專利名稱：：作為多肽支架的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)的制作方法作為多肽支架的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)本發(fā)明涉及用于制備對(duì)預(yù)定靶分子具有特異結(jié)合特性的多肽的方法，其中所述特異結(jié)合特性不天然為此多肽固有。同時(shí)本發(fā)明描述了優(yōu)化結(jié)合特異性的方法以及產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還涉及用于在多肽支架中鑒定和修飾可改變的M酸位置的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，與親和試劑相關(guān)的專利申請(qǐng)和公開的數(shù)量穩(wěn)定增加。它們中的大多數(shù)涉及抗體，即單克隆或多克隆的免疫球蛋白。僅有一小部分涉及可能的備選方案。這些備選方案之一是蛋白質(zhì)支架的使用。此概念需要在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平耐受多個(gè)替換或插入的穩(wěn)定蛋白質(zhì)架構(gòu)(Nygren,P-A.,Skerra，A.，J.Immun.Meth.2卯(2004)3-28)。域。眾多其它問題中唯一問M抗體在細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用.這種蛋白質(zhì)敲除技術(shù)的瓶頸在于并非細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有抗體均性能良好。這被稱作"二硫鍵問題"。為了解決該問題，不得不開展費(fèi)時(shí)的實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化一系列復(fù)雜參數(shù)(Visintin，M.等，J.Imnmn.Meth.290(2004)135-153),就此而言，蛋白質(zhì)具有數(shù)種優(yōu)勢。在這些優(yōu)勢中包括低分子量，易于由微生物產(chǎn)生、修飾筒單以及應(yīng)用廣泛。已經(jīng)在本上下文中描述了不同的蛋白質(zhì)支架，例如用于DNA識(shí)別的鋅指蛋白(Segal，D丄等，Biochem.42(2003)2137-2148);通過在活性中心環(huán)內(nèi)導(dǎo)入可變多肽序列加以修飾的基于疏氧還蛋白的肽適體(Klevenz，B.等，Cell.MoLLifeScL59(2002)1993-1998);作為"親和體(affibody)，，支架的蛋白A(Sandstrom，K.等，Prot.Eng.16(2003)691-697;Andersson，M.等，J.Immun.Meth.283(2003)225-234);第十纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的mRNA-蛋白質(zhì)分子(Xu，L等，Chem.Biol.9(2002)933-942)或基于a-淀粉酶抑制劑的結(jié)合分子(McConndl，S丄和Hoess，R.H.，J.Mol.Biol.250(1995)460-470)。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)基本上描述了可應(yīng)用蛋白質(zhì)支架的特征首先，蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)屬于顯示已充分定義的疏水核心的家族。各個(gè)家族成員間的密切關(guān)系是有益的(Skerra,A.,J.MoI.Recognit.13(2000)167-187)。其次，蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有空間上分隔且功能獨(dú)立的可接近的活性中心或結(jié)合袋。活性中心或結(jié)合袋不應(yīng)當(dāng)對(duì)核心的內(nèi)在穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)(Predki，P.F.等，NatureStruct.Biol.3(1996)54-58)。理想地，這種蛋白質(zhì)家族本身參與識(shí)別非相關(guān)的多個(gè)耙標(biāo)。如Nygren，P畫A.和Skerra，A.，J.Immun.Meth.290(2004)3-28中所述，已經(jīng)采用數(shù)種多肽支架用于開發(fā)新的親和蛋白質(zhì)。這些支架可以分為三類(i)單肽環(huán)、(ii)工程化的界面和(iii)非連續(xù)的超變環(huán)。對(duì)于第一類支架，使在暴露的環(huán)內(nèi)的單個(gè)氨基酸多樣化或者將小的多肽序列插入這個(gè)暴露的環(huán)內(nèi)(見例如Roberts,B丄.等，PNAS89(1992)2429-2433和Gene121(1992)9-16;Rottgen，P.和Collins,J.，Gene164(1995)243;Lu，Z.等，Bio/Technology13(1995)366-372)。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是難以實(shí)現(xiàn)對(duì)全新靶標(biāo)的親和性，即便有也很低(Klevenz，B.等，Cell.Mol.LifeSci.59(2002)1993-1998),可以修飾對(duì)天然的或密切相關(guān)的把標(biāo)的內(nèi)在結(jié)合親和性，但是幾乎難以改變靶標(biāo)或乾標(biāo)族。另一個(gè)缺點(diǎn)是在插入小的隨機(jī)化多肽時(shí)，靶標(biāo)必須已知并且這些序列必須基于已經(jīng)得到的知識(shí)事先產(chǎn)生。第二類支架屬于例如葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如SandstHim,K.等，Prot.Eng.16(2003)691-697)、真菌里氏木霉(7:i^ew/)纖維二糖水解酶I的羧基端纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Smith，G.P.等，J.Mol.Biol.277(1998)317畫322)和7曙晶態(tài)(Fiedler，U.和Rudolph,R.,WO01/04144).第三類支架以免疫球蛋白自身和遠(yuǎn)射目關(guān)的纖連蛋白ni型結(jié)構(gòu)域以及某些類型的神經(jīng)毒素為代表。除了作為用于產(chǎn)生對(duì)預(yù)定靶分子的特異結(jié)合特性的支架適合性(suitability)之外，還必須考慮應(yīng)用條件。其中尤其應(yīng)考慮親和多肽的穩(wěn)定性、選擇性、溶解性和功能性產(chǎn)生。例如，已經(jīng)如上提及，蛋白質(zhì)敲除技術(shù)的瓶頸在于并非細(xì)胞內(nèi)表達(dá)作為親和分子的全部抗體均功能性地產(chǎn)生("二硫鍵問題，，，Visintin，M.等，J.Immun.Meth.2卯(2004)135-153)。因此，本發(fā)明的目的是通過提供對(duì)預(yù)定靶分子具有特異結(jié)合特性的備選多肽支架而克月艮這些缺點(diǎn)，其中所述特異結(jié)合特性不天然為多肽固有。這包含氨基酸的隨機(jī)化、優(yōu)化結(jié)合特性以及產(chǎn)生具有特異結(jié)合特性的優(yōu)化多肽的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的多肽，其特征是多肽的氨基酸序列選自SEQIDNO:02至SEQIDNO:61，其中在所述^J^酸序列中改變根據(jù)表V的至少一個(gè)氨基酸。本發(fā)明還包含用于在原核微生物或真核微生物中產(chǎn)生特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的多肽的方法，其特征是所述微生物含有編碼所述多肽的基因并且該多肽得到表達(dá)。靶分子的多:的栽體。、，；'多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以分離和純化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)定靶分子是刺猬蛋白(hedgehogproteins)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白細(xì)胞介素和干擾素中的一個(gè)成員。