專利名稱：：癌癥標(biāo)記物和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在受試者，如疑似患有癌癥的人血液中檢測(cè)癌癥標(biāo)記物的方法。本發(fā)明更詳細(xì)地涉及檢測(cè)轉(zhuǎn)移性癌癥或釋放標(biāo)記物進(jìn)入血液中的其它癌癥的方法。其可用于初始診斷和預(yù)后(prognosis)，治療指導(dǎo)以及治療或疾病的監(jiān)測(cè)?？衫脤?duì)應(yīng)于該癌癥標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑完成檢測(cè)。紐當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞功能障礙并且開始不受控制地生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生癌癥。這些障礙由細(xì)胞DNA藍(lán)圖(blueprint)中的突變引起。因此，早年間癌癥診斷關(guān)注可疑癌細(xì)胞的生長(zhǎng)性質(zhì)和物理外形時(shí)，而更現(xiàn)代的技術(shù)已開始檢查細(xì)胞的內(nèi)部運(yùn)轉(zhuǎn)。不是所有的癌癥由相同的突變引起。對(duì)引起癌癥的特定突變有作用的一些治療對(duì)具有其它類型突變的癌癥不起作用，并且如果不適當(dāng)?shù)亻_處方實(shí)際上可能產(chǎn)生更多損害。因此，至關(guān)重要的是區(qū)別不同類型癌癥的癌癥診斷能力與治療不同類型癌癥的能力適當(dāng)同步。當(dāng)前的診斷方法正努力配合新療法發(fā)展的速度。當(dāng)前癌癥診斷方法的另一個(gè)問題為需要組織樣品進(jìn)行分析。所有目前成功的癌癥診斷方法(而非純粹的成像)，需要從患者身體移出癌細(xì)胞。這些細(xì)胞大多數(shù)通常獲自組織活組織檢查。雖然組織活組織檢查有效，但其昂貴、耗時(shí)，并且對(duì)患者是痛苦的。另外，安排和獲得組織活組織檢查，隨后分析而需要的時(shí)間造成治療耽誤，并且活組織檢查過程本身可能將癌細(xì)胞釋放進(jìn)入血流中，引起增加的轉(zhuǎn)移。甚至更壞地，由于肺瘤位置的原因，有時(shí)組織活組織檢查是不合適的。那些情況中，癌癥確切的性質(zhì)直至已進(jìn)行手術(shù)并且除去腫瘤后才能確定。雖然這些手術(shù)后檢驗(yàn)對(duì)于指導(dǎo)患者進(jìn)一步的治療仍然有效，但如可預(yù)先確定腫瘤的性質(zhì)，可能更加可行的是在患者經(jīng)受手術(shù)的嚴(yán)酷之前嘗試非侵襲性治療，如化療。即使需要手術(shù)，患者仍然可能受益于更詳細(xì)的手術(shù)前診斷。所述診斷可能例如允許手術(shù)前用所設(shè)計(jì)藥物治療以將手術(shù)期間從肺瘤移出的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性分布的幾率減到最低程度。其還可能提供對(duì)于手術(shù)技術(shù)更大的指導(dǎo)，如腫瘤周圍多少組織要除去。目前，基于細(xì)胞的最成功的診斷方法中的一些利用非-活組織檢查樣品。例如，PAP涂片尋找細(xì)胞的不規(guī)則性，但其利用由身體正常丟棄的細(xì)胞。PAP涂片允許在變?yōu)樽訉m頸癌的過程中容易地且非常早期地進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，從而每年持續(xù)挽救數(shù)以千計(jì)的生命。由于與活組織檢查有關(guān)的問題以及更簡(jiǎn)單方法(如PAP涂片)的成功，醫(yī)學(xué)界已花費(fèi)數(shù)年利用另外的速效樣品，血液，尤其是外周血尋找癌癥的診斷法。他們的工作已獲得一定的成功。例如，利用血液檢驗(yàn)迅速地監(jiān)測(cè)前列腺癌的發(fā)展或復(fù)發(fā)。然而，當(dāng)前的基于血液的癌癥診斷法，如前列腺癌檢驗(yàn)，仍維持關(guān)注特定類型的癌癥。仍需要對(duì)能利用血液診斷多種癌癥或一般性癌癥的癌癥診斷法。除基于組織的癌癥診斷法之外，大多數(shù)診斷方法依賴成像技術(shù)，從簡(jiǎn)單的X射線至MRI以及核成像，常常利用靶向癌癥或靶向組織的造影劑以產(chǎn)生更好的圖像。然而，即使最有效的成像技術(shù)也無法檢測(cè)小于大約2-5mm直徑的腫瘤。等到腫瘤已達(dá)到該大小時(shí)，其包含數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞。此外，這些復(fù)雜的成像技術(shù)太昂貴，而不能在癌癥早期應(yīng)用，即不能在當(dāng)患者除了可很容易除去的小腫瘤外沒有其它癥狀時(shí)應(yīng)用。事實(shí)上，復(fù)雜的成像診斷法最常見用于已具有大原發(fā)腫瘤并且疑似具有發(fā)展的轉(zhuǎn)移性癌癥的患者。檢測(cè)的小腫瘤實(shí)際上是由于癌癥已散布而轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的。因此，不同于常常包含許多良性細(xì)胞的原發(fā)腫瘤，檢測(cè)的小肺瘤包含數(shù)以千計(jì)的惡性、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，每個(gè)能在體內(nèi)別處產(chǎn)生另一個(gè)腫瘤。明顯地，通過當(dāng)前成像技術(shù)的檢測(cè)小轉(zhuǎn)移性腫瘤確實(shí)是挽救垂?；颊叩淖詈蟮呐?。如果這些轉(zhuǎn)移性細(xì)胞可更早檢測(cè)，如當(dāng)它們首先開始經(jīng)過血液時(shí)，則患者可針對(duì)其可能患有的所有轉(zhuǎn)移性腫瘤開始接受治療，盡管那些腫瘤仍然太小而不能通過診斷顯象或任何其它的當(dāng)前技術(shù)檢測(cè)。因此存在對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤的更早診斷或?qū)D(zhuǎn)移性肺瘤很大增加可能性進(jìn)行檢測(cè)的需求。然而現(xiàn)代癌癥診斷中的另一個(gè)缺點(diǎn)涉及其與治療聯(lián)合的能力。雖然可通過組織樣品診斷一些常見的突變，并用其指導(dǎo)對(duì)患者癌癥類型的一定程度上特定的治療，但該方法只適用少數(shù)癌癥類型。目前沒有診斷方法能檢測(cè)各種各樣類型的癌癥或提供用于治療許多類型癌癥的詳細(xì)靼標(biāo)。最后，當(dāng)前的癌癥診斷法，尤其那些依賴組織活組織檢查的，在監(jiān)測(cè)進(jìn)展或治療有效性方面非常差。如果治療醫(yī)師能在所有或相當(dāng)大數(shù)目癌細(xì)胞或特定類型的癌細(xì)胞已經(jīng)根除時(shí)告知，可挽回?cái)?shù)千美元并且可能甚至是患者的生命。另外，通過其性質(zhì)，癌細(xì)胞能夠非常迅速地變化。因此，其甚至可以進(jìn)一步在治療期間突變，造成一度有用的藥物變成無效的或有害的。基本上，癌細(xì)胞可變得對(duì)藥物耐受，就像細(xì)菌變得對(duì)抗生素耐受一樣。癌癥治療將從能檢測(cè)顯示治療有效性或患者癌細(xì)胞更進(jìn)一步突變的這些和其它變化的診斷方法大大受益。概要本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)記物(marker)，尤其是通常用于癌癥的標(biāo)記物高集(hyperset)和用于特定類型癌癥的標(biāo)記物超集(superset)，以及該高集和超集的子集(subset)。本發(fā)明還涉及利用癌癥檢測(cè)試劑篩查血液或組織以檢測(cè)癌癥標(biāo)記物的方法。癌癥檢測(cè)試劑為至少17個(gè)堿基長(zhǎng)的短核酸，其具有確定與受試者中癌癥存在有關(guān)，而非與健康組織有關(guān)的特定序列。因此，本發(fā)明涉及基于病理學(xué)的診斷法。當(dāng)篩查血液時(shí)，可以是任何類型的血液，只要便于獲得樣品，大多數(shù)情況可利用外周血。雖然本發(fā)明的方面可用于檢測(cè)組織中的癌癥，由于從受試者獲得外周血樣品相對(duì)容易以及其代表整個(gè)動(dòng)物癌癥狀態(tài)而不是單個(gè)腫瘤的能力，說明書在此集中于外周血。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是如何采用設(shè)計(jì)用于外周血的技術(shù)而與其它血液或組織一起〗吏用。癌癥標(biāo)記物可包括細(xì)胞的細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄部分中的任何突變?？梢酝ㄟ^以癌癥細(xì)胞DNA或其mRNA為基礎(chǔ)，利用對(duì)應(yīng)于突變DNA區(qū)域或癌癥標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑進(jìn)行分析，來檢測(cè)這些突變。具體的實(shí)施方案中，PCR分析，微陣列分析，或基于珠粒(bead)的分析可用于癌癥標(biāo)記物分析。利用專用軟件檢查來自已知癌癥和癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并且與正常人轉(zhuǎn)錄本組序列比較，來鑒定癌癥標(biāo)記物和對(duì)應(yīng)的癌癥檢測(cè)試劑。因此，這些核酸序列代表與無癌癥的人轉(zhuǎn)錄本組相比的突變或異常。具體地，癌癥標(biāo)記物存在于來自癌癥的mRNA轉(zhuǎn)錄物中，并且在全部健康人轉(zhuǎn)錄本組中普遍缺乏。因?yàn)榘┌Y標(biāo)記物僅包括癌細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄序列，其與癌癥相關(guān)的突變對(duì)應(yīng)。所述突變可包括引起癌癥的體細(xì)胞突變，或其還可包括存在于受試者基因組中的極少的異常變化。對(duì)應(yīng)于這些癌癥標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑，可單獨(dú)或組合用于確定受試者癌癥;f示記物的分布型。癌癥檢測(cè)試劑可用于檢測(cè)癌癥并且用于監(jiān)測(cè)癌癥的進(jìn)程或其治療。另外，用癌癥檢測(cè)試劑的檢驗(yàn)可用于提供展示出存在于受試者內(nèi)部的一種或多種轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的數(shù)種突變或異常的癌癥標(biāo)記物分布型。重復(fù)檢驗(yàn)可檢測(cè)受試者癌癥標(biāo)記物分布型的變化，這可能指示不同轉(zhuǎn)移性細(xì)胞治療或開發(fā)的效力。癌癥標(biāo)記物中大量的為重復(fù)存在于不同癌癥mRNA轉(zhuǎn)錄本中的序列，由此給出癌癥標(biāo)記物一對(duì)多的遺傳關(guān)聯(lián)性。此意味著一種癌癥檢測(cè)試劑可檢測(cè)多個(gè)基因，每個(gè)具有相同的癌癥標(biāo)記物，并且檢測(cè)并不取決于單基因的表達(dá)水平。在體外和在原位，最后結(jié)果為增強(qiáng)的檢測(cè)能力，便于甚至在具有相對(duì)低數(shù)目轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的樣品中的檢測(cè)。將不會(huì)在每個(gè)癌癥患者的血液或腫瘤發(fā)現(xiàn)所有癌癥標(biāo)記物。反而，每個(gè)患者通常具有存在于其血液或腫瘤中的癌癥標(biāo)記物的子集。因?yàn)樵S多癌癥標(biāo)記物每種與一種或多種基因有關(guān)，這些子集自動(dòng)產(chǎn)生反映患者癌癥個(gè)體性的遺傳特征。在一具體的實(shí)施方案中，可提供常規(guī)的癌癥診斷法。具體而言，已確定雖然不同類型癌癥中的癌癥標(biāo)記物存在一些變化，但一些標(biāo)記物在多個(gè)類型的癌癥中非常常見。因此，提供包括這些標(biāo)記物的常規(guī)診斷分析。當(dāng)不知道受試者是否患有癌癥或患者可能患有的該類型癌癥時(shí)，所述分析尤其有用于常規(guī)篩查或早期診斷。另外，已確定了對(duì)某些類型的癌癥特異的癌癥標(biāo)記物，并且基于出現(xiàn)頻率對(duì)它們進(jìn)行了排序。例如，已定位了常常在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的59個(gè)標(biāo)記物的子集，并且將其用于建造癌癥檢測(cè)試劑。利用這些特異于癌癥類型的標(biāo)記物組，提供了用于特定類型癌癥的診斷分析。這些分析尤其可用于監(jiān)測(cè)現(xiàn)有癌癥的發(fā)展或治療。其還可用于在已知具有對(duì)特定類型癌癥敏感性的受試者中進(jìn)行常規(guī)診斷。最后，已在超過一個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)癌癥標(biāo)記物。因此，利用僅適合癌癥標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑的診斷分析在常規(guī)癌癥檢測(cè)中非常有效，但在了解哪些基因受影響的檢測(cè)中作用較小。對(duì)受影響基因的認(rèn)識(shí)可影響患者的預(yù)后或治療。因此，本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供基因-選擇性癌癥檢測(cè)試劑。一旦鑒定癌癥標(biāo)記物，即可迅速發(fā)展所述試劑。癌癥標(biāo)記物序列可位于給定的基因中，隨后野生型基因中發(fā)現(xiàn)的側(cè)翼序列可并入癌癥檢測(cè)試劑。