專利名稱：：抗噬菌體的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乳酸菌(LAB),其中的YjaE蛋白是基本上失活性，從而該LAB具有改善的抗噬菌體性，此外，還涉及含有乳酸菌的起子培養(yǎng)物組合物，以及使用該起子培養(yǎng)物制備食品和飼料制品。
背景技術(shù)：
：噬菌體感染所引起的細(xì)菌培養(yǎng)物的產(chǎn)品失效被認(rèn)為是細(xì)菌培養(yǎng)物工業(yè)中的主要問題之一。該工業(yè)中使用的許多菌抹中均已發(fā)現(xiàn)存在噬菌體，例如乳酸菌種中的如乳球菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬、小球菌屬或鏈5求菌屬。在食品工業(yè)中，乳酸菌起子培養(yǎng)物被廣泛用于食物發(fā)酵。在所有的乳酸菌種類中，乳球菌屬是最容易被噬菌體感染所破壞的。導(dǎo)致乳酸菌起子培養(yǎng)物中頻繁的噬菌體感染的一個(gè)因素就是在食品工業(yè)中，包括乳品工業(yè)中的發(fā)酵條件通常不是無菌條件。因此，在這樣的工業(yè)條件下還不太可能消除噬菌體污染。噬菌體促使細(xì)胞溶解的過程包括噬菌體被吸附在宿主細(xì)胞表面、噬菌體DNA被注入到細(xì)胞內(nèi)、噬菌體蛋白質(zhì)的合成、噬菌體DNA的復(fù)制、后代噬菌體的裝配以及后代從宿主中釋放的過程。這些過程中的任何一步受到細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)理的干涉都能防止噬菌體感染。在工業(yè)應(yīng)用中的細(xì)菌培養(yǎng)物對(duì)噬菌體感染的抵抗能力在很大程度上取決于宿主菌林的特征，該特征能夠影響上述機(jī)理中的一個(gè)或多個(gè)。乳酸乳球菌中含有用于細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的染色體基因(pip)，其可充當(dāng)扁長(zhǎng)噬菌體c2以及其它c(diǎn)2種的噬菌體的受體。當(dāng)前，制造抗噬菌體乳球菌林的工業(yè)優(yōu)選方法是制備pip基因失活的菌抹。在Kraus等的文章(KrausJ.da/，1998J.DairyScience81:2339-2335)中描述了構(gòu)建一系列與商用相關(guān)的乳酸乳球菌林，其p)7基因未被激活(p*—菌株)。戸>-菌抹對(duì)c2種的扁長(zhǎng)噬菌體具有完全的抗性，但對(duì)936種的小的等軸噬菌體skl、小的等軸噬菌體腿210b和31(p335種)，以及大的等軸噬菌體949(949種)非常敏感。乳酸乳球菌IL1403的完整的基因組已經(jīng)測(cè)序并發(fā)表在基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中。yjaE五是乳酸乳球菌IL1403的基因。在本發(fā)明的申請(qǐng)日，基因庫(kù)進(jìn)入號(hào)AE006322顯示出乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的完整基因組的218個(gè)區(qū)中的84個(gè)。少>￡基因的編碼DNA序列的CDS序列為從5892到8291。就其功能而言，可被簡(jiǎn)單地稱為"假定的蛋白質(zhì)"。另外，"'a五基因也具有與p^基因的低的同源性。具體而言，"與噬菌體感染蛋白質(zhì)/*具有22%的等同性"?；驇?kù)進(jìn)入號(hào)NC—002662顯示出乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的完整序列。這里，；^五基因的編碼DNA序列的CDS序列為從904024到906423。WO01/77334公開了乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的完整基因組。在該文件中，W^;基因?qū)?yīng)于ORF900。該ORF900沒有相關(guān)功能。在第27-29頁，描述了涉及抗噬菌體的一些基因。在第29頁，第2-3行總結(jié)了這些噬菌體相關(guān)的基因，例如ORF38、41、448、452、518、1461和1472?？傊?，從技術(shù)的角度考慮，"'^;基因的功能在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日時(shí)是不為人所知的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的問題是提供新的抗噬菌體的乳酸菌(LAB)。解決方案的提出是基于本發(fā)明者們對(duì)Wfl五基因的參與的確認(rèn)。本發(fā)明者們對(duì)不同乳酸乳球菌菌抹的；^五基因進(jìn)行失活，并發(fā)現(xiàn)這些y力五菌抹對(duì)噬菌體具有抗性。具體參見實(shí)施例。按如上所述，乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的Wa五基因的DNA序列在基因庫(kù)中已有公開。其編碼DNA序列示于這里的SEQIDNO1中，相應(yīng)的"'a五蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于這里的SEQIDN02中。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及乳酸菌，其中由；;>￡基因表達(dá)的YjaE蛋白質(zhì)基本上沒有活性，且；^五基因表達(dá)的YjaE蛋白質(zhì)包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403Wa五DNA編碼序列)中位于1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性地具有YjaE蛋白質(zhì)活性，即與位于SEQIDN02(IL1403YjaE蛋白質(zhì)序列)1-799處的多肽序列的至少70%相同，例如，至少與80%，優(yōu)選為至少90%，例如至少95%或至少99%的相同。術(shù)語"基本上失活性"應(yīng)該根據(jù)本發(fā)明的目的而理解。本發(fā)明的目的是制備一種菌株，其中YjaE蛋白質(zhì)所起作用遠(yuǎn)不及其對(duì)應(yīng)的母體野生型菌抹。如下面將說明的，制備這樣的菌林屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的日常工作。例如，通過向基因中引入終止密碼子或進(jìn)行移碼插入，從而產(chǎn)生非功能性基因，該基因例如不表達(dá)YjaE蛋白質(zhì)，或者表達(dá)部分長(zhǎng)度的失活性YjaE蛋白質(zhì)。另外，也可在基因中引發(fā)突變，例如，給YjaE蛋白質(zhì)突變變異體，其雖具有一些活性，但對(duì)于與在此相關(guān)的實(shí)際目的而言基本上是失活性的。檢測(cè)YjaE蛋白質(zhì)的失活性的方法是分析細(xì)菌對(duì)適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌删w組的抗性的增加。