專利名稱：病毒恢復培養(yǎng)基及其用途和包括該病毒恢復培養(yǎng)基的病毒診斷試劑盒的制作方法
病毒恢復培養(yǎng)基及其用途和包括該病毒恢復培養(yǎng)基的病毒診斷試劑盒
本發(fā)明涉及病毒恢復培養(yǎng)基及其用途和包括該病毒恢復培養(yǎng)基的病 毒診斷試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及配有激素和酶的病毒恢復培養(yǎng)基， 所述激素如地塞米^^,所述酶如胰蛋白酶。
用于鑒別病毒的常規(guī)診斷過程包括下述步驟將所選的對某種病毒易 感的特定細胞系接種于容器，然后將可能含有病毒的生物樣品接種于該細 胞培養(yǎng)物。此類生物樣品除了包括其它物質(zhì)外，還包括唾液、尿、排泄物、 腦脊液(CSF)、呼吸液和諸如來自嘴、鼻腔、咽喉、皮膚和生殖器的化驗標 本。隨后對接種的細胞培養(yǎng)物進行孵育并考察所述細胞經(jīng)由病毒誘發(fā)的細 胞病變效應。由于某些病毒僅生長于某些細胞，因此可以病毒誘發(fā)細胞病 變效應(CPE)或未誘發(fā)細胞病變效應的細胞類型為基礎(chǔ)對病毒進行鑒別。
對于此過程具有大量備選的實驗方案，其包括下述步驟除去已接種 有病毒制品的細胞并使該細胞經(jīng)受胰蛋白酶作用(trypsinisation)并且通過 對源自病毒的多肽具有特異性的單克隆抗體來檢測病毒，所述源自病毒的 多肽使用報道分子，比如熒光素(FITC)分子進行標記。另外的備選方案包 括在培養(yǎng)管內(nèi)的蓋玻片以便促進細胞的恢復。
常規(guī)的管(或傳統(tǒng)的鼓)法使用了接種有適當細胞系的螺旋蓋管(screw cap tubes)。在達到約80%的細胞融合率后，將該管4秦種適當?shù)臉悠凡⒈O(jiān)控 CPE達三周。第一周須每天監(jiān)控CPE。第二周和第三周必須減少監(jiān)控頻率。 通常，需要盲傳來促進病毒的恢復。
由于需要每天對管進行監(jiān)控，因此常規(guī)管法的一個不利之處在于費時 費力。通常，為了避免主觀性，兩名人員通過光學顯微鏡對相同管的CPE 進行檢查。此外，并不是所有病毒均能引起可見的CPE,并且不能通過該 方法來檢測那些不引起CPE的病毒。而且，在常規(guī)的管法中監(jiān)控到的CPE 信息極大地取決于細胞系的易感性以及病毒產(chǎn)生可見CPE的能力。樣品的 毒性還可以不利地產(chǎn)生類似于病毒CPE的變化，從而得出錯誤的結(jié)果。此
外，某些病毒只有在很長的時間周期后才產(chǎn)生CPE(例如細胞巨化病毒 (CMV))。由于通過常規(guī)管法獲得的結(jié)果主要是基于CPE檢測并且不能按 慣例通過任何其他的方法進行確證，因此可能出現(xiàn)不準確的"if斷。
事實上，使用常規(guī)的管法不可能每個標本使用2個或3個以上的管， 這可歸因于其導致的管堆積(僅在第一周，40個樣品每天即可產(chǎn)生500個
快速培養(yǎng)法(shell vial method)是目前本領(lǐng)域技術(shù)人員用于病毒恢復的 最先進的方法。快速培養(yǎng)法使用5 ml的塑料瓶(直徑16mm)和半透明的蓋 子。繼適當?shù)奶幚砗螅瑢A形的(13mm)蓋玻片插入該瓶。將易感的細胞系 接種于瓶中，所述細胞系在蓋玻片上單層生長。當單層達到約80-卯％的融 合率時，丟棄培養(yǎng)基并將該瓶接種上患者的標本。隨后，監(jiān)控孵育瓶的CPE, 繼之除去蓋玻片。然后將蓋玻片固定于顯微鏡的載玻片并經(jīng)由單克隆抗體 染色。
快速培養(yǎng)法的優(yōu)勢在于接種后可以通過對瓶進行離心來促進病毒的 恢復，快速培養(yǎng)法可將獲得結(jié)果所需的時間長度縮短至2-3天。此外，使 用快速培養(yǎng)法無需等待可見的CPE?？梢栽诘诙虻谌斐ドw玻片并使 用適當?shù)膯慰寺】贵w進行染色且通過使用抗體抗原染色來確證結(jié)果(特異 性的CPE)。
但是，快速培養(yǎng)法也有一些局限性，由于蓋玻片需要下述的特殊處理 因此快速培養(yǎng)法是耗時的使用清潔劑和丙酮多次洗滌后以蒸餾水洗滌并 滅菌。還必須人工將蓋玻片插入瓶中。
