專利名稱：使用正義單鏈病毒rna載體在植物中生產(chǎn)抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用正義單鏈RNA病毒栽體在植物、植物部分或植物細(xì) 胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生異源寡聚蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的方法和栽體為植物細(xì)^l:
供產(chǎn)量提高的功能性異源寡聚重組蛋白，例如全長(zhǎng)的抗體或其異源寡聚合 成衍生物(包括與其它蛋白質(zhì)或其片段的融合).
背景技術(shù)：
基于植物的分子農(nóng)業(yè)是產(chǎn)生設(shè)計(jì)用于人類和動(dòng)物健康領(lǐng)域的重組蛋白 的良機(jī)，由于其潛在的低生產(chǎn)成本以及生物制藥工業(yè)為從制造方法中消除 動(dòng)物衍生蛋白質(zhì)的嘗試(因?yàn)檫@些產(chǎn)品可能受到人抗原，例如牛海綿狀腦炎 (BSE)或克雅病(CJD， vCJD)污染)而成為優(yōu)選.然而，使用基于強(qiáng)組成型或 組織特異性啟動(dòng)子的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)系統(tǒng)不能解決在植物細(xì)胞中高產(chǎn)量生產(chǎn)異源 寡聚蛋白質(zhì)的問(wèn)題，原因如下首先，大部分這樣的重組蛋白對(duì)植物生長(zhǎng) 和發(fā)育具有不利的影響，因此嚴(yán)重影響產(chǎn)量；其次，使用組織特異性啟動(dòng) 子(例如種子特異性)需要將編碼藥物蛋白質(zhì)的基因穩(wěn)定摻入可食用作物植 物(例如稻、玉米、小麥)的基因組，這在開(kāi)放領(lǐng)域栽培情況下可能產(chǎn)生轉(zhuǎn) 基因流控制的問(wèn)題.此外，如果出于產(chǎn)物的低產(chǎn)量而在封閉(溫室)環(huán)境中 使用，這些系統(tǒng)是不可商購(gòu)的.
基于植物病毒的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(見(jiàn)綜述Porta和Lomonossoff， 1996， Mo/.歷W"Aiw/" S， 209-221 ; Yusibov等人，1999， Cwir.r印.M,c^6iV^ /加挑m朋/" 2^. 81-94; Gleba等人2004， 0^/". 1V朋fL182-188) 能夠在植物葉組織中提供高表達(dá)水平并且在一定程度上能夠處理重組蛋白 質(zhì)的毒性及其對(duì)植物發(fā)育的有害影響的問(wèn)題，因?yàn)樵摷夹g(shù)能夠使生長(zhǎng)和生
產(chǎn)期分離.最佳已建立的和可商購(gòu)的系統(tǒng)是基于正義單鏈RNA病毒栽體， 優(yōu)選基于煙草花葉病毒(TMV)衍生的栽體(Kumagai等人，1994, Proc. Natl. Acad. ScL USA，卯，427-430; Mallory等人，2002， Nature Biotechnol. 20， 622-625; US5316931 ; US5589367; US5866785; US5977438; WO02088369; WO02097080; WO022卯68; US5491076)。然而，這些系統(tǒng)受到嚴(yán)重的局限， 限制其用于產(chǎn)生簡(jiǎn)單、相對(duì)小的蛋白質(zhì)。這部分是由于病毒栽體的不穩(wěn)定 及其高頻率的回復(fù)成為野生型(如果其帶有大于1 kb的異源序列)而引起。 該技術(shù)的另 一嚴(yán)重的局限是缺乏能夠表達(dá)^最有價(jià)值的重組蛋白類的復(fù) 合異源寡聚蛋白質(zhì)(例如治療的單克隆抗體及其衍生物)的病毒栽體系統(tǒng)。
