專利名稱：植物油體表達(dá)載體及利用植物油體表達(dá)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體的說，涉及植物油體表達(dá)載體及利用植物油體表達(dá)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的方法。
背景技術(shù)：
利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)醫(yī)用蛋白，近年越來越受到人們的關(guān)注，在植物油體中表達(dá)藥用蛋白，使目的基因插在油體蛋白基因的N端或C末端，構(gòu)建成融合蛋白基因。由于油體蛋白鑲嵌在油體表面，構(gòu)建的融合蛋白基因便可在受體植物種子的油體中特異表達(dá)，這樣便可大大提高外源蛋白在植物組織中的表達(dá)量，并可利用油體親脂疏水的特性，將種子粉碎后，再經(jīng)液體抽提離心等步驟，回收油相，便可將融合蛋白或目的蛋白與細(xì)胞內(nèi)的其它組份分開，這樣便可明顯簡化目的蛋白的分離純化過程，這種植物油體表達(dá)體系有利于外源基因的表達(dá)及產(chǎn)業(yè)化研究，因此本發(fā)明采用油體表達(dá)技術(shù)在植物種子中表達(dá)haFGF，為haFGF的產(chǎn)業(yè)化研究打下了基礎(chǔ)。
人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(human acidic fibroblast growthfactor，haFGF)是已知FGF家族中的成員，為中胚層和神經(jīng)外胚層來源的有絲分裂原，具有促進(jìn)血管生成、神經(jīng)元再生和存活、骨或軟骨組織修復(fù)及成肌細(xì)胞分化等多種生物學(xué)功能。
最近，有人發(fā)現(xiàn)每個(gè)aFGF分子可與兩個(gè)受體分子結(jié)合。還發(fā)現(xiàn)不同組織中存在有不同分子量的aFGF，推測這種情況可能是由于這些分子在不同細(xì)胞內(nèi)經(jīng)受不同的轉(zhuǎn)錄后加工過程所導(dǎo)致的。
一般來說，aFGF的化學(xué)特征是可與肝素緊密結(jié)合，其等電點(diǎn)呈酸性(pH5-7)。已知肝素可通過幾種方式調(diào)節(jié)FGF分子的功能(Loss，Eur.J.Clin.Invest，18321-326，1988)，例如肝素或肝素樣分子可直接作用于FGF，激活或增強(qiáng)aFGF的活性(Uhlrich et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm，1371205-1213，1986)。另外，發(fā)現(xiàn)可溶性肝素的增效作用似乎對aFGF有選擇性，而且其強(qiáng)化aFGF活性的程度級比bFGF大10倍。肝素樣物質(zhì)也是FGF特別是aFGF的優(yōu)選穩(wěn)定劑。
aFGF的獨(dú)特的血管生成活性和細(xì)胞增殖活性使之特別適用于促進(jìn)組織上口特別是深部傷口的愈合。例如國際專利WO9/08828和歐洲專利0741143分別公開了使用aFGF活性片段保護(hù)中樞神經(jīng)元并改善腦功能的方法。國際專利申請96/38167描述了以aFGF為基本活性成分的用于促進(jìn)骨組織修復(fù)和/或生長的藥物組合物。
aFGF在待治療的損傷部位，特別是在大部分的處于酸性環(huán)境的損傷部位(如淺表組織損傷和胃潰瘍)，aFGF可發(fā)揮其溫和而持久的生物學(xué)活性，從而有利于其在臨床上的應(yīng)用。
許多現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)已報(bào)道了以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)aFGF的方法(例如參見Biotechnology 5960，J.Biol.Chem.1987；26316471，1988；EP 0219052等)。近年來，為了進(jìn)一步改善aFGF的生物學(xué)活性，提高產(chǎn)物的表達(dá)效率及增加表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，一些實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了許多改良的重組表達(dá)系統(tǒng)(如參見WO96/08572、WO98/32869、EP 406738等)。另一方面，一些專利申請還公開了具有提高的生物學(xué)活性和/或穩(wěn)定性的aFGF類似物或突變體(如參見WO96/22369、WO92/11366、WO91/11459)。但也有人證明，整合形式的全長度aFGF的活性要比去除了N末端部分氨基的其他形式aFGF的活性大約高3倍(參見EP 0505811)。
迄今為止，主要是使用細(xì)菌特別是大腸桿菌作為以重組技術(shù)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，但使用大腸桿菌生產(chǎn)生物學(xué)活性蛋白質(zhì)特別是真核細(xì)胞蛋白的一個(gè)重要缺點(diǎn)是，表達(dá)產(chǎn)物在宿主胞漿內(nèi)形成所謂“包涵體”，即生物學(xué)活性的不溶性聚合體。雖然形成包涵體的優(yōu)點(diǎn)是可保護(hù)被表達(dá)的蛋白質(zhì)免于遭受宿主細(xì)胞中蛋白酶的降解，并能夠用離心方法很容易地將包涵體分離出來。但為了得到有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，必須對包體進(jìn)行變性-溶解-復(fù)性處理。這個(gè)過程一般要在反復(fù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上完成，而且常常不能得到令人滿足的產(chǎn)物回收率。為了解決這一難題，人們試圖采用真核植物來表達(dá)藥用蛋白，使蛋白質(zhì)正確折疊和糖基化，以此維持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在植物種子油體中表達(dá)aFGF的重組表達(dá)載體，其中所說的表達(dá)載體包含與油體蛋白啟動(dòng)子可操作地連接的haFGF的全長核苷酸序列，且haFGF全長核苷酸序列是按照植物偏好的密碼子設(shè)計(jì)合成的。