快速培養(yǎng)法的另 一個不利之處在于如常規(guī)的管法一樣，需要每天觀察 CPE。此外，需要進行熒光免疫染色時，所需的過程是復雜和耗時的。而 且必須丟棄來自快速培養(yǎng)的培養(yǎng)基并人工(使用特殊的鑷子)除去蓋玻片、 氣干并固定于顯微鏡的載玻片(使用真空油脂)。由于操作的不小心，或者 無意識地將上方的單層向下倒置并固定在顯微鏡的載玻片上可以使蓋玻 片破裂，因此蓋玻片的去除是令人厭煩的。由于接種的細胞也可在蓋玻片 的下方生長，從而使該蓋玻片固定于所述瓶，因此出現(xiàn)了另一個不利的因 素(complication)。此類蓋玻片的去除4艮煩瑣。
事實上，使用快速培養(yǎng)法不可能每個標本使用2個或3個以上的管，
這可歸因于管堆積(每周40個樣品每天產(chǎn)生500個快速培養(yǎng)并瓦)。此外，為 了覆蓋13 mm的圓形蓋玻片，熒光免疫染色需要大量的單克隆抗體。
96孔板法是僅在受限制的情況下用于恢復生長于相同細胞系的病毒 的另 一種方法(例如，該池接種LLC-MK2細胞系時，副流感病毒及流感病 毒的恢復是可能的)。單克隆抗體結(jié)合96孔板用于診斷。
該方法具有下述優(yōu)勢當接種細胞系時樣品相對容易才喿作；可以在同 一板上接種大量的樣品；經(jīng)由離心的促進作用是可能的；僅需要少量的培 養(yǎng)基(僅為0.2mL，而不是快速培養(yǎng)瓶中使用的1-1.5 mL);可以使用抗原 抗體技術(shù)確證結(jié)果；并且該方法還使得容易地"讀數(shù)"所監(jiān)控的CPE。
然而，96孔板法需要將整個板用于抗原抗體檢測，這通常很難實現(xiàn)。 此外，甚至當標本的數(shù)目小于整塊板所需的標本數(shù)目時，也必須在同一天 使用這一整塊板。這就意味著每天必須使用一套新的不同的板。而且，每 塊板通常只可使用 一種或兩種不同的細胞系(將相同類型的標本接種于板 上)。同樣地，確證病毒檢測結(jié)果的方法必須在整塊板上并且同時進行。這 就不利地導致了下述情況即檢測一經(jīng)完成，假設(shè)結(jié)果錯誤或者在延長的 孵育周期后就無剩余的細胞可以用于重復所述過程。
在上述方法中，所使用的細胞培養(yǎng)基經(jīng)常配有添加劑以允許改善病毒 的恢復。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)配有激素和酶的細胞培養(yǎng)基可通過下述情況有利地 優(yōu)化(optimises)病毒恢復將細胞系保持在最大的敏感性以及幫助病毒連 接于細胞壁且在某種情況下，縮短獲得結(jié)果所需的時間。這就得到了本發(fā) 明的病毒恢復培養(yǎng)基，所述病毒恢復培養(yǎng)基可以有利地用于所有病毒的恢 復，所述病毒適用于如下文描述所陳述的細胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明還旨在提供一種試劑盒，所述試劑盒促成了用于減少已知的微 量滴定托盤組件(micro titre tray assemblies)的不利因素并提供增強病毒恢 復的快速、有效和低廉的手段，優(yōu)選地，根據(jù)有待施行的特定診斷可容易 地對所述試劑盒進行改進。本發(fā)明還涉及一種使用本發(fā)明的病毒恢復培養(yǎng) 基檢測病毒的方法。有利地，本發(fā)明提供了在迄今為止未知的應用中選擇 的靈活性。
因此，本發(fā)明提供包括細胞培養(yǎng)基的病毒恢復培養(yǎng)基，所述細胞培養(yǎng) 基添加有至少 一種激素和至少一種酶。
如此處所用，術(shù)語"病毒恢復培養(yǎng)基(medium)，，或"病毒恢復培養(yǎng)基 (media)"指用于病毒生長和分離的培養(yǎng)基(medium)或培養(yǎng)基(media)。例如， 病毒恢復培養(yǎng)基包括維持培養(yǎng)基。
加至細胞培養(yǎng)基的酶無特殊限制并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適 的酶。在某些實施方案中，術(shù)語"酶"指蛋白水解酶。在這些實施方案中， 酶優(yōu)選絲氨酸或天冬氨酸蛋白酶。示例性的酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶或 胃蛋白酶。在優(yōu)選的實施方案中，酶為胰蛋白酶。