如以下將要解釋的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，當(dāng)這里描述的細(xì)菌對(duì)代表性的不同噬菌體的抗性的有所增加時(shí)，表明YjaE蛋白質(zhì)基本上是失活性的。如上所解釋，已知乳酸菌可對(duì)某些噬菌體敏感，而對(duì)其他的不敏感。因此，在本領(lǐng)域范圍內(nèi)應(yīng)該可以理解，如果i兌這里所述的細(xì)菌具有對(duì)適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌删w組的增加的抗性，則意味著該細(xì)菌對(duì)喧菌體組中的至少一種噬菌體具有增加的抗性。當(dāng)然，通常優(yōu)選的是細(xì)菌具有對(duì)噬菌體組中的兩種或多種噬菌體的增加的抗性?；臼筜jaE蛋白質(zhì)失去活性的優(yōu)點(diǎn)是得到的細(xì)菌不但可對(duì)c2型噬菌體具有抗性，而且可對(duì)其他類型的噬菌體也具有抗性。這里的實(shí)施例表明了這里描述的LAB不但對(duì)c2種的噬菌體具有抗性，而且對(duì)936種的小的等軸嗟菌體也具有抗性。這是對(duì)pip菌林的改進(jìn)。如上所述，pip菌株通常只對(duì)c2種的噬菌體具有抗性。使YjaE蛋白質(zhì)基本上失去活性通常不會(huì)對(duì)LAB的存活性、生長(zhǎng)速率或酸的產(chǎn)生帶來負(fù)面影響。例如，這里給出的一些實(shí)施例中展示了兩種不同的菌林。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及起子培養(yǎng)物組合物，其包含第一個(gè)方面的乳酸菌。本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及制備食品或飼料制品的方法，包含向食品或飼料制品起始材料中加入根據(jù)第二方面的起子培養(yǎng)物組合物，并在具有正常代謝活性的乳酸菌的條件下將該接種的起始材料保持。本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及制備乳酸菌的方法，其中，由；^五基因表達(dá)的YjaE蛋白質(zhì)是基本上失活性的，包含對(duì)"V^基因進(jìn)行適當(dāng)改性，從而不產(chǎn)生活性YjaE蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中，；^五基因包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403;^五DNA編碼序列)中位于1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性具有YjaE蛋白質(zhì)活性，即與位于SEQIDN02(IL1403YjaE蛋白質(zhì)序列)1-799處的多肽序列的至少80%相同，例如，至少與85%，優(yōu)選為至少90%,例如至少95%或至少99%的相同。以下描述本發(fā)明的實(shí)施方式，但僅以實(shí)施例的形式描述。發(fā)明的詳細(xì)描迷根據(jù)本發(fā)明，對(duì)問題的解決方法是提供新的乳酸菌(LAB),其對(duì)噬菌體具有抗性，其中，YjaE蛋白質(zhì)是基本上失活性，從而YjaE蛋白質(zhì)對(duì)于噬菌體感染的功能而言失活性。這里的表達(dá)"YjaE蛋白質(zhì)對(duì)于噬菌體感染的功能而言失活性"是指一種YjaE蛋白質(zhì)與所述的YjaE蛋白質(zhì)序列SEQIDNo.2中的不同，其特征是攜帶YjaE基因而編碼所述功能上失活性的YjaE蛋白質(zhì)的細(xì)菌對(duì)至少一種噬菌體有改善的抗性，其中，噬菌體是選自適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌氖删w組。適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌氖删w組優(yōu)選含有不同的相關(guān)的噬菌體，并代表c2種的扁長(zhǎng)噬菌體，936種的小的等軸噬菌體，p335種的小的等軸噬菌體，949種的大的等軸喧菌體。一個(gè)具體的有代表性的不同的噬菌體組是包含了c2種的扁長(zhǎng)噬菌體bIL67、CHL92、MPCIOO、c2、3、24、116、122、134、180、199、227、364、670;936種的小的等軸噬菌體234、649;以及P335種的小的等軸噬菌體228。術(shù)語"對(duì)噬菌體改善的抗性"是指當(dāng)在空斑測(cè)定，例如下面描述的"通過瓊脂覆蓋法確定噬菌體抗性，，對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行測(cè)試時(shí)，細(xì)菌菌林對(duì)至少一種噬菌體具有改善的噬菌體抗性，表現(xiàn)為對(duì)給定菌抹，由所述至少一種噬菌體獲得的pfU/ml(每ml的空斑形成單位)與在親菌抹上由相同的噬菌體獲得的pfb/ml相比較的差別。對(duì)噬菌體具有改善的抗性的菌株優(yōu)選地顯示出pfU/ml的降j氐的因子至少為50，例如，至少100，如500,l尤選至少為1000，更優(yōu)選至少為10000或更多。乳酸菌這里用的術(shù)語"乳酸菌"是指革蘭陽性、微嗜氣或厭氧菌，它們對(duì)糖進(jìn)行發(fā)酵，并產(chǎn)生酸，包括其主要為乳酸，以及乙酸、曱酸和丙酸等。工業(yè)上最為有用的乳酸菌被發(fā)現(xiàn)存在于乳球菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬、小球菌屬或腸球菌屬中。并且，屬于雙歧桿菌屬中的嚴(yán)格厭氧菌也通常包含在乳酸菌組中。如上所述，乳酸菌中的成員乳球菌亞種多被噬菌體感染所破壞。優(yōu)選的實(shí)施方式中的乳酸菌是乳球菌屬，優(yōu)選為乳酸乳球菌種。優(yōu)選的乳球菌亞種的例子有乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種或乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種(Lactococcuslactissubsp.lactisbiovar.Diacetylactis)。如上所述，乳球菌亞種含有膜蛋白質(zhì)的染色體基因(pip)，其可充當(dāng)扁長(zhǎng)噬菌體c2以及其它c(diǎn)2種的噬菌體的受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，這里描述的LAB也具有失活的pip基因。YiaE蛋白質(zhì)和yjaE五基因基于已知技術(shù)中的與yjaE五相關(guān)的序列信息，以及在此所揭露的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠相對(duì)容易地確認(rèn)在另一種類型的LAB中的基因是否為yjaE基因。例如，本發(fā)明者們擁有3種不同菌林的乳球菌亞種中的yjaE基因。在氨基酸水平上，這3種序列基本上與IL1430菌抹(SEQIDNO2)的序列相同。例如，菌抹CAal20的序列在IL1430的200位處具有Lys(K)而不是Glu(E)。