本發(fā)明的表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子是油菜啟動(dòng)子，將大豆油體蛋白基因與aFGF基因融合后克隆進(jìn)表達(dá)載體中，經(jīng)農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化進(jìn)真核植物中進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種在真核宿主中表達(dá)成酸性成纖維細(xì)胞生長因子的方法。該方法包括以下步驟(1)構(gòu)建植物油體表達(dá)載體p1390ONE；(2)按植物偏好的密碼子合成haFGF的核苷酸序列；(3)將haFGF的核苷酸序列連接到油體蛋白核苷酸序列的3`端，克隆進(jìn)表達(dá)載體中；(4)用步驟(3)的重組表達(dá)載體用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)恼婧怂拗饔鷤M織；(5)篩選轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織；(6)篩選抗性植物轉(zhuǎn)化苗；(7)將得到的植物種子經(jīng)粉碎、用提取液萃取，離心可除去90％以上的雜質(zhì)，經(jīng)洗滌純化回收所需的酸性成纖維細(xì)胞生長因子活性多肽。
根據(jù)本發(fā)明的方法，圖2顯示haFGF的的氨基酸序列。
本發(fā)明涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)aFGF的方法，特別是涉及以真核植物作為宿主生產(chǎn)aFGF的方法。更具體的說，本發(fā)明涉及用于在真核植物種子油體蛋白中融合表達(dá)aFGF蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及按本發(fā)明的方法制備的aFGF在治療由于血管病變、心肌梗塞或腦出血引起的局部缺血性疾病、促進(jìn)組織修復(fù)、傷口愈合中及其在個(gè)人護(hù)理品中的應(yīng)用。
一般的來說，為了提高基因的表達(dá)效率和產(chǎn)物的產(chǎn)率，本發(fā)明選擇用油體蛋白與aFGF融合表達(dá)，從而使融合蛋白表達(dá)量大大提高，并且更加穩(wěn)定。
可按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行基因的分離和合成、克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建、DNA序列分析及鑒定、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，以及表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化等操作(參見Sambrook ct al.，Molecular CloningALaboratory Mannual，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cola SpringHarbor，NY，1989)。
可以將按本發(fā)明方法制備的aFGF與選自人血清白蛋白、多聚甘氨酸、金屬陽離子(如Zn2+、Mn+和Mg2+)及低分子量肽的活性蛋白質(zhì)保護(hù)劑，選自聚乙二醇、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑混合，并加入本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥物載體或賦形劑，制成適于經(jīng)胃腸道途徑，特別是經(jīng)胃腸道外途徑給藥的藥物組合物?？梢园凑罩扑庮I(lǐng)域的常規(guī)方法，將這樣的藥物組合物制成適于經(jīng)血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、或腹腔內(nèi)給藥的溶液劑、經(jīng)口服給藥的片劑或粉末劑，或制成適合于外用的栓劑、軟膏、霜?jiǎng)?、乳化劑等劑型?br> 本發(fā)明的藥物組合物可用于促進(jìn)因燒傷或其他機(jī)械床上造成的軟組織、肌腱、人帶、軟骨或骨組織傷口的修復(fù)或愈合。所說的軟骨組織包括皮膚、肌肉、血管、內(nèi)臟器官及角膜組織等處古和軟骨組織外的所有組織。本發(fā)明的藥物組合物亦可用于治療血管組織損傷，如促進(jìn)血管生長(血管生成)和血管修復(fù)(促進(jìn)受損部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖)。本發(fā)明的藥物組合物還可用于促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)組織修復(fù)，包括刺激阿爾海默氏病(早老性癡呆)病理過程中受損的海馬神經(jīng)元的生長。作為本發(fā)明藥物組合物的活性成分，aFGF可刺激因各種原因受到損傷的神經(jīng)組織，使之通過成神經(jīng)細(xì)胞的有絲分裂再生新的神經(jīng)元，恢復(fù)受損部位的神經(jīng)細(xì)胞群體，并促進(jìn)軸突的延伸。


圖1表達(dá)載體p1390R的圖譜。