加至細胞培養(yǎng)基的激素無特殊限制并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合 適的激素。在某些實施方案中，術(shù)語"激素"指皮質(zhì)類固醇，優(yōu)選糖皮質(zhì)激 素。更優(yōu)選地，激素選自地塞米松、氳化可的松、醋酸可的松、潑尼松、 氫化潑尼松、甲基氫化潑尼松、倍他米松、氟羥潑尼松龍、倍氯米松、醋 酸氟氫可的杠、、醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)和醛固酮。在優(yōu)選的實施方案中， 激素為地塞米松。激素可以是合成的或者是天然形成的。
雖然激素和酶的組合是最優(yōu)選的實施方案，但是可選地，發(fā)現(xiàn)DMSO (二曱基亞砜)和DEAE (右旋糖酐)也是有用的。
加至培養(yǎng)基的酶的量優(yōu)選在1-5嗎/ml范圍內(nèi)，并且優(yōu)選約2.5 )ag/ml。 培養(yǎng)基中激素的濃度優(yōu)選在1(^M-10"M范圍內(nèi)并且優(yōu)選約1(T5M。但是， 在優(yōu)選地塞米松和胰蛋白酶的情況下，發(fā)現(xiàn)添加有約2.5嗎/ml胰蛋白酶和 濃度約為1(T5M的地塞米松的細胞培養(yǎng)基得到了最佳結(jié)果。
因此，本發(fā)明特定的實施方案提供包括細胞培養(yǎng)基的病毒恢復培養(yǎng) 基，所述細胞培養(yǎng)基添加有2.5 )ig/ml的胰蛋白酶和濃度為1(T5M的地塞米 松。
可以依據(jù)本發(fā)明使用的細胞培養(yǎng)基無特殊的限制。例如，這些細胞培 養(yǎng)基可以包括培養(yǎng)基199、 DMEM、 RPMI-1640或MEM-EAGLE。然而， 如同公認的，存在大量可以有助于細胞生長和本領(lǐng)域技術(shù)人員隨時可獲得 的不同的培養(yǎng)基。但是，根據(jù)優(yōu)選的實施方案，細胞培養(yǎng)基為 MEM-EAGLE 。
纟田胞培養(yǎng)基可以添加支持細胞和病毒生長的添加劑并且此類添加劑 為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。已知特定的細胞系和/或病毒可能需要用于最佳生 長和發(fā)育的特異性添加劑。示例性的添加劑包括L-谷氨酸、氨基酸、抗
生素、血清、Hanks平衡鹽、如D-葡萄糖的糖類、無機鹽、維生素、苯基 紅、如HEPES的緩沖液以及如Tween 80的表面活性劑。
以上描述的病毒恢復培養(yǎng)基可以在用于鑒別病毒的常規(guī)診斷過程中 使用，所述常規(guī)診斷的例子如常規(guī)的管法和快速培養(yǎng)法?？蛇x地，病毒恢
復培養(yǎng)基可以在下文描述的方法中使用。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了以上描述的病毒恢復培養(yǎng)基在
病毒檢測方法中的用途。
因此，提供一種4僉測病毒的方法，包括下述步驟
(i) 提供適用于病毒接種的細胞系；
(ii) 對標本進行特異性預處理以獲得潛在含有待檢測病毒的樣品； (m)將潛在含有待檢測病毒的樣品接種于細胞；
(iv) 孵育接種的細胞；
(v) 使用包括細胞培養(yǎng)基的病毒恢復培養(yǎng)基替換樣品培養(yǎng)基，所述細 胞培養(yǎng)基添加有至少 一種激素和至少 一種酶；
(vi) 孵育來自(iv)的樣品；和
(vii) 控-測病毒。
可以選擇適用于特定病毒生長和分離的細胞系。比如，細胞系 LLC-MK2適用于副流感病毒的4企測，MDCK適用于流感病毒，HEP-2適 用于呼吸道合胞病毒(RSV)以及MRC-5適用于細胞巨化病毒(CMV)、單純 皰滲病毒(HSV)、腸道病毒和鼻病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適于給定 病毒生長和分離的細胞系。
如此處所用，術(shù)語"潛在含有待檢測病毒的樣品，，包括由受試者獲得的 樣品標本，所述樣品標本可能受到病毒感染或未受到病毒感染。因此，樣 品可含有可^^測的病毒或者無病毒。適宜的樣品可以由下述物質(zhì)獲得唾 液、血清、尿、排泄物、腦脊液(CSF)、呼吸液，如支氣管肺泡灌洗液與鼻 咽吸出物、和諸如來自嘴、鼻腔、咽喉、皮膚和生殖器的化驗標本。可以 通過使用與細胞系和病毒相容的適宜介質(zhì)進行稀釋來制備使用的樣品標 本。