序列的其余部分與IL1430的相同。因此，目前認(rèn)為，特別是當(dāng)LAB是乳球菌亞種時(shí)，不同菌抹中的不同萬V必序列頗為相同。然而，在沒有任何理論限制下，在今后的測(cè)序從其他屬中找出具有類似yjaE序列的LAB。如上所述，YjaE蛋白質(zhì)可以是由yjaE基因表達(dá)的YjaE蛋白質(zhì)，該基因包含選自由以下序列組成的組的DNA序列(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性具有YjaE蛋白質(zhì)活性，即與位于SEQIDNO2(IL1403YjaE蛋白質(zhì)序列)1-799處的多肽序列的至少70%相同。(b)中編碼多肽的DNA序列，優(yōu)選為與位于SEQIDNO2的1-799處的多肽序列的至少80%相同，例如至少85%相同，更優(yōu)選為有至少90%相同，進(jìn)一步優(yōu)選為有至少93%相同的編碼多肽的DNA序列和最優(yōu)選的是(b)中編碼多肽的DNA序列優(yōu)選為與位于SEQIDNO2的1-799處的多肽序列的至少96%相同，更優(yōu)選為有至少99%相同的編碼多肽的DNA序列。(b)中的DNA序列可以是如(a)中的DNA序列的非天然的變異體，以編碼多肽的非天然的變異體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何制備這樣的變異體，例如，通過定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變或變換相似基因。使YiaE蛋白質(zhì)基本失活的方法如上所討論的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按常規(guī)操作制備出這里所描述的菌抹，其中的YjaE蛋白質(zhì)是基本上失活性的?？蓞⒁娺@里給出的實(shí)施例以及
背景技術(shù)：
部分KrausJ.等的描述。通常而言，一條常規(guī)的方法可以在；^五基因組的基因序列中通過同源重組引入或替代適當(dāng)?shù)腄NA片段(例如，通過使用公眾可獲得的pGhost載體)。如果引入的片段包含無義(停止)密碼子，則基因會(huì)失活，從而該LAB會(huì)成為具有失活性的YjaE蛋白質(zhì)的LAB。其他適合的改性可以是移碼突變，缺失、突變或插入。此外，適當(dāng)?shù)母男赃€可以被引入到相關(guān)區(qū)域，例如，啟動(dòng)區(qū)。如上所解釋的，yjaE基因的適當(dāng)?shù)母男钥梢允侵冈S多情況，例如，終止密碼子，可導(dǎo)致如移碼、缺失、突變等的插入。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可按常規(guī)選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ颍粂jaE五基因中虧1進(jìn)一適當(dāng)?shù)母男詮亩划a(chǎn)生活性YjaE蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外，還可以進(jìn)行隨機(jī)突變(例如，通過UV輻射)和對(duì)突變進(jìn)行選擇，其中，YjaE蛋白質(zhì)基本上失活性。此外，可以對(duì)相關(guān)的自發(fā)的突變進(jìn)行選擇，其中，YjaE蛋白質(zhì)基本上失活性。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，YjaE蛋白質(zhì)是失活性的。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，YjaE蛋白質(zhì)是失活性的。例如，可通過在YjaE蛋白質(zhì)中如引入移碼或終止密碼子進(jìn)行突變，而使YjaE蛋白質(zhì)失去活性，特別是當(dāng)突變發(fā)生在蛋白質(zhì)的大約一半處，見實(shí)施例1和3。然而，包括84核苷酸在2007-2090位上的框內(nèi)缺失在內(nèi)的任何突變，將導(dǎo)致蛋白質(zhì)缺少至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列中的氨基酸14-33,625-642,664-683，691-710,719-738或774-792的可預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)，都將導(dǎo)致YjaE蛋白質(zhì)對(duì)噬菌體感染在功能上失活性的一種失活的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方式涉及的乳酸菌中編碼YjaE蛋白質(zhì)的yjaE基因缺少至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于由推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列中的氨基酸14-33，625-642，664-683,691-710,719-738或774-792的可預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)。如在實(shí)施例4中所討論的，可以對(duì)YjaE蛋白質(zhì)的個(gè)體區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。YjaE蛋白質(zhì)的個(gè)體區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外定位被認(rèn)為在噬菌體感染中對(duì)其功能有重要影響。對(duì)此，84核苷酸在2007-2090位(氨基酸670-697)上的框內(nèi)缺失顯得尤為有趣。這是由于該缺失導(dǎo)致的一種蛋白質(zhì)，其中的其余部分的可預(yù)測(cè)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外定位發(fā)生了交換。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方式中的乳酸菌，其中，由yjaE基因編碼的YjaE蛋白質(zhì)，其中，YjaE蛋白質(zhì)的可預(yù)測(cè)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外定位區(qū)的分布隨著在菌抹IL1403中的可預(yù)測(cè)的情況而發(fā)生了改變。使YiaE蛋白質(zhì)失去活性的測(cè)定方法如上所述，檢測(cè)YjaE蛋白質(zhì)的失活性的方法是分析細(xì)菌對(duì)適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌删w組的抗性的增加。通?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的空斑測(cè)定法來完成?？蓞⒁妼?shí)施例1中根據(jù)瓊脂覆蓋法對(duì)合適的空斑測(cè)定的描述?？