圖2haFGF目的蛋白的Western檢測圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1aFGF基因的制備及序列測定以haFGF基因?yàn)樗{(lán)圖，首先按照植物偏好的密碼子將haFGF堿基序列重新改造，并按照密碼子的簡并性消除在本實(shí)驗(yàn)中所用到的酶切位點(diǎn)，利用在線軟件Primerfinder及DNASTAR設(shè)計(jì)引物，為了合成含植物偏好的aFGF全長基因，共設(shè)計(jì)合成了十一條引物，每條引物長度約為57～59bpPA1-PA5為正向引物，PA6-PA11為反向引物，其中PA5和PA6為互補(bǔ)的嵌合引物(有17個(gè)互補(bǔ)堿基)；在引物PA1和PA11中分別引入了HindIII、KpnI和凝血酶切位點(diǎn)及SpeI、EcoRI酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，以便克隆進(jìn)中間克隆載體及植物表達(dá)載體中。
aFGF全長基因合成第一輪PCR擴(kuò)增，如下建立100μl的反應(yīng)體系10×pfu buffer 10μldNTP(2.5mM) 8μl引物PA5(10μmol/L) 2μl引物PA6(10μmol/L) 2μl
pfu DNA聚合酶 0.5μlddH2O 77.5μl
Total 100μl反應(yīng)參數(shù)94℃5min55℃5min72℃5min4℃ ∞經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測無非特異性條帶后，用DNA膠回收試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物命名為A56。
第二輪PCR擴(kuò)增，如上采用100μl反應(yīng)體系10×pfu buffer 10μldNTP(2.5mM) 8μl引物PA4(10μmol/L) 2μl引物PA7(10μmol/L) 2μlA56模板 1μlpfu DNA聚合酶 0.5μlddH2O 76.5μl
Total 100μl反應(yīng)參數(shù)如下
72℃ 2min4℃保存如上用DNA膠回收試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物命名為A47。
其后，以A47為模板，以PA3及PA8作引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得PCR產(chǎn)物A3/8；再以A3/8為模板，以PA2及PA9作引物，擴(kuò)增得PCR產(chǎn)物A2/9；如此進(jìn)行，直至合成改造后的aFGF全長基因。
將PCR產(chǎn)物aFGF經(jīng)HindIII及EcoRI雙酶切后連接到pUC19上，得到pUCaFGF。重組質(zhì)粒pUCaFGF的DNA序列測序結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的aFGF核苷酸序列正確。獲得了408bp的haFGF基因，序列如下GCT AAC TAC AAG AAG CCA AAG TTG TTG TAC TGC TCTAAC GGA GGA CAT TTC TTG AGA ATT TTG CCA GAT GGAACT GTT GAT GGA ACT AGA GAT AGA TCA GAT CAA CATATT CAA TTG CAA TTG TCT GCT GAG TCT GTT GGA GAGGTT TAC ATT AAG TCT ACT GAG ACT GGA CAA TAC TTGGCT ATG GAT ACT GAT Gga TTG TTG TAC GGA TCT CAAACT CCA AAC GAG GAG TGC TTG TTC TTG GAG AGA TTGGAG GAG AAC CAT TAC AAC ACT TAC ATT TCT AAG AAGCAT GCT GAG AAG AAC TGG TTC GTT GGA TTG AAG AAGAAC GGA TCT TGC AAG AGA GGA CCA AGA ACT CAT TACGGA CAA AAG GCT ATT TTG TTC TTG CCA TTG CCA GTTTCT TCT GAT TAA實(shí)施例2重組油體表達(dá)載體的構(gòu)建以白菜型油菜的總DNA為模板，以oleosin基因的啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)引物，引物1含有HindIII酶切位點(diǎn)，引物2引入XbaI和EcoRI酶切位點(diǎn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了約900 bp的20 KD oleosin基因的啟動(dòng)子(PCR反應(yīng)條件為94℃，5分鐘；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘；25個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5分鐘)，PCR產(chǎn)物用HindIII和EcoRI雙酶切后，將其連接到pUC19上，得到pUCON，其測序結(jié)果表明克隆產(chǎn)物為油菜油體蛋白基因的啟動(dòng)子。
以大豆24kD油體蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物引物1序列為5′-GAATCT AGA GAT GAT GAT GAT AAG ATG ACC ACA CAA GTA CC，引物2序列為5′-GCC GGT ACC ATC ATC ATC ATC CTT GGT TGTTGC TGT CAC TG。引物1含有XbaI酶切位點(diǎn)，引物2引入KpnI酶切位點(diǎn)，以含完整大豆24KDa油體蛋白基因的pTO質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得完整的大豆24kDa油體蛋白基因編碼區(qū)序列678bp(PCR反應(yīng)條件為94℃，5分鐘；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃1分鐘；25個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸2分鐘)，PCR產(chǎn)物用KpnI和XbaI雙酶切后，將其連接到pUC19上，得到pUCOE，其測序結(jié)果表明克隆產(chǎn)物為大豆油體蛋白基因。