受試者可以是任何可受病毒感染的動物物種。例如，受試者可以是禽 類、魚或哺乳動物。在某些實施方案中，受試者為哺乳動物。適宜的哺乳
動物包括養(yǎng)殖動物，如綿羊、牛、豬、鹿等等；伴侶動物，如狗、貓、兔、 豚鼠等等；實驗動物，如小鼠、大鼠、猴等等；圏養(yǎng)動物，如動物園和人 類圏養(yǎng)的動物。優(yōu)選的哺乳動物為人類。在其他的實施方案中，受試者可 以是禽類，特別是養(yǎng)殖的禽類，如雞和火雞。獲得適用于病毒檢測的樣品 的標本特異性預處理方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且可以包括，但不限 于超聲裂法和離心法。
根據(jù)本發(fā)明的病毒恢復培養(yǎng)基可以用于多種不同病毒的恢復，所述病 毒適用于細胞培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應意識到此類病毒包括，但不限于 呼吸道病毒、副流感病毒1，2,3,4(PI 1 ，2,3,4)、流感病毒A,B(InfA,B)、呼吸 道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AD)、鼻病毒(RH)、細胞巨化病毒(CMV)以及 來自腸道病毒(ENT)的病毒，所述腸道病毒選自?？刹《尽⒖粕称娌《?、 腸道病毒與脊髓灰質(zhì)炎病毒；和非呼吸道病毒，所述非呼吸道病毒的例子 有，但不限于單純皰滲病毒(HSV) 1,2、水痘帶狀皰滲病毒(VZV)、風滲、 腮腺炎、麻滲、輪狀病毒和多瘤病毒。
在本發(fā)明的方法中，可以使用已知的條件將接種的細胞與樣品進行孵 育。例,，可以將接種的細胞在37。C孵育一段時間以導致細胞感染病毒， 所述時間如45-90分鐘，特別是60分鐘?？梢栽谂囵B(yǎng)箱中施行孵育或者可 以使用離心法施行孵育。
可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)檢測方法來檢測病毒，所述常規(guī)檢測方法 諸如免疫檢測技術(shù)、常用的分子技術(shù)；所述免疫檢測技術(shù)的例子有免疫熒 光法、染色、CPE的顯像，所述常用的分子技術(shù)的例子有多聚酶鏈式反應 (PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。
根據(jù)本發(fā)明的病毒恢復培養(yǎng)基可以有利地、相對容易地用于多孔微量 滴定托盤組件。然而，如同公認的，存在大量本領(lǐng)域技術(shù)人員隨時可獲得 的不同的細胞培養(yǎng)托盤組件。例如，包括多個孔的微量滴定板是本領(lǐng)域公 知的。在一個實施方案中，可以使用如澳大利亞創(chuàng)新專利第2001100242 號所描述的托盤組件。可選地，并且根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述微量滴定 托盤組件包括分別具有多個貯槽(receptacles)的第一、第二和第三托盤單 元；以及多個與所述貯槽配套(complimentary)的樣品池，所述池分別單個 并分開地保持在所述多個貯槽內(nèi)且可從所述多個貯槽中的各自的貯槽除
去；其中第二和第三托盤單元分別適合于可拆卸地嚙合第一托盤單元，以 使由第一托盤單元和第二托盤單元和/或第三托盤單元組成的微量滴定托 盤能夠進行組裝。
雖然應理解一般優(yōu)選矩形的托盤單元，但是第一、第二和第三托盤單 元也可以分別采用任何適宜的形式。在優(yōu)選的實施方案中，為了提供不同 排列的貯槽來容納具有有待分析的溶液的樣品池，第一托盤單元包括以 6x8矩陣排列的48個貯槽，第二托盤單元包括以6x8矩陣排列的48個貯 槽以及第三托盤單元包括以2x8矩陣排列的16個貯槽。因此，使用第一 托盤單元和第二托盤單元可以形成兩個6x8(即12x8)的微量滴定托盤，使 用第一托盤單元和第三托盤單元可以形成8x8的微量滴定托盤，以及使用 全部三個托盤單元可以形成14x8的微量滴定托盤。應理解的是可以包括 另外插入的托盤單元以達到所期望的|&槽或池數(shù)。