優(yōu)選地，包括的側(cè)翼序列足夠長(zhǎng)到允許在維持與所進(jìn)行的分析類型相容的同時(shí)對(duì)具有受試者中癌癥標(biāo)記物突變的一個(gè)或多個(gè)基因加以鑒定。對(duì)存在于患者的癌細(xì)胞中的突變的認(rèn)識(shí)可用于指導(dǎo)治療。例如，可基于患者的癌癥的基礎(chǔ)突變，采用或避免已知僅對(duì)某些類型癌癥或某些基因中突變有效的藥物。另外，對(duì)患者特異性癌癥突變的認(rèn)識(shí)可用于開發(fā)新類別的癌癥藥物，包括靶向到已診斷的突變上的患者特異性癌癥藥物。這些靶向藥物可影響突變體蛋白質(zhì)，尤其細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，或它們可作用于細(xì)胞核酸如mRNA。附圖簡(jiǎn)述可通過參考下列與附圖結(jié)合的詳細(xì)說明更好地理解本發(fā)明，附圖闡述了本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案。圖1闡述了與來自健康細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本組的序列相比在LTBR基因中發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明的數(shù)種突變體癌癥標(biāo)記物。指出了單核苷酸多態(tài)性(SNP)的位置。圖2闡述了來自四種不同癌細(xì)胞系以及四種不同癌癥類型mRNA之間的比對(duì)的一部分，相對(duì)相應(yīng)來自17個(gè)不同基因的健康mRNA作圖。圖3闡述了檢測(cè)癌癥標(biāo)記物的方法。圖4闡述了樣品癌癥檢測(cè)試劑。圖5闡述了癌細(xì)胞系之間兩種常見癌癥標(biāo)記物存在的不一致。圖6闡述了單個(gè)癌癥標(biāo)記物和癌癥類型之間的相關(guān)性。圖7闡述了利用癌癥檢測(cè)試劑的PCR還原的方法。圖8呈現(xiàn)了在凝膠上對(duì)來自健康人和來自兩個(gè)癌癥受試者的肺瘤或血液樣品cDNA分析的PCR還原結(jié)果。圖9闡述了血液檢測(cè)和癌癥標(biāo)記物分型的方法。詳細(xì)說明本發(fā)明涉及利用分析以從受試者樣品中檢測(cè)癌癥標(biāo)記物的癌癥，尤其是受試者中轉(zhuǎn)移性癌癥的檢測(cè)。具體的實(shí)施方案中，可利用對(duì)應(yīng)于該癌癥標(biāo)i己物的癌癥檢測(cè)試劑完成檢測(cè)。用于本發(fā)明的癌癥檢測(cè)試劑主要以對(duì)應(yīng)于癌癥標(biāo)記物的短DNA或其它核酸寡聚物的形式存在。這些癌癥標(biāo)記物之前已全部呈現(xiàn)在人的癌癥組織中。其可包括立即產(chǎn)生癌癥的突變，可能提高癌癥傾向性的早期突變或基因的異常等位變體。許多位于細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄部分，尤其在基因的外顯子中。然而，本發(fā)明的癌癥標(biāo)記物可能還與其它的突變DNA區(qū)域?qū)?yīng)。另外，可利用檢測(cè)或擴(kuò)增樣品中mRNA或DNA的技術(shù)，來檢測(cè)樣品中的標(biāo)記物。然而，還可通過對(duì)其編碼的肽進(jìn)行分析來檢測(cè)標(biāo){己物，該肽可才艮據(jù)癌癥標(biāo)記物序列預(yù)測(cè)。癌癥檢測(cè)試劑可包括單鏈和互補(bǔ)的雙鏈核酸。用作癌癥檢測(cè)試劑以鑒定癌癥標(biāo)記物的核酸的合適形式對(duì)技術(shù)人員本領(lǐng)域是顯而易見的。>^瘙癥標(biāo)記參^婆定利用專用軟件以及來自公共數(shù)據(jù)庫(kù)記錄關(guān)于癌癥和健康細(xì)胞和組織的遺傳信息的信息來分離本發(fā)明的癌癥標(biāo)記物。具體地，利用專用軟件和巨型計(jì)算機(jī)，將來自癌細(xì)胞系的mRNA數(shù)據(jù)的隨機(jī)部分與來自全部健康細(xì)胞系的所有可用mRNA數(shù)據(jù)比較，如圖3中圖解的。該過程產(chǎn)生如圖1和圖2中的兩個(gè)癌癥標(biāo)記物數(shù)據(jù)庫(kù)。得到的數(shù)據(jù)庫(kù)稱為常規(guī)癌癥標(biāo)記物高集，其包含幾十萬癌癥標(biāo)記物的序列，其可以包含在長(zhǎng)度為17體或更長(zhǎng)的癌癥檢測(cè)試劑中，根據(jù)癌癥類型歸入超集。超集中的每種癌癥標(biāo)記物必須在對(duì)應(yīng)于超集癌癥類型的癌細(xì)胞中至少出現(xiàn)一次。由于癌癥標(biāo)記物通常在許多不同癌癥類型超集中出現(xiàn)，超集當(dāng)中存在冗余。全部癌癥高集中癌癥標(biāo)記物的總數(shù)不斷地增加。計(jì)算機(jī)軟件一般連續(xù)不停地運(yùn)行，每月添加數(shù)千個(gè)新的癌癥標(biāo)記物。此外，隨著新的癌癥產(chǎn)生，可創(chuàng)建新的癌癥標(biāo)記物。基于現(xiàn)行的數(shù)據(jù)，已知單一類型癌癥的超集可包含數(shù)以萬計(jì)的癌癥標(biāo)記物。由于用于分離包含癌癥標(biāo)記物的mRNA分子的細(xì)胞系是已知的，并且其從患有癌癥的人類受試者獲得，因此如圖4所示，可以對(duì)這些細(xì)胞系進(jìn)行計(jì)數(shù)，作為人中癌癥標(biāo)記物過去的存在。這產(chǎn)生了一種簡(jiǎn)單方法，用于以其在癌細(xì)胞系中過去的存在速率為基礎(chǔ)，對(duì)每種癌癥標(biāo)記物存在可能性加以排列。癌癥標(biāo)記物代表特殊種類癌癥的突變，該突變具有對(duì)癌細(xì)胞特有的核酸成分。如圖3所示，如果所述專有性并不存在，該突變不會(huì)認(rèn)為是癌癥標(biāo)記物。選擇癌癥標(biāo)記物的此條件產(chǎn)生檢測(cè)癌細(xì)胞遺傳學(xué)有用差異的癌癥檢測(cè)試劑。此為用于診斷和治療癌癥的重要標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的癌癥標(biāo)記物和檢測(cè)試劑通常是小的并且因此不適合用于基因組作圖。然而，可對(duì)包含未分離癌癥標(biāo)記物的mRNA分子作圖。如此，可確定哪些基因與每種癌癥標(biāo)記物相關(guān)。許多基因可能與每種癌癥標(biāo)記物相關(guān)基因數(shù)目通常與包含公共數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的每種癌癥標(biāo)記物的特有mRNA分子的數(shù)目直接相關(guān)。有時(shí)，數(shù)據(jù)庫(kù)中有數(shù)百種mRNA分子包含癌癥標(biāo)記物，產(chǎn)生數(shù)以百計(jì)的作圖基因。此在表1和2中很明顯。雖然許多癌癥標(biāo)記物位于目前對(duì)癌癥沒有已知的重大意義的基因中，但一些位于已知對(duì)癌癥重要的基因中。這些癌癥標(biāo)記物常常代表SNP，含義模糊的剪接和其它的遺傳缺陷。例如，圖1闡述了發(fā)現(xiàn)于淋巴細(xì)胞毒素P受體(LTBR)基因中的癌癥檢測(cè)試劑。圖1顯示在患有不同類型癌癥的不同受試者中，相同的點(diǎn)突變存在于相同的基因中。具體地，圖1顯示了來自八個(gè)不同癌細(xì)胞系以及六個(gè)不同癌癥類型LTBRmRNA之間的比對(duì)部分，相對(duì)對(duì)應(yīng)的健康LTBRmRNA作圖。如圖所示，八個(gè)癌癥LTBR相互之間以及健康LTBR之間稍微不同。然而在位置6959bp，癌癥LTBR改變相同，每種缺失鳥噪呤(G)并且產(chǎn)生相同的癌癥標(biāo)記物，CCTGAGCAAACCTGAGC。該標(biāo)記物在細(xì)胞的LTBR核酸中的存在為癌癥存在的指標(biāo)。此為一對(duì)一的遺傳關(guān)聯(lián)。圖2表明相同的癌癥標(biāo)記物可由患有不同類型癌癥的不同受試者中不同基因中的不同突變引起。具體地，圖2顯示了來自四種不同癌細(xì)胞系以及四種不同癌癥類型mRNA之間的比對(duì)部分，相對(duì)對(duì)應(yīng)的來自17種不同基因的健康mRNA作圖。各基因的突變有所變化，但最后結(jié)果為相同的癌癥標(biāo)記物，CGCATGCGTGGCCACCA存在于每個(gè)基因中。此標(biāo)記物在17種基因的每個(gè)中的存在是相應(yīng)細(xì)胞或組織中癌癥存在的指標(biāo)。此序列具有一對(duì)多的遺傳關(guān)聯(lián)。圖1和圖2中顯示的癌癥標(biāo)記物并不依賴于出現(xiàn)標(biāo)記物的基因中或這些基因表達(dá)的組織中任何常見的功能性。此外，健康的人轉(zhuǎn)錄本組中還未發(fā)現(xiàn)癌癥標(biāo)記物。因此這些標(biāo)記物在任^TmRNA轉(zhuǎn)錄物(而不僅僅是圖中所示的那些來自基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物中)的存在是宿主細(xì)胞中癌癥存在的指標(biāo)。由于該序列代表癌細(xì)胞特有的mRNA，其反映癌癥相關(guān)的突變。同時(shí)，如果檢測(cè)到，立即可知道哪個(gè)組的基因可能包含他們。癌癥標(biāo)記物可為許多基因和許多癌癥所共有。這并不意味著每種癌癥標(biāo)記物將存在于每種癌細(xì)胞系或癌癥受試者中。圖5中展示了兩種癌癥標(biāo)記物和其存在于其中的癌細(xì)胞系。##遂^標(biāo)記參于桌對(duì)癌癥標(biāo)記物高集和超集的分析揭示各種不同類型的癌癥中常常發(fā)現(xiàn)許多癌癥標(biāo)記物。因此這些癌癥標(biāo)記物可作為常規(guī)癌癥標(biāo)記物被鑒定。常規(guī)癌癥標(biāo)記物已被鑒定，并且包括在表1和2內(nèi)。這些癌癥標(biāo)記物開始被鑒定為高頻率結(jié)腸癌標(biāo)記物，它們也可用于該目的。表1和2列表了結(jié)腸癌超集中最高等級(jí)的59種癌癥標(biāo)記物。這外種癌癥標(biāo)記物組成高頻率的結(jié)腸癌標(biāo)記物子集。還顯示了相關(guān)基因。組合后，表中呈現(xiàn)了超過1000種基因。這表明當(dāng)以檢測(cè)能力使用時(shí)，59種結(jié)腸癌標(biāo)記物可檢測(cè)超過1000種基因的突變通過其一對(duì)多的遺傳關(guān)聯(lián)合適產(chǎn)生的靈敏度。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>AIPL1(17)AKT1(14)ALDOA(16)ANAPC2(9)ANKRD19(9APOE(19)ARHGDIA(17)ARHGEF1(19)ARHGEF16(1ARL6IP4(12)ARPC2(2)ASPH(8)llASRGLl(ll)ASS(9)ATF4(22AZ2(3)bA395L14.12(2)BAT3(6)BCAS3(17)BLP1(8)BRMSl(llBSG(19)BTF3(5)C10orf45(10)C14orfl26(14)C20orf41(202orfl7(2)C3orf4(3)C4orf9(4)C5orf6(5)C6.1A(X)C6orfl07(66orfl1(6)C6orf48(6)C7orf30(7)CACNA2D3(3)CAMKK2(12CASP4(11)CASQl(l)CBS(21)CBX7(22)CBX8(17)CCND3(6CCT3(1)CCT5(5)CCT6A(7)CCT7(2)CD74(5)CD79A(19CD79B(17)CDC20(1)CDC2L2(1)CDCA5(11)CDCA8(1)CDH12(5CDH24(14)CDIPT(16)CDK4(12)CDW92(9)CEECAM1(9CENPB(20)CGI-96(22)CHCHD3(7)CIDEB(14)CNOT10(3COMT(22)OR01A(16)COR02A(9)COTL1(16)CRN(4)CRTAP(3CRYBB2P1(22)CS(12)CTAG3(6)CYB5-M(16)DBH(9)DBI(2DCLRE1C(10)DCTN2(12)DDBl(ll)DDX10(11)DDX56(7DGCR8(22)DGKA(12)DHCR24(1)DKFZp434B227(3DKFZP434C171(5)DKFZP434K046(16)DKFZP564D172(5DKFZp564K142(X)DKFZp586M1819(8)DNAJB1(19)DNCH1(14D匪2(19)DRIM(12)DustyPK(l)E1B-AP5(19)E2F4(16elF3k(19)EIF3S1(15)EIF3S2(1)EIF3S5(11)EIF3S7(22)EIF3S8(16EIF3S9(7)EIF4G1(3)ELM02(20)ENDOG(9)ENOl(l)ENOlP(lENTPD8(17)EPAC(12)ETFDH(4)FAH(15)FAM31B(1)FANCA(16FBL(19)FBX07(22)FDFT1(8)FECH(18)FGFR4(5)FKBP1B(2FKBP8(19)FKSG17(8)FLIl(ll)FLJ00038(9)FLJ10241(19FLJ22688(19)FLJ25222(15)FLJ27099(14)FLJ31121(5)FLJ32452(12)FLJ35827(11)FLJ38464(9)FLJ44216(5)FMN2(1)FM05(1)FOSLl(ll)FSCN1(7)FUS(16)G22P1(22)G2AN(11)GA17(11)GALK2(15)GAPD(12)GCC1(7)GCDH(19)GDI2(10)GA1(22)GGCX(2)GIT1(17)GLUL(l)GNB2L1(5)GOLGB1(3)GPAA1(8)GPI(19)GRHPR(9)GRSF1(4)GSPT1(16)GSTM4(1)GYS1(19)H3F3B(17)HAND1(5)HARS2(20)HAXl(l)HCA127(X)HCCR1(12)HCG4(6)HDACl(l)HDLBP(2)HLA-B(6)HMGA1(6)HMGA1L3(12)HMGN1(21)HMGN2(1)HNRPD(4)HNRPH3(10)HNRPU(l)HPS4(22)H畫T1L1(21)HS3ST4(16)HSA9761(5)HSPA9B(5)HSPB1(7)HSPC142(19)HSPC242(22)HSPCB(6)HSPCP1(4)HSPD1(2)ID3(1)IER3(6)IGFBP4(17)IGHV4-34(14)JM4(X)K-ALPHA-1(12)KCNN2(5)KCTD1(18)KHSRP(19)KIAA0141(5)KIAA0182(16)KIAA0258(9)KIAA0582(2)KIAA0774(13)KIAA1049(16)KIAA1055(15)KIAA1115(19)KIAA1211(4)KIAA1765(3)KNS2(14)KPNB1(17)KRT17(17)KRT5(12)KRT8(12)LAMR1P3(14)LARGE(22)LASP1(17)LCP1(13)LDHB(12)LDHBP(X)LENG5(19)LGALS1(22)LGALS3BP(17)LIMK2(22)LIN28(1)LM07(13)LOC113174(11)LOC127253(1)LOC129138(22)LOC136337(X)LOC137829(1)LOC144581(12)LOC145414(14)LOC145989(15)LOC146253(16)LOC148640(1)LOC149501(1)LOC150417(22)LOC158078(9)LOC192133(14)LOC201292(17)LOC220717(2)LOC221838(7)LOC253482(9)LOC266724(2)LOC266783(1)LOC283747(15)LOC283820(16)LOC284089(17)LOC284393(19)LOC285214(3)LOC285741(6)LOC285752(6)LOC286444(X)LOC339395(1)LOC339799(2)LOC342705(18)LOC348180(16)LOC374443(12)LOC387703(10)LOC388076(15)LOC388344(17)LOC388519(19)LOC389181(3)LOC389240(4)LOC389342(5)LOC389849(X)LOC389901(X)LOC3卯415(13)LOC390814(17)LOC3卯860(18)LOC391634(4)LOC391717(4)LOC391739(5)LOC391800(5)LOC399942(11)LOC399969(11)LOC400068(12)LOC400586(17)LOC400634(17)LOC400744(1)LOC400954(2)LOC400963(2)LOC401010(2)LOC401146(4)LOC401245(6)LOC401316(7)LOC401677(11)LOC401838(16)LOC402057(22)LOC402142(3)LOC402259(7)LOC402579(7)LOC402650(7)LOC51149(5)LOC91272(5)LOC92755(8)LPPR2(19)LSPl(ll)LU(19)LY6E(8)M6PRBP1(19)MAGED1(X)MAMDC2(9)MAP3K4(6)MAPRE1(20)MGAT4B(5)MGC10540(17)MGC10986(17)MGC11061(2)MGC12966(7)MGC19764(17)MGC20446(11)MGC2601(16)MGC2714(11)MGC2749(19)MGC29816(8)MGC3162(12)MGC35555(8)MGC4606(16)MGC48332(5)MGC52000(2)MGC5508(11)MGC71999(17)MGST2(4)MRPL2(6)MRPL28(16)MSN(X)MSNL1(5)MUS81(11)MVP(16)MYBL2(20)MYCT1(6)NACA(12)NAP1L1(12)NARF(17)NARS(18)NCOA4(10)NDE1(16)NDUFA10(2)NDUFAB1(16)NDUFB9(8)NDUFS1(2)NDUFS2(1)NICE-3(1)NICE-4(1)NME1(17)NME3(16)NONO(X)NPM1(5)NQ02(6)NRBF2(10)NRBP(2)NS(3)NUDT8(11)NUP210(3)NUTF2(16)NUTF2P2(14)NXFl(ll)OAZ1(19)OK/SW-cl.56(6)OS-9(12)OSBPL9(1)PBP(12)PCCA(13)PCOLCE2(3)PDAP1(7)PDHA1(X)PDXP(22)PEA15(1)PECI(6)Pfs2(16)PGD(l)PGK1(X)PH-4(3)PHGDH(l)PIGT(20)PIK4CA(22)PKD1P3(16)P認(rèn)2(15)PKM2(15)PLEKHA4(19)PM5(16)PMM2(16)POLDIP3(22)POLE3(9)POLH(6)POLR2E(19)POLR2H(3)POU2F1(1)PPFIBP2(11)PPIE(l)PPOX(l)PPP1R15A(19)PPP1R8(1)PPP2R1A(19)PPP4C(16)PRAME(22)PRDXl(l)PRKACA(19)PSME1(14)PSPC1(13)PTBP1(19)PTPN6(12)PTPRCAP(llPTPRD(9)PTPRG(3)PTTG1IP(21)PYCR1(17)RAB32(6RAE1(20)RALGDS(9)RAN(12)RANP1(6)RARS(5)RASAL1(12RBBP7(X)RDH11(14)REC14(15)RERl(l)RFC2(7)RGS16(1RHEBL1(12)RIOK1(6)RNF10(12)RNF20(9)RNF8(6)RoXaN(22RPL24(3)RPL28(19)RPL3(22)RPL30(8)RPL35(9)RPL35A(3RPL37A(2)RPL37AP1(20)RPL5(1)RPL8(8)RPL9(4)RPLP0(12RPLP0P2(11)RPLP2(11)RPS10(6)RPS14(5)RPS15(19)RPS16(19RPS17(15)RPS17P2(5)RPS19(19)RPS19P1(20)RPS2(16)RPS20(8RPS20P3(5)RPS2L1(20)RPS3(11)RPS6(9)RPS9(19)RPS9P2(22RRP4(9)RRP40(9)RTKN(2)RUVBL1(3)RUVBL2(19)S100A16(1SAFB(19)SARS(l)SART3(12)SATB1(3)SBDS(7)SCD(IOSCYLl(ll)SEC31L1(4)SFRS2(17)SH2D3A(19)SH3BP1(22SH3BP5(3)SHMT2(12)SIAHBP1(8)SIN3A(15)SKB1(14SLC25A3(12)SLC25A6(X)SLC25A6(Y)SLC7A5(16)SMARCA4(19SMARCB1(22)SNRPA(19)SNRPA1(15)SNRPB(20)SNRPC(6SNX17(2)SNX6(14)SOD1(21)SPINT1(15)SPPL2B(19)SRP14(15ST7(7)STAG3(7)STAMBP(2)STARD7(2)STAT6(12)STIMl(llSTK33(11)STMNl(l)STXBP2(19)SUPT16H(14)SUPT5H(19SV2A(1)SV2C(5)TADA2L(17)TADA3L(3)TAF11(6)TAGLN2(1TCEB1(8)TCL1A(14)TD-60(1)TDPX2(9)TIC(2)Tino(19TIP120A(12)TK1(17)TMEM4(12)TMSB4X(X)TOR3A(1)TPI1(12TPK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CCTCG結(jié)腸直腸、肺、腦、皮膚、胰腺、淋巴、目艮靶基因ACTB(7)ADCY6(12)BID(22)EIF3S6IP(22)EIF3S8(16)K-ALPHA-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>靶基因EEF1A1(6)LOC401146(4)42,潛J^f標(biāo)記參子桌斧f/參3癌癥寡聚體+CCTCTGTTAATCTCCTGTTACA-TGTAACAGGAGATTAACAGAGG引物寡聚體+CCTCTGTTAATCTCCTGTT-AACAGGAGATTAACAGAGG參照組織結(jié)腸—14528—155癌癥溫度62。C引物溫度54*C5癌癥寡聚體+GCCCAAGGAACCCCCTT-AAGGGGGTTCCTTGGGC參照組織結(jié)腸_52909_1157癌癥溫度561CG癌癥寡聚體+GACTGAATGCACCCAATATCCGACCTGGCTGCGTGT-ACACGCAGCCAGGTCGGATATTGGGTGCATTCAGTC引物寡聚體+GACTGAATGCACCCAATAT-ATATTGGGTGCATTCAGTC參照組織結(jié)腸—7084—373癌癥溫度112TC引物溫度54TC7癌癥寡聚體+CACCCTCTGTTAATCTCCTGTTACA-TGTAACAGGAGATTAACAGAGGGTG引物寡聚體+CACCCTCTGTTAATCTCC-GGAGATTAACAGAGGGTG參照組織結(jié)腸—14528_154癌癥溫度72TC引物溫度54*C8癌癥寡聚體+GCTCAGGTTTGCTCAGG-CCTGAGCAAACCTGAGC參照組織結(jié)腸_22882—6癌癥溫度54TC9癌癥寡聚體+TGTGCTTCTGGCAGGCC-GGCCTGCCAGAAGCACA參照組織結(jié)腸_46693_132癌癥溫度561C10癌癥寡聚體+ACCTGGGATCCAGTTGGAGGACGGC-GCCGTCCTCCAACTGGATCCCAGGT引物寡聚體:參照+ACCTGGGATCCAGTTGG-CCAACTGGATCCCAGGT組織結(jié)腸—38162—1403癌癥溫度821C引物溫度54"Cll癌癥寡聚體+CGCATGCGTGGCCACCA-TGGTGGCCACGCATGCG組織結(jié)腸_41436_2209癌癥溫度58*C12癌癥寡聚體:參照13癌癥寡聚體:引物寡聚體14癌癥寡聚體:引物寡聚體參照15癌癥寡聚體:引物寡聚體+CCCAGCAGGGACATCCG-CGGATGTCCCTGCTGGG組織結(jié)腸_134925_1443癌癥溫度58TC+GGCTAGGTACGAGGCTGG-CCAGCCTCGTACCTAGCC+GGCTAGGTACGAGGCTG-CAGCCTCGTACCTAGCC組織結(jié)腸_121812_797癌癥溫度601C引物溫度56TC+GGCTGGTGTTAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTAACACCAGCC+GGCTGGTGTTAATCGGC-GCCGATTAACACCAGCC組織結(jié)腸—122287—1352癌癥溫度721C引物溫度54*C+GGGGGTGAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTCACCCCC+GGGGGTGAATCGGCCG參照16癌癥寡聚體:引物寡聚體17癌癥寡聚體:引物寡聚體-CGGCCGATTCACCCCC組織結(jié)腸—122308—1392癌癥溫度661C引物溫度56匸+GCTGGGTGTGAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTCACACCCAGC+GCTGGGTGTGAATCGGC-GCCGATTCACACCCAGC組織結(jié)腸—123371—2691癌癥溫度741C引物溫度56匸+AGGTACGAGGCCGGGTGTT-AACACCCGGCCTCGTACCT+AGGTACGAGGCCGGGT-ACCCGGCCTCGTACCT組織結(jié)腸一124205_4458癌癥溫度62r引物溫度54*C18癌癥寡聚體+GTGTTAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTAACAC組織結(jié)腸_124503_5628癌癥溫度54*C19癌癥寡聚體:參照20癌癥寡聚體:引物寡聚體+AGATGGGTACCAACTGT-ACAGTTGGTACCCATCT組織結(jié)腸—132239—12738癌癥溫度50"C+CGGCTAGGTACGAGGCTGGGGT-ACCCCAGCCTCGTACCTAGCCG+CGGCTAGGTACGAGGC—GCCTCGTACCTAGCCG參照21癌癥寡聚體:引物寡聚體組織結(jié)腸—124479—5522癌癥溫度741C引物溫度54"C+GAGGCGGGTGTGAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTCACACCCGCCTC+GAGGCGGGTGTGAATCG-CGATTCACACCCGCCTC組織結(jié)腸—124382—5017癌癥溫度821C引物溫度56*C22癌癥寡聚體+AGGTACGAGGCCGGTGT-ACACCGGCCTCGTACCT組織結(jié)腸_124545—5835癌癥溫度561C23癌癥寡聚體:引物寡聚體+GTTAATCGGCCGAGGCGC-GCGCCTCGGCCGATTAAC+GTTAATCGGCCGAGGCG-CGCCTCGGCCGATTAAC組織結(jié)腸_124554_5891癌癥溫度60"C引物溫度56匸24癌癥寡聚體+AGACCAACAGAGTTCGG-CCGAACTCTGTTGGTCT組織結(jié)腸一128799—3222癌癥溫度521C25癌癥寡聚體:引物寡聚體參照+TGGCTTCGTGTCCCATGCA-TGCATGGGACACGAAGCCA+TGGCTTCGTGTCCCATG-CATGGGACACGAAGCCA組織結(jié)腸128901342726癌癥寡聚體引物寡聚體參照27癌癥寡聚體引物寡聚體參照28癌癥寡聚體參照29癌癥寡聚體引物寡聚體參照30癌癥寡聚體:引物寡聚體癌癥溫度601C引物溫度54"C+CCGGGTGTAAATCGGCCGA-TCGGCCGATTTACACCCGG+CCGGGTGTAAATCGGCC-GGCCGATTTACACCCGG組織結(jié)腸—121791—713癌