專利名稱：一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化和提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到用微生物將植物中的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇是一種三羥基芪類化合物，存在于葡萄、藜蘆、何首烏、虎杖等多種植物中，具有抗癌、抗病毒、抗氧化、阻止血小板凝聚等作用，主要用于預(yù)防和治療心血管疾病。目前，白藜蘆醇已被廣泛應(yīng)用于食品保健品和化妝品，其需求量在逐年上升。
白藜蘆醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成和從天然植物中提取?；瘜W(xué)合成法成本高，污染環(huán)境，所以目前白藜蘆醇的生產(chǎn)主要是從植物中提取。然而，植物中的白藜蘆醇含量特別低，其中在虎杖中含量最高，但也僅達(dá)到0.43％(漢中地區(qū))，這就使得其分離純化成本偏高。而白藜蘆醇類似物白藜蘆苷在植物中的含量遠(yuǎn)高于白藜蘆醇。在虎杖中，白藜蘆醇苷的含量可達(dá)到2.5％(漢中地區(qū))；在何首烏中，其最高含量可達(dá)4.8％(四川)。如果將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，白藜蘆醇的產(chǎn)率可大大提高。
傳統(tǒng)上，苷元的獲得是通過(guò)水解相應(yīng)的糖苷來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但水解反應(yīng)需要在高溫高壓下由酸或堿催化來(lái)完成，對(duì)設(shè)備要求高，且對(duì)環(huán)境造成污染。相比之下，生物轉(zhuǎn)化法具有條件溫和，過(guò)程簡(jiǎn)單，污染小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為藥物修飾的重要手段。
將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇主要是通過(guò)酶法轉(zhuǎn)化和微生物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的。例如，在粉末狀虎杖原料中加入復(fù)合酶恒溫酶解反應(yīng)48-72小時(shí)(CN1251363，F(xiàn)R2795964)，或者在虎杖提取液中加入纖維素酶進(jìn)行水解(CN1566349A)。酶法轉(zhuǎn)化雖然取得了一定的效果，但是酶價(jià)格昂貴，限制了這些方法的推廣使用。微生物轉(zhuǎn)化法是將浸潤(rùn)后的虎杖置于溫度為20-50℃的容器內(nèi)自然發(fā)酵24-96小時(shí)(CN1385535A)或者在虎杖中加入專用微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化(CN1513822A)。微生物轉(zhuǎn)化法可以有效地提高了白藜蘆醇的產(chǎn)率，但自然發(fā)酵過(guò)程中的菌群未知，條件難以控制，且空氣中的霉菌有可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)；專用微生物轉(zhuǎn)化法(CN1513822A)中所用微生物未公開，無(wú)法驗(yàn)證和重復(fù)，其實(shí)用性受到極大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種食品級(jí)微生物米曲霉(Aspergillus oryzae)作為菌種，對(duì)原料虎杖、何首烏、買麻藤、藜蘆、花生衣、葡萄皮或葡萄籽等進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再進(jìn)行微波輔助提取，可大大提高白藜蘆醇的收率。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的工藝步驟包括培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基為添加0~6％的原料粉末的麩皮培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基中必須具備微生物生長(zhǎng)所需的碳源和氮源。碳源為10~30g/L的麩皮，氮源為5~9g/L的硫酸銨、3~7g/L的硝酸銨或者3~5g/L的尿素。培養(yǎng)基須在121℃下滅菌15~20分鐘方能使用。
種子培養(yǎng)在搖瓶中進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速為100~200rpm，溫度為20~35℃，培養(yǎng)時(shí)間為18~24h。
發(fā)酵培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行，接種量為5％~15％，攪拌槳轉(zhuǎn)速為150~350rpm，溫度為20~40℃。發(fā)酵過(guò)程中通入空氣量為0.8~1.5vvm，發(fā)酵時(shí)間為12~48小時(shí)。發(fā)酵進(jìn)行16~44小時(shí)后，改變培養(yǎng)溫度為45~55℃，繼續(xù)培養(yǎng)1~6小時(shí)。
產(chǎn)物提取發(fā)酵液中加入一倍的50~95％的乙醇進(jìn)行微波輔助提取。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于直接將原料粉末進(jìn)行發(fā)酵，大大提高了其白藜蘆醇的收率，工藝簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。所用微生物為食品級(jí)，安全可靠。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合技術(shù)方案，以虎杖為例，詳細(xì)敘述本發(fā)明的實(shí)施方式。
實(shí)施例1發(fā)酵所用菌種為米曲霉(Aspergillus oryzae)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號(hào)為CICC 2436。