本發(fā)明還提供用于從DNA文庫中鑒定編碼特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的多肽的核酸的方法，其中該方法包括步驟a)從SEQIDNO:02至SEQIDNO:61中選#^序列；b)制備其中至少一個(gè)根據(jù)表V的M酸位置得到改變的所i^列的DNA文庫；c)對(duì)制備的DNA文庫篩選所編碼的特異性結(jié)合預(yù)定把分子的多肽；d)選擇編碼一種在步驟c)中經(jīng)鑒定的特異性結(jié)合物的核酸；e)重復(fù)步驟b)至d)二到五次；以及f)分離編碼特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的多肽的所述核酸。在另一實(shí)施方案中，用于從DNA文庫中鑒定編碼特異性結(jié)合耙分子的多肽的核酸的方法包括線性表達(dá)元件。在另一實(shí)施方案中，多肽文庫通過在核糖體上展示表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，多肽文庫通it^噬菌體上展示而表達(dá)。本發(fā)明還包括用于在多肽中確定可改變的M酸位置的方法，包括步激a)收集來自相同和/或不同生物的在結(jié)構(gòu)和/或功能上同源的多肽的多個(gè)序列；并且b)根據(jù)共有結(jié)構(gòu)和/或共有序列和/或功能性基序比對(duì)序列，和c)在比對(duì)中通過計(jì)數(shù)在序列每一位置處發(fā)現(xiàn)的不同氨基酸的數(shù)確定所有M酸位置的可變性；以及d)將可改變的M酸位置確定為具有總數(shù)為8個(gè)或更多個(gè)不同M酸的M酸位置。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的多肽，其特征是多肽的氨基酸序列選自SEQIDNO:02至SEQIDNO:61,其中在所述#^酸序列中改變至少一個(gè)根據(jù)表V的氨基酸。本發(fā)明還提供了用于從DNA文庫中鑒定編碼特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的多肽的核酸的方法和用于在多肽中確定可改變的M酸位置的方法。多肽可以通過其M酸序列和通過衍生自其的DNA序列進(jìn)行定義。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以通過重組方法或合成地產(chǎn)生。使用重組DNA技術(shù)能夠產(chǎn)生多肽的多種衍生物。此類衍生物例如可以在單個(gè)或數(shù)個(gè)M酸位置處通過替換、改變或交換得以修飾。衍生化可以例如通過位點(diǎn)定向誘變方式開展。此類變異可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地實(shí)施(Sambrook，L等，MolecularCloning:Alaboratorymanual(1999)ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,USA;Hames,B.D.和Higgins，S.G.，NucleicacidHybridation誦apracticalapproach(1985)IRLPress,Oxford,England)'本發(fā)明還包括在原核微生物或真核微生物中產(chǎn)生特異性結(jié)合預(yù)定靼分子的多肽的方法，其特征是所述微生物含有編碼所述多肽的核酸序列以及該多肽得到表達(dá)。本發(fā)明因此還涉及作為本發(fā)明外源核酸分子原核表達(dá)產(chǎn)物或真核表達(dá)產(chǎn)物的多肽。借助此類核酸，本發(fā)明的多肽可以以可重復(fù)方式大量得到。對(duì)于在原核或真核宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法，將編碼多肽的M酸序列的核酸整合入適合的表達(dá)栽體。這類表達(dá)載體優(yōu)選地含有可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。隨后將這些重組載體導(dǎo)入用于表達(dá)的合適宿主細(xì)胞，如作為原核宿主細(xì)胞的大腸桿菌(Eco//)或作為真核宿主細(xì)胞的釀酒酵母(5WccAflwwj;cgs"i^v/MV^)、昆蟲細(xì)胞或CHO細(xì)胞并且將轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞在允許異源基因表達(dá)的務(wù)fr下培養(yǎng)。多肽可以在重組產(chǎn)生后使用已知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，通過本領(lǐng)域4支術(shù)人員已知的方例如通過親和層析加以分離和純化，包括免疫沉淀、凝膠過濾、離子交換層析、層析聚焦、等電聚焦、選擇性沉淀、電泳等(見例如A謂bel，L和Frederick,M.，Curr.Prot.Mol.Biol,(1992)JohnWileyandSons,NewYork;Sambrook,J.等，MolecularCloning:Alaboratorymanual(1999)ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,USA;Hames,B.D.和Higgins，S.G.，Neucleicacidhybridization-apracticalapproach(1985)IRLPress,Oxford,England),在本發(fā)明中^f吏用如下縮寫和定義。"多肽"是通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物，無論其經(jīng)天然產(chǎn)生或合成地產(chǎn)生。少于大約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可以稱作"肽"。多于大約100個(gè)氨基酸殘基的多肽可以稱作"蛋白質(zhì)"。術(shù)語"血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域，，(PEX)代表對(duì)血液蛋白質(zhì)血紅素結(jié)合蛋白顯示序列同源性和結(jié)構(gòu)同源性的多肽。該結(jié)構(gòu)域具有大約200個(gè)氨基酸的平均序列并由四個(gè)的重復(fù)亞結(jié)構(gòu)域組成?？s寫"PEX2"代^A基質(zhì)金屬蛋白酶2的羧基端結(jié)構(gòu)域，包含全長蛋白質(zhì)的第466至660位M酸位置。術(shù)語"共有序列"代表作為核普酸序列或M酸序列的推導(dǎo)序列。這種序列代表多個(gè)相似序列。共有序列中每一位置對(duì)應(yīng)于通過比對(duì)三個(gè)或多個(gè)序列而確定在此位置處最常出現(xiàn)的4^或氨基酸。術(shù)語"改變"代表在其中序列即核酸序列或M酸序列中已定義的位置受到修^飾的方法。這包括氨基酸或核酸(核苷酸)以不同的氨基酸或核酸(核苷酸)替代以及缺失或插入。表述"結(jié)合分子的多肽"代表能夠結(jié)合靶分子的多肽。術(shù)語"特異性結(jié)合"代表具有大于10E7(107)升/摩爾的親和性常數(shù)的結(jié)合活性。表述"預(yù)定的靶分子"指作為包含刺猬蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、G^CSF、白細(xì)胞介素和干擾素、免疫球蛋白、酶、抑制劑、激活劑以及細(xì)胞表面蛋白的蛋白質(zhì)類中一個(gè)成員的分子。術(shù)語"表達(dá)載體"或"栽體"代表包含至少一個(gè)編碼多肽的ll^酸序列的核酸序列、啟動(dòng)子序列、終止子序列、選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)的天然或AJtDNA序列。術(shù)語"核酸分子"或"核酸"代表可以是例如DNA、RNA或其衍生物的多核苷酸分子。由于遺傳密碼子的簡并性，不同的核酸序列可編碼相同多肽。本發(fā)明也包括這些變異。術(shù)語"氨基酸"代表丙氨酸(三字母編碼ala,單字母編碼A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，1)、亮氨酸(leu，L)、賴氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F(xiàn))、脯氨酸(pro，P)、絲氨酸(ser，S)、蘇氨酸(thr，T)、色氨酸(t卬，W)、酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。術(shù)語"氨基酸多樣性數(shù)(aminoaciddiversitynumber)，，代^fr氨基酸序列的特定位置處存在的不同氨基酸的數(shù)目。此數(shù)字通過來自相同和/或不同生物的在結(jié)構(gòu)和/或功能上同源的多個(gè)多肽序列集合體的序列與參考或共有序列比對(duì)并鑒定在全部所比對(duì)序列中特定位置處存在的不同氨基酸的總lb^以確定。術(shù)語"比對(duì)"代表排列兩個(gè)或多個(gè)序列以實(shí)現(xiàn)最大程度同一性和保守的過程。這包括對(duì)分子序列確定位置同源性，包括平行排列同源分子中的氨基酸或核苷酸。