癥溫度621C引物溫度56*C+GCCGGTGTGAATCGGCCGA-TCGGCCGATTCACACCGGC+GCCGGTGTGAATCGGC-GCCGATTCACACCGGC組織結(jié)腸_122271—1321癌癥溫度641C引物溫度541C+TCATGATGGTGTATCGATGA-TCATCGATACACCATCATGA組織結(jié)腸—122810_2119癌癥溫度56TC+GCTCGGTGTTAATCGGCCGA-TCGGCCGATTAACACCGAGC+GCTCGGTGTTAATCGGC-GCCGATTAACACCGAGC組織結(jié)腸—123361—2652癌癥溫度64TC引物溫度54"C+TGGGGTTAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTAACCCCA+TGGGGTTAATCGGCCGA-TCGGCCGATTAACCCCA參照組織結(jié)腸—123408_2783癌癥溫度62"C引物溫度541C31癌癥寡聚體+AGGCCGGTGTTAATCGGCCGA-TCGGCCGATTAACACCGGCCT引物寡聚體+AGGCCGGTGTTAATCGG-CCGATTAACACCGGCCT參照組織結(jié)腸—124428_5212癌癥溫度68"C引物溫度54"C32癌癥寡聚體+TGGTGAATCGGCCGAGGGT-ACCCTCGGCCGATTCACCA引物寡聚體+TGGTGAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTCACCA參照組織結(jié)腸_124548_5844癌癥溫度62TC引物溫度56TC33癌癥寡聚體+AGCAAGTATGACAACAGC-GCTGTTGTCATACTTGCT參照組織結(jié)腸一124841—107癌癥溫度52TC34癌癥寡聚體+CTTAAACCAAGCTAGCC-GGCTAGCTTGGTTTAAG參照組織結(jié)腸_125327一1240癌癥溫度50"C35癌癥寡聚體+CAGTCTACATCACGTGG-CCACGTGATGTAGACTG參照組織結(jié)腸_131175_9725癌癥溫度52TC36癌癥寡聚體參照37癌癥寡聚體參照38癌癥寡聚體引物寡聚體參照39癌癥寡聚體參照40癌癥寡聚體參照41癌癥寡聚體參照+AATCTCCTGTTACACTCA-TGAGTGTAACAGGAGATT組織結(jié)腸—131332—10159癌癥溫度501C+GCCCAAGGAACCCCCTT-AAGGGGGTTCCTTGGGC組織結(jié)腸_52卯9—1157癌癥溫度561C+GGCTAGGACGAGGCCGGG-CCCGGCCTCGTCCTAGCC+GGCTAGGACGAGGCCG-CGGCCTCGTCCTAGCC組織結(jié)腸一121817_833癌癥溫度64TC引物溫度561C+GAGAAGGTTCCCGGGAA-TTCCCGGGAACCTTCTC組織結(jié)腸—123283—2553癌癥溫度54"C+GTGTTACTCGGCCGAGG-CCTCGGCCGAGTAACAC組織結(jié)腸一123389—2740癌癥溫度561C+TTGAATCGGCCGAGGGTG-CACCCTCGGCCGATTCAA組織結(jié)腸—124408—5119癌癥溫度58TC42癌癥寡聚體+GCCGGGTGGTGAATCGG-CCGATTCACCACCCGGC參照組織結(jié)腸—124566—5929癌癥溫度58"C43癌癥寡聚體+GCCGGTGGTTAATCGGC-GCCGATTAACCACCGGC參照組織結(jié)腸—124579—5999癌癥溫度56TC44癌癥寡聚體+GGGCGCAGCGACATCAG-CTGATGTCGCTGCGCCC參照組織結(jié)腸_128875_3358癌癥溫度58*C45癌癥寡聚體+GCTATTAGCAGATTGTGT-ACACAATCTGCTAATAGC參照組織結(jié)腸_130347_7716癌癥溫度50*C46癌癥寡聚體+TGTTAATCTCCTGTTACACTCA-TGAGTGTAACAGGAGATTAACA引物寡聚體+TGTTAATCTCCTGTTACACT-AGTGTAACAGGAGATTAACA參照組織結(jié)腸_131332_10158癌癥溫度60TC引物溫度54匸47癌癥寡聚體+CCACCGCACCGTTGGCC-GGCCAACGGTGCGGTGG引物寡聚體+CCACCGCACCGTTGGC-GCCAACGGTGCGGTGG參照組織結(jié)腸—131939—11900癌癥溫度60TC引物溫度56TC48癌癥寡聚體:參照+ACCTGGAGCCCTCTGAT-ATCAGAGGGCTCCAGGT組織結(jié)腸—132839—14455癌癥溫度541C49癌癥寡聚體+TCAGACAAACACAGATCG-CGATCTGTGTTTGTCTGA參照組織結(jié)腸一133990_18461癌癥溫度52TC引物溫度52*C50癌癥寡聚體+GAGAATACTGATTGAGACCTA-TAGGTCTCAATCAGTATTCTC組織結(jié)腸_134014—18566癌癥溫度58TC51癌癥寡聚體:引物寡聚體參照52癌癥寡聚體:參照53癌癥寡聚體:引物寡聚體+CCAGCCAGCACCCAGGC-GCCTGGGTGCTGGCTGG+CCAGCCAGCACCCAGG-CCTGGGTGCTGGCTGG組織結(jié)腸—78026_722癌癥溫度60TC引物溫度56TC+TAGACCAACAGAGTTCC-GGAACTCTGTTGGTCTA組織結(jié)腸—121771—670癌癥溫度50TC+CTAGGTACGAGGCTGGGTTTT-AAAACCCAGCCTCGTACCTAG+CTAGGTACGAGGCTGGG-CCCAGCCTCGTACCTAG參照組織結(jié)腸_121801_753癌癥溫度641C引物溫度56匸54癌癥寡聚體+CGAGGCGGGTGTTAATCGGCC-GGCCGATTAACACCCGCCTCG引物寡聚體+CGAGGCGGGTGTTAATC-GATTAACACCCGCCTCG參照組織結(jié)腸_123056—2392癌癥溫度70TC引物溫度54*C55癌癥寡聚體+AAGGCTAGGTAGAGGCTG-CAGCCTCTACCTAGCCTT參照組織結(jié)腸_123353—2625癌癥溫度56"C56癌癥寡聚體+CATGGCCATGCTGTGCA-TGCACAGCATGGCCATG參照組織結(jié)腸_123371_2693癌癥溫度54*C57癌癥寡聚體+AGGTACGAGGCCGGTGTTAATCGGCCGA-TCGGCCGATTAACACCGGCCTCGTACCT引物寡聚體+AGGTACGAGGCCGGTG-CACCGGCCTCGTACCT參照組織結(jié)腸_123372—2695癌癥溫度90"C引物溫度54TC58癌癥寡聚體+TGCACCACAAGCAAACAGGCC-GGCCTGTTTGCTTGTGGTGCA引物寡聚體+TGCACCACAAGCAAACAG-CTGTTTGCTTGTGGTGCA參照59癌癥寡聚體:參照60癌癥寡聚體:引物寡聚體參照61癌癥寡聚體:引物寡聚體參照62癌癥寡聚體:引物寡聚體組織結(jié)腸_123799—3379癌癥溫度661C引物溫度54匸+TGCTGCCCTCAATGGTC-GACCATTGAGGGCAGCA組織結(jié)腸—124226—4533癌癥溫度541C+AGGCCGGTGGTTAATCGGCCGAGG-CCTCGGCCGATTAACCACCGGCCT+AGGCCGGTGGTTAATCG-CGATTAACCACCGGCCT組織結(jié)腸_124431_5222癌癥溫度80X:引物溫度54"C+GAGGCCGGTGGTTAATCGGCCGAG-CTCGGCCGATTAACCACCGGCCTC+GAGGCCGGTGGTTAATC-GATTAACCACCGGCCTC組織結(jié)腸一124442_5305癌癥溫度80TC引物溫度54*C+GCTAGGTACGAGGCTGGGTTTT-AAAACCCAGCCTCGTACCTAGC+GCTAGGTACGAGGCTGG-CCAGCCTCGTACCTAGC組織結(jié)腸_124449—5356癌癥溫度68TC引物溫度56"C63癌癥寡聚體+AACATACGGCTAGGTACGA-TCGTACCTAGCCGTATGTT參照組織結(jié)腸_124461_5420癌癥溫度56"C64癌癥寡聚體+GGTGGTAATCGGACGAGG-CCTCGTCCGATTACCACC參照組織結(jié)腸_124495—5584癌癥溫度58匸65癌癥寡聚體+GGGTGATCGGACGAGGC-GCCTCGTCCGATCACCC參照組織結(jié)腸_124565_5924癌癥溫度58"C66癌癥寡聚體+ACATGCCTAGGGTTCAA-TTGAACCCTAGGCATGT參照組織結(jié)腸_128283_2235癌癥溫度50"C這59種癌癥標(biāo)記物包括許多SNP，但它們還包括更長(zhǎng)的突變。還鑒定了對(duì)其它類型癌癥特異的癌癥標(biāo)記物超集。表3中提供了針對(duì)肺癌的癌癥標(biāo)記物，表4中提供了針對(duì)、淋巴癌的癌癥標(biāo)記物?；?z>^#^^記#于桌A癌癥寡聚體+TGAGACAGCTCATCACA-TGTGATGAGCTGTCTCA參照組織肺—97380—1525癌癥溫度501C引物溫度501CB癌癥寡聚體+TCTGGACTGATCTAACA-TGTTAGATCAGTCCAGA參照組織肺—114200—11255癌癥溫度48"C引物溫度48°CC癌癥寡聚體+CAAGTTCCTATAGGAGT-ACTCCTATAGGAACTTG參照組織肺—116399—15887癌癥溫度48TC引物溫度481CD癌癥寡聚體+TGCCATAAACTGGGTTA-TAACCCAGTTTATGGCA參照組織肺—107413—2916癌癥溫度48TC引物溫度48X3E癌癥寡聚體+GGCTAGGTACGAGGCTGGGTGTG-CACACCCAGCCTCGTACCTAGCC引物寡聚體+GGCTAGGTACGAGGCTG-CAGCCTCGTACCTAGCC參照組織肺—99814_4327癌癥溫度76TC引物溫度56"CF癌癥寡聚體+AAACCTGCAATATGATG-CATCATATTGCAGGTTT參照組織肺_124202_2868癌癥溫度46X:引物溫度46"CG癌癥寡聚體+GCGTGATGGCGGGGGGCTCT-AGAGCCCCCCGCCATCACGC引物寡聚體+GCGTGATGGCGGGGG-CCCCCGCCATCACGC參照組織肺一98869—3329癌癥溫度701C引物溫度54TCH癌癥寡聚體+GCTTACATCCGTGATGT-ACATCACGGATGTAAGC參照I癌癥寡聚體:參照J(rèn)癌癥寡聚體:組織肺_108655—5362癌癥溫度501C引物溫度50*C+TTACTCTCATGTGGCCAA-TTGGCCACATGAGAGTAA組織肺—123536—1762癌癥溫度52t:引物溫度52TC+TCTGATGAACAGAAGAAG-CTTCTTCTGTTCATCAGA組織肺_125101_4407癌癥溫度50X:引物溫度50*C《《'沐S蕃標(biāo)記浙f桌i癌癥寡聚體引物寡聚體+GCTGAACCTGCGACTGGTA-TACCAGTCGCAGGTTCAGC+GCTGAACCTGCGACTGG-CCAGTCGCAGGTTCAGC組織淋巴—67664—6573癌癥溫度60TC引物溫度56TCii癌癥寡聚體+TAGGTACGAGGCTGGGT-ACCCAGCCTCGTACCTA組織淋巴—55415—7578癌癥溫度541C引物溫度54"Ciii癌癥寡聚體:引物寡聚體參照+GGCTAGTACGAGGCTGGGT-ACCCAGCCTCGTACTAGCC+GGCTAGTACGAGGCTGG-CCAGCCTCGTACTAGCC組織淋巴556007985癌癥溫度62TC引物溫度56TCiv癌癥寡聚體+CTAGGTACGAGGCTGGGTG-CACCCAGCCTCGTACCTAG引物寡聚體+CTAGGTACGAGGCTGGG-CCCAGCCTCGTACCTAG參照組織淋巴_60248_7359癌癥溫度621C引物溫度561Cv癌癥寡聚體+GTACGAGGCTGGGTGTT-AACACCCAGCCTCGTAC參照組織淋巴_60270_7430癌癥溫度541C引物溫度54TCvi癌癥寡聚體+GAAACTGTTGGCGTGAT-ATCACGCCAACAGTTTC參照組織淋巴_50077_1076癌癥溫度50t:引物溫度501Cvii癌癥寡聚體+GAGCAGAAACGGGAGACCTG-CAGGTCTCCCGTTTCTGCTC引物寡聚體+GAGCAGAAACGGGAGAC-GTCTCCCGTTTCTGCTC參照組織淋巴_69924_10602癌癥溫度64C引物溫度54TCviii癌癥寡聚體+GGCCTTCGAGCGGGGTGTTGGGG-CCCCAACACCCCGCTCGAAGGCC引物寡聚體+GGCCTTCGAGCGGGG-CCCCGCTCGAAGGCC參照組織淋巴—50152—1336癌癥溫度801C引物溫度54TCix癌癥寡聚體+AGTTTCTTCAAGATCAC-GTGATCTTGAAGAAACT參照:組織淋巴_62939—1828癌癥溫度461C引物溫度46"Cx癌癥寡聚體:+GAGGAAGTAATCTGCCC一GGGCAGATTACTTCCTC參照:組織淋巴—13680_599癌癥溫度52TC引物溫度52匸此處討論的癌癥檢測(cè)試劑可用于任何可能包含癌癥標(biāo)記物的樣品。然而，優(yōu)選實(shí)施方案中，在很容易獲得的體液(如外周血)中檢測(cè)該標(biāo)記物。外周血的利用還可提供下述優(yōu)點(diǎn)允許對(duì)來自相同受試者中數(shù)個(gè)分化腫瘤的標(biāo)記物進(jìn)行一次檢測(cè)。然而可能存在下述狀況，例如當(dāng)僅需要一種腫瘤的信息時(shí)，其中檢查了組織樣品或其它樣品。癌癥組織樣品和活組織檢查通常來自單個(gè)腫瘤，即使存在有多個(gè)腫瘤。在癌癥早期階段大多數(shù)癌細(xì)胞為親本腫瘤的子代，并且常常具有與腫瘤中細(xì)胞相同的突變。然而，轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞常常具有不同的突變。