專利名稱：用兩性離子化合物提高核酸雜交特異性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用特定的兩性離子化合物提高核酸雜交特異性的方法。
背景技術(shù)：
雜交特異性(也稱為雜交嚴(yán)格性)指當(dāng)兩條互補(bǔ)核酸和非互補(bǔ)核酸進(jìn)行雜交時(shí)，互補(bǔ)核酸相互形成特異性雜合體的程度。總的來說，已試圖通過調(diào)整緩沖液中的鹽濃度和反應(yīng)溫度，或者通過加入添加劑如Denhart溶液，或添加非特異性DNA或RNA以誘導(dǎo)雜交競爭來獲得更高的雜交特異性。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是擴(kuò)增核酸的方法，包括核酸的變性、退火和延伸，在退火進(jìn)程期間，發(fā)生探針與目標(biāo)核酸的雜交?？梢愿鶕?jù)探針與目標(biāo)核酸之間的同源程度更改PCR的條件。當(dāng)在給定PCR條件下提高退火溫度時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降，然而，當(dāng)降低退火溫度時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率增加。
雜交特異性對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(尤其是對(duì)多重PCR)有不利影響。多重PCR使待擴(kuò)增的不同基因能夠在同一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增。也就是說，將能夠擴(kuò)增各自的目標(biāo)序列的不同引物組放在一個(gè)反應(yīng)器中，目標(biāo)序列的擴(kuò)增在單個(gè)PCR中同時(shí)進(jìn)行。用于多重PCR的引物應(yīng)當(dāng)只對(duì)目標(biāo)DNA序列是特異性的，并且不應(yīng)干擾其它引物的反應(yīng)，這樣目標(biāo)DNAs可以充分地?cái)U(kuò)增。多重PCR產(chǎn)生許多目標(biāo)雜交產(chǎn)物，它們由許多的電泳條帶所顯示。因此，如果退火過程中雜交特異性低，那么除了許多目標(biāo)條帶之外，在電泳凝膠上還會(huì)出現(xiàn)許多的條帶，在多重PCR結(jié)果分析中帶來問題。因此，強(qiáng)烈需要提高雜交特異性。
美國專利4,936,963公開了是使用兩性離子物質(zhì)組氨酸減少電泳所用時(shí)間以降低電泳中總傳導(dǎo)率的方法。該發(fā)明利用兩性離子物質(zhì)，本發(fā)明也利用兩性離子物質(zhì)。然而，其使用兩性離子物質(zhì)的目的是減少電泳所用時(shí)間，不同于本發(fā)明的目的，本發(fā)明的目的是提高核酸雜交特異性。
出于這種考慮，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了研究，目的是解決相關(guān)領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)所暴露出來的問題，發(fā)現(xiàn)核酸雜交特異性的提高可以通過向核酸雜交反應(yīng)體系尤其是多重PCR中添加特定的兩性離子化合物來誘導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過在含特定兩性離子化合物的溶液中雜交核酸來提高核酸雜交特異性的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了提高核酸雜交特異性的方法，該方法包括在含兩性離子化合物的溶液中雜交核酸，所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propane sulfonate)(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法，該方法包括在含兩性離子化合物的溶液中雜交引物和目標(biāo)核酸，所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于核酸雜交的包含兩性離子化合物的溶液，所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含用于核酸雜交的溶液的核酸雜交試劑盒，所述溶液包含兩性離子化合物，所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。


通過參考附圖詳細(xì)描寫其示例性實(shí)施方案，本發(fā)明上述以及其他特征和優(yōu)勢將更為明顯，其中圖1為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降；圖2為目標(biāo)雜交產(chǎn)物和非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率的定量評(píng)估中，用Agilent 2100Bioanalyzer獲得的譜圖；圖3為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降；圖4為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降；和圖5為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加甜菜堿時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在將參考附圖更為充分地描述本發(fā)明，附圖中顯示本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。然而，本發(fā)明可以許多不同形式來具體體現(xiàn)，而不應(yīng)理解為限于本文所列出的實(shí)施方案；相反，提供這些實(shí)施方案將使本公開全面和完整，將充分地為本領(lǐng)域技術(shù)人員傳達(dá)本發(fā)明的構(gòu)思。
核酸雜交指不同來源的核酸之間的結(jié)合，雜交的條件可以根據(jù)所要結(jié)合的核酸的序列同源性而有所不同。換句話說，如果受試核酸之間的序列同源性高，則使用嚴(yán)格條件，如果序列同源性低，則使用溫和條件。當(dāng)雜交條件嚴(yán)格時(shí)，雜交特異性提高，此雜交特異性的提高導(dǎo)致非特異性雜交產(chǎn)物產(chǎn)率的下降。然而，在溫和雜交條件下，雜交特異性下降，此雜交特異性的下降導(dǎo)致非特異性雜交產(chǎn)物產(chǎn)率的提高。尤其在后一種情況下，需要降低非特異性雜交產(chǎn)物的水平，因此，在本發(fā)明中，嘗試通過在含特定兩性離子化合物的溶液中雜交核酸而提高核酸雜交特異性。