瞻邷y(cè)定通過將特定的噬菌體作用于目標(biāo)菌抹得到的pfU/ml(每毫升中含有的空斑單位)，相比于相同的噬菌體作用于親菌林(YjaE蛋白質(zhì)具有天然的野生型活性)所得到的pfWml,以它們之間的差別來測(cè)定目標(biāo)菌抹的抗謹(jǐn)菌體性(YjaE失活的蛋白質(zhì))。相應(yīng)地，這里所描述的乳酸菌對(duì)至少一種噬菌體具有增強(qiáng)的抵抗性的特點(diǎn)，其中該噬菌體選自于適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌删w組?？蓞⒁娺@里的實(shí)施例中的優(yōu)選方法來分析抗噬菌體性。適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌删w組應(yīng)優(yōu)選含有不同且相關(guān)的噬菌體，包括c2種的扁長(zhǎng)噬菌體，936種的小的等軸噬菌體，p335種的小的等軸噬菌體，949種的大的等軸噬菌體。c2種的扁長(zhǎng)噬菌體的適當(dāng)?shù)睦訛閎IL67,CHL92,MPC100,c2,3，24,364,P謝。936種小的等軸噬菌體的適當(dāng)?shù)睦訛閟kl,p2，jj50,234，649。p335種的小的等軸噬菌體的適當(dāng)?shù)睦訛閙m210b,31,p335。949種的大的等軸噬菌體的適當(dāng)?shù)睦訛?49。上述所列的所有噬菌體均可在文獻(xiàn)中查到或通過向Chr.HansenA/S,Denmark請(qǐng)求而得到。優(yōu)選地，這里所述的乳酸菌對(duì)c2種的扁長(zhǎng)噬菌體和/或936種小的等軸噬菌體已具有改善的抵抗性。另一種測(cè)量YjaE蛋白質(zhì)的失活性的方法就是分析的基因序列，看其是否含有適當(dāng)?shù)哪軌蛞鹬T如基因失活的改性。如上面所敘述的，適當(dāng)?shù)母男钥赏ㄟ^多種手段，例如終止密碼子、可導(dǎo)致如移碼、缺失、突變等的插入。這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員例行確定(如通過排序基因)是否基因含有這樣的適當(dāng)?shù)母男?。相?yīng)地，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這里所描述的乳酸菌含有對(duì);^五基因的適當(dāng)?shù)母男裕渲械母男詫?dǎo)致基本上不表達(dá)活性的YjaE蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，改性導(dǎo)致活性YjaE蛋白質(zhì)不被表達(dá)。測(cè)量YjaE蛋白質(zhì)失活性的進(jìn)一步方法就是分析活性YjaE蛋白質(zhì)是否會(huì)存在于細(xì)菌的細(xì)胞膜中。這可以通過此處實(shí)施例中描述的標(biāo)準(zhǔn)分離法測(cè)量。相應(yīng)地，在優(yōu)選的實(shí)施方式中此處所描述的乳酸菌并不含有細(xì)胞膜中活性YjaE蛋白質(zhì)的可測(cè)量的量。含有這里描述的LAB的起子培養(yǎng)物這里描述的乳酸菌被用作食品和飼料制品生產(chǎn)中的起子培養(yǎng)物。通常，這樣的^±培養(yǎng)物組合物包含濃縮形式的細(xì)菌，包括冷凍的，干燥的或凍干的濃縮物，在每克的組合物中，通?；罴?xì)胞的濃度范圍在io4到1012cfU(菌落形成單位)，每克組合物至少包括10、fU,例如，至少為105cfii/g,如至少為106cfo/g，如至少為107cfu/g,如至少為108cfii/g，如至少為109cfii/g,如至少為101GcfU/g，如至少為10"cfti/g。組合物還可進(jìn)一步含有防凍劑和/或傳統(tǒng)的添加劑，例如營(yíng)養(yǎng)物，如酵母提取物、糖和維生素。在乳酸菌發(fā)酵過程中，一般會(huì)采用混合的乳酸菌的培養(yǎng)物。因此，在一些實(shí)施方式中，組合物包含了多種菌抹，它們可以是屬于相同的種或可屬于不同的種。在起子培養(yǎng)物組合物中的這種有用的乳酸菌組合的典型例子是以下菌林的混合物明串珠菌屬，一種或多種乳球菌亞種，例如，乳酸乳球菌乳酸亞種，乳酸乳球菌乳脂亞種，或乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種。制備食品和飼料制品的方法如上所述，本發(fā)明的一方面涉及制備食品或飼料制品的方法，包含向食品或飼料制品起始材料中加入這里描述的起子培養(yǎng)物組合物，并在具有正常代謝活性的乳酸菌的條件下將該接種的起始材料保持。有用的食品起始材料包括任何可用于傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵步驟的材料，例如，奶、蔬菜材料、肉制品、水果汁、果汁、生面團(tuán)和牛奶雞蛋面糊。由該方法得到的發(fā)酵產(chǎn)品，包括典型的乳制品，例如奶酪，包括新鮮的奶酪制品和酪乳。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，底物材料為用于動(dòng)物祠養(yǎng)的起始材料，例如，青貯飼料，如草、谷類材料、豆、紫花苜?；蛱鸶娜~，其中，細(xì)菌培養(yǎng)物在被青貯的飼料農(nóng)作物中進(jìn)行接種，以保存這些材料。并且，在富含蛋白質(zhì)的動(dòng)物廢棄物中，例如屠宰后的碎屑和魚的廢棄物中，發(fā)酵的目的也是保存這些廢棄物，并為動(dòng)物飼養(yǎng)之用。本發(fā)明的乳酸菌的另一重要應(yīng)用是將細(xì)菌培養(yǎng)物用作所謂的益生菌。本文中的術(shù)語"益生菌，，是指微生物培養(yǎng)物，當(dāng)它們被人或動(dòng)物以活細(xì)胞的形式攝食后，能夠改善健康條件，例如，通過抑制胃腸道內(nèi)的有害微生物，通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，或通過有助于營(yíng)養(yǎng)物的消化。鑒定DNA序列這里所述的DNA序列鑒定二個(gè)序列之間的相似程度，其表示第一個(gè)序列偏離第二個(gè)序列的程度。在本發(fā)明的申請(qǐng)日,NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)在Internet站點(diǎn)(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/)中提供了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的BLAST計(jì)算機(jī)序列同源性檢索的可能性。在[Altschuletal(1997),"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",NucleicAcidsRes.25:3389-3402]中對(duì)BLAST程序進(jìn)行了描述。在本文中，優(yōu)選的計(jì)算機(jī)同源性檢索程序?yàn)?標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸-核苷酸BLAST[blastn]"檢索，該定義與在本發(fā)明的申請(qǐng)日，在NCBI的Internet站點(diǎn)上設(shè)置檢索條件Lowcomplexity;Expect:10，WordSize:11相一致。