將pUCON質(zhì)粒用HindIII和XbaI雙酶切后，將酶切片段油菜油體蛋白啟動(dòng)子連接到p1390R中，(見《貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》2006年第04期，“含aFGF基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其對根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化”)重組質(zhì)粒命名為p1390ON，經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行后續(xù)工作。將pUCOE質(zhì)粒經(jīng)XbaI和KpnI雙酶切后，將酶切片段大豆油體蛋白基因與p1390ON連接，重組質(zhì)粒命名為p1390ONE，此即油體表達(dá)載體。
實(shí)施例3含haFGF基因的重組油體表達(dá)載體的構(gòu)建將pUCaFGF質(zhì)粒用KpnI和SpeI雙酶切后，將得到的haFGF酶切片段與重組油體表達(dá)載體p1390ONE連接，得到重組植物油體表達(dá)載體p1390ONE-aFGF。
實(shí)施例4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜、紅花等遺傳轉(zhuǎn)化p1390ONE-aFGF質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌取1μg p1390ONE-aFGF質(zhì)粒DNA加入到100微升LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴放置5分鐘；然后置液氮中冷凍5分鐘后迅速轉(zhuǎn)至37℃水浴中溫育5分鐘。加入1毫升LB液體培養(yǎng)基，在28℃搖床上180rpm振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。取適量菌液涂布到含鏈霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，置28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，經(jīng)抗性篩選、PCR及酶切鑒定獲得帶有p1390ONE-aFGF質(zhì)粒DNA的農(nóng)桿菌單菌落。
含p1390ONE-aFGF質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的活化從平板上挑取含p1390ONE-aFGF質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到5毫升LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50mg/L，鏈霉素50mg/L)，振蕩培養(yǎng)過夜，取100微升菌液接種到50毫升LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/L，鏈霉素50mg/L)中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為1,1500rpm離心10分鐘，菌體用浸染培養(yǎng)基重懸，使OD600為0.5。
油菜或紅花等植物的遺傳轉(zhuǎn)化將油菜或紅花等子葉或下胚軸在重懸的農(nóng)桿菌菌液中浸泡15分鐘，放到含適當(dāng)激素配比的MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，之后轉(zhuǎn)到含有潮霉素15mg/L+頭孢霉素250mg/L的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選及進(jìn)行芽分化選擇培養(yǎng)，約8周左右有抗性芽出現(xiàn)，待抗性芽伸長至2～5厘米時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上，一般15～30天左右即可生根。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因油菜、紅化等植物的PCR檢測提取轉(zhuǎn)基因油菜或紅花等植物基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別以aFGF基因的一對引物擴(kuò)增目的基因aFGF、以大豆油體蛋白基因的一對引物擴(kuò)增大豆油體蛋白基因、以大豆油體蛋白基因5`端引物和aFGF基因的3`端引物擴(kuò)增融合蛋白基因。擴(kuò)增aFGF基因的PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘；94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃35秒，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸2分鐘。擴(kuò)增大豆油體蛋白基因的PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘，94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃ 1分鐘；25個(gè)循環(huán)；72延伸5分鐘。擴(kuò)增融合蛋白基因的PCR反應(yīng)條件為94℃分鐘。分別擴(kuò)增出預(yù)期的440bp的aFGF基因(含酶切位點(diǎn)和凝血酶切位點(diǎn))、690bp的大豆油體蛋白基因及1130bp的融合蛋白基因。
實(shí)施例5油菜籽和紅花籽中aFGF目的蛋白的Western檢測提取油菜籽中和紅花籽中的油體蛋白，經(jīng)凝血酶切割后過肝素親和層析柱，分離純化得到aFGF純品，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用山羊抗兔aFGF的多克隆抗體進(jìn)行Western分析，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因油菜和紅花的種子中有aFGF蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小約為15kD，與預(yù)期的大小一致，Western結(jié)果見附圖2。
