專利名稱：用脂質(zhì)膜被覆粒子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用脂質(zhì)膜被覆粒子的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，為了將藥物、核酸、肽、蛋白質(zhì)、糖等準(zhǔn)確遞送到靶向部 位的載體的開發(fā)很盛行。例如，在基因治療過程中，開發(fā)了將目的基因 導(dǎo)入靶細(xì)胞的載體-逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等的病毒載體。但 是，病毒栽體存在大量生產(chǎn)的困難性、抗原性、毒性等問題，因此，少 有這樣的問題出現(xiàn)的脂質(zhì)體載體正在引起人們的關(guān)注。脂質(zhì)體載體具有 通過向其表面導(dǎo)入抗體、蛋白質(zhì)、糖鏈等的功能性分子，能夠提高對(duì)靶 向部位的耙向性這一優(yōu)點(diǎn)。
公知的脂質(zhì)體的制備方法，例如有脂質(zhì)膜的單純水合法。根據(jù)脂質(zhì) 膜的單純水合法，在基因等目的物質(zhì)的存在下，能夠通過將脂質(zhì)膜水合 制備將目的物質(zhì)封入其中的多層膜脂質(zhì)體(非專利文獻(xiàn)1 )。通過對(duì)這樣 制備得到的多層膜脂質(zhì)體再次進(jìn)行脂質(zhì)膜的單純水合法，能夠在多層膜 脂質(zhì)體外側(cè)得到多層新的脂質(zhì)膜。就這樣通過反復(fù)進(jìn)行脂質(zhì)膜的單純水 合法，能夠增加多層膜脂質(zhì)體中含有的脂質(zhì)膜的數(shù)量。
非專利文獻(xiàn)l: Kogure等，"Journal of Control led Release", 2004 年，98巻，317-323頁(yè)。
但是，采用脂質(zhì)膜的單純水合法等以往的方法，脂質(zhì)膜被不均勻的 多層化，很難控制多層膜脂質(zhì)體含有的脂質(zhì)膜的數(shù)量。另外，采用脂質(zhì) 膜的單純水合法等以往的方法，脂質(zhì)膜只能像地層一樣層層重疊在一塊， 脂質(zhì)膜之間很難形成空間。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的在于提供一種能夠用兩張其間形成空間的脂質(zhì)膜 來(lái)被覆對(duì)象粒子的方法，以及提供通過該方法用兩張脂質(zhì)膜將對(duì)象粒子 被覆而得到的脂質(zhì)體。
本發(fā)明的第一種方法為，用兩張脂質(zhì)膜將帶正電粒子被覆的方法，
其特征在于，使所述帶正電粒子與多個(gè)帶負(fù)電suv型脂質(zhì)體接觸，形成 含有所述帶正電粒子和已與所述帶正電粒子靜電結(jié)合的所述帶負(fù)電suv 型脂質(zhì)體的帶負(fù)電復(fù)合物，用陽(yáng)離子處理所述帶負(fù)電復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的第 一種方法，能夠用其間形成空間的兩張脂質(zhì)膜被覆 帶正電粒子。通過本發(fā)明的第一種方法被覆帶正電粒子得到脂質(zhì)體，在 被覆帶正電粒子的兩張脂質(zhì)膜(形成于帶正電粒子外側(cè)的第一脂質(zhì)膜以 及形成于第一脂質(zhì)膜外側(cè)的第二脂質(zhì)膜)之間形成空間，所要求的物質(zhì) 能夠保留在該空間。
本發(fā)明的第一種方法中，所述帶正電粒子優(yōu)選為目的物質(zhì)的聚集物。 此時(shí)，通過本發(fā)明的第一種方法能夠制作封入目的物質(zhì)的聚集物，且被 覆目的物質(zhì)的聚集物的兩張脂質(zhì)膜之間形成有空間的兩張膜脂質(zhì)體。
本發(fā)明的第一種方法中，所述帶正電粒子優(yōu)選為帶正電的n張膜脂 質(zhì)體(n是大于1的整數(shù))。此時(shí)，通過本發(fā)明的第一種方法能夠制作被 覆帶正電的n張膜脂質(zhì)體的兩張脂質(zhì)膜之間形成有空間的(n+2)張膜脂 質(zhì)體。
本發(fā)明的第一種方法中，所述帶正電粒子的g電位優(yōu)選為20~ 30mV,所述帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的^電位優(yōu)選為-2G -30mV。此時(shí)，能 夠很有效地形成含有帶正電粒子和已與該帶正電粒子靜電結(jié)合的多個(gè)帶 負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的帶負(fù)電復(fù)合物。
本發(fā)明的第一種方法中，所述帶正電粒子的粒徑優(yōu)選在50mn以上。 此時(shí)，能夠很有效地形成含有帶正電粒子和已與該帶正電粒子靜電結(jié)合 的多個(gè)帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的帶負(fù)電復(fù)合物。
本發(fā)明的第二種方法為，用兩張脂質(zhì)膜將帶負(fù)電粒子被覆的方法， 其特征在于，使所述帶負(fù)電粒子與多個(gè)帶正電SUV型脂質(zhì)體接觸，形成
脂質(zhì)體的帶正電復(fù)合物，用陰離子處理所述帶正電復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的第二種方法，能夠用在其間形成空間的兩張脂質(zhì)膜被 覆帶負(fù)電粒子。通過本發(fā)明的第二種方法被覆帶負(fù)電粒子得到脂質(zhì)體， 在被覆有帶負(fù)電粒子的兩張脂質(zhì)膜(形成于帶負(fù)電粒子外側(cè)的第一脂質(zhì) 膜以及形成于第一脂質(zhì)膜外側(cè)的第二脂質(zhì)膜)之間形成空間，所要求的 物質(zhì)能夠保留在該空間。
本發(fā)明的第二種方法中，所述帶負(fù)電粒子優(yōu)選為目的物質(zhì)的聚集 物。此時(shí)，通過本發(fā)明的第二種方法能夠制作封入目的物質(zhì)的聚集物， 且被覆目的物質(zhì)的聚集物的兩張脂質(zhì)膜之間形成有空間的兩張膜脂質(zhì) 體。
本發(fā)明的第二種方法中，所述帶負(fù)電粒子優(yōu)選為帶負(fù)電的n張膜脂 質(zhì)體(n是大于1的整數(shù))。此時(shí)，通過本發(fā)明的第二種方法能夠制作被 覆帶負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體的兩張脂質(zhì)膜之間形成有空間的(n+2 )張膜脂 質(zhì)體。
本發(fā)明的第二種方法中，所述的帶負(fù)電粒子的《電位優(yōu)選為-20~ -30mV，所迷帶正電SUV型脂質(zhì)體的g電位優(yōu)選為20~ 30mV。此時(shí)，能 夠很有效地形成含有帶負(fù)電粒子和已與該帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合的多個(gè)帶 負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的帶正電復(fù)合物。
本發(fā)明的第二種方法中，所述帶負(fù)電粒子的粒徑優(yōu)選在50nm以上。 此時(shí)，能夠很有效地形成含有帶負(fù)電粒子和已與該帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合 的多個(gè)帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的帶正電復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠用兩張其間形成空間的脂質(zhì)膜來(lái)被覆對(duì)象 粒子。因此，如果使用目的物質(zhì)的聚集物作被覆的對(duì)象粒子，能夠制作 封入目的物質(zhì)的聚集物，且被覆目的物質(zhì)的聚集物的兩張脂質(zhì)膜之間形 成有空間的兩張膜脂質(zhì)體；如果使用n張膜脂質(zhì)體(n是大于1的整數(shù)) 作被覆的對(duì)象粒子，能夠制作被覆n張膜脂質(zhì)體的兩張脂質(zhì)膜之間形成 有空間的(n+2)張膜脂質(zhì)體。通過本發(fā)明的方法被覆帶正電粒子或帶負(fù) 電粒子得到的脂質(zhì)體，在被覆帶正電粒子或帶負(fù)電粒子的兩張脂質(zhì)膜之 間形成空間，要求的物質(zhì)能夠保留在該空間。