在程序中還引進(jìn)了參考序列，并且該程序能夠鑒定出發(fā)布序列的片段以及其與對(duì)應(yīng)的參考序列片段的相同百分比。鑒定氨基酸序列類似于核苷酸同源性分析，在本文中，優(yōu)選的計(jì)算機(jī)同源性檢索程序?yàn)?標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST[blastn]，，檢索，該定義與在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日，在NCBI的Internet站點(diǎn)上設(shè)置Composition-basedstatistics:yes，檢索條件Lowcomplexity;Expect:10,WordSize:3，Matrix:BLOSUM62,GapCosts:Existence11Extension1相一致。圖例圖1顯示了細(xì)菌細(xì)胞膜中可預(yù)測(cè)的if爭(zhēng)膜區(qū)域以及從CAal20中推斷出的YjaE蛋白質(zhì)位置。箭頭處的數(shù)字表示在氨基酸序列中的位置(SEQIDNo.2)以及表示圍繞跨膜區(qū)域的氨基酸。實(shí)施例材料和方法空班測(cè)定--通過瓊脂覆蓋法確定對(duì)噬菌體的抗性。該方法用于評(píng)價(jià)給定的乳酸乳球菌突變菌抹對(duì)噬菌體的抗性。將該給定菌株在給定噬菌體下獲得的pfti/ml(每ml的空斑形成單位)與親菌株在相同噬菌體作用下獲得的pfii/ml的差別進(jìn)行比較。各個(gè)空斑均起源于一個(gè)噬菌體，且在生長(zhǎng)著細(xì)菌的菌莒上呈現(xiàn)出清晰的無細(xì)菌生長(zhǎng)的圓形區(qū)域。期望的菌株在盤上(M17+所需的添加劑)呈現(xiàn)清晰的條紋。5-10個(gè)單獨(dú)的菌落被接種在培養(yǎng)液體中，且檢測(cè)呈指數(shù)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的OD600。當(dāng)培養(yǎng)物的OD6。。在0.5和0.8之間時(shí)，將100pl的培養(yǎng)物與100jil的噬菌體混合。對(duì)噬菌體-溶液進(jìn)行這樣的重復(fù)操作，滴定度范圍在1011pfu/ml到10pfWml,如在親菌林中所測(cè)量的。細(xì)胞和噬菌體在總量為3ml的上層瓊脂中混合(M17，10mMCaCI2，0.75%瓊脂)，再倒到盤(M17,10mMCaCl2,1.5%瓊脂)上，并在30°C培育過夜。通過計(jì)算形成的空斑數(shù)目來評(píng)價(jià)盤。確定用于給定菌抹的噬菌體的pfli/ml。給定菌抹的噬菌體抗性由在該菌株中發(fā)現(xiàn)的pfWml與在親菌林中發(fā)現(xiàn)的來決定。檢驗(yàn)在細(xì)菌膜中是否存在活性YJAE蛋白質(zhì)用溶解酵素消化細(xì)胞，使細(xì)胞壁與膜分離，并通過標(biāo)準(zhǔn)步驟，如差速離心收集膜。使用用于膜蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)增溶試劑盒，例如PierceBiotechnology(Rockford，IL,USA)的用于膜蛋白質(zhì)的2-D樣品制劑15(2-DSamplePreparationforMembraneProteins)或BioRad(Hercules,CA,USA)ReadyPrepProteinExtractionKit(MembraneIorII),通過增;容作用將蛋白質(zhì)從膜中分離。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)程式將溶解的蛋白質(zhì)在pH7.5-9.5(YjaE蛋白質(zhì)的pl是8.6-8.9)的范圍內(nèi)進(jìn)行二維凝膠電泳。YjaE蛋白質(zhì)的分子量(85kDa)和pi將決定其在二維凝膠中的位置，而YjaE蛋白質(zhì)的缺席或改變(例如，截短的)將與親菌林形成對(duì)比。親菌林的YjaE蛋白質(zhì)的確認(rèn)可通過凝膠內(nèi)消化和質(zhì)譜來驗(yàn)證。文獻(xiàn)Valyasevi，R.，Sandine，W.E.,Geller，B丄.,1991.Amembraneproteinisrequiredforbacteriophagec2infectionofLactococcuslactissubsp.lactisC2.J.Bact.173(19)，6095-6100.Silveira,M.G"Baumgartner,M.，Rombouts,F.M.,Abee,T.，2004.Effectofadaptationtoethanoloncytoplasmicandmembraneproteinprofilesof(9ewococcwsoe"/.Appl.Environ.Microbiol,70(5)，2748-2755.Nouwens，A.S.,Cordwell，S.J.,Larsen,M,R.，Molloy，M.P.，Gillings,M.,Willcox，M.D.P.，Walsh,B丄,2000.Complementinggenomicswithproteomics:themembranesubproteomeofi^Mi/o附owosam/g/wo犯PAOl.Electrophoresis21,3797-3809.Molloy,M.P.,Herbert,B.R.,Slade,M.B.,Rabilloud，T.,Nouwens，A.S.,Williams,K丄.，Gooley，A.A.，2000.ProteomicanalysisoftheEscAm'c/z/aco/z'outermembrane.Eur.J.Biochem.267,2871-2881.實(shí)施例l:炎#乙諒^霧#*的"'"￡差廚關(guān)去法#菌抹/丄〃05:參見W001/7733416Stuer-Lauridsen,B.,Janzen,T.,Schnabl,J.,Johansen，E.,2003.Identificationofthehostdeterminantoftwoprolate-headedphagesinfectingZ^ctococcws/adVirology309,10-17.載體pGhost載體詳細(xì)說明參見下列文章Maguin，E.，Pr6vost,H.,Gruss，A.,1996.Constructionoffood-grademutantsoflacticacidbacteria.Lait76，139-146.Biswas,I.，Gruss,A.,Ehrlich,S.D.，Maguin，E.，1993.High-efficiencygeneinactivationandreplacementsystemforGram-positivebacteria.JournalofBacteriology175(11)，3628-3635.失活歩驟的描述生成650bp的PCR片段，覆蓋在yjaE基因從nt703-1344的中間部分。使用的模板是來自乳酸乳球菌CAal20的染色體DNA。該片段被克隆于載體pGhost9中。該P(yáng)CR片段含有獨(dú)特的BsrGJKH位點(diǎn)，當(dāng)其被克列諾片段填充并再連接時(shí)，將變?yōu)镾mzBI位點(diǎn)并導(dǎo)致一個(gè)堿基的移碼。