培養(yǎng)基A.種子培養(yǎng)基10g麩皮加100ml自來(lái)水煮沸20min，過(guò)濾，濾液添加水到100ml，再加入6％的虎杖粉末。B.發(fā)酵培養(yǎng)基虎杖粉末200g(60目)，麩皮50g，硝酸銨12.5g，自來(lái)水2500ml，121℃滅菌20min。
發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)在250ml的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為30mL，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)溫度為30？，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行，實(shí)際裝液量為2.5L，接種量為5％，轉(zhuǎn)速控制為250rpm，通入空氣量為1.5vvm，溫度控制在37？。
發(fā)酵結(jié)束，加入1倍于發(fā)酵液的95％乙醇，微波輔助提取。
實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下發(fā)酵進(jìn)行24小時(shí)，白藜蘆醇的產(chǎn)率為1.34％(g/g藥材)，是未發(fā)酵藥材中白藜蘆醇產(chǎn)率(0.43％)的3.12倍。
實(shí)施例2發(fā)酵所用菌種為米曲霉(Aspergillus oryzae)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號(hào)為CICC 2436。
培養(yǎng)基A.種子培養(yǎng)基10g麩皮加100ml自來(lái)水煮沸20min，過(guò)濾，濾液添加水到100ml。B.發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)在250ml的搖瓶中進(jìn)行，裝液量為30mL，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)溫度為25？，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)在250ml搖瓶中進(jìn)行，實(shí)際裝液量為50ml，接種量為5％，轉(zhuǎn)速控制為150rpm，溫度控制在25？。發(fā)酵進(jìn)行44小時(shí)后，改變培養(yǎng)溫度為50？，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。
培養(yǎng)結(jié)束后，加入一倍于發(fā)酵液的95％乙醇，微波輔助提取。
實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下白藜蘆醇的產(chǎn)率為1.35％(g/g藥材)，是未發(fā)酵藥材中白藜蘆醇產(chǎn)率(0.35％)的3.86倍。
權(quán)利要求
1.一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征在于工藝步驟包括(1)將原料粉碎，加入碳源和氮源，配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)接種米曲霉；(3)攪拌發(fā)酵；(4)微波輔助提取發(fā)酵液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征在于所述原料為虎杖、何首烏、買麻藤、藜蘆、花生衣、葡萄皮或葡萄籽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征在于接種米曲霉為Aspergillus oryzae(CICC 2436)，為食品級(jí)微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基為添加0~6％的原料粉末的麩皮培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中所加入碳源為10~30g/L的麩皮，氮源為5~9g/L的硫酸銨、3~7g/L的硝酸銨或者3~5g/L的尿素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征在于接種量為5~15％，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為150~350rpm，培養(yǎng)溫度為20~40℃，空氣通入量為0.8~1.5vvm，發(fā)酵時(shí)間為12~48小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征還在于發(fā)酵進(jìn)行16~44小時(shí)后，改變培養(yǎng)溫度為45~55℃，繼續(xù)培養(yǎng)1~6小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，其特征在于微波輔助提取發(fā)酵液所用溶劑為50~95％的乙醇。
全文摘要
一種用微生物將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的方法，屬于天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化和提取技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)特征是將原料粉碎，加入碳源和氮源制成種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；接種米曲霉(Aspergillus oryzae)，通氣攪拌發(fā)酵；微波輔助提取發(fā)酵液。本發(fā)明的效果和益處是在原料粉末中直接加入碳源和氮源制成培養(yǎng)基，接種食品級(jí)微生物米曲霉進(jìn)行發(fā)酵，簡(jiǎn)化了工藝和操作程序，縮短了生產(chǎn)周期，大大提高了白藜蘆醇的收率，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/69GK1896256SQ20061020063
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者修志龍, 王輝, 劉琳, 李曉暉 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)