圖1 (a)為表示通過DNA瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定各分離物的DNA含量 的結(jié)果的圖，(b)為表示通過熒光強(qiáng)度測(cè)定各分離物的羅丹明含量以及 NBD含量的結(jié)果的圖。
圖2 (a)為表示通過DNA瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定各分離物的DNA含量 的結(jié)果的圖，(b)為表示通過焚光強(qiáng)度測(cè)定各分離物的羅丹明含量以及 NBD含量的結(jié)果的圖。
圖3為表示通過各種多層脂質(zhì)體被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶基因的表 現(xiàn)活性的圖。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的第一種方法中，首先，使帶正電粒子與多個(gè)帶負(fù)電suv 型脂質(zhì)體接觸，形成含有帶正電粒子和已與帶正電粒子靜電結(jié)合的帶負(fù)
電suv型脂質(zhì)體的帶負(fù)電復(fù)合物。
在本發(fā)明的第二種方法中，首先，使帶負(fù)電粒子與多個(gè)帶正電suv
型脂質(zhì)體接觸，形成含有帶負(fù)電粒子和已與帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合的帶正 電suv型脂質(zhì)體的帶正電復(fù)合物。
帶正電粒子的g電位沒有特別限制，只要它的e電位是正值即可，
通常為10 60mV，優(yōu)選為20 50mV，更優(yōu)選為20 30mV。帶負(fù)電粒子 的g電位沒有特別限制，只要它的g電位是負(fù)值，通常為-10 -60mV,
優(yōu)選為-20~-50mV，更優(yōu)選為-20 --30mV。 ？電位的測(cè)定條件無(wú)特別限 定，溫度條件通常為25°C。
帶正電粒子以及帶負(fù)電粒子的粒徑?jīng)]有特別限制，粒徑的下限值優(yōu) 選為50nm,更優(yōu)選為70nm,粒徑的上限值優(yōu)選為500nm,更優(yōu)選為200nm。 如果帶正電粒子的粒徑在上述范圍內(nèi)，在用陽(yáng)離子處理已與帶正電粒子 靜電結(jié)合的帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的時(shí)候，能夠用兩張脂質(zhì)膜很有效地被 覆帶正電粒子。另外，如果帶負(fù)電粒子的粒徑在上述范圍內(nèi)，在用陰離 子處理已與帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合的帶正電SUV型脂質(zhì)體的時(shí)候，能夠用 兩張脂質(zhì)膜很有效地被覆帶負(fù)電粒子。
帶正電粒子在整體為正值時(shí)，加入到陽(yáng)離子物質(zhì)，即使含有中性物 質(zhì)和/或陰離子物質(zhì)也可以。帶負(fù)電粒子在整體為負(fù)值時(shí)，加入到陰離子 物質(zhì)，即使含有中性物質(zhì)以及/或者陽(yáng)離子物質(zhì)也可以。
帶正電粒子或者帶負(fù)電粒子，能夠使用例如，目的物質(zhì)(例如應(yīng)遞 送到細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)的物質(zhì))的聚集物。帶正電粒子或者帶負(fù)電粒子在使 用目的物質(zhì)的聚集物時(shí)候，通過用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正電粒子或者帶負(fù) 電粒子，能夠制作封入有目的物質(zhì)的兩張膜脂質(zhì)體。目的物質(zhì)的聚集物 可以只由目的物質(zhì)構(gòu)成，也可以含有目的物質(zhì)以外的物質(zhì)(例如保留 目的物質(zhì)的栽體)。
目的物質(zhì)帶正電的時(shí)候，例如，可以通過使目的物質(zhì)和陰離子物質(zhì) 靜電結(jié)合，使其復(fù)合物化的方法來(lái)制備目的物質(zhì)的聚集物。目的物質(zhì)帶 負(fù)電的時(shí)候，例如，可以通過使目的物質(zhì)和陽(yáng)離子物質(zhì)靜電結(jié)合，使其 復(fù)合物化的方法來(lái)制備目的物質(zhì)的聚集物。目的物質(zhì)既不帶正電也不帶 負(fù)電的時(shí)候，通過目的物質(zhì)和陽(yáng)離子物質(zhì)以適當(dāng)方式(例如物理性吸 附、疏水性結(jié)合、化學(xué)結(jié)合等)，使其復(fù)合物化，制備目的物質(zhì)的聚集物。 復(fù)合物化時(shí)，通過調(diào)整目的物質(zhì)和陽(yáng)離子物質(zhì)或者和陰離子物質(zhì)的混合 比，能夠制備整體帶正或負(fù)電的目的物質(zhì)的聚集物。
目的物質(zhì)沒有特別的限定，例如，可以是核酸、肽、蛋白質(zhì)、藥物、 糖以及它們的復(fù)合物等。并且，向核酸中加入DNA或者RNA，就會(huì)含有 它們的類似物或者衍生物(例如肽核酸(PNA))、石危代磷酸酯DNA等。此 外，核酸可以是一條鏈或兩條鏈，可以是線狀也可以是環(huán)狀。
目的物質(zhì)為核酸的時(shí)候，通過核酸和陽(yáng)離子物質(zhì)靜電結(jié)合復(fù)合物化， 制備核酸的聚集物。復(fù)合物化的時(shí)候，通過調(diào)整核酸和陽(yáng)離子物質(zhì)的混 合比，能夠制備整體帶正或負(fù)電的核酸聚集物。
制備目的物質(zhì)的聚集物的時(shí)候使用的陽(yáng)離子物質(zhì)沒有特別限制，只 要分子中具有陽(yáng)離子基團(tuán)的物質(zhì)即可。陽(yáng)離子物質(zhì)能夠使用的有，例如， 陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如Lipofectamine ( Invitrogen乂A司制))；具有陽(yáng)離
子基團(tuán)的高分子；聚賴氨酸、聚精氨酸、賴氨酸和精氨酸的共聚物等的 堿性氨基酸的單聚物或者共聚物或者這些的衍生物(例如硬脂酰衍生 物)；聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨、氨基葡萄糖等 的多陽(yáng)離子聚合物；硫酸精蛋白等。陽(yáng)離子物質(zhì)具有的陽(yáng)離子基團(tuán)的數(shù) 目沒有特別的限定，優(yōu)選2個(gè)以上。陽(yáng)離子基團(tuán)帶有正電荷即可，沒有 特別的限定，例如，可為氨基；曱胺基、乙胺基等單烷胺基；二曱胺基、 二乙胺基等二烷胺基；亞氨基；胍基等。
制備目的物質(zhì)的聚集物的時(shí)候使用的陰離子物質(zhì)沒有特別的限制， 只要分子中具有陰離子基團(tuán)的物質(zhì)即可。陰離子物質(zhì)能夠使用的有，例 如，陰離子脂質(zhì)；具有陰離子基團(tuán)的高分子；聚天門冬酰胺等酸性氨基 酸的單聚合物或者共聚合物或者這些的衍生物；黃原膠、聚羧乙烯、羧
曱基纖維素聚苯乙烯砜酸鹽、多糖類、鹿角菜膠、等的多陰離'子聚合物。 陰離子物質(zhì)具有的陰離子基團(tuán)的數(shù)目沒有特別的限定，優(yōu)選2個(gè)以上。 陰離子基團(tuán)帶有負(fù)電荷即可，沒有特別的限定，例如，可為具有末端羧 基的官能團(tuán)(例如琥珀酸殘基、丙二酸殘基等)、磷酸根、硫酸根等。
例如，帶正電或者帶負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體(n為大于1的整數(shù))，可 以當(dāng)作帶正電或帶負(fù)電的粒子使用。在使用n張膜脂質(zhì)體為帶正電或者 帶負(fù)電的粒子的時(shí)候，通過用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正電或者帶負(fù)電的粒 子，能夠制作(n+2)張膜脂質(zhì)體。可以將目的物質(zhì)封入帶正電或者帶負(fù) 電的n張膜脂質(zhì)體內(nèi)部，也可以不封入。帶正電的n張膜脂質(zhì)體僅在整 體帶正電荷的時(shí)候，加入到陽(yáng)離子物質(zhì)，即使含有中性物質(zhì)以及/或者陰 離子物質(zhì)也可以。帶負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體僅在整體帶負(fù)電荷的時(shí)候，加 入到陰離子物質(zhì)，即使含有中性物質(zhì)以及/或者陽(yáng)離子物質(zhì)也可以。