僅有一份公開(kāi)提出使用植物病毒栽體在植物中表達(dá)全長(zhǎng)的單克隆抗體 (Verch等人，1998， J. Immunol. Meth.， 220， 69- 75).該文獻(xiàn)描述了使用兩 個(gè)系統(tǒng)的基于TMV的病毒栽體在體系的葉中表達(dá)單克隆抗體的重鏈和輕 鏈，通過(guò)使用所述栽體的體外合成的轉(zhuǎn)錄本共轉(zhuǎn)染本氏煙草(N. benthamiana)植物，從不同栽體表達(dá)不同的鏈.然而，重組蛋白在所述系 統(tǒng)中的產(chǎn)量4艮低，以至于必須使用高度靈敏的測(cè)試，例如Western印跡和 ELISA確定裝配的單克隆抗體的存在.由于重組抗體的微不足道的產(chǎn)量， 該系統(tǒng)不適于實(shí)際應(yīng)用并且不具有商業(yè)價(jià)值。因?yàn)閮蓚€(gè)或多個(gè)基于TMV 的病毒栽體通常不存在于被轉(zhuǎn)染植物的相同植物組織中(見(jiàn)實(shí)施例1),檢測(cè) 的抗原結(jié)合活性可能歸因于在分離^Mt中來(lái)自不同細(xì)胞或組織中表達(dá)的抗 體重鏈和輕鏈的體外裝配.先前已表明功能性的抗體可以由變性和還原的 抗體組分體外裝配(Petersen和Dorrington， 1974，工及》/L 0^ i.，12i 5633-5641; Maeda等人1996， iVvtei"五"g/"從i7"g，丄95-100),然而， 在缺乏這樣裝配的適宜條件下，這樣的裝配的效率極低。
因此，對(duì)于重組的異源寡聚蛋白質(zhì)，在植物中沒(méi)有其產(chǎn)量和效率足以 與其它大,表達(dá)系統(tǒng)(例如真菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))市場(chǎng)竟?fàn)幍拇螅?表達(dá)系統(tǒng)。這樣的植物表達(dá)必須盡可能好地滿足下列標(biāo)準(zhǔn)
(i)高產(chǎn)量，包括在盡可能多的植物組織中和所述組織的盡可能多的細(xì) 胞中表達(dá)目標(biāo)異源寡聚蛋白質(zhì)；
(ii)為了避免重組蛋白表^j"植物生長(zhǎng)的有害影響，蛋白質(zhì)或目標(biāo)產(chǎn)物 的表達(dá)應(yīng)該為瞬時(shí)(或可轉(zhuǎn)換的)從而能夠在期望的植物發(fā)育階段開(kāi)始表
達(dá)；
(m)提供在植物細(xì)胞中編碼異源寡聚蛋白質(zhì)不同亞基的多蛋白的最佳 比率，從而在由所述亞基組裝的所述重組蛋白水平上支持重組蛋白的高產(chǎn) 量。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供在植物、植物部分或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn) 生異源寡聚蛋白質(zhì)的有效方法。另 一 目標(biāo)是提供能夠表達(dá)異源寡聚蛋白質(zhì) 的高產(chǎn)量的植物表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供在相同植物細(xì)胞中共 表M過(guò)一種目的多肽的有效方法。此外，本發(fā)明的目標(biāo)是為在植物、植 物部分或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)抗M供快速和高產(chǎn)量的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供在植物、植物組織或植物細(xì)胞中產(chǎn)生包括至少第一和第二 蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括通過(guò)以下方式在植物
中表達(dá)至少所述第 一和第二蛋白質(zhì)亞基
(i) 向所^ti物、所i^iL物組織或所述植物細(xì)胞提供第一和笫二正義單
鏈RNA病毒栽體，所述第一病毒載體編碼至少所述第一蛋白質(zhì)亞基，所 述第二病毒栽體編碼至少所述第二蛋白質(zhì)亞基，其中，至少所述第一病毒 栽體和所述第二病毒栽體是非竟?fàn)幍牟《驹泽w；或
(ii) 向所i^HL物、所i^物組織或所i^ML物細(xì)胞提供編碼至少所述第一 和所述第二蛋白質(zhì)亞基的正義單鏈RNA病毒栽體.