作為結(jié)果，已比較序列以顯示具有最大統(tǒng)計(jì)相似性的區(qū)域的形式得到展示。在此過程期間，發(fā)現(xiàn)某些序列不含其它比對(duì)序列的4^位置，即可能序列含有一個(gè)或多個(gè)缺失。為實(shí)現(xiàn)最大程度的同一性和保守，可以在這些序列中導(dǎo)y^缺口。缺口在比對(duì)圖中以連字符標(biāo)注。術(shù)語"重疊延伸連接PCR(OEL-PCR)"和"線性表達(dá)元件"(LEE)代表連接DNA片段的方法并描述在此方法中所用的及通過此方法得到的線性DNA片段(見例如Ho，S.N.等，Gene77(1989)51-59;Kain，K.C.等，Biotechniques10(1991)366-374;Shuldiner，A.R.等，Anal.Biochem.194(1991)9-15)。基因轉(zhuǎn)錄物分為如下模塊(module):"啟動(dòng)子模塊"、"基因模塊，，和"終止子模塊"。啟動(dòng)子模塊編碼T7噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列、翻譯控制序列(RBS-核糖體結(jié)合位點(diǎn))和T7噬菌體增強(qiáng)子序列(glOe)(Lee,S.S.和Kang,C，Kor.Biochem.J.24(1991)673-679)。這些調(diào)節(jié)序列在快速翻譯系統(tǒng)中使轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)發(fā)生，例如來自RocheAppliedSciences,Mannheim,Germany的RTS100;U^桿菌HY系統(tǒng)。終止子模塊編碼翻譯終止密碼子以及T7噬菌體回文終止基序(T7T)。任選地，這些模塊包含編碼可在隨后親和純化或標(biāo)記方法中使用的多肽的DNA序列。線性表達(dá)元件(Sykes，K.F.和Johnston,S.A.，NatureBiotechnol.17(1999)355-359)由這些模塊通過兩步法PCR組裝。在4吏用PyrococcuswoesiiDNA聚合酵的第一標(biāo)準(zhǔn)PCR(PWO-PCR)中，無內(nèi)含子的可讀框即基因模塊，通過序列特異性的側(cè)翼引物寡核苷酸擴(kuò)增，該引物寡核苷酸向啟動(dòng)子模塊和終止子模塊導(dǎo)入重疊互補(bǔ)序列。這些DNA片段的PCR介導(dǎo)連接需要必須低于-25kcal/molAG的互補(bǔ)序列雜交自由能。這通過平均25bp長度的序列延伸物得以實(shí)現(xiàn)。設(shè)計(jì)引物寡核苷酸以在溫度48"C至551C間與基因模板雜交。這迫使使用具有平均長度45bp至55bp的引物寡核苷酸。在30個(gè)PCR循環(huán)后，將含有大約50ng已延伸的基因模塊DNA的PCR混合物轉(zhuǎn)移入第二PCR混合物。對(duì)這個(gè)PCR提供50ng至100ng分別的啟動(dòng)子DNA模塊和終止子DNA模塊以及序列特異性末端引物。在DNA聚合酶存在下，雜交的互補(bǔ)性DNA片段的3'端酶延伸(Barik，S.，Meth.MoLBiol.192(2002)185-196)為包含全部三種模塊的全長DNA轉(zhuǎn)錄物。術(shù)語"微生物"指原核微生物和真核微生物。"微生物"優(yōu)選地選自;U^桿菌菌林、枯草芽孢桿菌(5fld//nss"6說/s)菌株、克雷伯氏菌(A/e6w'e/to)菌林、沙門氏菌(5^/加做e/Zfl)菌林、假單胞菌(/^^wfo挑卵fls)菌林或者鏈霉菌(5^印to/iy;ces)菌林以及酵母(yeast)菌林。例如，大腸桿菌菌林包含;U^桿菌K12、UT5600、HB101、XL1、X1776、W3110;酵母菌林例如包含酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(iVc似fl)、漢遜酵母屬(仔a"seiiM/a)、克魯維酵母屬()和裂殖酵母屬兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)基本上描述了可應(yīng)用蛋白質(zhì)支架的特征首先，蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)屬于顯示已充分定義的疏水核心的家族。各個(gè)家族成員間的密切關(guān)系是有益的(Skerra，A.，J.MoLRecognit.13(2000)167-187)。其次，蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有空間上分隔的且功能獨(dú)立的可接近的活性中心或結(jié)合袋。活性中心或結(jié)合袋不應(yīng)當(dāng)對(duì)核心的內(nèi)在穩(wěn)定性提供貢獻(xiàn)(Predki，P.F.等，NatureStruct.Biol.3(1996)54-58)。理想地，這種蛋白質(zhì)家族本身參與識(shí)別非相關(guān)的多個(gè)把標(biāo)。血紅素結(jié)合蛋白樣(PEX)蛋白質(zhì)支架符合這些標(biāo)準(zhǔn)。這種結(jié)構(gòu)性基序存在于多種不同蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)家族中，例如血紅素結(jié)合蛋白(Altruda，F(xiàn).等，NucleicAcidsRes.13(1985)3841-3859)、玻連蛋白(Jenne，D.和Stanley,K.K,Biochemistry26(1987)6735-6742)或豌豆種子白蛋白2(Jenne，D.，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(1991)1000-1006)。采取四葉/8螺旋槳拓樸結(jié)構(gòu)(Li，J.等，Structure3(1995)541-549;Faber，H.R.等，Structure3(1995)551-559)。每一槳葉由反平行方向的4個(gè)0折疊組成。這些槳葉在分子中央共同組成一個(gè)空腔。四個(gè)槳葉通過從前一槳葉最外側(cè)的第四iS鏈與下一槳葉最內(nèi)側(cè)的第一/3鏈的環(huán)凈皮連接在一起。^T^危鍵將此結(jié)構(gòu)的末端即槳葉4和槳葉1連接。PEX支架參與不同的，*為特異的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-配體相互作用。因此，血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)形成用于分子識(shí)別的通用框架(Bode,W.，Structure3(1995)527-530)。例如，用于離子如釣、鈉、和氯離子的結(jié)合位點(diǎn)(Libson,A.M.等，Nat.Struct.Biol.2(1995)938-942;Gohlke，U.等，F(xiàn)EBSLett.378(1996)126誦130)以及用于與纖連蛋白、TIMP-l/2(Aj^質(zhì)金屬蛋白酶的組織滅活物1/2)、整合素和肝素相互作用的結(jié)合位點(diǎn)(Wallon，U.M.和Overall,CM"J.Biol.Chem.272(1997)7473-7481;Willenbrock，F(xiàn).等，Biochemistry32(1993)4330,4337;Brooks,P.C.等，Cell92(1998)391-400;Bode,W.，Structure3(1995)527-530)是已知的。血紅素結(jié)合蛋白樣蛋白結(jié)構(gòu)域在其蛋白質(zhì)家族成員中提供了高度的結(jié)構(gòu)同源性。例如已經(jīng)報(bào)iiAM金屬蛋白酶1、2和13的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的高度結(jié)構(gòu)等效性(Gomis-Ruth，F(xiàn)X等，J.Mol.Biol.264(1996)556-566)。田比鄰和垂直方向的]3折疊之間占優(yōu)勢的疏水相互作用提供大部分所需的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性(Gomis-Ruth，F(xiàn).X.等，J.Mol.Biol.264(1996)556-566;Fulop，V.和Jones,D.T.，Curr.Opin.Struct.Biol.9(1999)715-721)。最近，將蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫如SMART(Schultz,J.等，PNAS95(1998)5857-5864;Letunic，L等，Nuc.AcidsRes.30(2002)242-244)用于比較同源序列和蛋白質(zhì)折疊，以便在合適的蛋白質(zhì)框架內(nèi)鑒定非保守的并且因此在理論上可變的，即可隨機(jī)化的氨基酸位置(Binz，H.K.