n張膜脂質(zhì)體能夠使用，例如，水合法、超聲波處理法、注入乙醇 法、注入乙醚法、反相蒸發(fā)法、表面活性劑法、凍結(jié)溶解法等公知方法 制作。另外，使用本發(fā)明的方法，通過用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正電或者帶 負(fù)電的粒子，也能夠制得n張膜脂質(zhì)體。
通過調(diào)節(jié)構(gòu)成n張膜脂質(zhì)體的物質(zhì)(例如脂質(zhì)膜構(gòu)成成分、被封 入脂質(zhì)體內(nèi)部的物質(zhì)等)的種類以及含量，能夠制作帶正電或者帶負(fù)電 的n張膜脂質(zhì)體。另外，通過用陽(yáng)離子物質(zhì)修飾帶負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體 或者中性的n張膜脂質(zhì)體，能夠制作帶正電的n張膜脂質(zhì)體；通過用陰 離子物質(zhì)修飾帶正電的n張膜脂質(zhì)體或者中性的n張膜脂質(zhì)體，能夠制 作帶負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體。
n張膜脂質(zhì)體能夠通過例如水合法，按如下所述制得。將脂質(zhì)膜的 構(gòu)成成分溶解于有機(jī)溶劑后，通過蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑得到脂質(zhì)膜。此時(shí)， 有機(jī)溶劑，例如，可以是戊烷、己烷、庚烷、環(huán)己烷等的碳水化合物；
二氯曱烷、氯仿等卣代碳水化合物；苯、甲苯等芳香族碳水化合物；甲 醇、乙醇等低級(jí)醇類；醋酸曱酯等酯類；丙酮等酮類；可將這些有機(jī)溶 劑單獨(dú)或者兩種以上相互組合使用。然后，通過水合該脂質(zhì)膜、攪拌或 者超聲波處理，可轉(zhuǎn)化為多層膜脂質(zhì)體。按照公知的方法能夠進(jìn)行由多 層膜脂質(zhì)體向一張膜脂質(zhì)體或者由一張膜脂質(zhì)體向多層膜脂質(zhì)體的轉(zhuǎn) 化。通過將n張膜脂質(zhì)體通過預(yù)定的孔徑大小的過濾器，能夠得到有一 定粒度分布的n張膜脂質(zhì)體。
目的物質(zhì)為水溶性的時(shí)候，通過向制造n張膜脂質(zhì)體過程中水合脂 質(zhì)膜時(shí)使用的水性介質(zhì)中添加目的物質(zhì)或者其聚集物，能夠?qū)⒛康奈镔|(zhì) 封入脂質(zhì)體內(nèi)部的水相中。此外，目的物質(zhì)為脂溶性的時(shí)候，通過向制 造n張膜脂質(zhì)體過程中使用的有機(jī)溶劑中添加目的物質(zhì)或者其聚集物， 能夠?qū)⒛康奈镔|(zhì)封入脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜中。
在用陽(yáng)離子物質(zhì)修飾帶負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體或者中性的n張膜脂質(zhì) 體的表面的時(shí)候，例如，向帶負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體或者中性的n張膜脂 質(zhì)體的外液中添加具有疏水性基團(tuán)的陽(yáng)離子物質(zhì)。由此，為使陽(yáng)離子物 質(zhì)從脂質(zhì)膜露出，將疏水性基團(tuán)插入脂質(zhì)膜，使陽(yáng)離子物質(zhì)能夠?qū)霂?負(fù)電的n張膜脂質(zhì)體或者中性的n張膜脂質(zhì)體的表面。
在用陰離子物質(zhì)修飾帶正電的n張膜脂質(zhì)體或者中性的n張膜脂質(zhì) 體的表面的時(shí)候，例如，向帶正電的n張膜脂質(zhì)體或者中性的n張膜脂 質(zhì)體的外液中添加具有疏水性基團(tuán)的陰離子物質(zhì)。由此，為使陰離子物 質(zhì)從脂質(zhì)膜露出，將疏水性基團(tuán)插入脂質(zhì)膜，使陰離子物質(zhì)能夠?qū)霂?正電的n張膜脂質(zhì)體或者中性的n張膜脂質(zhì)體的表面。
疏水性基團(tuán)插入脂質(zhì)膜即可，并沒有特別的限定。疏水性基團(tuán)可以 是，例如硬脂?；鹊娘柡突蛘卟伙柡椭舅峄鶊F(tuán)、膽固醇?xì)埢鹊墓?醇?xì)埢?、磷脂質(zhì)殘基、糖脂殘基、長(zhǎng)鏈脂肪族羥基殘基(例如磷脂乙 胺殘基等)、羥基丙烯烷基、甘油脂肪酸酯殘基等，其中特別優(yōu)選碳原子 數(shù)為10 20的脂肪酸基團(tuán)(例如棕櫚?；?、油醇基、硬脂?；?、花生 四烯酰基等)。
n張膜脂質(zhì)體中脂質(zhì)膜構(gòu)成成分，只要不阻礙二層脂質(zhì)的形成即可， 并無(wú)特殊限定。脂質(zhì)膜構(gòu)成成分，例如是脂質(zhì)、膜穩(wěn)定劑、抗氧化劑、 荷電物質(zhì)、膜蛋白質(zhì)等。
調(diào)節(jié)帶正電n張膜脂質(zhì)體中脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的種類以及含量，以使 n張膜脂質(zhì)體整體帶正電；調(diào)節(jié)帶負(fù)電n張膜脂質(zhì)體中脂質(zhì)膜構(gòu)成成分 的種類以及含量，以使n張膜脂質(zhì)體整體帶負(fù)電。賦予正電荷的脂質(zhì)膜 構(gòu)成成分，例如，可以是陽(yáng)離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子膜穩(wěn)定劑等，賦予負(fù)電荷 的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分，例如，可以是陰離子脂質(zhì)、陰離子膜穩(wěn)定劑等。并
且，向n張膜脂質(zhì)體內(nèi)部封入預(yù)定物質(zhì)(例如目的物質(zhì)的聚集物)的時(shí) 候，按照封入n張膜脂質(zhì)體內(nèi)部的物質(zhì)整體所帶的電荷，來(lái)調(diào)節(jié)n張膜 脂質(zhì)體中脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的種類以及含量。
SUV (small unilamellar vesicle)型脂質(zhì)體為粒徑(直徑)在lOOnm 以下的一張膜脂質(zhì)體。SUV型脂質(zhì)體的粒徑(直徑)只要在lOOnm以下 即可，無(wú)特別限定，通常為30 ~ lOOnm，優(yōu)選30- 70nm,更優(yōu)選30 ~ 50nm。
多層膜脂質(zhì)體(MLV )、除SUV之外的一張膜脂質(zhì)體(例如LUV( large unilamellar vesicle)、 GUV (giant unlamellar vesicle)等)粒子直 徑在lOOnm以上( 一般認(rèn)為有l(wèi)OOnm以上粒子直徑的脂質(zhì)膜為平面膜)， 膜的曲度以及膜表面能小，脂質(zhì)體之間難以產(chǎn)生聚集。相反，SUV型脂 質(zhì)體粒子直徑?jīng)]到lOOnm,膜的曲度以及膜表面能大，脂質(zhì)體之間易于 產(chǎn)生聚集。因此，如果用陽(yáng)離子處理與帶正電粒子靜電結(jié)合的帶負(fù)電SUV 型脂質(zhì)體，帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體之間就能夠有效膜融合。另外，如果用 陰離子處理與帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合的帶正電SUV型脂質(zhì)體，帶正電SUV 型脂質(zhì)體之間就能夠有效膜融合。