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一病毒載體和所述第二病毒栽體由于是不 同的病毒栽體因而是非竟?fàn)幮缘?。在另一?shí)施方案中，所述第一病毒栽體 和所述第二病毒栽體由于并非衍生自相同的RNA病毒因而是非竟?fàn)幮缘? 在另一實(shí)施方案中，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體由于在除了編 碼所述第一和第二蛋白質(zhì)亞基的序列部分之外的序列部分不同因而是非竟 爭(zhēng)性的.在另一實(shí)施方案中，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體由于
衍生自屬于不同病毒種的RNA病毒因而是非竟?fàn)幮缘?。在另一?shí)施方案 中，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體由于衍生自屬于不同病毒屬的 RNA病毒因而是非竟?fàn)幮缘摹?br> 本發(fā)明的另一實(shí)施方案是在植物、植物組織或植物細(xì)胞中產(chǎn)生包含至 少第 一和第二蛋白質(zhì)亞基(例如抗體的重鏈和輕鏈)的抗體，所述方法包括 在植物細(xì)胞中通過(guò)以下方法表達(dá)至少所述第 一和所述第二蛋白質(zhì)亞基
(i) 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染向所述植物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞 提供第一正義單鏈RNA病毒栽體的DNA前體和笫二正義單鏈RNA病毒 栽體的DNA前體，所述第一病毒栽體編碼至少所述笫一蛋白質(zhì)亞基，所 述第二病毒栽體編碼至少所述第二蛋白質(zhì)亞基，其中，至少所述第一病毒 載體或所述第二病毒栽體缺少編碼所述第一或所述第二病毒栽體在所^L 物中系統(tǒng)轉(zhuǎn)移所需的功能性蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框；或
(ii) 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染向所述植物、所iitt物組織或所述植物細(xì) 胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基的正義單鏈RNA病毒栽 體的DNA前體，其中，所述病毒栽體缺少編碼系統(tǒng)移動(dòng)所需的功能性蛋 白質(zhì)的ORF.
本發(fā)明還提供在植物、植物組織或植物細(xì)胞中產(chǎn)生包含至少第一和笫 二蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在植物細(xì)胞中表達(dá) 來(lái)自一個(gè)或多個(gè)正義單鏈RNA病毒栽體的至少所述第一和所述笫二蛋白 質(zhì)亞基。
在權(quán)利要求和下^t本發(fā)明的另 一實(shí)施方案進(jìn)行描述， 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇的建立了使用植物病毒栽體在植物中產(chǎn) 生高產(chǎn)量的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法。在植物中有效產(chǎn)生異源寡聚蛋白質(zhì)需 要在相同植物細(xì)胞中高產(chǎn)量的產(chǎn)生異源寡聚蛋白質(zhì)的不同蛋白質(zhì)亞基。這 樣，可以利用所述細(xì)胞的天然蛋白組裝能力，例如其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，在具有 表達(dá)的所述至少兩種蛋白質(zhì)亞基的細(xì)胞中有效組裝異源寡聚蛋白質(zhì)。因此 無(wú)需在體外低效率地組裝所述異源寡聚蛋白質(zhì).本發(fā)明通過(guò)以上步驟(i)或 通過(guò)以上步驟(ii)或通過(guò)以上步驟(i)和(ii)的組合，首次在相同細(xì)胞中獲得兩
個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的有效共表達(dá)。
所述第一蛋白質(zhì)亞M RNA病毒栽體中由第一異源(核酸)序列編碼. 所述第二蛋白質(zhì)亞M RNA病毒栽體中由第二異源(核酸)序列編碼。因 此，這些異源序列是所述病毒載體的RNA序列并且通常包含或編碼表達(dá) 所述蛋白質(zhì)亞基所需的調(diào)節(jié)序列。這類調(diào)節(jié)序列的實(shí)例為亞基因組啟動(dòng)子、 IRES元件和3，-非翻譯序列。這里，如果序列并非天然存在于其衍生自的 病毒中，則該序列為異源序列。
根據(jù)本發(fā)明，可生產(chǎn)的異源寡聚蛋白質(zhì)具有至少第一和第二亞基，其 中，所述第一和所述第二亞基具有不同的多肽序列。因此，所述第一和所 述第二亞基通常必須由不同的異源核酸序列表達(dá)。寡聚蛋白質(zhì)的亞基組裝 形成寡聚蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基的組裝通常涉及亞基之間的非共價(jià)鍵。 此外，可以在所述蛋白質(zhì)亞基之間形成共價(jià)鍵，例如二疏鍵.