等，J.Mol.Biol.332(2003)489-503;Forrer，P.等，ChemBioChem5(2004)183-189)。為鑒定PEX折疊中潛在可變的，即可隨機(jī)化的氨基酸位置，使用SMART數(shù)據(jù)庫實(shí)施類似方法。在PEX結(jié)構(gòu)域中鑒定了可隨機(jī)化而不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能性構(gòu)象和穩(wěn)定性的#*酸位置。將在如下表I中列出的來自不同種的來自SMART數(shù)據(jù)庫的60個(gè)PEX結(jié)構(gòu)域以Pretty生物信息工具(GCG)使用記分矩陣blosum62進(jìn)行比對(duì)。表I:含有PEX結(jié)構(gòu)域的60個(gè)蛋白質(zhì)的列表<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(表I結(jié)束)，血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域僅占全長蛋白質(zhì)的一小部分。下表列出比對(duì)的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域在全長蛋白質(zhì)中的位置。表II:血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域在表I蛋白質(zhì)中的位置。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(表II結(jié)束)，通過比對(duì)如上所列的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:01、SEQIDNO:88)確定了210個(gè)位置的共有序列。已確定了每一位置處的不同M酸數(shù)目以便得出M酸多樣性數(shù)("可變性的確定"；見表III)。序列中的缺口以連字符(-)標(biāo)出(見比對(duì)全部序列的表IV)。對(duì)于共有序列的每一位置，給出不同M酸的數(shù)目(IL^酸多樣性數(shù))。最大可能數(shù)目是21(20個(gè)不同氨基酸+1個(gè)缺口)。低多樣性數(shù)目顯示高度保守的位置。高多樣性數(shù)目顯示在此位置處的變動(dòng)性。表III:共有序列中210個(gè)位置處每一位置的氨基酸多樣性數(shù)；對(duì)于無缺口的共有序列，見SEQIDNO:Ol，對(duì)于帶缺口的共有序列，見SEQIDNO:88。l在共有序列中的1氨基酸位置氛基酸的多樣性數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>鄉(xiāng)IDNO:02鄉(xiāng)1DN0加鄉(xiāng)IDNO:04鄉(xiāng)tDNO加敏IDNO加鄉(xiāng)10NO:07鄉(xiāng)IDNO加SEQ)DNO加SEQIDNO:10鄉(xiāng)IDNO:11SEQU3NO:12SEQIDNO:13SeQIDNO:"SEQ,DNO:1。從Q10NO:17SEQIONO:18鄉(xiāng))DN0:19SEQIDNO鄰SEQ10140:21啦I。NO"鄉(xiāng)IONO:幼鄉(xiāng)I0N0:248EQIDNO:站SEQ'DNO鄰SEQI。MO:27鄉(xiāng)IDNO:38SEQIDNO:29郷IDNO鄰鄉(xiāng)IDN0313EQ)0NO:32郷IDNO幼SEQK)NO:34S的IDNO鄰卿IONO加SEQIDNO:37SE0tDNO3SSEQIDNO加3的IDNO:40SEQIDNO:42SEQ10N0:43郷IDNO:44郷10NO:46SEQU)NO:46鄉(xiāng)IDNO:4d鄉(xiāng)，DNO;49郷(0NO:60鵬10NO:51鄉(xiāng)IDNO您鄉(xiāng)IDNO幼敏K)N094鄉(xiāng)1DNO加鄉(xiāng)10NOS6鄉(xiāng)IDNOS7鄉(xiāng)IDNO幼3幼IDNO:抑敏IDNO加鄉(xiāng)IDN0:6111DyyipQo0-p-p一--MIMV---<(接上頁表IV)-DOMM33MII..RRRRQQOGKRRWWQRIBOKOQaTQQQQQQQRRRRRBCRQQOHHHHaclnRCVOAD-"RRHDOQ<woozzzp<:LwwwacRa"RRa"RRRRRRRRRRRTTRRRB"RRacRBWWWW.WWWWWWWWWWYYPYY----WWWWHLL.JLWWEFIrlrlrtrllrFb.-wwww(接上頁表IV):KKTYDPPOAOGacRRR<-ppppMul::3TOOT8TTEUlEEOC9GOGOOO&odosQOQQQQGC900000AM:KWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWOWWWWWWWWWWWWWWWWWWFILPI.LWWWWWWWWW:(接上頁表IV)-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>(接上頁表IV)______ILLIILLL.J.JLVVVMMMMMM:vvvlll"LLWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWW5WWWWWWWWWWTWWWWWWWWWWW一(接上頁表IV),00E.E'U'FHH:XHB'U'U'1L11.WWWWW3SHYYYYY:CRRBC81WWVVVVLVW<JLL(IIJ!l!—Fla'VLIl>>>>Lli.JP.(接上頁表IV):__KQRRQKNQQQQRRQQQQQHRQQEEEHRHHOCRRRROQKKKRKKRIKRRKRRRR*,YYYYYYU.FFFYYYFFU'FPU.U'u'YYYYYV'YYlLlkFFPFFYYYYyv'WWYYYyYYYYIt8ss8-WWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWYYYYYWWWWWWWWWWYYYywwwwYFff.FU..FCYYCU'YYYFU-CCB'c'IIVYYYYYYYYVVVVYYYYYYYYYYYyYYYYYYYYYYYYLL5w:WW-:K-KKKKKKKKK"(接上頁表IV):HKKKKZKRKKKRRSZDNKQlcelKKKKKKKK338s833SSST3KORQOHl.wwu.e-pplrpFO-WWWWWWWWWWWWC.FF.rpFO-wwwww:經(jīng)DWWOEDHEDEnlEEG38GVQRKDDTTKTKTBIESSI**--.....ZOEBSU1CE,,wwww-yVVVOo-M:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>(接上頁表IV)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>(接上頁表IV)(表IV結(jié)束)。用于確定氨基酸多樣性數(shù)的這個(gè)方法是通用方法并且可以廣泛使用并且不限于具體的#^酸序列、多肽、結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)，因而，該方法可以類似并且據(jù)此應(yīng)用于其它序列以確定和鑒定這樣的M酸位置，其具有高可變性和可用于改變而不強(qiáng)烈影響結(jié)構(gòu)的穩(wěn)、定性和功能性。根據(jù)氨基酸多樣性的計(jì)算，已經(jīng)鑒定了具有低多樣性數(shù)目即小于6的M酸位置。這種低多樣性數(shù)目代表了高度的保守如對(duì)于位置編號(hào)4處的WWWWWWWWWWWWW.J___-WWFFWWWWLL—LWWWWWFFFPFWWWWWWWWWWWWWWWWWW5KCVKKGLOOQOI1I11JLAAO'1半胱氨酸殘基(見表III),發(fā)現(xiàn)其在所分析60個(gè)序列的57個(gè)序列中保守(見表IV)。發(fā)現(xiàn)位置編號(hào)210處的半胱氨酸殘M全部已分析的血紅素結(jié)合蛋白樣序列中保守。這顯示了本方法的優(yōu)異可用性，因?yàn)檫@兩個(gè)半胱氨酸殘基在支架中非常重要。這兩個(gè)半胱氨酸殘基通過連接多肽的第四和第一槳葉構(gòu)成對(duì)血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)形成所必須的二硫鍵。Mill匯編并列出的氨基酸多樣性數(shù)中，可以鑒定共有序列中具有高多樣性/可變性的M酸位置。因?yàn)閺墓灿行蛄械乃b定的高多樣性M酸數(shù)中不能直接得到全長多肽中相應(yīng)的Jl&酸數(shù)，因此表V列出了SEQIDNO:02至SEQIDNO:61全長多肽中已鑒定的高多樣性氨基酸即可變氨基酸的M酸數(shù)。表V:序列SEQIDNO:02至SEQIDNO:61的每一序列中可改變的氨基酸位置的列表。每一序列中位置的編號(hào)與相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的M酸編號(hào)一致。