此外，轉(zhuǎn)移性肺瘤即使最初類似，它們也會(huì)遵循不同的發(fā)展途徑，并且可隨著時(shí)間累積不同的額外突變。最后，已熟知許多癌癥治療引起癌細(xì)胞中另外的突變。因此，癌癥晚期中的癌細(xì)胞常常不具有如早期時(shí)的相同的突變。相同的個(gè)體中還常常見到多個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤間存在突變的變化。由于腫瘤傾向于具有單個(gè)突變，從而取自單個(gè)腫瘤的組織樣品可能不包含整個(gè)受試者癌癥中發(fā)現(xiàn)的所有癌癥突變。因此，受試者身體中所有或大多數(shù)突變利用常規(guī)方法的分布型將需要來自多個(gè)腫瘤的樣品。相反，在利用血液作為樣品的本發(fā)明實(shí)施方案中，可在單個(gè)樣品中檢測(cè)存在于轉(zhuǎn)移性癌癥中的所有或大多數(shù)突變，因?yàn)槠浒瑏碜远鄠€(gè)肺瘤的細(xì)胞。此外血液樣品甚至可包含來自利用常規(guī)方法未檢出的小轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞。本發(fā)明的癌癥標(biāo)記物和相應(yīng)的癌癥檢測(cè)試劑可用于對(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥的診斷，尤其是基于病理學(xué)的診斷，包括初始診斷以及治療和疾病發(fā)展監(jiān)測(cè)，并且還包括對(duì)靶癌細(xì)胞死亡的監(jiān)測(cè)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明用于檢測(cè)多個(gè)癌癥標(biāo)記物，以提供受試者的癌癥標(biāo)記物特征。可以基于多種因素來選擇檢測(cè)的標(biāo)記物。兩種因素包括在任何類型癌癥發(fā)生的總可能性或與發(fā)生于特定組織中的癌癥的關(guān)聯(lián)性。本發(fā)明的篩查方法可用于各種診斷目的。對(duì)本說明書來說，"診斷"不僅涉及對(duì)受試者是否患病的初始確定，而且涉及檢查疾病性質(zhì)的任何檢測(cè)。例如，本說明書中的診斷形式可包括篩查健康受試者或患有病征的受試者以最初確定癌癥是否存在，在已確定受試者患有癌癥后的任一點(diǎn)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)以幫助建議或監(jiān)測(cè)治療過程，預(yù)后性(prognostic)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)以監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展，包括任何新突變的發(fā)展，以及檢驗(yàn)以確定轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的存在或缺乏或根除。例如，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)癌細(xì)胞的存在，尤其是轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞或血液中發(fā)現(xiàn)的其它癌細(xì)胞。該方法可用于對(duì)癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥的初始診斷，即使在腫瘤非常小而難以通過成像或其它技術(shù)檢測(cè)到時(shí)。本發(fā)明的篩查不僅可用于指示癌細(xì)胞的存在，其還可用于確定這些細(xì)胞中存在的一些或所有突變或異常。對(duì)所存在的突變的認(rèn)識(shí)可用于指導(dǎo)治療。例如，基于受試者癌癥的根本突變，可采用或避免已知僅針對(duì)某些類型癌癥有效的藥物。另外，對(duì)受試者特異性癌癥突變的認(rèn)識(shí)可用于開發(fā)新類癌癥藥物，包括靶向?qū)б言\斷突變的受試者特異性癌癥藥物。這些靶向藥物可影響突變體蛋白質(zhì)，尤其細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或其可作用于細(xì)胞核酸如mRNA。此外，引入癌癥標(biāo)記物位點(diǎn)側(cè)翼的另外的檢驗(yàn)可用于確定受給定的癌癥患者中癌癥標(biāo)記物影響的特定基因。如表1和2清楚地顯示的，雖然一些癌癥標(biāo)記物僅與一些基因有關(guān)，但大多數(shù)在許多基因中發(fā)現(xiàn)。已知這些基因中一些的功能。因此，確定其中癌癥標(biāo)記物所在基因的能力提供了可用于指導(dǎo)癌癥治療的另外的信息?？紤]到產(chǎn)生公共數(shù)據(jù)的方法，預(yù)期任何公眾中會(huì)有很大幾率和一致性，或癌癥標(biāo)記物和癌細(xì)胞系之間缺乏一致性。然而，圖5提示一些癌癥標(biāo)記物在一些細(xì)胞系中出現(xiàn)，而其它的在不同的細(xì)胞系中出現(xiàn)。這提示一些癌癥標(biāo)記物在一些癌癥受試者中發(fā)現(xiàn)，而其它的在不同的癌癥受試者中發(fā)現(xiàn)。每個(gè)癌癥受試者預(yù)期具有包含組成個(gè)人癌癥分布型并且鑒定該個(gè)體中哪些基因可被突變的癌癥標(biāo)記物子集的mRNA。然而有可能用足夠大的受試者庫(kù)，可在不同的受試者當(dāng)中觀察到相同的癌癥分布型，然而不能預(yù)期庫(kù)中的每個(gè)受試者具有相同的癌癥分布型。癌癥的個(gè)體性程度并未被清楚地了解。然而如圖6中闡述的，個(gè)體性仍然看起來與癌癥類型有關(guān)。癌癥標(biāo)記物高集可組成對(duì)癌細(xì)胞特有的長(zhǎng)度為17體或更大的所有mRNA分子。隨后每種癌癥類型具有對(duì)應(yīng)的癌癥標(biāo)記物超集，并且每個(gè)癌癥受試者具有癌癥標(biāo)記物子集，其與它們的個(gè)體癌癥情況同義。因?yàn)楸?和2呈現(xiàn)各種不同癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的癌癥標(biāo)記物組，不應(yīng)該期待在單個(gè)癌癥受試者中發(fā)現(xiàn)它們所有，雖然這并不是不可能。相反地，表1和2的59種癌癥標(biāo)記物或其子組合可用于產(chǎn)生特定受試者癌癥的癌癥分布型。通過在任何分析或分析組中包含大量癌癥標(biāo)記物，可開發(fā)更完全的癌癥分布型。另外，對(duì)哪些癌癥標(biāo)記物不存在于受試者mRNA中的認(rèn)識(shí)也對(duì)診斷，包括預(yù)后，以及癌癥發(fā)展和治療監(jiān)測(cè)非常有用。例如其可用于選擇受試者的療法?？衫醚簶悠泛痛颂幩龅姆椒▽?duì)癌癥受試者建立癌癥分布型。圖9闡述了一種上述示例性方法的步驟。大多數(shù)情況中，可在從受試者獲得血液樣品后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)至幾天內(nèi)獲得癌癥分布型。因?yàn)榇蠖鄶?shù)癌癥標(biāo)記物與基因的組有關(guān)，可快速確定哪組基因正在受試者癌癥中以癌細(xì)胞特有的方式發(fā)生突變。任何后續(xù)療法可利用靶向特定癌細(xì)胞的該遺傳信息。令人遺憾的是，大多數(shù)現(xiàn)有的療法不具有這種靶向能力。因此，本發(fā)明基于血液的檢測(cè)還可以是對(duì)新療法的預(yù)備檢測(cè)，該療法可利用耙向特異性癌細(xì)胞的癌癥檢測(cè)試劑。本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案中，提供了三種常規(guī)類型的分析。第一種類型的分析檢查樣品中多個(gè)類型癌癥中常見癌癥標(biāo)記物的存在或缺乏。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于其在常規(guī)癌癥高集的癌癥中的出現(xiàn)頻率，來選擇癌癥標(biāo)記物的檢驗(yàn)子集。例如，可選擇在超過若干癌癥中發(fā)現(xiàn)的所有癌癥標(biāo)記物。或者，可以以出現(xiàn)頻率來對(duì)這些癌癥標(biāo)記物排序，并且可選擇它們中的某些。例如，可選擇最前面的300種癌癥標(biāo)記物用于診斷分析中。隨著新的癌癥樣品添加至高集，這對(duì)癌癥組織中發(fā)現(xiàn)哪些癌癥才示記物的相對(duì)頻率幾乎沒有顯著的影響。這表明高集為全部癌癥的代表并且存在一些癌癥標(biāo)記物，它們比其它的標(biāo)記物更可能出現(xiàn)于任何類型的癌癥中。例如，可利用檢查來自常規(guī)癌癥標(biāo)記物高集的癌癥標(biāo)記物的常規(guī)診斷分析作為常規(guī)篩查的一部分，如每年的血液檢查。其還可能用于患有下述癥狀的個(gè)體，如與癌癥和許多其它的疾病一致的體重減輕。第二種類型的分析可集中于特定類型的癌癥，如結(jié)腸癌。如常規(guī)分析，該分析可尋找以超過某種頻率存在的癌癥標(biāo)記物的子集，或其可尋找在頻率排序表中某些最前面的標(biāo)記物。由于添加新數(shù)據(jù)，特定癌癥的癌癥標(biāo)記物超集在更高頻率標(biāo)記物的相對(duì)頻率上也幾乎沒有表現(xiàn)出變化。該第二種類型的分析可以用于已知患有特定類型癌癥的受試者。其可提供比可利用常規(guī)癌癥分析所獲得的更為詳細(xì)的、對(duì)存在于受試者癌癥中的突變指示。其也可提供更詳細(xì)的預(yù)后或治療計(jì)劃。第三種類型的分析確定哪些基因受受試者癌癥突變的影響。該分析可用于任何點(diǎn)，但為成本和效率的原因，可集中于特定的癌癥標(biāo)記物，并且可僅用于之前顯示具有那些癌癥標(biāo)記物的受試者。然而，一些實(shí)施方案中，如集中于常見癌癥標(biāo)記物的那些，其可能對(duì)在癌癥標(biāo)記物篩查同時(shí)篩查受影響的基因是有效的。該第三種類型的分析也可通過檢查癌癥標(biāo)記物附近的側(cè)翼核苷區(qū)域來檢測(cè)特定基因。這些側(cè)翼區(qū)在基因和基因間傾向于不同。適于給定的測(cè)定法并且能區(qū)別可能互相起作用的基因的側(cè)翼區(qū)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。癥癥^^記參為、有費(fèi)可開發(fā)用于個(gè)體受試者的癌癥標(biāo)記物分布型。這些受試者最常見是人，如患有或懷疑患有癌癥的人。然而，受試者也可以包括其它的哺乳動(dòng)物。受試者可包括患者。一定的上下文中，受試者可以是腫瘤或疑是肺瘤。癌癥標(biāo)記物分布型包括癌癥標(biāo)記物的身份(identity)以及關(guān)于其在受試者中是否檢測(cè)到的指示。癌癥標(biāo)記物分布型通常提供超過一種癌癥標(biāo)記物的信息。癌癥標(biāo)記物分布型可以簡(jiǎn)單的陽性/陰性格式提供結(jié)果。其還可顯示定量或定性發(fā)現(xiàn)的大量癌癥標(biāo)記物。最后，癌癥標(biāo)記物分布型可包括關(guān)于受試者中在其中發(fā)現(xiàn)癌癥標(biāo)記物的基因的信息。所有哺乳動(dòng)物隨著年齡增長(zhǎng)而累積體細(xì)胞突變。實(shí)驗(yàn)已表明健康組織無癌癥標(biāo)記物。然而，由于血液常常包含在體內(nèi)任何地方發(fā)現(xiàn)的異常細(xì)胞，很可能成年哺乳動(dòng)物或甚至幼年哺乳動(dòng)物將在其血液中呈現(xiàn)一些癌癥標(biāo)記物。一些癌癥標(biāo)記物在受試者血液中的存在不一定表示受試者患有癌癥。相反，癌癥標(biāo)記物的數(shù)目、類型或組合為受試者是否患有癌癥的可能指示。對(duì)于任何給定的癌癥標(biāo)記物組，將來自健康個(gè)體的血液與來自已知患有癌癥的患者的血液比較的常規(guī)實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)易于揭示哪些癌癥標(biāo)記物分布型為癌癥以及哪些不是的指示。此外，跟蹤健康的受試者是否發(fā)展癌癥，在什么時(shí)候發(fā)展以及在研究的整個(gè)過程中其癌癥標(biāo)記物分布型是怎樣的的長(zhǎng)期研究應(yīng)當(dāng)揭示癌癥標(biāo)記物分布型，其為發(fā)展癌癥提高的傾向性的指示。該信息可用于指導(dǎo)預(yù)防方法或早期的癌癥療法?？衫萌魏魏线m的方法來鑒定樣品中的癌癥標(biāo)記物。然而在一具體的實(shí)施方案中，可通過外周血樣品的PCR分析來鑒定癌癥標(biāo)記物.PCR分析可包括RT-PCR，其中來自樣品的mRNA轉(zhuǎn)變成cDNA.該cDNA隨后經(jīng)PCR還原。此外，PCR分析可非常迅速地調(diào)整以包括側(cè)翼區(qū)的檢測(cè)，允許受癌癥標(biāo)記物作用的基因的分析。戶C及f戶C及MrfM"/0WJ常規(guī)的PCR擴(kuò)增位于5，和3'引物之間的核酸組區(qū)域。由于利用5，和3，引物，新產(chǎn)生的核酸鏈在下一個(gè)循環(huán)中可有效用作模板。所有引物和PCR條件在擴(kuò)增時(shí)不同樣有效的，因此一些比其它的引物以更高的速率產(chǎn)生新模板。當(dāng)利用不同的引物時(shí)，與新鏈用作模板的能力結(jié)合的結(jié)果造成具有所擴(kuò)增序列的單個(gè)核酸鏈數(shù)目的顯著差異。該差異涉及引物和PCR-條件效率而不是原始樣品中有效的模板鏈的實(shí)際數(shù)目?？衫酶倪M(jìn)的PCR類型，此處稱為"PCR還原"獲得對(duì)給定的樣品中包含不同癌癥標(biāo)記物的mRNA分子數(shù)目的更精確的比較。利用該方法，僅提供5，引物。這些引物能夠與最初的模板核酸雜交，而不是與作為PCR過程一部分而產(chǎn)生的任何鏈雜交，因?yàn)樗鲦湴c5，引物相同而不是互補(bǔ)的序列。