通過同源重組，將此構(gòu)建并入到CAal20的yjaE的染色體版本中，則載體pGhost9隨后成功雜交，留下移碼突變。產(chǎn)生的突變通過限制性分析和對(duì)PCR片段測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，突變株被命名為CAal20AyjaE。在乳酸乳球菌IL1403上進(jìn)行類似的構(gòu)建，其突變株命名為IL1403AyjaE。通過空斑測(cè)定測(cè)試這些菌林對(duì)感染親菌抹的噬菌體的抗性，發(fā)現(xiàn)這些構(gòu)建的菌抹對(duì)一些噬菌體(即用YjaE蛋白質(zhì)感染的噬菌體)產(chǎn)生了抗性。該失活性的yjaE基因是基于與構(gòu)建的片段的同源重組，當(dāng)代替正常片段時(shí)，該構(gòu)建的片段經(jīng)改性產(chǎn)生功能障礙的基因。代替是通過使用pGhost9作為載體進(jìn)行，但也可用任何其他沒有在乳酸乳球菌中進(jìn)行重組功能的載體。結(jié)果以下的噬菌體組凈皮用于進(jìn)行如上描述的空斑測(cè)定。c2種的扁長(zhǎng)噬菌體blL67、CHL92、MPCIOO、c2、3、24、116、122、134、180、199、227、364、670。936種的小的等軸噬菌體234、649。p335種的小的等軸噬菌體228。結(jié)果示于以下表l中。表1示出了一些噬菌體對(duì)兩種乳酸乳球菌菌抹和他們的；^五突變抹產(chǎn)生感染(+)或不產(chǎn)生感染(-)<table></column><column>-</column><column>IL1403</column><column>IL1403Ayja</column><column>CAal20</column><column>CAal20deltayja</column></row><row><column></column><column>3</column><column>+</column><column>-</column><column>+</column><column>-</column></row><row><column></column><column>24</column><column>+</column><column>-</column><column>+</column><column>-</column></row><row><column></column><column>116</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>122</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>134</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>180</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>199</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>227</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>228</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>234</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column><column>-</column></row><row><column></column><column>364</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column><column>-</column></row><row><column></column><column>649</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column><column>-</column></row><row><column></column><column>670</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column>CHL92</column><column>+</column><column>-</column><column>+</column><column>-</column></row><row><column></column><column>blL67</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>MPC100</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column>c2</column><column>+</column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><table>結(jié)果表明，具有失活性的；^五基因的菌抹對(duì)c2種的扁長(zhǎng)噬菌體和936種的小的等軸噬菌體均具有改善的抗噬菌體性。進(jìn)一步測(cè)試菌抹的存活性、生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸性。對(duì)比相應(yīng)的野生型菌抹，沒有可測(cè)量的負(fù)面影響被發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例2:用于產(chǎn)生自發(fā)性抗噬菌體突變體的一般方法該方法可通過在yjaE基因中由DNA測(cè)序確定的突變而被用于獲得自發(fā)性抗噬菌體突變體。從保存的冷凍儲(chǔ)存中刮下期望的菌抹在10ml的培養(yǎng)液體M17(OxoidCM0817，OxoidLtd.,Basingstoke,Hampshire,England)+所需的添加劑中進(jìn)行接種。在本例中，所述的添加劑是0.5%的乳糖用于菌抹CAal20和34，0.5%的葡萄糖用于菌林IL1403和Bu2-60。檢測(cè)呈指數(shù)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的OD600。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.5和0.8之間時(shí)，將100ul的培養(yǎng)物與感染復(fù)數(shù)(MOI)為每個(gè)細(xì)胞1-10個(gè)噬菌體的噬菌體混合。細(xì)胞和噬菌體在總量為3ml的上層瓊脂中混合(M17,10mMCaC12，0.75%瓊脂)，再倒到盤(M17,10mMCaC12,1.5%瓊月旨)上，并在30℃培育一天或兩天。大多數(shù)的細(xì)胞都被感染性的噬菌體殺滅，但自發(fā)性抗噬菌體的突變體菌落最終將出現(xiàn)。自發(fā)性抗噬菌體的突變體的出現(xiàn)的頻率在不同菌林中可有所不同。