可以通過任何適宜的方式來實現(xiàn)第二和第三托盤單元與第 一托盤單 元的連接。比如，所述方式可以包括搭扣配合嚙合或類似的手段。根據(jù)優(yōu) 選的實施方案，當?shù)诙偷谌斜P單元與第一托盤單元嚙合時，第二和第 三托盤單元鄰接第一托盤單元的對側(cè)。優(yōu)選地，第二和第三托盤單元包括 外緣臂，所述外緣臂可拆卸地嚙合第 一托盤單元任一側(cè)的配套套管。
在優(yōu)選的實施方案中，所述池分別彈性地(resiliently)保持在各自的貯 槽中。例如，每個所述池可經(jīng)由摩擦固定分別彈性地保持在各自的貯槽內(nèi)。 換言之，除了因池的直徑增加而嵌入各自的貯槽之外，還可以使每個池為 錐形以便所述池的基座可以嵌入各自的貯槽。其他的備選方案應由本領(lǐng)域 的技術(shù)人員確定。比如，所述池可以分別包括至少一個在其外表面上的脊， 所述溝嚙合內(nèi)壁，或者嚙合第一、第二和/或第三托盤單元的各自貯槽的內(nèi) 壁以產(chǎn)生摩擦固定。
優(yōu)選地，至少一個托盤單元設(shè)置有用于鑒別保持在貯槽中的樣品池的 鑒別工具。特別地，所述鑒別工具可以包括參考柵極，其中所述多個貯槽 的每排設(shè)置有相應的字母代碼和所述多個貯槽的每欄設(shè)置有相應的數(shù)字 代碼。
第 一、第二和第三托盤單元或其任意組合可以分別設(shè)置有配套的蓋， 優(yōu)選適合為樣品池分別設(shè)置的單獨的蓋。特別地，所述蓋優(yōu)選包括多個圓
形的脊，當將蓋放置在各自的托盤單元或多個單元時，所述脊分別環(huán)繞各 自樣品池的開口以充分蓋住保持在池中的樣品。
在另一個實施方案中，樣品池未單獨和分開地保#，而是作為小單元 的樣品池保持。樣品池單元僅優(yōu)選小單元，包括達四個的樣品池。
因此，微量滴定托盤組件優(yōu)選包括第一、第二和第三托盤單元，所述 第一、第二和第三托盤單元分別具有多個貯槽和多個樣品池單元，其中所 述樣品池單元分別包括達四個的樣品池，所述樣品池分別與各自的貯槽配 套，并且其中樣品池單元分別作為一個單元保持在多個貯槽的一部分貯槽 內(nèi)并可以從多個貯槽的一部分貯槽移出，所述多個貯槽與樣品池單元的樣
品池數(shù)目相對應；其中第二和第三托盤單元分別適合于可拆卸地嚙合第一 托盤單元，以使由第一托盤單元和第二托盤單元和/或第三托盤單元組成的 微量滴定托盤能夠進行組裝。
根據(jù)此實施方案，可以根據(jù)有待施行的特定診斷來構(gòu)建包括達四個樣 品池的樣品池單元。例如，可能期望提供兩份相同的樣品以便可以進行雙 重分析。在某些實施方案中，對托盤單元進行構(gòu)建以便在組件每排或每欄 中的貯槽數(shù)目與每個樣品池單元中樣品池的數(shù)目相對應。
可以根據(jù)需要制造樣品池單元?；谶@點考慮，每個樣品池單元的樣 品池可以整體地形成，或者;f皮此可以拆卸以形成單獨的樣品池。對于這兩 種選擇的后者而言，應理解的是可以使用適合將小塑料物品彼此可拆卸地 接合的任何方式來實現(xiàn)單個樣品池的連接。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種病毒診斷試劑盒，所述病毒診斷 試劑盒包括本發(fā)明的病毒恢復培養(yǎng)基、如上描述的微量滴定托盤組件和任 選地適合于將樣品池或樣品池單元從微量滴定板除去的鑷子。
所述鑷子可以采用任何適宜的形狀，條件是所述鑷子的形狀可以方便 的抓牢單個樣品池或包括達四個樣品池的樣品池單元。在優(yōu)選的實施方案 中，包括有待插入池中的第一部分和與第一部分協(xié)作并抓牢所述池外表面 的第二部分的鑷子特別適用于所述目的。第一部分優(yōu)選具有圓形的截面并
且優(yōu)選具有當插入池中時與所述池的內(nèi)壁僅有最小間隙的尺寸。
以上描迷的組件和病毒恢復培養(yǎng)基可以提供超過已知方法和當前可 獲得的組件的特定優(yōu)勢。特別地，該組件和溶液可以促使增加敏感性并針
對相同的標本使用五種或更多的高度特異性細胞系。此外，可以實現(xiàn)經(jīng)由 離心的促進作用?；谶@點考慮，離心力促進病毒的吸收并且因此縮短了
病毒檢測的時間，在某些情況下，可將病毒檢測的時間縮短10倍。此外， 可以在一個盤上接種8-16種之間的樣品，使得通過一名操作人員即可處理 更多的樣品。而且，通過第一、第二和第三托盤單元來提供組件設(shè)計中的 增強的靈活性。