實(shí)施例6油體蛋白與aFGF融合蛋白的分離純化及生物活性測定1.油菜和紅花籽中油體蛋白-aFGF融合蛋白的提取(1)分別取油菜種子和紅花種子10粒去掉外殼，加2.5倍體積的緩沖液A(0.15M Tricine-KOH pH7.5，10mM KCI，1mM MgCl2，1mMEDTA，0.6M蔗糖)研磨，5000g、4℃離心15分鐘。
(2)上清用含0.65M蔗糖的緩沖液A重懸。
(3)液面上覆以等體積的含0.12M蔗糖的緩沖液A。
(4)15000g、4℃離心25分鐘，重復(fù)兩次，取上清。
至此將油體與種子中的其它成份分開。
(5)上清中加2倍體積的乙醚，15000g離心8分鐘，上部的乙醚層中多為中性脂類，磷脂留在下面的水相中，取中間的蛋白層。
(6)以適量含0.1M蔗糖的緩沖液A重懸蛋白，加三倍體積的氯仿/甲醇(2∶1)混合物，抽提3次。
(7)取中間蛋白層，用乙醚抽提一次，-70℃超低溫冰箱中凍干保存。
2.油體蛋白與aFGF蛋白的分離(1)將油體蛋白-aFGF融合蛋白溶于無菌水中，加入0.2U凝血酶，37℃酶切過夜。
(4)將酶切反應(yīng)液上Harpin-Sepharose CL-6B親和層析柱，
(4)將酶切反應(yīng)液上Harpin-Sepharose CL-6B親和層析柱，用平衡緩沖液(10mmol/L PBS，PH7.0，0.2mol/L NaCl)洗至基線，用含0.6mol/L NaCl洗除雜蛋白，再用含1.2mol/L NaCl的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰，經(jīng)SDS-PAGE、考馬氏亮藍(lán)染色，BandScan軟件分析得到aFGF純品，純度達(dá)98％。
用MTT法測定純化后aFGF蛋白和野生型aFGF對Balb/c3T3細(xì)胞的促分裂活性。結(jié)果表明，油體表達(dá)aFGF純品的ED50為4.4ng/ml，野生型aFGF的ED50為4.32ng/ml；油體表達(dá)得到的aFGF蛋白純品與野生型活性相當(dāng)。
序 列 表<110>吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>植物油體表達(dá)載體及利用植物油體表達(dá)人酸性<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>408<212>DNA<213>人工序列<400>1gctaactaca agaagccaaa gttgttgtac tgctctaacg gaggacattt cttgagaatt 60ttgccagatg gaactgttga tggaactaga gatagatcag atcaacatat tcaattgcaa120ttgtctgctg agtctgttgg agaggtttac attaagtcta ctgagactgg acaatacttg180gctatggata ctgatggatt gttgtacgga tctcaaactc caaacgagga gtgcttgttc240ttggagagat tggaggagaa ccattacaac acttacattt ctaagaagca tgctgagaag300aactggttcg ttggattgaa gaagaacgga tcttgcaaga gaggaccaag aactcattac360ggacaaaagg ctattttgtt cttgccattg ccagtttctt ctgattaa 408
權(quán)利要求
1.油體蛋白和人酸性成纖維細(xì)胞生長因子融合基因的植物油體表達(dá)載體p1390ONE-aFGF。
2.一種在植物種子油體中表達(dá)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的方法，包括步驟將權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物，經(jīng)篩選鑒定獲得轉(zhuǎn)基因受體植物并獲得植物種子，將得到的植物種子提取獲得酸性成纖維細(xì)胞生長因子活性多肽。
全文摘要
本發(fā)明采用體外基因重組方法，將人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(Human acidic fibroblast growth factors haFGF)與油體蛋白基因融合合成，構(gòu)建成一種植物油體表達(dá)載體，建立一種油體蛋白遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)體系，用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了擬南芥、紅花、大豆、黑豆、油菜，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因紅花、油菜的分子生物學(xué)檢測證明外源基因的整合和表達(dá)，經(jīng)活性檢測，獲得的重組蛋白具有生物活性，其生物活性與人aFGF標(biāo)準(zhǔn)品活性相當(dāng)。本發(fā)明還提供一種方法在植物種子中表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子，這種方法可以提供一種經(jīng)濟(jì)的方法生產(chǎn)酸性成纖維細(xì)胞生長因子，可開發(fā)出一種醫(yī)類新藥。
文檔編號C12N15/29GK1986817SQ200610169598
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者李校堃, 龐實(shí)鋒, 肖業(yè)臣, 柯實(shí), 張馳 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)