核酸之間的雜交可以分為DNA與DNA之間的雜交、DNA與RNA之間的雜交、和RNA與RNA之間的雜交。核酸雜交反應(yīng)通常分為Southern雜交反應(yīng)或Northern雜交反應(yīng)。核酸雜交反應(yīng)對(duì)于DNA芯片尤其重要，因?yàn)閷?shí)施雜交反應(yīng)時(shí)，可能影響特異于探針的目標(biāo)核酸的快速檢測，其中所述探針固定在芯片上，且含目標(biāo)核酸的樣品添加到固定的探針上。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供通過在含特定兩性離子化合物的溶液中雜交核酸來提高核酸雜交特異性的方法。兩性離子化合物指在中性溶液中能夠同時(shí)作為酸和堿起作用的化合物。兩性離子化合物的例子包括甜菜堿、氨基酸、3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)等。兩性離子化合物甜菜堿和CAPS具有如下所示的結(jié)構(gòu)。
大多數(shù)情況下，兩性離子化合物在核酸雜交反應(yīng)中都傾向于提高核酸雜交特異性，因此降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，但不幸的是，相同化合物也降低目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。然而，一些兩性離子化合物顯示出所期望的特征，即降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率而提高核酸雜交特異性，同時(shí)維持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了具有此期望特征的兩性離子化合物，包括3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)等。
當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的這種兩性離子化合物添加到核酸雜交反應(yīng)體系時(shí)，核酸雜交反應(yīng)的特異性提高，結(jié)果可以減少假陽性條帶的產(chǎn)生，假陽性條帶的產(chǎn)生在雜交反應(yīng)期間帶來顯著的問題。假陽性條帶是分離目標(biāo)基因方法的結(jié)果，其在核酸雜交反應(yīng)的特異性下降時(shí)大量產(chǎn)生。這些假陽性條帶使得目標(biāo)雜交產(chǎn)物的分離很困難，在處理時(shí)間和操作成本方面給分離目標(biāo)基因的方法帶來不利影響。因此，目標(biāo)基因的分離強(qiáng)烈需要消除這樣的非特異性雜交產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)可以為0.2至3％。當(dāng)兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)低于0.2％時(shí)，核酸雜交特異性降低，降低非特異性雜交產(chǎn)物產(chǎn)率的效果將因此下降。當(dāng)兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)高于3％時(shí)，目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法，包括在溶液中雜交引物和目標(biāo)核酸，所述溶液含有選自以下的兩性離子化合物3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。
根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前的實(shí)施方案，擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法包括變性、退火和延伸，探針與目標(biāo)核酸之間的雜交發(fā)生在退火過程期間。當(dāng)把根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物添加到雜交反應(yīng)體系時(shí)，探針與目標(biāo)核酸之間的雜交特異性增強(qiáng)。此核酸雜交特異性的增強(qiáng)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)率的降低，只有所需的目標(biāo)雜交產(chǎn)物特異地?cái)U(kuò)增。
擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法的例子包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增、核酸依賴的擴(kuò)增、修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(repair chain reaction)、解旋酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(helicase chain reaction)、QB復(fù)制酶擴(kuò)增、以及連接(反應(yīng))激活的轉(zhuǎn)錄(ligation activated transcription)，優(yōu)選使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)施目標(biāo)核酸的擴(kuò)增。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，PCR為多重PCR。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法預(yù)計(jì)用于增強(qiáng)核酸雜交反應(yīng)的特異性，更具體地，預(yù)計(jì)用于消除目標(biāo)基因擴(kuò)增期間多重PCR的非特異性雜交產(chǎn)物，其可用于鑒定大量病原體。大多數(shù)情況下，兩性離子化合物都傾向于提高核酸雜交反應(yīng)中的核酸雜交特異性，因此降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，但不幸的是，同樣的化合物也降低目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。然而，一些兩性離子化合物顯示出所期望的特征，即降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率而提高核酸雜交特異性，同時(shí)維持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。這些所期望的特征構(gòu)成能夠通過降低多重PCR中的假陽性條帶正確鑒定特異性病原體的基本要素。