可以通過采用該組件和溶液的方法使用依賴于熒光或酶標記以及在 1-2天內(nèi)產(chǎn)生可獲得的(80。/。的普通病毒)確證結(jié)果的快速^r測技術(shù)來提供增 加的客觀性?；谶@點考慮，由于可以利用高達14種不同的細胞系來允 許大范圍的病毒有待使用不同的單克隆抗體組合進行檢測，因此該組件是 通用的。也可以監(jiān)控CPE。此外，由于可以將標本接種于不同的細胞系， 因此可以在不同的細胞系上并且在不同的時限內(nèi)使用不同的單克隆。在出
結(jié)合該組件和溶液使用的方法還可以通過使結(jié)果在-3天內(nèi)獲得來提 供節(jié)省時間的益處。這樣的方法在實踐工作中表現(xiàn)出大量的節(jié)約。如所舉 的例子一樣，因為一次試-瞼僅需少量的單克隆抗體(與使用快速培養(yǎng)法一次 試驗所需的60-80 )Lil的單克隆抗體相比，為20 (il)，所以該組件還使得枱r
驗的成本有效。
在使用中，將盤接種多種細胞系。用于檢測的細胞系的選擇取決于標 本的類型和期望的病毒的存在。例如，未將本發(fā)明限制于特定的細胞系 LLC-MK2細胞系可用于副流感病毒的檢測，MDCK可用于流感病毒， HEP-2適用于RSV以及MRC-5細胞系適用于CMV、 HSV、腸道病毒和 鼻病毒的分離。繼接種之后，隨后將標本分別接種于盤上不同的排。舉例 說明，如果該盤為8x12,則每盤可以接種8種不同的標本，每種標本可以 接種入任意給定排的高達12種不同細胞系的12個池中。這就有利地促進 了至少十二種病毒的檢測。但是，應理解的是可以根據(jù)明確的診斷需求來 改變這種96孔板的構(gòu)形。上述方法僅需要對細胞系選擇作出適當?shù)母倪M
本發(fā)明逸過參考以下的非限制性附圖和/或?qū)嵤├鬟M一步描述。
目前參考附圖，所述附圖展示在本發(fā)明 一方面的試劑盒中與病毒恢復
培養(yǎng)基一起使用的托盤的實施方案，其中
圖l展示分解形式的第一、第二和第三托盤單元；
圖2^_示組裝形式的第一、第二和第三托盤單元；
圖3展示半組裝形式的第一和第二托盤單元；
圖4展示組裝形式的第一和第三托盤單元；
圖5展示多個樣品池；及
圖6展示典型的12x8矩陣孔構(gòu)形。
參考

圖1，設(shè)置托盤組件10,所述托盤組件10包括第一托盤單元11、 第二托盤單元12和第三托盤單元13。托盤單元11、 12和13分別包括多 個貯槽14，所述貯槽14適合于容納單個的樣品池(參見圖5)或者由達四個 單個的樣品池組成的樣品池單元。
第一托盤單元11包括沿著所述第一托盤單元11外邊緣的套管15。套 管15適合于一側(cè)容納第二托盤單元的外緣臂16和對側(cè)容納第三托盤單元 的外緣臂17。同樣地，可以通過將外緣臂16、 17滑入第一托盤單元11的 套管15來使第二和第三托盤單元12、 13與第一托盤單元11可拆卸地嚙合 成如圖2所展示的最佳狀態(tài)。圖3特別充分地展示了第一和第二托盤單元 的嚙合。
參考圖5,樣品池50分別有利地包括錐形的主體51 、基座52和界定 池50的開口的環(huán)形唇53。使用此構(gòu)形，可以將池分別彈性地保持在第一、 第二或第三托盤單元的各自的貯槽內(nèi)并且可以根據(jù)需要除去。
圖6示例性地展示典型的12x8孔板構(gòu)形(即2x6x8)的例子，包括有待 檢測的病毒列表、相關(guān)的細胞系和每種細胞系的除去天數(shù)。
如圖6所示，該板可以按照以下順序接種不同的細胞系
1-3欄 LLC-MK2
4、 5欄 MDCK
6欄 Hep2
7欄 A549
8欄 RK13
9-12柱 MRC-5
以此樣式設(shè)置的板將允許選擇諸如下述的病毒，但是不限于呼吸道 病毒副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A，B (Inf A,B)、 RSV、腺病 毒(AD)、鼻病毒(RH)、細胞巨化病毒(CMV)和來自腸道病毒(ENT)的病毒， 所述腸道病毒選自?？刹《?Eco)、科沙奇病毒(cox)、腸道病毒(Ent)與脊髓 灰質(zhì)炎病毒(Polio);以及但不限于非呼吸道病毒——單純皰疹病毒(HSV) 1,2與水痘帶狀皰滲病毒(VZV)。
在另外的實施例中，6x8孔板的構(gòu)形可以由下述順序接種的細胞系組
成
1-3欄 A 549 4-6欄 MRC-5
這可允許用于例如以下病毒的檢測，例子有CMV、 HSV1，2、 VZV、 AD和來自腸道病毒的病毒。