SUV型脂質(zhì)體能夠用如超聲波法，依如下所述制作。將脂質(zhì)膜的構(gòu) 成成分溶解于有機(jī)溶劑后，通過蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑得到脂質(zhì)膜。此時(shí)， 有機(jī)溶劑可以是，例如戊烷、己烷、庚烷、環(huán)己烷等的碳水化合物；二 氯甲烷、氯仿等卣代碳水化合物；苯、甲苯等芳香族碳水化合物；曱醇、 乙醇等低級(jí)醇類；醋酸曱酯等酯類；丙酮等酮類；可將這些有機(jī)溶劑單 獨(dú)或者兩種以上相互組合使用。然后，通過水合該脂質(zhì)膜、攪拌或者超 聲波處理可轉(zhuǎn)化為多層膜脂質(zhì)體。將得到的多層脂質(zhì)體再由探針型超聲 波裝置進(jìn)行處理，可制得一張小的膜脂質(zhì)體SUV型脂質(zhì)體。
SUV型脂質(zhì)體中的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分沒有特別限制，只要不阻礙形成 二層脂質(zhì)即可，脂質(zhì)膜的構(gòu)成成分，例如，可以是脂質(zhì)、膜穩(wěn)定化劑、 抗氧化劑、荷電物質(zhì)、膜蛋白質(zhì)等。
調(diào)節(jié)帶正電SUV型脂質(zhì)體中脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的種類以及含量，以使 SUV型脂質(zhì)體整體帶正電；調(diào)節(jié)帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體中脂質(zhì)膜構(gòu)成成分 的種類以及含量，以使SUV型脂質(zhì)體整體帶負(fù)電。賦予正電荷的脂質(zhì)膜 構(gòu)成成分，例如，可以是陽(yáng)離子物質(zhì)、陽(yáng)離子膜穩(wěn)定化劑等；賦予負(fù)電 荷的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分，可以是陰離子物質(zhì)、陰離子膜穩(wěn)定化劑等。帶正 電SUV型脂質(zhì)體只要整體帶正電，加入到賦予正電荷的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分， 可以含有賦予負(fù)電荷的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分和/或中性的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分；帶 負(fù)電suv型脂質(zhì)體只要整體帶負(fù)電，加入到賦予負(fù)電荷的脂質(zhì)膜構(gòu)成成
分，可以含有賦予正電荷的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分和/或中性的脂質(zhì)膜構(gòu)成成 分。
帶正電SUV型脂質(zhì)體含有的賦予正電荷的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分為陽(yáng)離子 脂質(zhì)的時(shí)候，陽(yáng)離子脂質(zhì)的配量通常為脂質(zhì)的總配量的5~30%(摩爾 比)，優(yōu)選10~20% (摩爾比)，更優(yōu)選10~ 15% (摩爾比)。
帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體含有賦予負(fù)電荷的脂質(zhì)膜構(gòu)成成分為陰離子脂 質(zhì)的時(shí)候，陰離子脂質(zhì)的配量通常為脂質(zhì)的總配量的5~ 30% (摩爾比), 優(yōu)選10-20% (摩爾比)，更優(yōu)選10~ 15% (摩爾比)。
帶正電SUV型脂質(zhì)體的g電位沒有特別限制，只要它的g電位是正 值即可，通常為10-60mV，優(yōu)選為20 50mV，更優(yōu)選為20 - 30mV。帶 負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的g電位沒有特別限制，只要它的^電位是負(fù)值，通 常為-10~-60mV,優(yōu)選為-20 -50mV，更優(yōu)選為-20 ~-30mV。
^電位的 測(cè)定條件無(wú)特別限定，溫度條件通常為25。C。
在n張膜脂質(zhì)體或SUV型脂質(zhì)體中，脂質(zhì)是脂質(zhì)膜的必要成分，其 配量通常為脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的總配量的30~100% (摩爾比)，優(yōu)選50~ 100% (摩爾比)，更優(yōu)選70~ 100% (摩爾比)。
脂質(zhì)，可以為例如，磷脂、糖脂、固醇、飽和或者不飽和的脂肪酸 等。磷脂，例如，可以是磷脂酰膽堿(例如二油酰磷脂酰膽堿、二月 桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酸酰磷脂酰膽堿、二 硬脂酰磷脂酰膽堿等)、磷脂酰甘油(例如二油酰磷脂酰甘油、二月桂 酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂 酰磷脂酰甘油等)、磷脂酰乙醇胺(例如二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂 酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心肌 磷脂、神經(jīng)鞘髓磷脂、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、它們的氫化物等。糖 脂質(zhì)，例如，可以是甘油糖脂(例如次石危酸核糖基甘油酯、二糖基二 甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯)、鞘 糖脂(例如半乳糖基糖脂、神經(jīng)節(jié)苷脂)等。固醇，例如，可以是來(lái) 源于動(dòng)物的固醇(例如膽固醇、膽固醇琥珀酸、羊毛甾醇、二氫羊毛 甾醇、鏈甾醇、二氫膽固醇)、來(lái)源于植物的固醇(植物甾醇)(例如 豆甾醇、谷甾醇、菜子甾醇、菜油甾醇)、來(lái)源于微生物的固醇(例如 酵母甾醇、麥角甾醇)等。飽和或者不飽和的脂肪酸，例如，可以是棕 櫚酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等的碳原子數(shù)12 20的飽 和或者不飽和的脂肪酸。
脂質(zhì)分中性脂質(zhì)、陽(yáng)離子脂質(zhì)以及陰離子脂質(zhì)，中性脂質(zhì)，例如， 可以是二酰磷脂酰膽義威、二酰磷脂酰乙胺、膽固醇、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)鞘 磷脂、腦磷脂、腦苷脂等；陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如，可以是DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride ) 、 DOTMA ( N- ( 2 ，
3-dioleyloxy ) propyl-N ，N , N-trimethylammonium ) 、 DDAB ( didodecylammonium bromide )、 D0TAP ( 1 ， 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane )、 DC-Chol ( 3 P -N- (N ',N' -dimethyl-aminoethane ) -carbamolcholesterol )、 DMRIE ( 1， 2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium )、 D0SPA (2 ， 3- dioleoyioxy-N-[2 ( sperminecarboxamido ) ethyl]-N， N-dimethyl-l-propanaminum trifluoroacetate )等；P月離子月旨質(zhì)，例 如，心肌磷脂、二酰磷脂酰絲氨酸、二酰磷脂酸、N-琥珀酰磷脂酰乙胺 (N-琥珀酰PE)、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙二醇、 膽固醇琥珀酸等。
n張膜脂質(zhì)體或者SUV型脂質(zhì)體中，膜穩(wěn)定劑是為了使脂質(zhì)膜物理 性或者化學(xué)性穩(wěn)定、調(diào)節(jié)脂質(zhì)膜的流動(dòng)性而添加任意成分，其配量通常 是脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的總配量的10~ 50% (摩爾比)，優(yōu)選20~ 50°/ (摩爾 比)、更優(yōu)選30~ 50% (摩爾比)。