非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)生成為多重PCR中的特殊問題。多重PCR允許通過單一PCR檢測大量基因，電泳凝膠上出現(xiàn)許多條帶。在多重PCR中，如果除了所需大小的基因雜交產(chǎn)物的條帶之外，還產(chǎn)生太多非特異性雜交產(chǎn)物的條帶，則不可能進(jìn)行特異性病原體的正確鑒定。因此，在多重PCR中，有必要減少非特異性雜交產(chǎn)物條帶的數(shù)目。當(dāng)把適量的根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物添加到多重PCR中時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的數(shù)目明顯減少。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，多重PCR消除非特異性雜交產(chǎn)物，而保留目標(biāo)雜交產(chǎn)物。如以上所討論的，當(dāng)把適量的兩性離子化合物添加到多重PCR和時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的數(shù)目明顯減少。然而，如果目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率也隨著非特異性雜交產(chǎn)物的減少而降低，則不能獲得所需的效果。大多數(shù)情況下，兩性離子化合物同時(shí)降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率和目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。然而，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物時(shí)，有利地，同時(shí)減小非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率和維持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，可以以按重量計(jì)0.2至3％的濃度使用所述兩性離子化合物。當(dāng)兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)低于0.2％時(shí)，核酸雜交特異性降低，降低非特異性雜交產(chǎn)物產(chǎn)率的效果將因此降低。當(dāng)兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)高于3％時(shí)，目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率將降低。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，引物對(duì)大量病原體的檢測來說是特異的。當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物實(shí)施多重PCR時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的條帶數(shù)目減少，同時(shí)維持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。因此，現(xiàn)在可以輕易地解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，所述問題即由于非特異性雜交產(chǎn)物的高產(chǎn)率而難以正確檢測大量的基因。大量基因的檢測包括與病原體、遺傳性疾病等等相關(guān)的基因序列的分析。例如，導(dǎo)致人類呼吸性疾病的最常見的病毒包括麻疹病毒、腸道病毒、鼻病毒、SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-coV)、水痘帶狀皰疹病毒(VSV)、腺病毒、人副流感病毒1(HPIV1)、人副流感病毒2(HPIV2)、人副流感病毒3(HPIV3)、流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、呼吸道合胞病毒A(RSVA)、和呼吸道合胞病毒B(RSVB)。快速特異地檢測這些病毒對(duì)于診斷、預(yù)放和治療呼吸性疾病是必需的，通過使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物實(shí)施多重PCR，可以快速正確地檢測所述病毒。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了用于核酸雜交的溶液，所述溶液含有選自以下的兩性離子化合物3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于核酸雜交的溶液含有核酸雜交反應(yīng)所需的多種化合物。當(dāng)使用根據(jù)當(dāng)前實(shí)施方案的用于核酸雜交的溶液實(shí)施核酸雜交反應(yīng)時(shí)，核酸雜交的特異性增強(qiáng)，可以獲得更好的雜交結(jié)果，其中除了所述的多種化合物之外，所述溶液還含有根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物。核酸雜交反應(yīng)對(duì)于DNA芯片是尤其重要的。當(dāng)探針固定在芯片上時(shí)，向其添加含有目標(biāo)核酸的樣品，用本實(shí)施方案的核酸雜交溶液實(shí)施核酸雜交反應(yīng)，由此可以快速地檢測特異于探針的目標(biāo)核酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供包含用于核酸雜交的溶液的核酸雜交試劑盒，所述溶液含有選自以下的兩性離子化合物3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。所述核酸雜交試劑盒可以包含核酸雜交必需的多種組成成分，所述組成成分可能是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