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源寡聚蛋白質(zhì)為異源二聚體蛋白質(zhì)，即具 有兩個(gè)不同蛋白質(zhì)亞基的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，所述異源寡聚蛋白 質(zhì)可能具有超過(guò)兩個(gè)不同亞基，例如3或4個(gè)不同亞基(分別為異源三聚體 或異源四聚體蛋白質(zhì))。在另一實(shí)施方案中，所述異源寡聚蛋白質(zhì)可以具有 兩個(gè)不同的亞基，其中，在所述異源寡聚蛋白質(zhì)中所述亞基的一個(gè)或兩個(gè) 可以存在超過(guò)一次，所述異源寡聚蛋白質(zhì)的亞基組成的實(shí)例是AaBb、 AJBbCc和AaBbCcDd，其中A代表第一蛋白質(zhì)亞基，B代表第二蛋白質(zhì)亞 基，C和D代表其它的蛋白質(zhì)亞基。每個(gè)大寫字母A、 B、 C和D代表與 其它蛋白質(zhì)亞基不同的蛋白質(zhì)亞基，且小寫字母代表至少為1的整數(shù)，其 表示在所述異源寡聚蛋白質(zhì)中各個(gè)蛋白質(zhì)亞基的拷貝數(shù). 一個(gè)實(shí)例是IgG 抗體，其具有亞基組成A2B2，其中A代表第一蛋白質(zhì)亞基(例如重鏈)且B 代表第二蛋白質(zhì)亞基(例如輕鏈)，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的異源寡聚蛋 白質(zhì)具有兩個(gè)或三個(gè)不同的蛋白質(zhì)亞基，更優(yōu)選具有兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)亞 基。
在本發(fā)明的方法中，通過(guò)所述步驟(i)或/和所述步驟(ii)在所述植物、所 述植物組織或所述植物細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)
亞基。每種所述步驟(i)和(ii)使能夠在相同細(xì)胞中表達(dá)至少所述第一和所述 第二蛋白質(zhì)亞基，從而可以在所述細(xì)胞中有效產(chǎn)生所述異源寡聚蛋白質(zhì)。 步驟(i)和(ii)可以相似，特別是對(duì)于產(chǎn)生具有三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)不同蛋白
質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)(見(jiàn)實(shí)施例7)。
本發(fā)明的所述正義單鏈RNA病毒載體在這里也被簡(jiǎn)稱為"病毒載體"。 通常所述正義單鏈RNA病毒栽體衍生自正義單鏈植物RNA病毒。
在步驟(ii)中，向所述植物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞提供編碼至 少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基的正義單鏈RNA病毒栽體。編碼至少 所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基的所述病毒栽體含有作為插入片段的編碼 所述第一蛋白質(zhì)亞基的第一異源序列，該蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)可能在第一亞 基因組啟動(dòng)子的控制之下。此外，所述病毒栽體含有作為插入片段的編碼 所述第二蛋白質(zhì)亞基的第二異源序列，該蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)可能在第二亞 基因組啟動(dòng)子的控制之下。如果所述第 一和所述第二蛋白質(zhì)亞基都在亞基 因組啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，這些亞基因組啟動(dòng)子優(yōu)選在序列上不同，以避 免在所述病毒栽體中的自身同源(self-homology)，其將在植物細(xì)胞中導(dǎo)致 不期望的重組事件。可以^物病毒的不同菌林或種采集這樣的不同亞基 因組啟動(dòng)子，例如一個(gè)亞基因組啟動(dòng)子可以是(或可以衍生自)煙草花葉病 毒(TMV) Ul的包被蛋白(CP)亞基因組啟動(dòng)子和其它的亞基因組啟動(dòng)子可 以是(或可以衍生自)煙草花葉病毒(TMV) U5的CP亞基因組啟動(dòng)子或來(lái)自 感染十字花科植物的煙草花葉病毒(cr-TMV),