膜穩(wěn)定劑，例如，可以是固醇、甘油或者其脂肪酸酯等。固醇，可 以是與上述同樣的具體例，甘油的脂肪酸酯，例如，可以是甘油三酸酯、 三辛酸。
n張膜脂質(zhì)體或者SUV型脂質(zhì)體中，抗氧化劑是為了防止脂質(zhì)膜氧 化而添加的任意成分，其配量通常是脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的總配量的5~30% (摩爾比)，優(yōu)選10~30% (摩爾比)、更優(yōu)選20~30°/ (摩爾比)。
抗氧化劑，例如，可以是生育酚、丙烷基沒食子酸、抗壞血酸棕櫚 酸脂、丁基羥基曱苯等。
n張膜脂質(zhì)體或者SUV型脂質(zhì)體中，荷電物質(zhì)是為了賦予正電荷或 者負(fù)電荷而添加的任意成分，其配量通常是脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的總配量的 5~30%(摩爾比)，優(yōu)選10~ 20% (摩爾比)、更優(yōu)選10~ 15% (摩爾比)。
賦予正電荷的荷電物質(zhì)，例如，硬脂酰胺、油醇氨等的飽和或者不 飽和脂肪族胺；二油酰基三曱基氨基丙烷等的飽和或者不飽和陽(yáng)離子合 成脂質(zhì)等，賦予負(fù)電荷的荷電物質(zhì)，例如，可以是二(十六烷基)磷酸 酯、膽固醇琥珀酸、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
n張膜脂質(zhì)體或者SUV型脂質(zhì)體中，膜蛋白質(zhì)是為了維持脂質(zhì)膜的 構(gòu)造和賦予脂質(zhì)膜功能性而添加的任意成分，其配量通常是脂質(zhì)膜構(gòu)成 成分的總配量的0. 1 ~ 2%(摩爾比)，優(yōu)選0. 5~2%(摩爾比)、更優(yōu)選1 ~ 2% (摩爾比)。
膜蛋白質(zhì)，例如，可以是膜表面蛋白質(zhì)、膜內(nèi)蛋白質(zhì)等。 使帶正電或者帶負(fù)電粒子分別與帶負(fù)電或者帶正電SUV型脂質(zhì)體接 觸的條件沒有特別的限定，溫度通常為10~40°C、優(yōu)選20~3(TC， PH
通常為6, 5 ~ 8. 0、優(yōu)選為7. 0 ~ 7. 5，時(shí)間通常為1 ~ 20分鐘、優(yōu)選為5 ~ IO分鐘。接觸時(shí)使用的溶媒?jīng)]有特別的限定，例如，可以使用HEPES緩 沖液、生理鹽水、蔗糖溶液等。分散于溶媒中的帶負(fù)電或者帶正電SUV 型脂質(zhì)體的量通常相對(duì)于帶正電或者帶負(fù)電粒子過剩，例如，為理論上 封入帶正電或者帶負(fù)電粒子的最低限量所必需的帶負(fù)電或者帶正電SUV 型脂質(zhì)體的量的2~4倍量。
帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體如果和帶正電粒子接觸，帶正電粒子和帶負(fù)電 SUV型脂質(zhì)體通過靜電相互作用而結(jié)合，由多個(gè)帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體被 覆帶正電粒子。由此，形成含有帶正電粒子和與帶正電粒子靜電結(jié)合的 多個(gè)帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的帶負(fù)電復(fù)合物。此時(shí)，優(yōu)選形成g電位為 -20~-50mV的帶負(fù)電復(fù)合物，更優(yōu)選形成g電位為-20~-30mV的帶負(fù)電 復(fù)合物。由此，能夠用陽(yáng)離子有效處理與帶正電粒子靜電結(jié)合的帶負(fù)電 SUV型脂質(zhì)體。帶負(fù)電復(fù)合物的《電位能夠通過調(diào)節(jié)帶正電粒子以及帶 負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的g電位、粒徑等來(lái)調(diào)節(jié)。
帶正電SUV型脂質(zhì)體如果和帶負(fù)電粒子接觸，帶負(fù)電粒子和帶正電 SUV型脂質(zhì)體通過靜電相互作用而結(jié)合，由多個(gè)帶正電SUV型脂質(zhì)體被 覆帶負(fù)電粒子。由此，形成含有帶負(fù)電粒子和與帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合的 多個(gè)帶正電SUV型脂質(zhì)體的帶正電復(fù)合物。此時(shí)，優(yōu)選形成^電位為20~ 50mV的帶正電復(fù)合物，更優(yōu)選形成《電位為20 ~ 30mV的帶正電復(fù)合物。 由此，能夠用陰離子有效處理與帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合的帶正電SUV型脂 質(zhì)體。帶正電復(fù)合物的^電位能夠通過調(diào)節(jié)帶負(fù)電粒子以及帶正電SUV 型脂質(zhì)體的S電位、粒徑等來(lái)調(diào)節(jié)。
按照本發(fā)明的第一種方法，接著用陽(yáng)離子處理形成的帶負(fù)電復(fù)合物。 按照本發(fā)明的第 一種方法，接著用陰離子處理形成的帶正電復(fù)合物。 陽(yáng)離子沒有特別的限定，例如，可以是H+等的l價(jià)陽(yáng)離子；Ca2+、 Mg2+ 等的2價(jià)陽(yáng)離子；A廣等的3價(jià)陽(yáng)離子等。產(chǎn)生H+的物質(zhì)，例如，可以使 用鹽酸、醋酸等，產(chǎn)生Ca'+的物質(zhì)，例如，可以使用氯化鈣等，產(chǎn)生Mg" 的物質(zhì)，例如，可以使用氯化鎂等，產(chǎn)生A廣的物質(zhì)，例如，可以使用 氯化鋁等。
陰離子沒有特別的限定，例如，可以是0H—、 SO,、 P0A、離解型短 鏈脂肪酸等。產(chǎn)生H-的物質(zhì)，例如，可以使用氫氧化鈉等，產(chǎn)生S0,的 物質(zhì)，例如，可以使用硫酸鈉等，產(chǎn)生P0,的物質(zhì)，例如，可以使用磷 酸鈉等，產(chǎn)生離解型短鏈脂肪酸的物質(zhì)，例如，可以使用辛酸(CH3(CH2) 6C00H)等。
用陽(yáng)離子處理帶負(fù)電復(fù)合物的條件沒有特別的限定，溫度通常為 10~40°C、優(yōu)選20 30。C, pH通常為6. 5 ~ 8. 0、優(yōu)選為7.0~7. 5，時(shí) 間通常為1 20分鐘、優(yōu)選為5~10分鐘。陽(yáng)離子處理時(shí)使用的溶^ 某沒 有特別限定于水溶液，例如，可以使用HEPES緩沖液。溶媒中添加的陽(yáng) 離子的量可以按照陽(yáng)離子的性質(zhì)等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，通常為脂質(zhì)的50倍量 (陽(yáng)離子摩爾/脂質(zhì)摩爾)以上。
用陰離子處理帶正電復(fù)合物的條件沒有特別的限定，溫度通常為 10- 40°C、優(yōu)選20 ~ 30°C， pH通常為6. 5 ~ 8. 0、優(yōu)選為7. 0~ 7. 5,時(shí) 間通常為l-20分鐘、優(yōu)選為5 10分鐘。陰離子處理時(shí)使用的溶媒?jīng)] 有特別限定于水溶液，例如，可以使用HEPES緩沖液。溶媒中添加的陰 離子的量可以按照陰離子的性質(zhì)等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，通常為脂質(zhì)的50倍量 (陰離子摩爾/脂質(zhì)摩爾)以上。
如果用陽(yáng)離子處理帶負(fù)電復(fù)合物，與帶正電粒子靜電結(jié)合的帶負(fù)電 SUV型脂質(zhì)體的表面的負(fù)電荷消失，帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的表面的疏水 性增強(qiáng)，引起挨著的帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體之間的膜融合，帶正電粒子被 兩張脂質(zhì)膜被覆。此外，如果用陰離子處理帶正電復(fù)合物，與帶負(fù)電粒 子靜電結(jié)合的帶正電SUV型脂質(zhì)體的表面的正電荷消失，帶正電SUV型 脂質(zhì)體的表面的疏水性增強(qiáng)，引起挨著的帶正電SUV型脂質(zhì)體之間的膜 融合，帶負(fù)電粒子被兩張脂質(zhì)膜被覆。這樣，在帶正電或者帶負(fù)電粒子 的外側(cè)，重新形成了被覆帶正電或者帶負(fù)電粒子的兩張脂質(zhì)膜，此時(shí)， 兩張脂質(zhì)膜之間形成空間。
