非核苷抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物應(yīng)未從治療中排除。這里也可考慮在治療中包括蛋白酶抑制劑的可能性。
實(shí)施例10未用藥的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實(shí)施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑和蛋白酶抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表6顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖10A中表示。還制備了抗病毒圖并在圖10B中顯示。
表6

從這些數(shù)據(jù)可確定病人被非常相似于野生型HIV的HIV病毒株感染。沒有一個藥物方案被排除，因此可用諸如AZT，3TC或其它具有陽性記錄的藥物開始化療。
實(shí)施例11具有包括RT和蛋白酶抑制劑治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實(shí)施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑和蛋白酶抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表7顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖11A中表示。還制備了抗病毒圖并在圖11B中顯示。
表7

從這些數(shù)據(jù)可確定病人被表現(xiàn)出對RT抑制劑3TC和蛋白酶抑制劑indinavir及ritonavir敏感性降低的HIV病毒株感染。因此可用諸如AZT或saquinavir的具有陽性記錄的藥物調(diào)節(jié)化療。
實(shí)施例12具有包括RT和蛋白酶抑制劑治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實(shí)施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑和蛋白酶抑制劑的敏感性。表8顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖12A中表示。還制備了抗病毒圖并在圖12B中顯示。
表8

從這些數(shù)據(jù)可確定病人被表現(xiàn)出對RT抑制劑3TC及AZT和蛋白酶抑制劑indinavir，ritonavir及saquinavir的敏感性降低的HIV病毒株感染。
實(shí)施例13表型與基因型的相對比較從接受非核苷RT抑制劑(NNRTI)長期單一治療的HIV感染的個體獲得血漿樣品。按實(shí)施例1所述提取HIV-RNA，逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。從陽性樣品的外部PCR物質(zhì)開始，擴(kuò)增RT基因的前785個核苷酸且該物質(zhì)進(jìn)一步用于測基因型。
簡單地說，使用來自Amersham(目錄號RPN2438)帶有7-deaze-dGTP的TermoSequenase(TermoSequenase是商標(biāo))熒光標(biāo)記的引物循環(huán)測序試劑盒對該785個核苷酸的片斷進(jìn)行循環(huán)測序反應(yīng)。選擇4個測序引物使得在RT基因核苷酸27至核苷酸681的兩個方向進(jìn)行序列測定，這些引物用于每個樣品。反應(yīng)物在ALF(ALF是商標(biāo))自動測序儀(Pharmacia)上分析。產(chǎn)生的序列輸出到Power Macintosh上并用GeneWorks 2.5軟件(牛津分子集團(tuán)公司)進(jìn)一步分析。將所得的氨基酸序列與實(shí)驗室HIV-1克隆HXB2D的相應(yīng)序列及病人物質(zhì)中鑒定的抗性相關(guān)突變進(jìn)行比較。結(jié)果在表9中顯示，其中使用單字母氨基酸代碼。
表9