最后，14x8孔的構(gòu)形可允許最終用于病原體的纟僉測，所述病原體如 PI1，2，3,4、 Inf A,B、 RSV、 AD、 RH、 ENT (Echo, cox, Ent, Polio)、 HSV 1,2、 vzv、風滲、腮腺炎、麻滲、輪狀病毒、多瘤病毒以及其他使用合適的細
胞系的病原體病毒。
由于池的獨立的性質(zhì)，可以根據(jù)適用于正在討i侖的特定病毒^r測的時 間表來選擇除去的細胞系。特別地，取A排進行舉例，如果期望檢測PI1-4, 則在第二天除去池A1-A3;如果期望檢測InfA,B,則在第二天除去池A4 和A5。然而，如果需要檢測腸病毒，則隨后在合適的天數(shù)(l-3)除去池All。 獨立池的獨特性質(zhì)使得這種選擇除去和病毒檢測更加容易進行。
現(xiàn)在參考特定的過程使用本發(fā)明一方面的試劑盒，其中許多步驟可以 進行優(yōu)化并且不應認為其以任何方式限制本發(fā)明。
使用真空滅菌的玻璃巴斯德吸管從有待接種的所有池中吸出培養(yǎng)基。 在大的細長容器中丟棄巴斯德吸管是有利的。
使用一次性吸管使孔板合適數(shù)目的池接種有約每池150-200 jal的標 本。剩余的樣品在-7(TC保存。隨后將蓋放置在板上并于板中培養(yǎng)的池上方 i己錄日期。
然后將板在數(shù)字天平上稱重并使用平衡板和平衡卡進行平衡直到所 有的板等重(+A0.5g)并且能夠在離心中平衡。離心機在37。C和以3500 rpm
運行60 min。然后使用真空滅菌的巴斯德吸管分別從每個池中吸出標本， 并且將每個池填充上本發(fā)明的病毒恢復培養(yǎng)基，其中每個標本均使用干凈 的一次性吸管。
隨后在聶后的標本接種后通過將板小心地放入(302培養(yǎng)箱并在37°C 孵育達七天來使樣品在37。C的C02培養(yǎng)箱(5。/。)中的潮濕環(huán)境下孵育。
通過使用特異性的單克隆抗體，可以有利地將熒光免疫染色用于單個 池中特定病毒的檢測。通常，隨后的過程如下使用真空吸引器從合適的 池中除去培養(yǎng)基并使用專用的鑷子從該板除去所述池并轉(zhuǎn)移入不同的支 架。然后將這些物體氣干5分鐘。然后將300 pl的冷丙酮加至每個池并允 許在-20。C固定15分鐘。隨后丟棄固定液并將樣品再次氣干2-3分鐘。然 后分別往池中加入特異性的單克隆抗體(一抗)并將蓋有蓋子的板置入適當 的位置中，且將樣品在'37。C孵育30分鐘。然后從培養(yǎng)箱中移出樣品并且 分別往池中添加PBS。隨后丟棄PBS。此過程重復四次以上。再次將樣品 氣干5分鐘，之后分別往池中加入二抗。該步驟后，再次進行樣品的孵育， 繼之使用如上所述的PBS重復處理且最終使用雙蒸水洗滌。然后加入少量 (1滴)專門制備的封片介質(zhì)并在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
除非上下文另有要求，否則遍及本說明書和隨后的權(quán)利要求的詞"包括 (comprise)"及其變體如"包括(comprises)"和"包括(comprising)"應理解為包 含所規(guī)定的整體或整體組合或步驟而不排除任何其他的整體或整體組合 或步驟。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，除了專門描述的之外，可以對此處描述的本 發(fā)明進行變化和改進。有待理解的是本發(fā)明包括所有這樣的變化和改進。 本發(fā)明還個別或全體地包括說明書中涉及或預示的所有步驟、特征、組合 物和化合物，以及任意兩種或多種所述步驟或特征的任意和全部的組合。
權(quán)利要求
1.一種病毒恢復培養(yǎng)基，其包括細胞培養(yǎng)基，所述細胞培養(yǎng)基添加有至少一種激素和至少一種酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述激素為糖皮質(zhì) 激素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述激素選自地塞 米松、氫化可的松、醋酸可的松、潑尼松、氬化潑尼松、曱基氫化潑尼松、 倍他米松、氟羥潑尼松龍、倍氯米松、醋酸氟氬可的松、醋酸脫氧皮質(zhì)酮 (DOCA)和酪固酮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述激素為地塞米松。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述酶為絲氨酸或 天冬氨酸蛋白酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述酶選自胰蛋白 酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶。