以下將參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明性目的，不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1多重PCR中CAPS對(duì)核酸雜交特異性的影響從呼吸道感染的主要病原體流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)(來自Samsung Medical Center)分離基因組DNA(gDNA)，作為多重PCR的模板，以0.2ng或1ng的量使用所分離的gDNA。以0.5％或1％的濃度使用作為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物的3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)，以實(shí)施多重PCR。用GeneAmp PCR系統(tǒng)9700(ABI)、PCR混合物(模板gDNA0.2ng或1ng、CAPS 0.5％或1％、1×Taq Pol緩沖液、dNTP混合物每種200μM、PCR引物每種400nM(SEQ ID NO1至SEQ ID NO10)、和Taq Pol 5個(gè)單位)，于95℃1分鐘，使DNA完全變性，然后對(duì)所述PCR混合物進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)(95℃5秒、62℃13秒、72℃15秒)，72℃最后延伸1分鐘，如此實(shí)施多重PCR。
圖1為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加CAPS時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。由圖1可以看到，與沒有添加CAPS的樣品(稱為-CAPS)相比，添加有CAPS的樣品(稱為+CAPS)中非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度明顯降低，當(dāng)CAPS的濃度提高時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低。在添加有CAPS(+CAPS)的情況下，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低，但保持了目標(biāo)雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度。此外，當(dāng)如預(yù)期的增加模板DNA的量時(shí)，目標(biāo)雜交產(chǎn)物的量和非特異性雜交產(chǎn)物的量也增加。
在用CAPS處理期間，為了定量評(píng)估產(chǎn)生目標(biāo)雜交產(chǎn)物和非特異性雜交產(chǎn)物的程度，使每種PCR產(chǎn)物都進(jìn)行電泳，然后用Agilent 2100Bioanalyzer檢測熒光。
圖2為目標(biāo)雜交產(chǎn)物和非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率定量評(píng)估中用Agilent2100Bioanalyzer獲得的譜圖。參見圖2，在圖2主圖下面的放大圖中所示的兩條曲線當(dāng)中，上曲線對(duì)應(yīng)于用0.2ng gDNA而未經(jīng)CAPS處理所獲得的圖線，下曲線對(duì)應(yīng)于用經(jīng)0.5％CAPS處理的0.2ng gDNA獲得的圖線。箭頭指示非特異性雜交產(chǎn)物的條帶位置。如圖2所示，無論gDNA是否經(jīng)由CAPS處理過，目標(biāo)雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度都幾乎是一致的。然而，當(dāng)用CAPS處理時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的條帶大部分被消除。
因此，可以看到，當(dāng)把根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物CAPS添加到多重PCR中時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率明顯降低，同時(shí)保持了目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。由此發(fā)現(xiàn)添加CAPS可用于檢測特定病原體。
實(shí)施例2多重PCR中CAPSO和CHES對(duì)核酸雜交特異性的影響為研究多重PCR中不同類型兩性離子化合物的核酸雜交特異性，還使用了CAPSO和CHES。以與實(shí)施例1中相同的方式進(jìn)行相同的試驗(yàn)，不同之處是分別向多重PCR添加濃度為0.2％、0.4％、0.8％和1.6％的CAPSO和CHES，并使用1ng的流感嗜血桿菌gDNA模板。
圖3為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加CAPSO時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。參見圖3，對(duì)對(duì)照物進(jìn)行不添加CAPSO的多重PCR。由圖3可以看到，與不添加CAPSO的情況相比，在添加CAPSO的情況下，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低，并且更高的CAPSO濃度導(dǎo)致條帶強(qiáng)度更顯著的降低。圖4為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加CHES時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。如圖4所示，CHES產(chǎn)生與CAPSO類似的結(jié)果。
實(shí)施例3多重PCR中兩性離子化合物的類型對(duì)核酸雜交特異性的影響使用甜菜堿研究多重PCR中不同類型兩性離子化合物的核酸雜交特異性。以與實(shí)施例1中相同的方式實(shí)施相同的試驗(yàn)，不同之處是用Solgent，Inc.的5×頻帶輔助器具(band doctor)以2.5μl(0.25×)、5μl(0.5×)、10μl(1×)、和15μl(1.5×)的量將甜菜堿添加到多重PCR中，并且分別以1ng、0.1ng和0.01ng的量使用流感嗜血桿菌gDNA模板。