S即DNO:02:4704714754764774845015025035045055065075105145155225295305315345415475495505535585595665675685695705775785795805895卯597598600604608611612617618619620626627628629638639645646647648650652654655658663)NO:03:9899103104105111128131135136145146153159161162165170171179180181182183190191192193202203210211213217221224225230231232233239.240241242251252258259260261266268270271274279)NO:04:989910310410511112813113513614514615315916116216517017117918018118218319019119219320220321021121321722122422523023123223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9410411413420421427428429430434437439440443448〕NO:61:291292296297298305323324325326327330334335341345346347350357362364365368373374380381382383384387388389390397404405407411415418419424425426427429436437443444445446450453455456459464沐v結(jié)束)具有高多樣性數(shù)目，即等于或大于8或甚至10的位置也已經(jīng)確定。此分析表明這些位置主要位于環(huán)區(qū)內(nèi)。這些位置顯示了高可變性，即變動(dòng)性并且因此在空間上將數(shù)個(gè)暴露于表面的來自槳葉連接環(huán)的M酸拉近。此結(jié)果還提示通道的內(nèi)表面不能用于隨機(jī)化實(shí)驗(yàn).每一槳葉的三個(gè)內(nèi)部0折疊也重要，因?yàn)樗鼈兇砀叨鹊谋Ｊ匦圆⑶覍?duì)蛋白質(zhì)的核心穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)。因此對(duì)于誘變方法而言，暴露于溶劑的M^A令人感興趣的重點(diǎn)，這些Jl^酸對(duì)蛋白質(zhì)疏#心的穩(wěn)定沒有貢獻(xiàn)并顯示足夠高的多樣性數(shù)目以及因此顯示低的保守性。借助本方法，有可能同時(shí)地對(duì)在比對(duì)中所采用的全部蛋白質(zhì)中或?qū)@些蛋白質(zhì)得到一列可變的，即可改變的M酸位置。對(duì)于血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域，如前文例舉，已經(jīng)采用60個(gè)蛋白質(zhì)的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域并且因此對(duì)于全部60個(gè)結(jié)構(gòu)域，已經(jīng)鑒定了可變的，即可改變的M酸位置。這些位置列于表V(編號(hào)與全長多^/蛋白質(zhì)一致)。在表V中列出了60個(gè)血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:02至SEQIDNO:61)中的可改變的M酸位置。^J^酸位置根據(jù)含有血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的全長序列編號(hào)。例如對(duì)于根據(jù)SEQIDNO:02的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域，這些^酸位置是表V中副標(biāo)題SEQIDNO:02之后所列的^J^酸位置，并且因而是470、471、475、476、477、484、501、502、503、504、505、506、507、510、514、515、522、529、530、531、534、541、547、549、550、553、558、559、566、567、568、569、570、577、578、579、580、589、5卯、597、598、600、604、608、611、612、617、618、619、620、626、627、628、629、638、639、645、646、647、648、650、652、654、655、658、663。SEQIDNO:03至SEQIDNO:61的可改變M酸位置因此列于表V中各自的副標(biāo)題之后，隨著獲得用于SEQIDNO:01至SEQIDNO:61的可改變M酸位置，這些序列中的每一序列均可以作為進(jìn)一步操作的起點(diǎn)加以利用?？梢允篃o細(xì)胞產(chǎn)生和分析經(jīng)合理工程化的蛋白質(zhì)變體自動(dòng)化，但是合理設(shè)計(jì)待加工的蛋白質(zhì)構(gòu)建體文庫的大小仍總是受每一系統(tǒng)的技術(shù)性通量限制。因此，大量基因產(chǎn)物的結(jié)合特性分析需要額外的努力.可以得到用于多肽文庫的展示和篩選的多種技術(shù)，例如噬菌體展示、核糖體展示或細(xì)菌展示(Smith，G.P.，Science228(1985)1315-1317;Hanes，J.和Pluckthim，A"PNAS94(1997)4937-4942;Stahl，S.和Uhlen，M"TIBTECH15(1997)185-192)。本發(fā)明將例舉核糖體展示技術(shù)(見例如Hanes，J.和Pluckthun,A.，PNAS94(1997)4937-4942;Mattheakis，L.C.等，PNAS91(1994)9022-9026;He，M.和Taussig,M.J.，Nuc.AcidsRes.25(1997)5132-5134)，但是也可應(yīng)51用其它技術(shù)。定向演化技術(shù)非常適合于實(shí)現(xiàn)高通量蛋白質(zhì)產(chǎn)生平臺(tái)的技術(shù)能力?；跓o細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)的核糖體展示是有待itJL為高通量蛋白質(zhì)產(chǎn)生和分析方法的優(yōu)秀方法。核糖體展示的目的是產(chǎn)生三元復(fù)合體，在其中通過核糖體將復(fù)合體的信4吏RNA(mRNA)所^征的基因型與所編碼的表型物理聯(lián)系，所述的表型通it^達(dá)的多JI^征。為此目的，在體外(,《vi>"轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼基因文庫的線性DNA模板。在基因序列的下游融合間隔序列，其中最明顯的特點(diǎn)是缺少翻譯終止密碼子。這種間隔結(jié)構(gòu)域有助于展示仍然附著于核糖體的已翻譯和共翻譯折疊的新生多肽。將這些復(fù)合體經(jīng)過淘選過程，在此過程中允許由核糖體展示的多肽結(jié)合至預(yù)定配體分子。將來自緊密結(jié)合的復(fù)合體中的mRNA分離，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并且通過PCR加以擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物亞克隆至栽體系統(tǒng)并且隨后的DNA測序揭示了與所結(jié)合多M型相關(guān)的基因型的信息。在誘變和核糖體展示的反復(fù)循環(huán)中，可以鑒定來自高達(dá)1014個(gè)成員的文庫中特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合物(Mattheakis，L.C.等，PNAS91(1994)9022-卯26;Hanes，J.和Pluckthun，A"PNAS94(1997)4937-4942;Lamia，T.和Erdmann，V.A.，J.Mol.Biol.329(2003)381-388)'通常，核糖體展示需要核糖體在抵達(dá)mRNA3，端時(shí)終止而核糖體亞基不解離。在核糖體遇到mRNA3'端后，核糖體的轉(zhuǎn)移-RNA(tRNA)iiA^位點(diǎn)(A位點(diǎn))未被占用。在原核生物中，這種狀態(tài)引起由tmRNA(轉(zhuǎn)移信使RNA;Abo，T.等EMBOJ.19(2000)3762-3769;Hayes，C.S.和Sauer，R.T.，Mol.Cell.12(2003)卯3-911;Keiler，K.C.等，Science271(1996)990-993)豫導(dǎo)的核糖體拯救機(jī)制激活。就核糖體展示選擇而言，此機(jī)制降低功能性三元復(fù)合體的量并且顯著減少PCR產(chǎn)物產(chǎn)量(Hanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS94(1997)4937-4942)。