使用目的物質(zhì)的聚集物為帶正電或者帶負(fù)電粒子的時(shí)候，封入目的 物質(zhì)的聚集物，制作在被覆目的物質(zhì)的聚集物的兩張脂質(zhì)膜之間形成空 間的兩張膜脂質(zhì)體；使用n張膜脂質(zhì)體(n為大于1的整數(shù))為帶正電 或者帶負(fù)電粒子的時(shí)候，制作在被覆n張膜脂質(zhì)體的兩張脂質(zhì)膜之間形 成空間的(n+2)張膜脂質(zhì)體。
使用本發(fā)明的第 一種方法通過用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正電粒子得到的 脂質(zhì)體，通常帶負(fù)電。但是，根據(jù)帶負(fù)電復(fù)合物的？電位的大小、陽(yáng)離 子的種類等，也有帶正電的情況。使用本發(fā)明的第二種方法通過用兩張 脂質(zhì)膜被覆帶負(fù)電粒子得到的脂質(zhì)體，通常帶正電。但是，根據(jù)帶正電 復(fù)合物的g電位的大小、陰離子的種類等，也有帶負(fù)電的情況。
使用本發(fā)明的第一種方法或者第二種方法通過用兩張脂質(zhì)膜被覆帶 正電或者帶負(fù)電粒子得到帶正電脂質(zhì)體的時(shí)候，得到的帶正電脂質(zhì)體能 夠當(dāng)作本發(fā)明的第一種方法中的帶正電粒子；當(dāng)?shù)玫綆ж?fù)電脂質(zhì)體或者 中性電脂質(zhì)體的時(shí)候，用陽(yáng)離子物質(zhì)修飾該帶負(fù)電脂質(zhì)體或者中性電脂 質(zhì)體，制備帶正電脂質(zhì)體，制備的該帶正電脂質(zhì)體能夠能夠當(dāng)作本發(fā)明 的第一種方法中的帶正電粒子。這樣通過反復(fù)操作本發(fā)明的第一和/或第 二種方法，能夠控制脂質(zhì)膜的數(shù)量，制作多層膜脂質(zhì)體。
使用本發(fā)明的第一種方法或者第二種方法通過用兩張脂質(zhì)艇被覆帶 正電或者帶負(fù)電粒子得到帶負(fù)電脂質(zhì)體的時(shí)候，得到的帶負(fù)電脂質(zhì)體能
夠當(dāng)作本發(fā)明的第二種方法中的帶負(fù)電粒子；當(dāng)?shù)玫降氖菐д娭|(zhì)體 或者中性電脂質(zhì)體的時(shí)候，用陰離子物質(zhì)修飾該帶正電脂質(zhì)體或者中性 電脂質(zhì)體制備帶負(fù)電脂質(zhì)體，該帶負(fù)電脂質(zhì)體能夠當(dāng)作本發(fā)明的第二種 方法中的帶負(fù)電粒子。這樣通過反復(fù)操作本發(fā)明的第一和/或第二種方 法，能夠在已經(jīng)形成的兩張脂質(zhì)膜的外側(cè)形成新的兩張脂質(zhì)膜，能夠控 制脂質(zhì)膜的數(shù)量，制作多層膜脂質(zhì)體。而且，在已經(jīng)形成的兩張脂質(zhì)膜 的外側(cè)形成新的脂質(zhì)膜的時(shí)候，還保留著已經(jīng)形成的兩張脂質(zhì)膜以及該 兩張脂質(zhì)膜之間形成的空間。
根據(jù)本發(fā)明的第一或者第二種方法，向通過用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正 電或者帶負(fù)電粒子得到的脂質(zhì)體中，優(yōu)選封入目的物質(zhì)。目的物質(zhì)為需 要遞送到細(xì)胞內(nèi)或者核內(nèi)的物質(zhì)(例如核酸、肽、蛋白質(zhì)、藥物、糖、 它們的復(fù)合物等)的時(shí)候，封入目的物質(zhì)的脂質(zhì)體能夠可作為目的物質(zhì) 的細(xì)胞內(nèi)或者核內(nèi)遞送用載體。封入目的物質(zhì)的脂質(zhì)體，可通過使用目 的物質(zhì)的聚集物作為帶正電或者帶負(fù)電粒子，或，通過使用封入目的物 質(zhì)的n張膜脂質(zhì)體作為帶正電或者帶負(fù)電粒子得到。此外，能夠通過在 帶正電或者帶負(fù)電粒子的外側(cè)新形成的兩張脂質(zhì)膜之間保留目的物質(zhì) (例如通過保留含有目的物質(zhì)的液體)得到。
遞送目的物質(zhì)的細(xì)胞不局限于原來(lái)的生物種類，動(dòng)物、植物、微生 物等任意一個(gè)都可以，優(yōu)選動(dòng)物，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物，例如， 可以是人類、猿猴、牛、羊、山羊、馬、豬、兔、狗、貓、白鼠、老鼠、 土撥鼠等。此外，遞送目的物質(zhì)的細(xì)胞的種類沒有特別的限定，例如， 可以是體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞或者它們的培養(yǎng)細(xì)胞等。
封入目的物質(zhì)的脂質(zhì)體，例如，可以在分散液狀態(tài)下使用。分散溶 媒，例如，可以使用生理鹽水、磷酸緩沖溶液、枸櫞酸緩沖溶液、醋酸 緩沖溶液等的緩沖溶液。向分散液中，例如，可以添加糖類、多元醇、 水溶性高分子、非離子表面活性劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、水合促進(jìn)劑 等的添加劑來(lái)使用。
封入目的物質(zhì)的脂質(zhì)體，可以通過in vivo以及in vitro的任意一 個(gè)來(lái)使用。在通過in vivo使用的時(shí)候，給藥途徑，例如，可以是靜樂^、 腹腔內(nèi)、皮下、經(jīng)鼻等的非口服給藥，給藥量以及給藥次數(shù)按照封入脂 質(zhì)體的目的物質(zhì)的種類或者數(shù)量等能夠進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。 實(shí)施例
實(shí)施例1
(1 ) DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物的形成DNA以及多聚賴氨酸分別溶解于5mM HEPES緩沖劑(pH7. 4 )中。而 且，使用質(zhì)體DNA (含有在CMV促進(jìn)劑以及其下游連接有熒光素酶基因 全長(zhǎng)約7kbp的質(zhì)體DNA)。然后，混合DNA溶液(0. Img/mL)以及多聚 賴氨酸溶液(0. Img/mL),室溫下，用渦流攪拌，制備含有DNA/多聚賴 氨酸復(fù)合物的溶液。這樣制備得到的DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物的粒徑約 70~100nm, g電位約30~40mV。而且，根據(jù)準(zhǔn)彈性光散亂方法測(cè)定流 體力學(xué)的直徑，根據(jù)電泳的光散亂分光測(cè)光器(ELS-8000 )分析g電位 (以下相同)。
(2) SUV型脂質(zhì)體的制備
將蛋黃磷脂酰膽堿/膽固醇琥珀酸(9: 2(摩爾比))溶解于0.5mL 氯仿中，放置溶液于玻璃試管中。通過吹入氮?dú)獬ト苊胶?，放置干?器中干燥1小時(shí)。將得到的脂質(zhì)膜(0. 55微摩爾)用預(yù)先加熱到25。C的 lmL HEPES緩沖溶液水合，在超聲波槽內(nèi)用超聲波處理剝離脂質(zhì)膜。最 后用探針型超聲波裝置進(jìn)行10分鐘的超聲波處理，制備SUV型脂質(zhì)體。 這樣制備的SUV型脂質(zhì)體的粒徑約為50~100nm， g電位約30mV。
SUV型脂質(zhì)體的焚光標(biāo)識(shí)通過導(dǎo)入羅丹明(紅色)或考NBD (4-nitrobenzo-2-oxa-l， 3-diazole )標(biāo)識(shí)化二油酰磷脂酰乙胺(藍(lán)色) 來(lái)實(shí)現(xiàn)。此時(shí)，溶解水相標(biāo)識(shí)物羅丹明于水合脂質(zhì)膜的溶媒中UOmM)、 溶解脂質(zhì)標(biāo)識(shí)物NBD標(biāo)識(shí)化二油酰磷脂酰乙胺于氯仿溶液中(相當(dāng)于總 脂質(zhì)的0. 1摩爾％)。
(3) 由DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物的脂質(zhì)膜被覆