由于只有最初的模板核酸可用作PCR反應(yīng)的模板，不同癌癥檢測(cè)試劑序列拷貝數(shù)因?yàn)橐锘騊CR效率的差異不是那么顯著?？截悢?shù)具有與最初模板的實(shí)際數(shù)目更加緊密的相關(guān)性。PCR還原中，聚合作用一直存在，直到聚合酶從模板鏈落下。此易于留下5，引物后的尾端。這些尾部長(zhǎng)度有些不同，但通常都在引物的數(shù)百個(gè)堿基對(duì)內(nèi)終止。因此，所有PCR反應(yīng)產(chǎn)物可作為單條但稍微模糊的條帶而在凝膠上經(jīng)電泳解析。PCR還原方法的一個(gè)實(shí)施例在圖7中闡述。雖然癌癥標(biāo)記物擴(kuò)增可單獨(dú)用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，但在上述PCR還原技術(shù)中末尾允許容易的基于凝膠的檢測(cè)，其單獨(dú)利用小癌癥檢測(cè)試劑不容易獲得。如果樣品中不存在癌癥檢測(cè)試劑序列，則引物沒有模板且電泳后在預(yù)期的位置沒有條帶出現(xiàn)。另一方面，如果癌癥檢測(cè)試劑序列存在，則存在模糊的條帶?？衫贸Ｒ?guī)方法分析該條帶的強(qiáng)度，以評(píng)估包含每種檢測(cè)試劑序列的樣品中模板的相對(duì)豐度。雖然僅利用PCR還原和凝膠難以檢測(cè)出哪個(gè)基因包含特定的癌癥標(biāo)記物，但可通過對(duì)PCR還原產(chǎn)物的進(jìn)一步分析來確定所述信息。例如，可在PCR還原產(chǎn)物上進(jìn)行利用不同基因的特異性引物的常規(guī)PCR。由于PCR還原引物與癌癥標(biāo)記物相關(guān)，但在高達(dá)數(shù)百個(gè)堿基對(duì)都存在轉(zhuǎn)錄，尾端通常足夠長(zhǎng)而允許區(qū)別不同的基因。測(cè)序PCR還原產(chǎn)物以確定哪個(gè)基因或哪些基因包含該癌癥標(biāo)記物也是可能的。凝^W在另一實(shí)施方案中，可以以癌癥標(biāo)記物為基礎(chǔ)構(gòu)建微陣列。包括這些標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑可置于微陣列上。這些癌癥檢測(cè)試劑可以不同于PCR方法中所用的那些。然而，應(yīng)該在使得只有具有癌癥標(biāo)記物的核酸可雜交并且產(chǎn)生陽性結(jié)果的條件下對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)和利用?；谖㈥嚵械姆治鲞€非常經(jīng)得起側(cè)翼區(qū)的檢測(cè)，允許對(duì)特定的受影響基因的鑒定。大多數(shù)現(xiàn)有的微陣列，如由Affymetrix(California)提供的那些，可與本發(fā)明一起使用。能特異性檢測(cè)SNP或小缺失的微陣列尤其有用，因?yàn)樵S多癌癥標(biāo)記物落入這兩種異常的種類中。特定的實(shí)施方案中，可提供大致與上述三種類型的分析對(duì)應(yīng)的三種類型的微陣列。具體地，可提供常規(guī)的癌癥標(biāo)記物微陣列，例如用于常規(guī)篩查?？商峁┝硪环N類型的微陣列，每種針對(duì)特定類型的癌癥，例如用于對(duì)已知強(qiáng)烈疑似患有給定類型癌癥的受試者更詳細(xì)的診斷。最后，可提供能區(qū)別受癌癥標(biāo)記物作用的基因的第三種類型的微陣列。這類微陣列可適合于一種癌癥標(biāo)記物，或者，其也許能對(duì)許多癌癥標(biāo)記物檢測(cè)特異性起作用的基因。能在同樣的陣列上進(jìn)行多種類型分析的雜交微陣列。例如，單個(gè)微陣列也許能檢測(cè)癌癥標(biāo)記物并且確定那些標(biāo)記物的起作用基因。另外的實(shí)施方案中，可利用其它的核酸分析方法。例如，基于珠粒分析的FACS，如可通過Luminex(Texas)或Becton-Dickinson(NewJersey)用于核酸分析的那些可用來檢測(cè)癌癥標(biāo)記物以及基因-鑒定側(cè)翼序列。最后，基于肽的分析也是合適的。由于癌癥標(biāo)記物通過mRNA分析鑒定，預(yù)計(jì)其大多數(shù)可表達(dá)為異常的蛋白質(zhì)。這些分析尤其可用于常常在表面蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的癌癥標(biāo)記物，雖然細(xì)胞可迅速裂解而同樣允許內(nèi)部蛋白質(zhì)接近。利用抗體的肽分析可能尤其有用，因?yàn)樗隹贵w可在治療中具有較晚的應(yīng)用。本發(fā)明的癌癥標(biāo)記物可利用試劑盒檢測(cè)。這些試劑盒可包括適于特定類型分析的癌癥檢測(cè)試劑?？捎糜诜治龅钠渌噭┛砂ㄔ谠撛噭┖袃?nèi)。使用試劑盒可產(chǎn)生受試者的癌癥標(biāo)記物分布型。試劑盒可設(shè)計(jì)來用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的任何方面，包括實(shí)驗(yàn)室研究、商品化診斷小試驗(yàn)、醫(yī)院或診所小試驗(yàn)或醫(yī)生辦公室檢驗(yàn)。試劑盒可能需要特定的輔助設(shè)備，如PCR循環(huán)儀、微陣列讀數(shù)器或FACS機(jī)器。本發(fā)明還可作為檢驗(yàn)服務(wù)商業(yè)化提供。例如，可提供樣品給商業(yè)化的檢驗(yàn)室，其隨后利用合適的癌癥檢測(cè)試劑和測(cè)定法確定樣品的癌癥分布型。結(jié)果可隨后返回至提供樣品的實(shí)體。診斷結(jié)果可以以許多方式用于指導(dǎo)對(duì)看起來患有癌癥或很可能發(fā)展癌癥的患者的治療?？梢曰诖罅堪┌Y標(biāo)記物或某些組合的存在，給予換著預(yù)防性的治療。還可根據(jù)疾病的階段對(duì)患者不同地治療。由于疾病和癌癥標(biāo)記物變化，治療可以改變。治療本身可包括常規(guī)處理，如化療。其還可包括基于患者特定的癌癥分布型的抗體或反義療法?；颊叩陌┌Y標(biāo)記物可用于開發(fā)癌癥標(biāo)記物特定的表位的抗體。其也可用于開發(fā)反義分子，其干擾癌細(xì)胞而不是正常細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)理。由于本發(fā)明的癌癥檢測(cè)試劑在健康細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本組中缺乏，其代表誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的癌癥特異性靶標(biāo)。例如，一些癌癥檢測(cè)試劑可翻譯成主要位于細(xì)胞內(nèi)的肽，而一些嵌入通常編碼胞外或膜蛋白質(zhì)的序列中。所述序列對(duì)本領(lǐng)域來說很容易得知，并且被認(rèn)為能預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)及其部分的合適細(xì)胞位置。因此，尤其對(duì)于具有胞外區(qū)的蛋白質(zhì)，給予由癌癥檢測(cè)試劑編碼的肽的特異性抗體預(yù)期會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。由于僅僅癌細(xì)胞呈現(xiàn)這些肽，所以只有癌細(xì)胞是靶標(biāo)并且由抗體殺死。與本發(fā)明結(jié)合使用的抗體可包括單克隆和多克隆抗體、非人、人和人源化的抗體以及任何其功能片段。雖然單種癌癥檢測(cè)試劑可用于靶向本發(fā)明誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的方法中的多基因或基因產(chǎn)物，一些實(shí)施方案中可靶向多癌癥檢測(cè)試劑以產(chǎn)生有效的結(jié)果。如果給予患有多肺瘤的受試者，靶向超過一種癌癥檢測(cè)試劑的結(jié)合藥劑也特別有用。受試者的腫瘤可已分化，使得每個(gè)腫瘤不包含任何一種癌癥檢測(cè)試劑序列。引入耙向多癌癥檢測(cè)試劑序列的藥劑可允許這些分化的癌細(xì)胞被更有效地殺死。所述結(jié)合方法對(duì)新的或小肺瘤特別有效，這些小腫瘤可能不能利用常規(guī)方法檢測(cè)到，然而當(dāng)本發(fā)明的診斷方法用于建立癌癥分布型時(shí)，其包含可檢測(cè)的癌癥檢測(cè)試劑序列。因此，可根據(jù)三步方法，按照本發(fā)明所選擇的方法實(shí)現(xiàn)靶癌細(xì)胞的死亡。首先，建立受試者的癌癥分布型。第二，產(chǎn)生靶癌細(xì)胞死亡藥劑，并且對(duì)受試者的血液或其它組織樣品檢驗(yàn)。第三，給予受試者藥劑，以引起受試者中癌細(xì)胞的靶向死亡。該過程可在少至三周內(nèi)完成。持續(xù)的監(jiān)測(cè)可允許受試者中對(duì)任何癌癥檢測(cè)試劑的消失以及任何新的一些的出現(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)。隨后可由此改變給予受試者的藥劑或藥劑組合。實(shí)施例下列實(shí)施例包含用以展示本發(fā)明的特定實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解隨后實(shí)施例中公開的技術(shù)表示本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，它們?cè)诒景l(fā)明的實(shí)踐中很好地起作用。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本說明書應(yīng)當(dāng)理解在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，公開的特定實(shí)施方案中可產(chǎn)生許多變化并且仍然可獲得類似的或同樣的結(jié)果。實(shí)施例l:方法、試劑和受試者背景為了完成這些檢驗(yàn)，選擇患有4期轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌的兩個(gè)志愿者。這些志愿者在此稱為受試者R和受試者H。受試者R為女性。受試者R提供9mm、切除的腫瘤用于檢驗(yàn)以及60mL的外周血樣品。受試者H為男性。受試者H提供60mL的外周血樣品。構(gòu)建來自所有樣品的cDNA文庫(kù)。還構(gòu)建來自健康、無癌癥個(gè)體的任意組織樣品庫(kù)的cDNA文庫(kù)。這些實(shí)施例中，該cDNA庫(kù)代表正常的、無癌癥的樣品。實(shí)施例2:癌癥才示i己物組通過利用專有的計(jì)算機(jī)程序，對(duì)例如公共數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的來自癌細(xì)胞的mRNA與也在癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的正常人的mRNA加以比較，已鑒定了許多癌癥標(biāo)記物。這些癌癥標(biāo)記物已按頻率排序。由于通常用于在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的癌細(xì)胞的每種樣品獲自不同的患者，數(shù)據(jù)庫(kù)中每種癌癥標(biāo)記物的存在與在實(shí)際的人受試者中的存在相關(guān)聯(lián)。因此，數(shù)據(jù)庫(kù)中的出現(xiàn)頻率與癌癥標(biāo)記物出現(xiàn)的過去的和預(yù)期將來的頻率大致一致。已基于所檢查的每種類型癌癥的頻率對(duì)癌癥標(biāo)記物進(jìn)行了排序。另外，本發(fā)明揭示許多癌癥標(biāo)記物常常在多個(gè)類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)。因此，已以其在所檢查全部癌癥中的總出現(xiàn)頻率為基礎(chǔ)對(duì)標(biāo)記物排序。至今鑒定的一些結(jié)腸癌標(biāo)記物，其也是優(yōu)良的常規(guī)癌癥標(biāo)記物，頁在表1和2中提供。實(shí)施例3:血液樣品制備利用在包含EDTA的真空管紫色前端的標(biāo)準(zhǔn)IV放血針，收集60mL外周血。包含肝素的試管也是合適的。血液隨后存儲(chǔ)在4TC直至進(jìn)一步處理。處理盡快完成以減少RNA降解。利用QIAampRNA血液mini試劑盒分離總RNA。(Quiagen，California)RNA總量為大約60pg。后期檢驗(yàn)揭示利用Trizol試劑(Invitrogen，California)制備血樣產(chǎn)生大約400pg。然而，這些樣品不在本實(shí)施例中使用。血液還可以被收集于包含預(yù)等分穩(wěn)定試劑的試管中，如PaxgeneBloodRNA試管(Quiagen，California)。Paxgene試管保存2.5ml/血液每試管，血液通常在室溫下5天維持穩(wěn)定。特異性地設(shè)計(jì)Paxgene試管，以預(yù)防RNA降解以及血液收集后有時(shí)發(fā)生的基因誘導(dǎo)。實(shí)施例4:用于PCR檢驗(yàn)的引物由廠家提供的代表性的引物數(shù)據(jù)如下。合成規(guī)模200nmol長(zhǎng)度17體分子量(銨鹽)5383.4每OD的精確重量(銨鹽)32.34每OD的亳納摩爾(銨鹽)6.12亳克分子的消光系數(shù)163.35該試管中的總OD:20ILig總數(shù)646.76納摩爾總數(shù)122.44純化脫鹽解鏈溫度(攝氏度)56.05，端OH3'端OH對(duì)于表2中鑒定的59種常規(guī)癌癥標(biāo)記物的每種，提供用于所鑒定標(biāo)記物的PCR引物以及PCR條件。實(shí)施例5:cDNA合成cDNA合成之前，通過DNAaseI酶切消化從總RNA除去殘留dna。具體地，建立具有10pL總量并且包含5jng總rna，1ml10X緩沖液和1luLDNAaseI的反應(yīng)混合物。