若在核糖體遇到mRNA3，端之前，已經(jīng)迫使核糖體翻譯裝置終止，則可以避開tmRNA誘導(dǎo)的核糖^救機(jī)制。因?yàn)榉g停滯的誘導(dǎo)，核糖體A位點(diǎn)仍被占用。核糖體展示構(gòu)建體的展示間隔區(qū)具有如SEQIDNO:62中所示的序列。借助這個(gè)間隔區(qū)，翻譯可以在全長多肽翻譯后和核糖^救機(jī)制發(fā)生前受到停滯。這可以通it^核糖體展示構(gòu)建體的DNA間隔序列中除去翻譯終止密碼子而實(shí)現(xiàn)(Mattheakis，L.C.等，PNAS91(1994)卯22-卯26;Hanes,J.和Pluckthun，A.，PNAS94(1997)4937-4942)。因此，產(chǎn)生由mRNA、核糖體和翻譯中止的多肽(translationallystalledpolypeptide)組成的高分子量復(fù)合體。對(duì)于文庫產(chǎn)生，多種技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知。在下文概述所例舉的技術(shù)。作為DNA文庫基礎(chǔ)的線性表達(dá)元件(LEE)以模塊方式產(chǎn)生。為以隨機(jī)化的DNA片段i2tit支持重疊延伸連接PCR(OEL-PCR)，預(yù)先產(chǎn)生DNA模塊文庫。為得到PCR產(chǎn)物的足夠產(chǎn)量，前提^1使用經(jīng)HPLC純化的引物寡核苷酸和具有3'-5，外切核酸酶活性的產(chǎn)生平端DNA片段的DNA聚合酶(Garrity，P.A.和Wold，B丄，PNAS89(1992)1021-1025)。例如，將編碼蛋白質(zhì)PEX2(人基質(zhì)金屬蛋白酶2g端的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域)、TIMP2(人基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制物2)、HDAC-I(人組蛋白脫酖基酶I)、BirA(大腸桿菌生物素全酶連接酶)和GFP(綠色熒光蛋白)的基因與DNA模塊的不同組合加以融合。PCR產(chǎn)物的濃度使用LUMIImagerSystem(RocheAppliedSciences,Mannheim,Germany)通過比較光密度定量法加以確定。得到的線性表達(dá)元件的PCR產(chǎn)物平均產(chǎn)量是大約60ng/pl±20ng/|d(ng每PCR混合物)。使用P.woesiiDNA聚合酶(PWO)，有可能產(chǎn)生長度達(dá)2000bp的LEE.在一個(gè)實(shí)例中，產(chǎn)生了其中PEX2多肽的8個(gè)M酸位置受到隨機(jī)化的小型文庫。為此目的，將這些位置以及因此下列M酸從SEQIDNO:10在表V中所列加以選擇:528(Gln)、529(Ghi)、550(Arg)、576(Lys)、577(Asn)、578(Lys)、594(Val)和596(Lys)。文庫如實(shí)施例2中所述通過無模板PCR合成產(chǎn)生。核糖體展示模板例如由模塊T7P-gl0f-ATG(SEQIDNO:74)、來自所生成的文庫中的多肽和核糖體展示間隔區(qū)(SEQIDNO:62)組裝。合適的蛋白質(zhì)支架的前M其穩(wěn)定折疊為活性構(gòu)象的能力，即便在該蛋白質(zhì)支架必須攜帶多個(gè)經(jīng)替換的氨基酸的條件下。這可以通過針對(duì)已知的蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體(partner)篩選文庫進(jìn)行檢驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)例中，PEX2文庫得到展示以識(shí)別金屬蛋白酶的組織抑制物2(TIMP2)蛋白質(zhì)配體。來自PEX2文庫的隨機(jī)化多肽仍能夠在核糖體展示方法中識(shí)別其固有的TIMP2結(jié)合配偶體。i^明盡管支架受到多個(gè)突變，支架的結(jié)構(gòu)-功能仍得以保留。為制備并優(yōu)化基于多肽支架的特定結(jié)合物對(duì)預(yù)定靶分子的結(jié)合特性，其中所述預(yù)定靶分子不被所述支架固有地結(jié)合，必須進(jìn)行數(shù)次包含四個(gè)主要步驟的循環(huán)。這些步驟是(i)改變至少一個(gè)根據(jù)表V的M酸位置、(ii)制備展示構(gòu)建體、(iii)展示并選擇特異性結(jié)合的變體以及(iv)分離并對(duì)所選變體測序。通常需要2至5輪循環(huán)以確定支架中新的特異性結(jié)合特征。預(yù)定靶分子不限于多肽的具體類別。預(yù)定的多肽可以屬于例如刺猬蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白細(xì)胞介素和干擾素之一的類別，以及免疫球蛋白、酶、抑制物、激活物以及細(xì)胞表面蛋白之一的類別。在一個(gè)實(shí)例中，選擇非PEX2結(jié)合物IGF-I作為預(yù)定把分子用于產(chǎn)生基于PEX2支架的特定結(jié)合物。將把分子鋪板作為生物素化的配體。在以PEX2文庫進(jìn)行第二輪核糖體展示后，可視的PCR產(chǎn)物信號(hào)仍保留.明此文庫充分適合于選擇特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的蛋白質(zhì)/多肽，其中所述預(yù)定把分子不固有地受此蛋白質(zhì)/多肽結(jié)合。提供如下實(shí)施例、參考文獻(xiàn)和序列表以輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍由附加的權(quán)利要求書陳述。可以理解的是可以在不脫離本發(fā)明的精神下對(duì)所述方法進(jìn)行修改。實(shí)施例實(shí)施例1重疊延伸連接PCR(OEL-PCR)線性表達(dá)元件利用重疊DNA連接原理，通過兩步驟PCR方案以模塊方式組裝。在標(biāo)準(zhǔn)PWO-PCR中，無內(nèi)含子的可讀框通過序列特異性末端橋接引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生與側(cè)翼DNA序列重疊的同源序列。將2pl含有大約50ng已延伸基因片段(基因模塊)的第一PCR混合物轉(zhuǎn)移至第二PWO-PCR混合物。向該混合物提供SOng至100ng預(yù)先產(chǎn)生的DNA片段(啟動(dòng)子模塊和終止子模塊)以及各自的序列特異性末端引物分別l/iM。一般，第二PCR步驟包含30個(gè)循環(huán)。PCR特性的物理參數(shù)根據(jù)待連接DNA片段的需要進(jìn)行調(diào)整。實(shí)施例2合成PEX2DNA文庫編碼血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸64、65、86、112、113、114、130和132(等同于全長人基質(zhì)金屬蛋白酶2中的528(Gln)、529(Glu)、550(Arg)、576(Lys)、577(Asn)、578(Lys)、594(Val)和596(Lys))的PEX2三重密碼子通過NNK-基序隨機(jī)化。人野生型PEX2DNA序列分為三個(gè)序列部分。對(duì)其提供10ng栽體模板pIVEX2.1MCSPEX2和引物PEX2forw(SEQIDNO:63)和PEXR4(SEQIDNO:64)各1/iM的標(biāo)準(zhǔn)PWO-PCR擴(kuò)增了1bp-218bp片段。402bp-605bp片段以10ng栽^M^板pIVEX2.1MCSPEX2和引物PEXF4(SEQIDNO:65)和PEX2rev(SEQIDNO:66)各lpM在標(biāo)準(zhǔn)PWO-PCR中擴(kuò)增。形成的序列196bp-432bp與DNA片段1bp-218bp和402bp-605bp重疊并以引物PEXFl(SEQIDNO:67)和PEXRl(SEQIDNO:68)各lpM以及PEXR3(SEQIDNO:69)、PEXR2(SEQIDNO:70)和PEXF2(SEQIDNO:71)各0.25pM通過無模板PCR進(jìn)行合成。PCR^Nft對(duì)三個(gè)PCR相同TIM(起始解鏈溫度)94X:1分鐘，TM(解鏈溫度)94X:20秒，TA(復(fù)性溫度)60X330秒，TE(延伸溫度)72*C15秒，25個(gè)循環(huán)，TFE(終末延伸溫度)2分鐘。全長的隨機(jī)化PEX2序列(588bp)在將70ng各DNA序列片段用于帶橋接引物T7P_PEX2(SEQIDNO:72)和PEX2—RD(SEQIDNO:73)各lpM的標(biāo)準(zhǔn)PWO-PCR時(shí)得到。PCR參數(shù)為TIM:9411分鐘，TM:94X:20秒，TA:30秒，TE:60秒，25個(gè)循環(huán)，TFE:72t:5分鐘。