取出抗噬菌體的突變體，在盤上整齊劃線，通過在本文中它處所描述的空斑測(cè)定，測(cè)試對(duì)產(chǎn)生這些突變體的步鑒中所用的噬菌體以及對(duì)感染親菌株的其他噬菌體的噬菌體抗性。隨后，將突變體在培養(yǎng)液體中接種，并取出染色體DNA,用于產(chǎn)生包括了期望基因的PCR片段，本例中，該期望基因是yjaE基因。然后對(duì)這些PCR片段進(jìn)行測(cè)序，以確定各突變體中的DNA序列與親抹中的是怎樣不同。實(shí)施例3:自發(fā)性抗噬菌體yjaE突變體的產(chǎn)生菌抹IL1403:乳酸乳球菌。參見W001/77334CAal20:乳酸乳球菌。參見Chr.HansenCultureCollection.Stuer隱Lauridsen,B.,Janzen,T.,Schnabl，J.,Johansen,E.,2003.Identificationofthehostdeterminantoftwoprolate-headedphagesinfectingLactococcuslactis.Virology309:10-17。Bu2-60:乳酸乳球菌。Wetzel,A"Neve,H.，Geis,A.,Teuber,M.，1986.Transferofplasmid-mediatedphageresistanceinlacticacidStreptococci.Chem.Mikrobiol.Technol.Lebensm.10:86-89。菌抹34:乳酸乳球菌。參見Chr.HansenCultureCollection.菌抹CAal20和34可由Chr.Hansen購(gòu)得。歩驟的描述按照在"材料和方法"中所描述的，菌抹經(jīng)過該歩驟而產(chǎn)生自發(fā)性抗噬菌體的突變體。在不同組合下的一個(gè)菌林和一個(gè)噬菌體分別為菌抹34和(D24,Bu2-60和03,Bu2-60和①364,IL1403和OblL67,CAal20和0>24。以染色體DNA為基礎(chǔ)，從每個(gè)自發(fā)性突變體產(chǎn)生包括了全部yjaE基因的PCR片段以及產(chǎn)生從該基因的起始和終止密碼子開始的大約150nt上游和下游的基因的PCR片段。對(duì)這些PCR片段進(jìn)行測(cè)序，并將每個(gè)突變體的序列與親菌林的比較。結(jié)果用PCR和DNA測(cè)序?qū)偣?1個(gè)自發(fā)性突變體進(jìn)行了研究。所有的突變體菌抹均具有yjaE基因的突變(詳細(xì)情況見表2)。表2.自發(fā)性突變。所有的位置均指DNASEQno.l<table><row><column>突變</column><column>描述</column></row><row><column></column><column>192位的a</column><column>在8個(gè)自發(fā)性突變體中缺失a(3個(gè)來自34,l個(gè)來自CAa120,1個(gè)來自IL1403,以及3個(gè)來自Bu2-60),導(dǎo)致在224-226位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>192位的a</column><column>l個(gè)自發(fā)性突變體(來自34)具有一個(gè)額外的a,導(dǎo)致在204-206位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>291位的a</column><column>在2個(gè)自發(fā)性突變體中缺失a(來自IL1403),導(dǎo)致在350-352位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>419位的c</column><column>在1個(gè)自發(fā)性突變體(來自CAal20)中c被a取代，導(dǎo)致在418-420位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>766位的c</column><column>在2個(gè)自發(fā)性突變體(來自CAal20)中c被t取代，導(dǎo)致在766-768位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>865位的c</column><column>在1個(gè)自發(fā)性突變體(來自Bu2-60)中c凈皮t取代，導(dǎo)致在865-867位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>998位的a</column><column>在2個(gè)自發(fā)性突變體中缺少a(—個(gè)來自IL1403,一個(gè)來自CAal20),導(dǎo)致在1040-1042位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>1869位的c</column><column>在1個(gè)自發(fā)性突變體(來自Bu2-60)中c被a取代，導(dǎo)致在1867-1869位出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子。</column></row><row><column></column><column>-111到-16位</column><column>在1個(gè)自發(fā)性突變體(來自Bu2-60)中發(fā)現(xiàn)96nt的缺失，導(dǎo)致從yjaE基因的上游發(fā)生啟動(dòng)子的缺失。</column></row><row><column></column><column>601到1987位</column><column>在1個(gè)自發(fā)性突變體(來自CAal20)中發(fā)現(xiàn)1386nt的框內(nèi)缺失，其跨越了推導(dǎo)YjaE蛋白質(zhì)的預(yù)期的大外環(huán)的主要部分和在預(yù)期的膜錨定區(qū)的第一個(gè)跨膜區(qū)(對(duì)應(yīng)于推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列中的氨基酸201-663)</column></row><row><column></column><column>2007到2090位</column><column>在l個(gè)自發(fā)性突變體(來自Bu2-60)中的推導(dǎo)YjaE蛋白質(zhì)的預(yù)期的膜錨定區(qū)中發(fā)現(xiàn)84nt的框內(nèi)缺失(對(duì)應(yīng)于推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列中的氨基酸670-697)</column></row><table>還測(cè)試了這些突變體對(duì)以下表3中所示的其他噬菌體的噬菌體抗性。所有的自發(fā)性抗噬菌體突變體均顯示出對(duì)c2種的扁長(zhǎng)噬菌體和936種的小的等軸噬菌體的改善的抗噬菌體性。每個(gè)菌林的所有自發(fā)性抗噬菌體突變體顯示出相同的噬菌體感染分布謙，因此表中示出自發(fā)性抗喧菌體突變體的欄代表了本例中所有#皮研究的自發(fā)性突變體。表3.示出了不同乳酸乳球菌菌林和它們的構(gòu)建的(AyjaE)或自發(fā)性的(spont)yjaE突變體被一些噬菌體感染(+)或不被感染(-)。自發(fā)性突變體的詳細(xì)情況參見表2。