P＝病人表9的頂行顯示了在野生型序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸(AA)序列及其位置。在下面各行中顯示了各病人在這些位置上的氨基酸改變。僅顯示了在病人物質(zhì)中觀察到改變的位置。表9的右部分表示對各病人樣品以根據(jù)本發(fā)明的方法測定的對不同RT抑制劑的抗性倍數(shù)。NNRTI1是給病人施用的非核苷RT抑制劑。NNRTI2是另一個非核苷RT抑制劑，觀察到它與第一個具有一定程度的交叉抗性。
對于核苷類似物RT抑制劑的抗性的基因型測定結(jié)果如下-M41L，D67N，K70R，T215F/Y和K219Q/E是AZT抗性相關(guān)性突變(Larder，B.和Kemp，S.(1989)，科學(xué)246，1155-1158；Kellam，P.等PNAS89，1934-1938)。其在從病人物質(zhì)分離的HIV基因組中單獨(dú)或以不同組合的存在與產(chǎn)生的抗病毒圖(病人11和12)確定的表型抗性相關(guān)。
-同樣適用于與M184V突變相聯(lián)系的對3TC的抗性(Tisdale，M.等(1993)PNAS90，5653-5656)，僅在顯示出對該藥物的表型抗性的病人(病人11和16)中觀察到該突變。
關(guān)于NNRTIs抗性的基因型測定結(jié)果如下-三個病人(3，4和12)沒有與突變相關(guān)的NNRTI抗性且在表型上對該藥物敏感。
-大多數(shù)顯示出對NNRTIs的表型抗性的病人具有與在位置103突變(K103N/S)相關(guān)的NNRTI抗性。
-一個病人(9)具有與突變相關(guān)的Y181C NNRTI抗性且顯示出對NNRTI1的高表型抗性(＞1432倍)。
-病人13具有一些與突變相關(guān)的NNRTI抗性(K101E，部分K103N和部分G190A)。該病人也顯示出對NNRTI1的高表型抗性(＞1466倍)。在該樣品中觀察到的E138A突變至今未與抗性相聯(lián)系。然而，在這一相同位置的另一突變，即，E138K，已證實(shí)在對TSAO化合物的抗性中起重要作用(Balzarini，J.等，(1993)PNAS 90，6952-9656)。E138A突變的作用仍需測定。
-病人20具有與突變相關(guān)的A98G NNRTI抗性且顯示出對所試驗的NNRTIs的表型抗性。
-病人22具有與突變相關(guān)的V108I NNRTI抗性但不顯示出對所試驗的NNRTIs的任何表型抗性。
-病人24顯示出沒有與突變相關(guān)的NNRTI抗性(在一些HIV-1野生型基因組中發(fā)現(xiàn)K101Q突變)但對所試驗的NNRTIs具有表型抗性。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱VIRCO N.V.
(B)街道Drie Eikenstraat 661(C)城市Edegem(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-2650(A)名稱DE BETHUNE，Marie-Pierre(B)街道Tweeleeuwenstraat 15(C)城市Everburg(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-3078(A)名稱HERTOGS，KURT(B)街道Sint Vincentiusstraat 53(C)城市Antwerpen(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-2018(A)名稱PAUWELS，Rudi(B)街道Damstraat 166(C)城市Weerde(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-1982(ii)發(fā)明名稱根據(jù)人類HIV病毒株的表型藥物敏感性控制HIV陽性病人化療的方法(iii)序列數(shù)6
(iv)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朎P 96200175.6(B)申請日1996年1月26日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO1的序列描述CATTGCTCTC CAATTACTGT GATATTTCTC ATG(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ii)分子類型cDNA
(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO2的序列描述GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO3的序列描述GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG TTGG(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO4的序列描述TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO5的序列描述GATATTTCTC ATGTTCATCT TGGG
(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO6的序列描述AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC
權(quán)利要求
1.一種臨床控制系統(tǒng)，用于控制HIV陽性病人的HIV化療，所述系統(tǒng)包括在多邊形或準(zhǔn)圓形圖上圖示多個數(shù)據(jù)組，其中所述數(shù)據(jù)組的生成方法是以來自HIV pol基因的序列和已缺失該序列的HIV-DNA構(gòu)建體體外轉(zhuǎn)染對HIV感染敏感的細(xì)胞系，所述序列通過從病人的生物學(xué)材料的樣品分離病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄所述pol基因的所需區(qū)域而獲得的；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以產(chǎn)生嵌合病毒的原種，評價所述嵌合病毒對HIV pol基因編碼的所述酶的抑制劑的表型敏感性并對其指定一個值，構(gòu)建含有所述嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相應(yīng)值的數(shù)據(jù)組，重復(fù)至少二個其它抑制劑的敏感性評價從而構(gòu)建總共至少三個該數(shù)據(jù)組，以二維或三維圖解方式圖示該數(shù)據(jù)組，由此(a)多個從原點(diǎn)放射延伸的標(biāo)準(zhǔn)化軸，每個軸相應(yīng)于一個數(shù)據(jù)組或抑制劑或其組合；(b)軸被標(biāo)準(zhǔn)化使野生型HIV對各種抑制劑的敏感性值在各軸上相等，任選表示野生型HIV的數(shù)據(jù)點(diǎn)并連接起來形成規(guī)則多邊形，其頂點(diǎn)在軸上，而其中心由原點(diǎn)限定；(c)在各軸上描繪出相應(yīng)于所述軸的表示嵌合HIV原種對抑制劑敏感性值的數(shù)據(jù)點(diǎn)，任意連接嵌合數(shù)據(jù)點(diǎn)以形成規(guī)則或不規(guī)則的多邊形，其形狀表示嵌合原種對一定范圍的抑制劑的抗性；以便各數(shù)據(jù)組中嵌合型和野生型敏感性之間的區(qū)別提供嵌合原種對所述抑制劑處理的抗性的肉眼測量值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的臨床控制系統(tǒng)，其中各軸上有對數(shù)刻度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的臨床控制系統(tǒng)，其中在嵌合多邊形中如果表示了偏心數(shù)據(jù)點(diǎn)，則認(rèn)定的抑制劑可認(rèn)為其對病人具有很小或沒有用處，而位于野生型多邊形內(nèi)，其上或靠近其外側(cè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)認(rèn)定的抑制劑可認(rèn)為其對病人具有實(shí)質(zhì)性用處。
4.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的臨床控制系統(tǒng)，其中所述的三個或更多個數(shù)據(jù)組中的每一個還含有對所述抑制劑最壞情況可測量抗性的值，在所述的圖示中表示所述的最壞情況值，使嵌合原種的數(shù)據(jù)點(diǎn)可與野生型和最壞情況HIV相比，從而提供對特定情況中抑制劑相對值的評價。
全文摘要
一種控制HIV陽性病人化療的方法，包括用一個序列，優(yōu)選來自從病人獲得的HIV pol基因的編碼RT和蛋白酶的序列和已缺失該序列的HIV－DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染對HIV感染敏感的細(xì)胞系，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以產(chǎn)生嵌合病毒的原種，評價嵌合病毒對HIV pol基因編碼的酶的抑制劑的表型敏感性并對其指定一個值，構(gòu)建含有嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相應(yīng)值的數(shù)據(jù)組，重復(fù)至少二個其它的抑制劑的敏感性評價從而構(gòu)建總共至少三個該數(shù)據(jù)組，以二維或三維圖解形式表示該數(shù)據(jù)組使各數(shù)據(jù)組中嵌合型和野生型敏感性之間的區(qū)別提供嵌合原種對所述抑制劑處理的抗性的肉眼測量值，根據(jù)所測量的抗性圖示選擇最適抑制劑。該方法經(jīng)濟(jì)而快捷地得到大量不同的HIV感染的病人的表型信息。該方法可應(yīng)用于所有目前可得到的化療方案且預(yù)期同樣可應(yīng)用于將來的化療方案。
文檔編號C12N15/86GK1991365SQ20061016850
公開日2007年7月4日 申請日期1997年1月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月26日
發(fā)明者瑪麗－皮埃爾·德貝蒂納, 庫爾特·赫托格斯, 魯?shù)稀け８査?申請人:沃爾科股份有限公司