7. 裉據(jù)權(quán)利要求6所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述酶為胰蛋白酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述酶以1至5 |ig/mL 的范圍，特別是約2.5(ig/mL的量存在。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述激素以104至 10—6 M的濃麼.，特別是約10—5 M的濃度存在。
10. —種檢測病毒的方法，其包括(i) 提供適用于病毒接種的細胞系；(ii) 對標本進行特異性預處理以獲得潛在含有待檢測病毒的樣品；(iii) 使用潛在含有待檢測病毒的樣品接種細胞；(iv) 孵育接種的細胞；(v) 使用包括細胞培養(yǎng)基的病毒恢復培養(yǎng)基替換樣品培養(yǎng)基，所述細 胞培養(yǎng)基添加有至少 一種激素和至少 一種酶；(vii)檢測所述病毒。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述激素為糖皮質(zhì)激素。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述激素選自地塞米松、氫化 可的松、醋酸可的松、潑尼松、氫化潑尼松、曱基氳化潑尼松、倍他米松、 氟羥潑尼松龍、倍氯米松、醋酸氟氫可的松、醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)和醛固酮。根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述激素為地塞米^^。 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述酶為絲氨酸或天冬氨酸
13.
14.蛋白酶。
15. 白酶、J
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述酶選自胰蛋 L蛋白酶和胃蛋白酶。根據(jù)權(quán)利要求15所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述酶為胰蛋白
17. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述酶以1至5 pg/mL的范圍，特別是約2.5嗎/mL的量存在。
18. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的病毒恢復培養(yǎng)基，其中所述激素以104 至10^M的濃度，特別是約10^M的濃度存在。
19. 一種病毒"^斷試劑盒，其包括(i) 病毒恢復培養(yǎng)基，所述病毒恢復培養(yǎng)基包括細胞培養(yǎng)基，所述細胞 培養(yǎng)基添加有至少一種激素和至少一種酶；和(ii) ^:量滴定托盤組件。
20. 根據(jù)秋利要求19所述的病毒診斷試劑盒，其中所述微量滴定托 盤組件包括多個相互連接但可拆卸的微量滴定托盤。'
全文摘要
本發(fā)明涉及一種病毒恢復培養(yǎng)基及包括該病毒恢復培養(yǎng)基的病毒診斷試劑盒。所述病毒恢復培養(yǎng)基添加有激素和酶。所述激素優(yōu)選糖皮質(zhì)激素，更優(yōu)選地塞米松。所述酶優(yōu)選蛋白酶，更優(yōu)選胰蛋白酶。
文檔編號C12N5/02GK101103102SQ200680002001
公開日2008年1月9日 申請日期2006年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月14日
發(fā)明者羅伯特·亞歷山大 申請人:羅伯特·亞歷山大