Complextableseetheoriginaldocumentpagexc2種的扁長(zhǎng)噬菌體blL67、CHL92、MPCIOO、c2、3、24、116、122、134、180、199、227、364、670。936種的小的等軸噬菌體234、649。p335種的小的等軸噬菌體228。實(shí)施例4:預(yù)測(cè)推導(dǎo)YjaE五蛋白質(zhì)中的跨膜區(qū)一些公共網(wǎng)站提供從氨基^列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)的服務(wù)。例如SwissEmbnet的www.ch.embnet.org,和DTU的PredictionServersofComplextableseetheoriginaldocumentpagexCenterforBiologicalSequenceAnalysis的www.genome.cbs.dtu.dk/services/。將由CAal20的yjaE基因序列4,導(dǎo)出的氨基酸序列輸入SwissEmbnet的TMPRED，則給出了如圖1所示的預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)和在YjaE蛋白質(zhì)的細(xì)菌膜中的位置。由DTU的CBSServer的預(yù)測(cè)給出了類似的結(jié)果。權(quán)利要求1.乳酸菌，其中，由yjaE基因表達(dá)的YiaE蛋白質(zhì)是基本上失活性，其中，yjaE基因表達(dá)的YjaE蛋白質(zhì)包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403yjaEDNA編碼序列)中位于1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，選擇性地具有YjaE蛋白質(zhì)活性，即與位于SEQIDNO2(IL1403Yjae蛋白質(zhì)序列)1-799處的多肽序列的至少70％相同。2.權(quán)利要求1的乳酸菌，其中，所述的基本上失活性的YjaE蛋白質(zhì)對(duì)于噬菌體感染而言是功能上失活性。3.權(quán)利要求2的乳酸菌，其中，所述細(xì)菌具有對(duì)噬菌體改善的抗性，優(yōu)選地顯示出在pfti/ml上降低的因子至少為50，例如，至少100，如500，優(yōu)選至少為1000，更優(yōu)選至少為10000或更多。4.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，乳酸菌是乳球菌屬，優(yōu)選是選自由以下乳球菌屬的菌種所組成的組乳酸乳球菌乳脂亞種，乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種。5.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，編碼多肽(b)的DNA序列是編碼與位于SEQIDNO2中的1-799處的多肽序列至少90%相同的多肽的DNA序列，更優(yōu)選的是編碼與位于SEQIDNO2中的1-799處的多肽序列至少96%相同的多肽的DNA序列。6.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，yjaE基因編碼的YjaE蛋白質(zhì)缺少至少一個(gè)可預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)。7.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，yjaE基因編碼的YjaE蛋白質(zhì)，其中，YjaE蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外定位區(qū)的可預(yù)期分布相對(duì)于在菌抹IL1403中位置發(fā)生了變化。8.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，YjaE蛋白質(zhì)是失活性。9.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，YjaE基因是失活性。10.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，YjaE蛋白質(zhì)是失活性，其是由于向；YjaE基因引入了適當(dāng)?shù)母男?，?yōu)選的適當(dāng)?shù)母男赃x自由以下情況組成的組終止密碼子，可導(dǎo)致如移碼、缺失和突變的插入。11.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，乳酸菌的特征是具有對(duì)至少一種噬菌體有改善的抗性，其中，噬菌體是選自適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌氖删w組，其中，適當(dāng)?shù)挠写硇缘牟煌氖删w組優(yōu)選含有不同的相關(guān)的噬菌體，并代表c2種的扁長(zhǎng)噬菌體、936種的小的等軸噬菌體、p335種的小的等軸噬菌體和949種的大的等軸噬菌體。12.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求中的乳酸菌，其中，乳酸菌在細(xì)胞膜中不含可測(cè)量的活性YjaE蛋白質(zhì)的量。13.—種起子培養(yǎng)物組合物,包含權(quán)利要求l-12中任何一項(xiàng)的乳酸菌，其中，優(yōu)選的起子培養(yǎng)物組合物具有活細(xì)胞的濃度范圍是每克組合物中為104-1012cfu。14.一種制備食品或飼料制品的方法，包含向食品或飼料制品起始材料中加入權(quán)利要求13的起子培養(yǎng)物組合物，并在具有正常代謝活性的乳酸菌的條件下將該接種的起始材料保持。15.—種制備權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)的乳酸菌的方法，其中，由yjaE基因表達(dá)的YjaE蛋白質(zhì)是基本上失活性，包含對(duì)yjaE基因進(jìn)行適當(dāng)改性，從而不產(chǎn)生活性YjaE蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中，yjaE基因包含了選自由以下序列組成的組中的DNA序列(a)在SEQIDNO1(IL1403YjaEDNA編碼序列)中位于1-2400處的DNA序列；(b)編碼多肽的DNA序列，可選擇性具有YjaE蛋白質(zhì)活性，即與位于SEQIDNO2(IL1403YjaE蛋白質(zhì)序列)1-799處的多肽序列的至少80%相同。全文摘要一種乳酸菌(LAB)，其中的YjaE蛋白質(zhì)是基本上失活性，從而該LAB得到改善的抗噬菌體抗性，以及一種起子培養(yǎng)物組合物包含該乳酸菌和使用該起子培養(yǎng)物制備食品或飼料制品。文檔編號(hào)C12N1/21GK101175848SQ200680001787公開日2008年5月7日申請(qǐng)日期2006年1月6日優(yōu)先權(quán)日2005年1月6日發(fā)明者托馬斯·簡(jiǎn)森,柏姬·斯圖-勞里森申請(qǐng)人:科·漢森有限公司