圖5為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加甜菜堿時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。參見圖5，對(duì)照實(shí)施不添加甜菜堿的多重PCR，數(shù)字″1″、″2″和″3″指用于PCR的模板gDNA的量，例如分別為1ng、0.1ng和0.01ng。由圖5可以看到，與不添加甜菜堿的情況相比，在添加甜菜堿的情況下，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低，并且更高的甜菜堿濃度導(dǎo)致條帶強(qiáng)度更顯著的降低。然而，可以看到，與CAPS的情況不同，雖然隨著甜菜堿濃度的不斷增加，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低，但目標(biāo)雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度也顯著降低。因此，顯示甜菜堿不適合于提高核酸雜交特異性以檢測特定病原體的目的。
因此，并非所有的兩性離子化合物都顯示本發(fā)明的效果，只有特定的兩性離子化合物如CAPS能夠?qū)е路翘禺愋噪s交產(chǎn)物條帶強(qiáng)度的降低，同時(shí)保持目標(biāo)雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度。
如以上所討論的，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的方法允許在多重PCR中減小非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，同時(shí)保持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，因此提高核酸雜交的特異性，可以有效地用于特定病原體的鑒定、遺傳性疾病的診斷、基因序列的分析等等。
雖然已經(jīng)詳細(xì)地展示了本發(fā)明并參考其示例性實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)了解可以在其中作出多種形式上和細(xì)節(jié)上的改變，而不背離下述權(quán)利要求確定的本發(fā)明的精神和范圍。
序列表<110>三星電子株式會(huì)社(Samsung Electronics Co.，Ltd.)<120>用兩性離子化合物提高核酸雜交特異性的方法<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>22<212>DNA<212>人工序列<220>
<223>正向引物<400>1gcgtaccttt tgtataatgg gtc 23<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2gaccttagct ggcggtctg19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>3tgtcgggtaa gttccgacc19
<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>4crgaaccacc ggatcacta 19<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>5cacctcgatg tcgrctcatc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>6ggtcctctcg tactagrarc a21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物
<400>7tagcatatca gaaggcacac cc 22<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>8atccactcaa gagagacaac att 23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>9yccakactcc tacgggaggc 20<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>10gtattaccgc rrctgctggc ac 2權(quán)利要求
1.提高核酸雜交特異性的方法，所述方法包括在含有選自以下的兩性離子化合物的溶液中雜交核酸3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)為0.2至3％。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述雜交選自DNA與DNA之間的雜交、DNA與RNA之間的雜交，以及RNA與RNA之間的雜交。
4.擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法，所述方法包括在溶液中雜交引物和目標(biāo)核酸，所述溶液含有選自以下的兩性離子化合物3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)施目標(biāo)核酸的擴(kuò)增。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為多重PCR。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述引物對(duì)于大量病原體的檢測是特異性的。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)為0.2至3％。
9.用于核酸雜交的溶液，其含有選自以下的兩性離子化合物3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。
10.核酸雜交試劑盒，其包含權(quán)利要求9的用于核酸雜交的溶液。
全文摘要
提供提高核酸雜交特異性的方法，包括在含有選自以下的兩性離子化合物的溶液中雜交核酸3－(環(huán)己基氨基)－1－丙磺酸(CAPS)、3－[(3－膽酰胺基丙基)二甲基銨基]－1－丙磺酸鹽(CHAPS)、3－(環(huán)己基氨基)－2－羥基－1－丙磺酸鹽(CAPSO)和2－(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。所述方法允許在多重PCRs中減小非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率而同時(shí)保持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，由此提高核酸雜交的特異性。因此，所述方法能夠有效地用于特定病原體的鑒定、遺傳性疾病的診斷、基因序列的分析等等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101050472SQ20061016864
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者李貞男, 白象鉉 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社