代替所述第一或所述第二亞基因組啟動(dòng)子，可以在1RES(內(nèi)部核糖體 ii/v位點(diǎn))元件控制下翻譯所述第一或所述第二蛋白質(zhì)亞基。盡管所述第一 或所述第二蛋白質(zhì)亞基兩者的翻譯可以在IRES元件控制下進(jìn)行，優(yōu)選使 用亞基因組啟動(dòng)子表達(dá)所述蛋白質(zhì)亞基的至少一種.在本發(fā)明中使用的 IRES元件可以從例如cr-TMV植物病毒或其它植物病毒獲得(Proc Natl Acad Sci USA 2002， 99， 5301-6; Virology 1999， 263， 139-54; WO03020927; WO0229068)。
步驟(ii)的所述病毒載體優(yōu)選不能在所述植物或所述植物組織中系統(tǒng)
移動(dòng)。這可以例如通過(guò)省略病毒顆粒組裝的功能起點(diǎn)而獲得。例如在煙草
花葉病毒中，病毒顆粒組裝的起點(diǎn)位于MP ORF。因此可以通過(guò)從所述病 毒載體缺失全部或部分的MP ORF省略病毒顆粒組裝的起點(diǎn)。因此所述病 毒栽體優(yōu)選缺少功能性移動(dòng)蛋白(MP) ORF。更優(yōu)選地，所述病毒載體缺 少系統(tǒng)移動(dòng)所述病毒栽體所需的功能性蛋白質(zhì)。在這一實(shí)施方案中，所述 病毒載體可以缺少功能性包被蛋白質(zhì)ORF,且大部分優(yōu)選的所述病毒載體 同時(shí)缺少功能性移動(dòng)蛋白ORF和功能性包被蛋白質(zhì)ORF。從病毒栽體省 略MP ORF和/或CP ORF為在所述病毒載體中編碼至少所述笫一和所述 第二蛋白質(zhì)亞基而不損害病毒栽體的穩(wěn)定性提供了更多的空間。在這一實(shí)
施方案中，優(yōu)選向所述植物或所述植物組織的多數(shù)細(xì)胞提供所述病毒栽體 以獲得大量細(xì)胞的感染。這可以使用農(nóng)桿菌通過(guò)將所述RNA病毒栽體的 DNA前體作為T-DNA ^供而獲得(見(jiàn)以下)。
步驟(ii)的所述病毒栽體可以衍生自任何正義單鏈植物RNA病毒，例 如在"發(fā)明詳述"部分所列。優(yōu)選的病毒組為煙草花葉病毒、馬鈴薯X病 毒(potexvirus)和馬鈴薯Y病毒(potyvirus)。最優(yōu)選的病毒是TMV和PVX。 所述病毒栽體至少含有來(lái)自病毒的ORF，其衍生自所述病毒栽體復(fù)制所需 蛋白質(zhì)的編碼序列。所述病毒栽體通常還包含病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)元件和至少 一個(gè)亞基因組啟動(dòng)子.
在步驟(i)中，向所述植物、所逸汰物組織或所述植物細(xì)胞提供第一和 第二正義單鏈RNA病毒栽體。所述第一病毒栽體編碼至少所述第一蛋白 質(zhì)亞基，所述第二病毒栽體編碼至少所述第二蛋白質(zhì)亞基，
步驟(i)使能夠產(chǎn)生具有兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)。步 驟(i)還使能夠產(chǎn)生具有超過(guò)兩個(gè)不同亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)，例如三個(gè)或 四個(gè)不同的蛋白質(zhì)亞基。在這種情況下，可以向所述植物、植物組織或植 物細(xì)胞提供第一、笫二和第三病毒載體(且任選地提供更多的病毒載體)， 每個(gè)栽體編碼所述不同蛋白質(zhì)亞基之一 。如果在步驟(i)必須表達(dá)三個(gè)或四 個(gè)不同的蛋白質(zhì)亞基，優(yōu)選該三個(gè)或四個(gè)病毒載體彼此分別都是非竟?fàn)幮?病毒栽體。在三個(gè)病毒載體的情況，第一病毒栽體可以衍生自煙草花葉病
毒，第二病毒載體可以衍生自馬鈴薯Y病毒，第三病毒載體可以衍生自馬 鈴薯X病毒。
如果兩個(gè)病毒栽體能夠在相同的植物細(xì)胞中有^達(dá)其編碼的蛋白質(zhì)
亞基(共表達(dá))，則這兩個(gè)病毒載體是非竟?fàn)幮缘?。共表達(dá)需要至少兩個(gè)不 同的病毒載體在大量表達(dá)其編碼的異源序列之前的復(fù)制期間不彼此戰(zhàn)勝.