將500jaL的SUV型脂質(zhì)體添加到250jaL的DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物 溶液中，令兩者接觸。據(jù)此，形成含有DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物和與DNA/ 多聚賴氨酸復(fù)合物靜電結(jié)合的多個(gè)SUV型脂質(zhì)體的復(fù)合物。此復(fù)合物的 粒徑約為500 ~ 3000nm, g電位約為-30mV。并且，在室溫(25。C)下接 觸5分鐘。
接觸后，添加0. 1N鹽酸55 mL,用H+處理所述復(fù)合物。由此，與MA/ 多聚賴氨酸復(fù)合物靜電結(jié)合的SUV型脂質(zhì)體的表面的負(fù)電荷消失，SUV 型脂質(zhì)體的表面的疏水性增強(qiáng)，緊鄰的SUV型脂質(zhì)體之間發(fā)生膜融合。 H+處理后的粒徑約85 ~ 130nm， g電位約-20 ~-40mV。通過H+處理粒徑變 小，DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物靜電結(jié)合的SUV型脂質(zhì)體之間發(fā)生膜融合， 表明形成了封入有DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物的脂質(zhì)體。
H+處理后的懸濁液在不連續(xù)蔗糖密度梯度(0, 30, 60°/。)上分層， 在20。C、 160000g的條件下進(jìn)行2小時(shí)的離心分離。從上部開始每lmL 回收一個(gè)分離物，測(cè)定熒光強(qiáng)度。通過不連續(xù)蔗糖密度梯度離心分離回 收得到的分離物里面，DNA含量高的分離物作為含有脂質(zhì)體的分離物。
含有脂質(zhì)體的分離物，能夠從蔗糖30 - 60%部分(境界)回收得到。 實(shí)施例2
與實(shí)施例l同樣，用脂質(zhì)膜將DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物被覆，制備封 入有DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物的脂質(zhì)體(以下稱作第一脂質(zhì)體)。并且， 此時(shí)，使用NBD標(biāo)識(shí)脂質(zhì)(藍(lán)色)標(biāo)識(shí)后的物質(zhì)作為SUV型脂質(zhì)體。
向第一脂質(zhì)體的外液添加lmg/mL硬脂?；辆彼崛芤?2pL,通 過在室溫下放置30分鐘，將辛精氨酸(總脂質(zhì)的5摩爾％)導(dǎo)入至第一 脂質(zhì)體(以下稱為第二脂質(zhì)體)。并且，第一脂質(zhì)體的《電位為負(fù)(約 -30mV)，在第一脂質(zhì)體表面上導(dǎo)入辛精氨酸得到的第二脂質(zhì)體的^電位 為正(約30~ 50mV)。
與實(shí)施例l同樣，將SUV型脂質(zhì)體(粒徑約50 100nm, g電位 約-30mV，脂質(zhì)濃度Q. 55mM,添加量1. 5mL )添加到第二脂質(zhì)體溶液 (0.37mM， 750juL)中，令兩者接觸。據(jù)此，形成含有第二脂質(zhì)體和與 第二脂質(zhì)體靜電結(jié)合的多個(gè)SUV型脂質(zhì)體的復(fù)合物。并且，此時(shí)，使用 羅丹明熒光標(biāo)識(shí)內(nèi)水相后的物質(zhì)作為SUV型脂質(zhì)體。形成的復(fù)合物的粒 徑約為340 ~ 15 00nm，《電位約為-30mV。
接觸后，添加0. 1n鹽酸165mL，用H+處理所述復(fù)合物。由此，與 第二脂質(zhì)體靜電結(jié)合的SUV型脂質(zhì)體的表面的負(fù)電荷消失，SUV型脂質(zhì) 體的表面的疏水性增強(qiáng)，緊鄰的SUV型脂質(zhì)體之間發(fā)生膜融合。H+處理 后的粒徑約170~ 240nm， g電位約-60mV。通過H+處理粒徑變小，第二 脂質(zhì)體靜電結(jié)合的SUV型脂質(zhì)體之間發(fā)生膜融合，表明第二脂質(zhì)體被脂 質(zhì)膜被覆。
H+處理后的懸濁液在不連續(xù)蔗糖密度梯度(0， 5, 30%)上分層，在 2(TC、 160000g的條件下進(jìn)行2小時(shí)的離心分離。從上部開始每lmL回 收一個(gè)分離物。通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定各分離部分的DM的含量(參 照?qǐng)Dl(a))，同時(shí)測(cè)定羅丹明以及NBD的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出羅丹明含量 以及NBD含量(參照?qǐng)D1 (b))。
通過不連續(xù)蔗糖密度梯度離心分離回收得到的分離物里面，DM含 量高的分離物(分離物11)作為含有脂質(zhì)體的分離物。含有脂質(zhì)體的分 離物，能夠從蔗糖5~30%部分(境界)回收得到。
另外，在含有脂質(zhì)體的分離物中，NBD、羅丹明以及DNA共存，SUV 型脂質(zhì)體保留著含有羅丹明的內(nèi)水相進(jìn)行融合，在融合后的脂質(zhì)體中形 成了保留著含有羅丹明的內(nèi)水相的空間。
并且，含有脂質(zhì)體的分離物中，NBD和羅丹明之間的熒光能量沒有 觀察到移動(dòng)。第二脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜和含有NBD標(biāo)識(shí)化脂質(zhì)(藍(lán)色)，第二 脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜和含有羅丹明的內(nèi)水相沒有接觸。即，通過與第二脂質(zhì)
體靜電結(jié)合的suv型脂質(zhì)體之間的膜融合，第二脂質(zhì)體被兩張脂質(zhì)膜被
覆，含有羅丹明的內(nèi)水相保留在第二脂質(zhì)體外側(cè)新形成的兩張脂質(zhì)膜之
間的空間里。假如，如果通過與第二脂質(zhì)體靜電結(jié)合的SUV型脂質(zhì)體之
間的膜融合，第二脂質(zhì)體被一張脂質(zhì)膜被覆，含有羅丹明的內(nèi)水相保留 在第二脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜和第二脂質(zhì)體外側(cè)形成的脂質(zhì)膜之間，這樣，就
能夠觀察NBD和羅丹明之間的熒光能量移動(dòng)。另外，假如，通過與第二 脂質(zhì)體靜電結(jié)合的SUV型脂質(zhì)體之間的膜融合，如果第二脂質(zhì)體的脂質(zhì) 膜和SUV型脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜發(fā)生融合，(脂質(zhì)膜的數(shù)量無(wú)變化)、含有羅 丹明的內(nèi)水相保留在第二脂質(zhì)體內(nèi)部，這樣，就能夠觀察NBD和羅丹明 之間的熒光能量移動(dòng)。 實(shí)施例3
DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物被脂質(zhì)膜被覆，除了制備封入DNA/多聚賴氨 酸復(fù)合物的脂質(zhì)體(第一脂質(zhì)體)時(shí)、使用內(nèi)水相被羅丹明熒光標(biāo)識(shí)后 的物質(zhì)作為SUV型脂質(zhì)體這一點(diǎn)，以及，除了形成含有第二脂質(zhì)體和與 第二脂質(zhì)體靜電結(jié)合的多個(gè)SUV型脂質(zhì)體的復(fù)合物時(shí)，使用用NBD標(biāo)識(shí) 化脂質(zhì)熒光標(biāo)識(shí)的物質(zhì)這一點(diǎn)，與實(shí)施例2進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。
并且，根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果，第一脂質(zhì)體以及第二脂質(zhì)體中，DNA/ 多聚賴氨酸復(fù)合物被兩張脂質(zhì)膜被覆，這兩張脂質(zhì)膜之間保留著含有羅 丹明的內(nèi)水相。