橋接引物導(dǎo)入的同源DNA重疊，用于通過OEL-PCR將PEX2基因文庫組裝為核糖體展示模板。實(shí)施例3無細(xì)胞的蛋白質(zhì)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯根據(jù)制造商說明書，將線性表達(dá)元件在RTS100HY大腸桿菌系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄和翻譯。線性DNA模板(IOOng-500ng)在30"C溫育。任選地添加6plGroE補(bǔ)充物(Roche)。實(shí)施例4融和蛋白的位點(diǎn)特異性生物素化調(diào)整RTS100HY大腸桿菌系統(tǒng)用于序列特異性的酶促生物素化。根據(jù)制造商說明書組裝RTS混合物。該混合物補(bǔ)充以2/d無EDTA的完全蛋白酶抑制劑貯存溶液、2pMd-(+)-生物素、50ng編碼大腸桿菌生物素連接酶(BirA，EC6丄4.15)的T7P_BirA—T7T線性表達(dá)元件(1405bp)和編碼底物融合蛋白的IOOng至500ng線性模板。底物融合蛋白在氨基端或氯基端融合于生物素接受肽序列(BAP)。在全部實(shí)驗(yàn)中，使用如由Schatz鑒定的序列#85(Schatz，P丄，Biotechnology(NY)l1(1993)1138-1143;Beckett，D.等，ProteinSci.8(1999)921-929)的15聚變體(Avitag，AvidityInc.，Denver,Colo.USA)。生物素連接酶從線性模板T7Pgl0e—birA—T7T中共表達(dá)。實(shí)施例5a)核糖體展示方案所有緩沖液放置在冰上。全部裝置均無菌、無DNA酶和無RNA酶。工作臺(tái)以RNA酶-ZAP清潔。10x貯存洗滌緩沖液(貯存WB)核糖體展示0.5MTRIS(三(羥甲基)-氨基甲烷)，pH7,5(4。C)由AcOH(乙酸)調(diào)節(jié)；1.5MNaCl;0.5M乙酸鎂，貯存在-20匸10x洗脫緩沖液(貯存EB)核糖體展示0.5MTRIS，pH7.5(4。C)由AcOH調(diào)節(jié)；1.5MNaCl;200mMEDTA，貯存在-20C10ml核糖體展示洗滌緩沖液(WB):1200gl10x貯存WBpH7.5，0.05%吐溫20(50pL10%吐溫20),5%BSA(5ml封閉劑BSA10%)，5pg/mlt-RNA，670mMKCI(0.5gKCl)，添加PCR級(jí)水至10ml10ml核糖體展示終止緩沖液(SB):1200/*L10x貯存WBpH7.5,0.05%吐溫20(50pL10%吐溫20),5%BSA(5ml封閉劑BSA10%),5將/mlt-RNA，670mMKCl(0.5gKCl)，4mMGSSG(氧化型谷胱甘肽)，25pMcAMP(10jttl貯存溶液)，添加PCR級(jí)水至10ml2ml核糖體展示洗脫緩沖液200/tL10xji&存EB，0.25%BSA(50/d封閉劑BSA10%)，5000A260單位核糖體r-RNA16S-23S，5/tg/mlt-RNA，添加PCR級(jí)水至2ml封閉劑5%BSA緩沖液(2.5ml封閉劑BSA10%),50%通用綴合緩沖液10xPBS緩沖液0.1MNaH2PO4;0.01MKH2PO4(10xpH7.0;lxpH7.4);1.37MNaCl;27mMKCl。b)制備胞外結(jié)構(gòu)域erbB2和erbB3人受體胞外結(jié)構(gòu)域erbB2和erbB3作為受體嵌合物從R&DSystems得到。受體胞外結(jié)構(gòu)域基因融合至人蛋白質(zhì)IgGlFC(人IgGl抗體FC片段)。兩種分子顯示分子量96kDa并且在其氛基端含有六組氨酸肽。由于糖基化，蛋白質(zhì)的分子量增加至130至140kDa。嵌合蛋白質(zhì)作為凍千的蛋白質(zhì)得到并且在含有0.1%BSA的PBS緩沖液中再溶解。將蛋白質(zhì)貯藏在-80X:直至使用。c)包被微量滴定板一個(gè)反應(yīng)體積(RV)的微量滴定(MT)板以通用綴合緩沖液洗滌三次。將2.5/ig配體溶解于100W封閉劑中.將生物素化的配體交替在經(jīng)鏈親和素包被和親和素包被的MT板的孔中固定。erbB2/FC嵌合物和erbB3/FC嵌合物交替在蛋白A和蛋白G包被的MT板的孔中固定.將配體-溶';^tMT板內(nèi)在每分鐘500轉(zhuǎn)振搖的Biorobot8000機(jī)器人振蕩平臺(tái)上室溫溫育l小時(shí)。為測定背景信號(hào)，將一個(gè)孔以不帶配體的100/d封閉劑包被，孔以3RV封閉劑洗滌。將封閉劑(300pl)在每一孔內(nèi)在4"C在和每分鐘200轉(zhuǎn)溫育1小時(shí)。在實(shí)施終止翻譯混合物前，孔以3RV水冷的緩沖液WB洗滌。d)產(chǎn)生核糖體展示模板對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)核糖體展示方法，將單個(gè)基因或基因文庫以特定橋接引物延伸。延伸的DNA-片段使用末端引物T7Pfor(SEQIDNO:75)和R1A(SEQIDNO:76)5'-AAATCGAAAGGCCCAGTTTTTCG-3，通過OEL-PCR融合至DNA模塊T7Pgl0f(SEQIDNO:74)和核糖體展示間隔序列(SEQIDNO:62)。用于PCR組裝的PCR參lbl:TIM:94X:1分鐘，TM:94X:20秒，TA:60C30秒，TE:對(duì)于1000bp是72t！60秒，30個(gè)循環(huán)，TFE:72X:5分鐘線性表達(dá)元件(LEE)T7PAviTagFXa-PEX2-T7T的產(chǎn)生人PEX2基因使用SEQIDNO:77和SEQIDNO:78的橋接引物自10ng質(zhì)粒模板pDSPEX2(Roche)在標(biāo)準(zhǔn)PWO-PCR中擴(kuò)增。重疊的基因使用引物T7Pfor(SEQIDNO:82)和T7Trev(SEQIDNO:81)通過OEL-PCR融合至DNA模塊T7PAviTagFXa(SEQIDNO:79)和T7T(SEQIDNO:80)。e)制備核糖體展示翻譯混合物RTS大腸桿菌100HY系統(tǒng)根據(jù)制造商說明書準(zhǔn)備。100/d混合物提供以40單位(lpl)RNA酶抑制劑、2pM(2|il)抗ssrA-寡核苷酸5'-TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCGACTA-3，(SEQIDNO:85)、lpL無EDTA的小量完全蛋白酶抑制劑的貯存溶液和在20plPWO-PCR混合物中的500ng線性核糖體展示DNA模板。核糖體展示DNA模板在每分鐘550轉(zhuǎn)振搖下在30"C在1.5ml反應(yīng)管內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯40分鐘。當(dāng)反應(yīng)立即以500^1水冷的緩沖液SB終止時(shí)，由mRNA、核糖體和所展示的多肽組成的復(fù)合體被穩(wěn)定。將混合物在2匸于15.000g離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至冰冷卻的1.5ml新反應(yīng)管內(nèi)。將250/tl混合物轉(zhuǎn)移至配體包被的MT板孔(信號(hào))并且將另外250/d混合物轉(zhuǎn)移至無配體包被的孔內(nèi)(背景)。將混合物在4C和每分鐘300轉(zhuǎn)溫育1小時(shí)。為除去背景蛋白質(zhì)和弱結(jié)合的三元復(fù)合體，孔以水冷緩沖液WB洗滌，來自結(jié)合的三元復(fù)合體的信使RNA由100pl冰冷緩沖液EB在4X:和每分鐘750轉(zhuǎn)下持續(xù)10分鐘加以洗脫。f)制M白G包被的磁珠合物，其非特異性地識(shí)別IgGl-FC結(jié)合物。lOOpl磁珠混懸液在500pi緩沖液SB中洗滌磁珠5次而在終止緩沖液SB中平衡。磁#含有50pgIgGl-FC蛋白質(zhì)的500Atl緩沖液SB中4匸溫育1小時(shí)。磁珠以緩沖液SB洗滌三次并貯藏在水上的10(Vtl緩沖液SB中。在使用前，磁珠以磁性方式分離并儲(chǔ)藏在水上。將已停止的核糖體展示翻譯混合物添加至磁珠。混合物在4匸每分鐘750轉(zhuǎn)溫育30分鐘。在使用前，磁珠以磁性方式從混合物中分離。g)純化mRNA并除去殘留的DNA信使RNA使用高純RNA分離試劑盒(RocheAppliedScience,Mannheim,Germany)純化。洗脫物中殘留的DNA模板以AmbionDNA去除試劑盒(ambionInc.，USA)的改良方案加以去除。洗脫物補(bǔ)充以5.7jtdDNA酶I緩沖液和1.3pi含有DNA酶I的溶液。在37^C溫育混合物30分鐘后，添加6.5/dDNA酶I滅活試劑。將此漿液在消化分析法中室溫溫育2分鐘，Pt^在ll，000g離心l分鐘。上清、^tfc逆轉(zhuǎn)錄中使用。