在所述至少兩個(gè)病毒栽體的RNA水平上序列差異越高，其在相同植物細(xì) 胞中越為非竟?fàn)幮?由于所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體是不同的 病毒栽體，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體是非竟?fàn)幮圆《据d體。
為了是非竟?fàn)幮缘牟《据d體，在一個(gè)通常的實(shí)施方案中，所述第一和 所述第二病毒載體(所述兩個(gè)非竟?fàn)幮圆《据d體)除了在編碼所述蛋白質(zhì)亞
基的所述異源序列上不同，還至少在序列部分有差異。優(yōu)選地，除了所述 異源序列，序列部分中的這類差異衍生自植物RNA病毒，例如涉及病毒 功能的序列部分，例如病毒在植物細(xì)胞中的復(fù)制(例如編碼復(fù)制酶的序列)、 病毒蛋白質(zhì)的翻譯(例如亞基因組啟動(dòng)子)或病毒的細(xì)胞-至—細(xì)胞或長(zhǎng)距 離的運(yùn)動(dòng)。
為了是非竟?fàn)幮缘牟《驹泽w，在另一個(gè)通常的實(shí)施方案中，所述第一 和所述第二病毒栽體(所述兩個(gè)非竟?fàn)幮圆《驹泽w)來(lái)自不同的植物病毒。
在這一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例中，所迷至少兩個(gè)非竟?fàn)幮圆《驹泽w并非衍生 自相同病毒菌林的病毒。在另一實(shí)例中，所迷至少兩個(gè)非竟?fàn)幮圆《驹泽w 并非衍生自相同病毒種的病毒.在更多的實(shí)例中，所述至少兩個(gè)非竟?fàn)幮?病毒栽體并非衍生自相同病毒屬的病毒.因此，所述第一病毒栽體和所述 第二病毒載體優(yōu)選衍生自不同菌林的病毒，更優(yōu)選來(lái)自不同種的病毒，最 優(yōu)選來(lái)自不同屬的病毒。
所述笫一病毒栽體可以衍生自屬于馬鈴薯X病毒屬的病毒，且所述第 二病毒載體可以衍生自屬于馬鈴薯Y病毒屬的病毒.具體的，所述第一病 毒載體可以衍生自馬鈴薯病毒X，且所述第二病毒栽體可以衍生自馬鈴薯 病毒Y.