r處理后的懸濁液在不連續(xù)蔗糖密度梯度(0， 5, 30%)上分層，在 20。C、 160000g的條件下進(jìn)行2小時(shí)的離心分離。從上部開始每lmL回 收一個(gè)分離物。通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定各分離部分的DNA的含量(參 照?qǐng)D2(a))，同時(shí)測(cè)定羅丹明以及NBD的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出羅丹明含量 以及NBD含量(參照?qǐng)D2 (b))。
通過不連續(xù)蔗糖密度梯度離心分離回收得到的分離物里面，DNA含 量高的分離物(分離物11)作為含有脂質(zhì)體的分離物。含有脂質(zhì)體的分 離物，能夠從蔗糖5~30%部分(境界)回收得到。
另外，在含有脂質(zhì)體的分離物中，NBD、羅丹明以及DNA共存，NBD 和羅丹明之間未觀察到熒光能移動(dòng)，與第二脂質(zhì)體靜電結(jié)合的SUV型脂 質(zhì)體發(fā)生膜融合時(shí)，第二脂質(zhì)體中存在著兩張脂質(zhì)膜之間形成的空間(存 在著含有羅丹明的內(nèi)水相的空間)。
實(shí)施例4
按照實(shí)施例l(l),形成DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物。并且，與實(shí)施例 1同樣使用質(zhì)體DNA(含有在CMV促進(jìn)劑以及其下游連接有熒光素酶基因 全長(zhǎng)約7037kbp的質(zhì)體DNA(含有在CMV促進(jìn)劑的pcDNA3. 1質(zhì)體中導(dǎo)入 熒光素酶基因的物質(zhì)))作為DM。
按照實(shí)施例1(2)，制備含有由蛋黃磷脂酰膽堿/膽固醇琥珀酸(9: 2 (摩爾比))構(gòu)成的脂質(zhì)膜的SUV型脂質(zhì)體(以下稱作第一 SUV型脂質(zhì) 體)、含有由二油酰磷脂酰乙胺/膽固醇琥珀酸(9: 2(摩爾比))構(gòu)成的 脂質(zhì)膜的SUV型脂質(zhì)體(以下稱作第二SUV型脂質(zhì)體)。
按照實(shí)施例l (3),使用第一 SUV型脂質(zhì)體將DNA/多聚賴氨酸復(fù)合 物用脂質(zhì)膜被覆，制備脂質(zhì)體A(兩張膜)。此外，使用第二SUV型脂質(zhì) 體將DNA/多聚賴氨酸復(fù)合物用脂質(zhì)膜被覆，制備脂質(zhì)體B(兩張膜)。另 外，使用第二S[JV型脂質(zhì)體將脂質(zhì)體A用脂質(zhì)膜被覆，制備脂質(zhì)體C(四 張膜)。另外，使用第一SUV型脂質(zhì)體將脂質(zhì)體B用脂質(zhì)膜被覆，制備脂 質(zhì)體D (四張膜)。
脂質(zhì)體A ~ D的外液中添加lmg/mL的^J旨?；辆彼崛芤?2 p L, 通過在室溫下放置30分鐘，將辛精氨酸(總脂質(zhì)的5摩爾％)導(dǎo)入至各 脂質(zhì)體表面。并且，通過向各脂質(zhì)體表面導(dǎo)入辛精氨酸，統(tǒng)一了全體脂
質(zhì)體向細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)路徑(微胞飲作用)。
將混懸有各脂質(zhì)體(相當(dāng)于DNAO. 4 ja g )的0. 25mL的不含血清的DMEM 培養(yǎng)基添加到在24孔板上培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞(4 x 104細(xì)胞/孔)，在37 。C孵化3小時(shí)。3小時(shí)后，加入10%小牛血清培養(yǎng)基lmL，再孵化45小 時(shí)。然后，溶解細(xì)胞，將熒光素酶活性測(cè)定試劑加入到細(xì)胞溶解液中， 用亮度計(jì)(LuminescencerPSN、 ATTO)測(cè)定熒光素酶的活性。使用BCA 蛋白質(zhì)定量?jī)x(PIERCE、羅克福德(IL))測(cè)定細(xì)胞溶解液中的蛋白質(zhì)舍 量。
其結(jié)果用圖3表示。如圖3所示，隨著構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜的組成、 數(shù)量等的變化，脂質(zhì)體的功能(導(dǎo)入基因的能力)發(fā)生變化。
權(quán)利要求
1.一種用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正電粒子的方法，其特征在于，使所述帶正電粒子與多個(gè)帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體接觸，形成含有所述帶正電粒子和已與所述帶正電粒子靜電結(jié)合的所述帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的帶負(fù)電復(fù)合物，用陽(yáng)離子處理所述帶負(fù)電復(fù)合物。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子為目的物 質(zhì)的聚集物。
3. 權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子為帶正電 n張膜脂質(zhì)體(n是大于1的整數(shù))。
4. 權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子的《電位 為20~ 30mV，所述帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的g電位為-20 ~-30mV。
5. 權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子的粒徑在 50nm以上。
6. —種用兩張脂質(zhì)膜被覆帶負(fù)電粒子的方法，特征在于， 使所述帶負(fù)電粒子與多個(gè)帶正電SUV型脂質(zhì)體接觸，形成含有所述帶負(fù)電粒子和已與所述帶負(fù)電粒子靜電結(jié)合的所述帶正電SUV型脂質(zhì)體 的帶正電復(fù)合物，用陰離子處理所述帶正電復(fù)合物。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電粒子為目的物 質(zhì)的聚集物。
8. 權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電粒子為帶負(fù)電 n張膜脂質(zhì)體(n是大于1的整數(shù))。
9. 權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電粒子的《電位 為-20~-30mV，所述帶正電SUV型脂質(zhì)體的《電位為20 ~ 30mV。
10. 權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電粒子的粒徑 在5 Onm以上。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正 電粒子得到的脂質(zhì)體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6至IO任一項(xiàng)所述的方法用兩張脂質(zhì)膜被覆帶負(fù) 電粒子得到的脂質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠用兩張其間形成空間的脂質(zhì)膜來(lái)被覆對(duì)象粒子的方法。為達(dá)到此目的，采用兩張脂質(zhì)膜被覆帶正電粒子的方法，其中使所述帶正電粒子與多個(gè)帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體接觸，形成含有由所述帶正電粒子和與所述帶正電粒子靜電結(jié)合的所述帶負(fù)電SUV型脂質(zhì)體的帶負(fù)電復(fù)合物，用陽(yáng)離子處理所述帶負(fù)電復(fù)合物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101107069SQ200680002579
公開日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2006年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日
發(fā)明者原島秀吉, 小暮健太朗, 箕浦愛麗莎 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人北海道大學(xué);塩野義制藥株式會(huì)社