h)逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增為逆轉(zhuǎn)錄mRNA，使用了C.therm.RT聚合酶試劑盒(RocheAppliedSciences,Mannheim,Germany),組建20^1反應(yīng)體系4#15xRT緩沖A1#1DTT(二硫蘇糖醇)溶液、1.6/tldNTP、1^1DMSO溶液、0.1^M(1jk1)RT5，-CAGAGCCTGCACCAGCTCCAGAGCCAGC-3'(SEQIDNO:86)，40單位(lpl)RNA酶抑制劑、1.5piC.therm.RNA聚合酶、含有mRNA的9/d洗脫物'轉(zhuǎn)錄在70C進(jìn)行35分鐘'cDNA的進(jìn)一步擴(kuò)增在含有10|d帶MgS04的10xPWO-PCR緩沖液、200pMdNTP、12pl轉(zhuǎn)錄混合物、2.5單位PWODNA聚合酶和引物RT5'-CAGAGCCTGCACCAGCTCCAGAGCCAGC-3，(SEQIDNO:86)和Fl5'翻GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG誦3，(SEQIDNO:87)各lpM的100^PWO-PCR中進(jìn)行。PCR#^bl_:TIM:94t!1分鐘，TM:20秒，TA:60^C30秒，TE:72X:60秒，20個(gè)循環(huán)，TFE:5分鐘。通過標(biāo)準(zhǔn)PWO-PCR再次進(jìn)行擴(kuò)增。將2/dPCR混合物轉(zhuǎn)移至第二標(biāo)準(zhǔn)pwo-pcr。根據(jù)需^f吏用基因特異性橋接引物。pcrM與基因模板和寡核苷酸引物的物理^t相適應(yīng)。進(jìn)行25次PCR循環(huán)。基因序列在又一個(gè)OEL-PCR中以與DNA模塊T7Pgl0e及核糖體展示間隔區(qū)雜交的DNA重疊區(qū)加以延伸。核糖體展示DNA模板隨后在又一輪核糖體展示循環(huán)中再次使用。i)核糖體展示后基因的亞克隆以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將PCR產(chǎn)物亞克隆至栽體系統(tǒng)內(nèi)。PEX2的文庫成員使用引物Ndel-PEX2for(SEQIDNO:83)和EcoRI-PEX2rev(SEQIDNO:84)通過Ndel/EcoRI位點(diǎn)亞克隆至載體pUCl8。參考文獻(xiàn)列表Abo，T.等EMBOJ.19(2000)3762-3769Altruda，F(xiàn).等，NucleicAcidsRes.13(1985)3841-3859Andersson，M.等，J.Immunol.Methods283(2003)225-234Ausubel，L和Frederick,M.，Curr.Prot.Mol.Biol.(1992)JohnWileyandSons,NewYorkBeckett,D.等，ProteinSci.8(1999)921-929Binz，H.K.等，J.Mol.Biol.332(2003)489-503Bode，W.,Structure3(1995)527-530Brooks,P.C.等，Cell92(1998)391-400Faber，H.R.等，Structure3(1995)551-559Forrer，P.等，ChemBioChem5(2004)183-189Fulop，V.和Jones,D.T.，Curr.Opin.Struct.Biol.9(1999)715-721Garrity，P.A.和Wold，B丄，PNAS89(1992)1021-1025Gohlke，U.等，F(xiàn)EBSLett.378(1996)126-130Gomis-Ruth，F(xiàn).X.等，J.Mol.Biol.264(1996)556-566Hames，B.D.和Higgins，S.G.，NucleicacidHybridation-apracticalapproach(1985)IRLPress,Oxford,EnglandHanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS94(1997)4937-4942Hayes，C.S.和Sauer，R.T.，MoLCell.12(2003)卯3畫911He，M.和Taussig,M丄，Nuc.AcidsRes.25(1997)5132-5134Ho，S.N.等，Gene77(1989)51-59Jenne,D.和Stanley,K.K"Biochemistry26(1987)6735-6742Jenne，D.，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(1991)1000-1006Kain，K.C.等，Biotechniques10(1991)366-374Keiler，K，C.等，Science271(1996)9卯誦993Klevenz，B.等，Cell.Mol.LifeSci.59(2002)1993-1998Lamia，T.和Erdmann，V.A.，J.MoLBiol.329(2003)381-388Lee，S.S.和Kang，C，Kor，股ochem.J.24(1991)673-679Letunic，L等，Nuc.AcidsRes.30(2002)242-244Li，J.等，Structure3(1995)541-549Libson，A.M.等，Nat.Struct.Biol.2(1995)938-942Lu，Z.等，Bio/Technology13(1995)366-372Mattheakis，L.C.等，PNAS91(1994)9022-9026McConnellS丄和Hoess，R.H.，J.MoLBiol.250(1995)460470Nygren，P.-A.和Skerra，A.，J.Immun.Methods290(2004)3-28Predki，P.F,等，Nat.Struct.Biol.3(1996)54-58Roberts,B丄.等，Gene121(1992)9-15Roberts,B.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)2429-2433Rottgen，P.和Collins,J"Gene164(1995)243-250Sambrook，J.等，MolecularCloning:Alaboratorymanual(1999)ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,USASandstrom，K.等，ProteinEng.16(2003)691-697Schatz，P.J.，Biotechnology(NY)l1(1993)1138-1143Schultz，J.等，PNAS95(1998)5857-5864頁Segal，DJ.等，Biochemistry42(2003)2137-2148Shuldiner，A.R.等，Anal.Biochem.194(1991)9-15Skerra，A.，J.MoLRecognit.13(2000)167-187Smith,G.P.等，J.MoLBiol.277(1998)317-332Smith,G.P.，Science228(1985)1315-1317Stahl，S.和Uhlen，M.，TIBTECH15(1997)185-192Sykes，K.F.和Johnston,S.A.，NatureBiotechnol.17(1999)355-359Visintin，M.等，J.Immun.Methods2卯(2004)135-153Wallon，U.M.和Overall,CM.，J.Biol.Chem.272(1997)7473-7481Willenbrock，F(xiàn).等，Biochemistry32(1993)4330-4337WO01/04144Xu，L.等，Chem.Biol.9(2002)933-94權(quán)利要求1、特異性結(jié)合預(yù)定靶分子的多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列選自SEQIDNO02至SEQIDNO61，其中在所述氨基酸序列中至少一個(gè)根據(jù)表V的氨基酸被改變。10、適合在原核微生物或真核微生物中表達(dá)多肽的載體，其特征在于所述載體編碼如權(quán)利要求1所述的多肽。全文摘要本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生對(duì)預(yù)定靶分子具有特異結(jié)合特性的多肽的方法，其中所述特異結(jié)合特性不天然為此多肽固有。同時(shí)本發(fā)明描述了結(jié)合特異性的優(yōu)化以及產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還涉及用于在多肽支架中鑒定和修飾特定氨基酸位置的方法。文檔編號(hào)C12N9/64GK101098887SQ200680001756公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2006年1月2日優(yōu)先權(quán)日2005年1月3日發(fā)明者M(jìn)·蘭岑多費(fèi)爾,M·施拉伊姆爾申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司