在馬鈴薯Y病毒載體(potyviral vector)的情況下，所述蛋白質(zhì)亞基能
夠作為與病毒多蛋白的融合而表達(dá)，其中，可以通過(guò)馬鈴薯Y病毒蛋白酶 識(shí)別位點(diǎn)從所述多蛋白分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)亞基。
在另一實(shí)施方案中，所述第一病毒栽體可以衍生自屬于馬鈴薯X病毒 屬的病毒，且所述第二病毒載體可以衍生自屬于煙草花葉病毒屬的病毒. 具體的，所述第一病毒載體可以衍生自馬鈴薯病毒X，且所述第二病毒栽 體可以衍生自煙草花葉病毒。
"從病*生"意指病毒栽體含有其衍生自的病毒的遺傳元件或序列 部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒栽體含有從RNA病毒獲得的復(fù)制酶 ORF (開(kāi)放閱讀框).在另一實(shí)施方案中，病毒栽體含有來(lái)自RNA病毒的 運(yùn)動(dòng)蛋白ORF以及任選的還有復(fù)制酶ORF。如果需要，可以突變從RNA 病毒獲得的病毒遺傳元件,例如從而引入病毒載體克隆所需要的限制位點(diǎn)。
其中所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體都是基于煙草花葉病毒載 體TMV 30 B的一個(gè)實(shí)施方案被排除在本發(fā)明方法的步驟(i)之外，因?yàn)樵?這種情況下所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體并非不同的病毒栽體而 是相同的病毒載體(參見(jiàn)Verch等人，J. Immunological Methods 220 (1998) 69-75)。
所述第一和所述第二病毒載體(所述非竟?fàn)幮圆《驹泽w)優(yōu)選具有至多 90%，更優(yōu)選至多80%，甚至更優(yōu)選至多70%和最優(yōu)選至多60。/。的RNA 水平上的序列同源性.更具體的，所述第一病毒栽體的任何序列段的100 個(gè)威基與所述第二病毒栽體的任何序列段的100個(gè)M具有至多90% ,優(yōu) 選至多80 % ，更優(yōu)選至多70 %和最優(yōu)選至多60 %的序列同源性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一病毒栽體的復(fù)制酶ORF(或者，如果該 復(fù)制酶由超過(guò)一個(gè)ORF編碼，則為多個(gè)ORF)和所述第二病毒栽體的復(fù)制 酶ORF(或者，如果該復(fù)制酶由超過(guò)一個(gè)ORF編碼，則為多個(gè)ORF)具有 至多卯％,更優(yōu)選至多80%，甚至更優(yōu)選至多70%和最優(yōu)選至多60%的 序列同源性。在另一實(shí)施方案中，所述第一病毒栽體的復(fù)制酶ORF和所 述第二病毒載體的復(fù)制酶ORF具有至多85%，更優(yōu)選至多75%，甚至更 優(yōu)選至多65 %和最優(yōu)選至多55%的同 一性。
在步驟(i)中，所述第一病毒載體優(yōu)選含有編碼所述第一蛋白質(zhì)亞基的
第一異源序列，該蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)可能在笫一亞基因組啟動(dòng)子的控制下。 所述第二病毒載體優(yōu)選含有編碼所述第二蛋白質(zhì)亞基的第二異源序列，該
蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)可能在第二亞基因組啟動(dòng)子的控制下。可以以IRES元
件代替所述亞基因組啟動(dòng)子的一個(gè)或兩個(gè)。對(duì)于步驟(ii)與上述相似，如果
所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基都在亞基因組啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，這些
亞基因組啟動(dòng)子優(yōu)選在序列上不同以避免在所述第 一和所述第二病毒載體
(以及任何更多的病毒栽體)之間的同源性，該同源性將在植物細(xì)胞中導(dǎo)致
不希望的重組事件?？梢詮牟煌木只蛑参锊《痉N獲得這類不同的亞基
因組啟動(dòng)子，例如一個(gè)亞基因組啟動(dòng)子可以是煙草花葉病毒(TMV) Ul的
包被蛋白(CP)亞基因組啟動(dòng)子，和另一亞基因組啟動(dòng)子可以是TMVU5或
十字花科感染的煙草花葉病毒(cr-TMV)的CP亞基因組啟動(dòng)子。
由于在構(gòu)建本發(fā)明的病毒栽體時(shí)可以省略細(xì)胞-至-細(xì)胞或"1U巨離移 動(dòng)所需要的植物病毒的ORF，可以通過(guò)比較所述病毒栽體的復(fù)制酶ORF 確定所述非竟?fàn)幮圆《驹泽w的相關(guān)性.