該混合物在室溫下維持15分鐘，隨后添加lpL的25mMEDTA。EDTA混合物在651C溫育15分鐘，隨后置于水上l分鐘。通過離心收集反應(yīng)物。用SuperscriptIII試劑盒(Invitrogen，CA)從DNAaseI消化的總RNA樣品合成第一鏈cDNA。利用聚T引物。然而，也可利用隨機(jī)引物。如果癌癥標(biāo)記物位于mRNApolyT尾部的遠(yuǎn)上游，隨機(jī)引物尤其合乎需要。大約10nlDNAaseI消化的RNA與1jliL10mMdNTP和1pLoligodT(0.5ng/|LiL)引物混合。該RNA/引物混合物在65*€溫育5分鐘，隨后置于冰上l分鐘。制備包含2pL10XRT緩沖液，4jliL25mMMgCl2，2pL0.1MDTT和1jnLRNAaseOut(Invitrogen,California)的反應(yīng)混合物。將9pL反應(yīng)混合物添加至RNA/引物混合物。通過離心，收集全部的混合物，隨后在42TC溫育2分鐘。隨后添加1pL(50單位)SuperscriptIIIRT(Invitrogen,California)，并且得到的混合物在42TC溫育50分4中。通過在701C溫育15分鐘或在851C溫育5分鐘終止反應(yīng)，隨后水上冷凍。通過離心收集反應(yīng)物。最后，添加lpLRNAaseH,樣品在37t!溫育20分鐘以降解殘留的RNA。每種樣品如此處理。產(chǎn)生的單個(gè)cDNA樣品隨后用作每種隨后PCR還原反應(yīng)的起始材料。實(shí)施例7:PCR還原PCR還原用于擴(kuò)增cDNA中的任何癌癥標(biāo)記物。如以上解釋的，由于其不產(chǎn)生本身可變成擴(kuò)增模板的產(chǎn)物，PCR還原給出對(duì)樣品中攜帶癌癥標(biāo)記物的mRNA相對(duì)量的更精確描述。相反，通過僅利用一種引物，整個(gè)反應(yīng)僅最初的模板可用于擴(kuò)增。制備具有20pL總體積并且包含13.8pLDEPC-處理水，2yL無Mg的10XPCR緩沖液，1jiL25mMMgCl2，0.5jliL10mMdNTP混合物，lML20pM反義引物(癌癥檢測(cè)試劑)，1.5juLcDNA樣品以及0.2pL高保真5單位/pLTaqDNA聚合酶的PCR反應(yīng)混合物。pcr進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。首先pcr反應(yīng)混合物在941C變性5分鐘。隨后，35個(gè)循環(huán)的每一個(gè)包括94TC變性30秒，在引物退火溫度(退火溫度在表2中顯示)退火30秒以及721C延伸l分鐘。完成后，反應(yīng)物維持在4TC。選擇條件以獲得在100-500bp范圍內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物?？筛淖儣l件以獲得不同大小的產(chǎn)物。利用表2的對(duì)應(yīng)于癌癥標(biāo)記物3和5-66的反義癌癥檢測(cè)試劑進(jìn)行對(duì)兩個(gè)嚴(yán)重病情受試者的血液和腫瘤組織的PCR分析。實(shí)施例8:PCR結(jié)果為了確定癌癥標(biāo)記物是否存在于樣品中，PCR完成后將10nLPCR反應(yīng)混合物加載到1%瓊脂糖凝膠上，進(jìn)行電泳。隨后凝膠成像。PCR結(jié)果在表5中提供。如表所示，鑒定的標(biāo)記物在正常組織中通常不存在。(正常組織中出現(xiàn)的一種已作為癌癥標(biāo)記物從內(nèi)含物排除，雖然很可能由于體細(xì)胞突變的逐步累積，其為存在于表面上健康的組織中的癌癥標(biāo)記物。)表5顯示利用具有來自表1凋亡序列的引物的單啟動(dòng)RT-PCR的結(jié)果，三種癌癥樣品以及血管壁的健康對(duì)照樣品。表5中加號(hào)表示序列的存在并且減號(hào)表示序列的缺乏。健康對(duì)照樣品中發(fā)現(xiàn)的那些序列從候選凋亡序列庫(kù)丟棄，雖然其它的可用于隨后的細(xì)胞死亡檢驗(yàn)。表5候選調(diào)亡序列RT-PCR檢測(cè)檢驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表5還表明血液分析實(shí)際上鑒定了比腫瘤組織分析更多的癌癥標(biāo)記物。當(dāng)比較來自不同受試者以及來自相同受試者的血液和胂瘤時(shí)，其是正確的。這很可能源于每個(gè)受試者中多個(gè)腫瘤的存在。不同腫瘤很可能已隨著時(shí)間累積不同的突變。腫瘤組織樣品只能揭示單個(gè)肺瘤中的突變。然而，本發(fā)明的血液分析技術(shù)可同時(shí)揭示來自多個(gè)腫瘤的突變，只要其癌癥標(biāo)記物存在于血液中。這些人樣品檢驗(yàn)指導(dǎo)評(píng)估i)癌癥標(biāo)記物的有效性；ii)其個(gè)體性;和iii)純粹地基于計(jì)算排序從隨機(jī)的癌癥受試者的超集選擇其的能力。由于目前從對(duì)應(yīng)于人檢驗(yàn)樣品癌癥類型的每個(gè)超集檢驗(yàn)數(shù)以萬計(jì)的癌癥標(biāo)記物是不實(shí)際的，因此后者的特征很重要。表1顯示了用于檢驗(yàn)這些樣品的癌癥檢測(cè)試劑的兩條鏈(雖然實(shí)際上只利用反義鏈)。癌癥標(biāo)記物還作用于受試者中DNA的兩條鏈。如上所述，癌癥標(biāo)記物濾過數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的健康人轉(zhuǎn)錄本組并且都不一直存在。該設(shè)計(jì)限制以及癌癥檢測(cè)試劑小的大小使得其最適用于cDNA文庫(kù)診斷中的體外應(yīng)用。因此，對(duì)表l中的每種癌癥標(biāo)記物建立癌癥檢測(cè)試劑。圖8顯示了利用表1中的癌癥檢測(cè)試劑以及來自患者R的腫瘤、患者H的外周血以及來自健康無癌癥受試者的任意組織的cDNA的PCR還原結(jié)果。健康受試者的結(jié)果在泳道l，患者R的結(jié)果在泳道2，而患者H的結(jié)果在泳道3。圖8中呈現(xiàn)的模糊帶由尾端長(zhǎng)度的變化造成。由于癌癥檢測(cè)試劑絕對(duì)的癌癥-如果-存在以及健康-如果-缺乏的性質(zhì)，結(jié)果解釋為信號(hào)=癌癥以及無信號(hào)=健康。如圖8所示，表1中的癌癥檢測(cè)試劑從未產(chǎn)生來自凝膠泳道1的健康cDNA的陽性結(jié)果。(除了癌癥檢測(cè)試劑58，其如上所述，目前已被排除。)患者R和患者H呈現(xiàn)共同的標(biāo)記物，如已知均患有結(jié)腸癌而預(yù)料的一樣。然而，還如不同個(gè)體之間預(yù)期的那樣，其癌癥標(biāo)記物分布型中存在一些變化。此揭示兩個(gè)受試者的癌癥標(biāo)記物分布型的個(gè)體性。最后，表1僅包括來自結(jié)腸癌超集的最高順序的標(biāo)記物。如圖8表明的，計(jì)算出的、特定類型癌細(xì)胞系中癌癥標(biāo)記物的存在給出了用于降低對(duì)實(shí)際的人類受試者建立個(gè)體癌癥標(biāo)記物分布型體外檢驗(yàn)所需量的可行的排序方法。圖8顯示了不同癌癥檢測(cè)試劑不同程度的條帶強(qiáng)度。由于PCR還原用于該分析中，該變幅為包含相關(guān)樣品中存在的每種癌癥標(biāo)記物的mRNA轉(zhuǎn)錄物數(shù)量的良好反映。該信息在確定用于診斷和治療目的的合適靶標(biāo)中是有用的。為了澄清的目的，表5呈現(xiàn)圖8中結(jié)果的表格式列表。表5和圖8表明利用表1的59種癌癥檢測(cè)試劑的PCR還原分析足夠敏感到能檢測(cè)來自血樣的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中其代表的癌癥標(biāo)記物。該靈敏度源于癌癥標(biāo)記物的一對(duì)多遺傳關(guān)聯(lián)性，并且因此在許多情況中，只要提供了血樣，將不再需要組織樣品或活組織檢查以協(xié)助癌癥的病理學(xué)分析。本發(fā)明的癌癥檢測(cè)試劑通常被設(shè)計(jì)為能檢測(cè)癌細(xì)胞而非特定腫瘤特有的突變。已表明癌癥檢測(cè)試劑可檢測(cè)在血液中循環(huán)的細(xì)胞的癌癥標(biāo)記物。所以，PCR還原預(yù)計(jì)能檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織樣品以及來自相同受試者的血樣，以顯示血液中癌癥標(biāo)記物提高的數(shù)量。實(shí)際上，僅來自組織樣品的任何癌癥標(biāo)記物分布型將很可能次于血樣，因?yàn)榻M織樣品分布型實(shí)際上為單個(gè)活組織檢查腫瘤，而通常不是受試者癌癥的分布型。此可在表5中看到一些，其顯示來自患者H血樣對(duì)患者R組織樣品的提高的突變數(shù)量。然而，為了更清楚地顯示血樣超過組織樣品的優(yōu)越性，利用來自相同癌癥受試者的樣品類型進(jìn)行并排(sidebyside)PCR還原分析。對(duì)來自患者R樣品的分析結(jié)果在表5中顯示?；旧蠈?duì)于患者R，血樣相比僅組織樣品而言，更多的癌癥檢測(cè)試劑產(chǎn)生陽性結(jié)果。此外，組織樣品在2004年3月獲得，而血樣在2004年12月獲得。在這期間受試者經(jīng)歷廣泛的癌癥療法。十二月血樣中突變的高數(shù)量不僅反映了癌癥療法不起作用(如通過標(biāo)準(zhǔn)臨床觀察證實(shí)的)，其還反映了患者R的血液中癌細(xì)胞交流的高水平。這種大量交流很可能與高活性癌癥有關(guān)，如通過患者R對(duì)常規(guī)治療響應(yīng)的失敗以及其不斷惡化的病情所示的。實(shí)施例9:微陣列還可以利用包含具有癌癥標(biāo)記物序列的單鏈DNA分子的微陣列來分析血樣。這些DNA分子代表另一種類型的癌癥檢測(cè)試劑?？衫靡阎夹g(shù)產(chǎn)生所述微陣列，但引入新的癌癥標(biāo)記物。例如，用于檢測(cè)癌癥標(biāo)記物3和5-87的微陣列可包含來自列于表1中的寡聚體任一鏈的單鏈DNA。隨后可將血樣應(yīng)用于該微陣列，并且利用已知方法讀取微陣列，以揭示哪種癌癥標(biāo)記物由特定的受試者肺瘤呈現(xiàn)。為了確認(rèn)該方法的可行性，可將血樣與腫瘤樣品相比較，以觀察是否正如所料，血樣中觀察到提高的癌癥標(biāo)記物數(shù)量。另外，可將結(jié)果與利用PCR獲得的結(jié)果相比較。預(yù)計(jì)利用微陣列的結(jié)果應(yīng)該相同或幾乎相同，僅是存在由于該方法不同的靈敏度而產(chǎn)生的可解釋的一些差異。尤其，可利用微陣列廠商如Affymetrix(California)的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生微陣列。雖然已詳細(xì)描寫了本發(fā)明和其優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)理解在不背離下列權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的情況下可進(jìn)行各種變化、取代和替換。權(quán)利要求1.癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少10種常規(guī)癌癥標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑。2.權(quán)利要求l的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少50種常規(guī)癌癥才示i5物的癌癥檢測(cè)試劑。3.權(quán)利要求l的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少IOO種常規(guī)癌癥4示i己物的癌癥檢測(cè)試劑。4.癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少IO種結(jié)腸癌標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑。5.權(quán)利要求4的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少50種結(jié)腸癌才示i己物的癌癥檢測(cè)試劑。6.權(quán)利要求4的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少IOO種結(jié)腸癌標(biāo)i己物的癌癥檢測(cè)試劑。7.癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少IO種肺癌標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑。8.權(quán)利要求7的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少50種肺癌標(biāo)i己物的癌癥檢測(cè)試劑。9.權(quán)利要求7的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少IOO種肺癌標(biāo)i己物的癌癥檢測(cè)試劑。10.癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少io種淋巴癌標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑。11.權(quán)利要求10的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少50種淋巴癌標(biāo)i己物的癌癥檢測(cè)試劑。12.權(quán)利要求10的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少100種淋巴癌4示i己物的癌癥檢測(cè)試劑。13.癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少IO種乳腺癌標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑。14.權(quán)利要求13的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少50種乳腺癌標(biāo)i5物的癌癥檢測(cè)試劑。15.權(quán)利要求13的癌癥檢測(cè)試劑組，其包括對(duì)應(yīng)于至少100種乳腺癌標(biāo)記物的癌癥檢測(cè)試劑。16.癌癥檢測(cè)試劑組，其包括癌癥標(biāo)記物3和55-66的至少50種。17.包括至少50種癌癥檢測(cè)試劑的微陣列，每種癌癥檢測(cè)試劑可用于檢測(cè)樣品中癌癥標(biāo)記物的存在。18.權(quán)利要求17的微陣列，其中所述癌癥標(biāo)記物包括常規(guī)癌癥標(biāo)記物。19.權(quán)利要求17的微陣列，其中所述癌癥標(biāo)記物包括結(jié)腸癌標(biāo)記物o20.權(quán)利要求17的微陣列，其中所述癌癥標(biāo)記物包括肺癌標(biāo)記物。21.權(quán)利要求17的微陣列，其中所述癌癥標(biāo)記物包括淋巴癌標(biāo)記物。22.權(quán)利要求17的微陣列，其中所述癌癥標(biāo)記物包括乳腺癌標(biāo)記物。23.包括至少50種反義引物的PCR試劑盒，每種反義引物對(duì)應(yīng)于癌癥標(biāo)記物，并且可用于檢測(cè)樣品中癌癥標(biāo)記物的存在。24.權(quán)利要求23的PCR試劑盒，其中所述癌癥標(biāo)記物包括常規(guī)癌癥標(biāo)記物。25.權(quán)利要求23的PCR試劑盒，其中所述癌癥標(biāo)記物包括結(jié)腸癌標(biāo)記物。26.權(quán)利要求23的PCR試劑盒，其中所述癌癥標(biāo)記物包括肺癌標(biāo)記物。27.權(quán)利要求23的PCR試劑盒，其中所述癌癥標(biāo)記物包括淋巴癌標(biāo)記物，28.權(quán)利要求23的PCR試劑盒，其中所述癌癥標(biāo)記物包括乳腺癌標(biāo)記物。29.檢測(cè)樣品中癌癥標(biāo)記物的方法，包括從樣品提取mRNA;從mRNA產(chǎn)生cDNA;利用cDNA作為模板和至少IO種不同的單引物，在每個(gè)單獨(dú)的PCR還原反應(yīng)中用不同的單引物，進(jìn)行至少IO個(gè)單獨(dú)的PCR還原反應(yīng)；以及分析10個(gè)單獨(dú)的PCR還原反應(yīng)中每個(gè)的產(chǎn)物，以確定由引物擴(kuò)增的DNA分子的存在或缺乏，其中任何PCR還原反應(yīng)中由引物擴(kuò)增的DNA分子的存在表示癌癥標(biāo)記物的存在；其中所述10個(gè)不同的單引物每個(gè)具有對(duì)應(yīng)于不同癌癥標(biāo)記物的反義序列。30.權(quán)利要求29的方法，其中樣品包括外周血。31.權(quán)利要求29的方法，其中樣品包括組織。32.權(quán)利要求29的方法，其中樣品包括具有癌癥標(biāo)記物的癌細(xì)胞。33.權(quán)利要求29的方法，還包括利用至少50種不同的單引物進(jìn)行至少50個(gè)不同的PCR還原反應(yīng)。34.權(quán)利要求29的方法，還包括利用至少IOO種不同的單引物進(jìn)行至少IOO個(gè)不同的PCR還原反應(yīng)。35.權(quán)利要求29的方法，其中所述單引物包括5，引物。36.權(quán)利要求29的方法，其中所述單引物包括3，引物。37.權(quán)利要求29的方法，其中通過PCR還原反應(yīng)產(chǎn)生的任何DNA分子具有100和500個(gè)堿基對(duì)之間的長(zhǎng)度。38.權(quán)利要求29的方法，其中分析包括對(duì)瓊脂糖凝膠上的樣品進(jìn)行的電泳，隨后是對(duì)合適長(zhǎng)度DNA條帶的目測(cè)，所述條帶為PCR還原產(chǎn)物。39.權(quán)利要求29的方法，其中分析包括對(duì)PCR還原產(chǎn)生的產(chǎn)物中DNA分子的純化;和對(duì)所述DNA分子進(jìn)行測(cè)序。40.權(quán)利要求29的方法，其中所述DNA分子的序列指示癌癥標(biāo)記物所在的那個(gè)基因。41.權(quán)利要求29的方法，還包括利用對(duì)應(yīng)于至少兩種不同基因的引物，對(duì)每種PCR還原產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步基因檢測(cè)PCR反應(yīng)，其中所述基因是癌癥標(biāo)記物可能位于其中的基因；其中所述引物可用于確定，以所述PCR產(chǎn)物為基礎(chǔ)，所述癌癥標(biāo)記是否位于該至少兩種基因的每種中；和確定所述癌癥標(biāo)記物是否位于該至少兩種基因的每種中。42.權(quán)利要求29的方法，其中所述10種不同的單引物的每種具有對(duì)應(yīng)于不同常規(guī)癌癥標(biāo)記物的反義序列。43.權(quán)利要求29的方法，其中所述10種不同的單引物的每種具有對(duì)應(yīng)于不同結(jié)腸癌標(biāo)記物的反義序列。44.權(quán)利要求29的方法，其中所述10種不同的單引物的每種具有對(duì)應(yīng)于選自標(biāo)記物3和5-66的不同結(jié)腸癌標(biāo)記物的反義序列。45.權(quán)利要求29的方法，其中所述10種不同的單引物的每種具有對(duì)應(yīng)于不同肺癌標(biāo)記物的反義序列。46.權(quán)利要求29的方法，其中所述10種不同的單引物的每種具有對(duì)應(yīng)于不同淋巴癌標(biāo)記物的反義序列。47.權(quán)利要求29的方法，其中所述10種不同的單引物的每種具有對(duì)應(yīng)于不同乳腺癌標(biāo)記物的反義序列。48.權(quán)利要求29的方法，還包括建立樣品的癌癥標(biāo)記物分布型，其中所述癌癥標(biāo)記物分布型包括指示樣品中癌癥標(biāo)記物存在或缺乏的信息。49.檢測(cè)樣品中癌癥標(biāo)記物的方法，包括從樣品分離樣品核酸；在足以允許樣品核酸與微陣列的互補(bǔ)DNA分子可檢測(cè)地且特異性地結(jié)合的條件下，將所述樣品核酸置于微陣列上，所述微陣列具有可用于檢測(cè)和區(qū)別至少IO種對(duì)應(yīng)癌癥標(biāo)記物的DNA分子;和檢測(cè)樣品核酸與所述微陣列的結(jié)合，其中樣品核酸與微陣列上的DNA分子的結(jié)合表明樣品中對(duì)應(yīng)于所述DNA分子的癌癥標(biāo)記物的存在。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述樣品核酸包括mRNA。51.權(quán)利要求49的方法，其中所述樣品核酸包括從樣品中存在的mRNA產(chǎn)生的cDNA。52.權(quán)利要求49的方法，還包括具有可用于區(qū)別至少50種對(duì)應(yīng)癌癥標(biāo)記物的DNA分子的微陣列。53.權(quán)利要求49的方法，還包括具有可用于區(qū)別至少IOO種對(duì)應(yīng)癌癥標(biāo)記物的DNA分子的微陣列。54.權(quán)利要求49的方法，還包括具有可用于區(qū)別癌癥標(biāo)記物所在基因的DNA分子的微陣列。55.權(quán)利要求49的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括常規(guī)癌癥標(biāo)記物。56.權(quán)利要求49的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括結(jié)腸癌標(biāo)記物。57.權(quán)利要求49的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物選自癌癥標(biāo)記物3和5-66構(gòu)成的組。58.權(quán)利要求49的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括肺癌標(biāo)記物。59.權(quán)利要求49的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括淋巴癌標(biāo)記物。60.權(quán)利要求49的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括乳腺癌標(biāo)記物。61.權(quán)利要求49的方法，其中所述樣品包括外周血。62.權(quán)利要求49的方法，其中所述樣品包括組織。63.權(quán)利要求49的方法，還包括建立樣品的癌癥標(biāo)記物分布型，其中所述癌癥標(biāo)記物分布型包括指示樣品中癌癥標(biāo)記物存在或缺乏的信息。64.診斷受試者中癌癥的方法，包括從受試者獲得樣品；檢測(cè)樣品中至少IO種癌癥標(biāo)記物的存在或缺乏，以建立癌癥標(biāo)記物分布型，其中所述癌癥標(biāo)記物分布型包括指示受試者中癌癥標(biāo)記物存在或缺乏的信息;和以所述癌癥標(biāo)記物分布型為基礎(chǔ)確定受試者是否患有癌癥。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述樣品包括外周血。66.權(quán)利要求64的方法，其中所述樣品包括腫瘤組織。67.權(quán)利要求64的方法，其中受試者為人.68.權(quán)利要求64的方法，其中檢測(cè)包括對(duì)樣品進(jìn)行PCR還原。69.權(quán)利要求64的方法，其中檢測(cè)包括進(jìn)行樣品的微陣列分析70.權(quán)利要求64的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)至少50種癌癥標(biāo)記物。71.權(quán)利要求64的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)至少IOO種癌癥標(biāo)記物。72.權(quán)利要求64的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括常規(guī)癌癥標(biāo)記物o73.權(quán)利要求64的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括結(jié)腸癌標(biāo)記物。74.權(quán)利要求64的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物選自癌癥標(biāo)記物375.權(quán)利要求64的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括肺癌標(biāo)記物。76.權(quán)利要求64的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括淋巴癌標(biāo)記物。77.權(quán)利要求64的方法，其中所述癌癥標(biāo)記物包括乳腺癌標(biāo)記物。78.權(quán)利要求64的方法，其中確定受試者是否患有癌癥包括分析樣品中存在的癌癥標(biāo)記物的數(shù)目。79.權(quán)利要求64的方法，其中確定受試者是否患有癌癥包括分析樣品中存在的癌癥標(biāo)記物的身份。80.權(quán)利要求64的方法，其中診斷包括初始診斷。81.權(quán)利要求64的方法，其中所述診斷形成常規(guī)醫(yī)學(xué)篩查的一部分。82.權(quán)利要求64的方法，其中受試者疑似患有特定類型的癌癥。83.權(quán)利要求64的方法，還包括以所述癌癥標(biāo)記物分布型為基礎(chǔ)提供對(duì)患有癌癥的患者的預(yù)后。84.權(quán)利要求64的方法，還包括以所述癌癥標(biāo)記物分布型為基礎(chǔ)對(duì)患有癌癥的患者推薦治療。85.權(quán)利要求64的方法，還包括以所述癌癥標(biāo)記物分布型為基礎(chǔ)監(jiān)測(cè)患有癌癥的患者的治療。86.權(quán)利要求64的方法，還包括將癌癥標(biāo)記物分布型與之前的癌癥標(biāo)記物分布型比較以檢測(cè)受試者癌癥的變化。全文摘要本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)記物和檢測(cè)樣品中癌癥標(biāo)記物的方法。樣品可以是外周血。癌癥標(biāo)記物最通常為與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的突變或異常DNA序列?？衫肞CR、微陣列或基于核酸或肽的其它分析來檢測(cè)標(biāo)記物。這些方法可用于各種診斷目的，包括對(duì)癌癥，尤其是轉(zhuǎn)移性癌癥的初始、早期階段或晚期診斷，以及對(duì)癌癥或治療進(jìn)展的監(jiān)測(cè)。癌癥標(biāo)記物還可用于建立癌癥標(biāo)記物分布型?？梢曰谠摲植夹椭笇?dǎo)治療。另外，利用血液的方法可提供在體內(nèi)數(shù)個(gè)腫瘤的至少一個(gè)，而不是僅僅一個(gè)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的突變或異常的癌癥標(biāo)記物分布型。本發(fā)明還包括用于進(jìn)行各種方法的試劑盒，如引物試劑盒和微陣列。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101107367SQ200680003151公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年1月24日優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日發(fā)明者D·A·諾爾思申請(qǐng)人:天空遺傳學(xué)公司