可以將分別編碼所述第 一和所述第二蛋白質(zhì)亞基的所述第 一和所述第 二異源序列作為附加序列加入所述病毒栽體。優(yōu)選加入所述異源序列使能 夠獲得高水平的表達(dá)。為此目的，將所述異源序列加在病毒的3，末端，因 為在許多病毒中，3， ORF通常是表達(dá)水平最高的ORF.然而，優(yōu)選用所 述異源序列代替所述病毒的天然序列，例如所述病毒的天然3， ORF，其在 許多病毒例如煙草花葉病毒中為CPORF.因此，所述第一和/或所述第二 病毒載體優(yōu)選缺少所述病毒栽體系統(tǒng)移動(dòng)的ORF。所述病毒栽體還可以缺 少細(xì)胞-至-細(xì)胞移動(dòng)的ORF,例如在煙草花葉病毒中的MPORF.
在本發(fā)明中，可以將步驟(i)和步驟(ii)組合，特別是對(duì)于表達(dá)具有三個(gè) 或更多不同亞基的異源寡聚蛋白質(zhì).如果要生產(chǎn)的異源寡聚蛋白質(zhì)具有四 個(gè)不同蛋白質(zhì)亞基，可以根據(jù)步驟(i)表達(dá)兩個(gè)蛋白質(zhì)亞基，根據(jù)步驟(ii)在 植物或植物組織的細(xì)胞中生產(chǎn)另外的兩個(gè)蛋白質(zhì)亞基。然而，優(yōu)選的，可 以從第一病毒栽體表達(dá)兩個(gè)蛋白質(zhì)亞基，從對(duì)第一病毒載體非竟?fàn)幮缘牡?br> 二病毒栽體表達(dá)兩個(gè)蛋白質(zhì)亞基。如果要生產(chǎn)具有三個(gè)不同蛋白質(zhì)亞基的
異源寡聚蛋白質(zhì)，可以根據(jù)步驟(i)通過(guò)從笫一病毒載體表達(dá)兩個(gè)蛋白質(zhì)(與 步驟(ii)所述相似)，并且從非竟?fàn)幮圆《驹泽w表達(dá)第三個(gè)蛋白質(zhì)亞基來(lái)表 達(dá)所述三個(gè)蛋白質(zhì)亞基。
通常在DNA水平^it本發(fā)明的病毒栽體。如果將所述病毒栽體作為 RNA病毒栽體提供給植物細(xì)胞或植物組織細(xì)胞，可以例如使用噬菌體聚合 酶，例如T7聚合酶以及合適的啟動(dòng)子將所述DNA體外轉(zhuǎn)錄為所述RNA 病毒栽體。優(yōu)選將兩個(gè)不同的病毒栽體作為混合物用于所述植物以保證向 所述植物細(xì)胞同時(shí)提供兩個(gè)病毒載體。然而，優(yōu)選使用所述RNA病毒載
細(xì)胞提供本發(fā)明的病毒栽體。所述DNA前體在所述植物的細(xì)胞中具有轉(zhuǎn) 錄啟動(dòng)子活性，通過(guò)所述DNA前體的轉(zhuǎn)錄形成所述病毒栽體。最優(yōu)選的 所述DNA前體是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的T-DNA。接著通過(guò)用兩個(gè)或多個(gè)農(nóng) 桿菌菌林的混合物(如懸液)處理所述植物，向所述植物或所述植物組織提 供兩個(gè)或多個(gè)病毒栽體，其中，每個(gè)菌抹含有編碼特定病毒栽體的T-DNA。 使用這樣的農(nóng)桿菌懸液處理植物的主要部分可以代替天然植物病毒的系統(tǒng) 移動(dòng)功能和/或細(xì)胞-至-細(xì)胞移動(dòng)功能。
在本發(fā)明中最優(yōu)選通it^桿菌使用所述病毒栽體的DNA前體瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染所述植物、植物組織或植物細(xì)胞.然而，可以將所述病毒栽體的所述DNA 前體穩(wěn)定摻入植物染色體DNA。可以通過(guò)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制所述病毒栽 體從染色體DNA的釋放.
如果通過(guò)DNA前體向所述植物提供所述病毒栽體，優(yōu)選采取措施以 提高所述病毒栽體從細(xì)J!^亥(栽體在其中被轉(zhuǎn)錄)至細(xì)胞質(zhì)(所述病毒栽體在 其中復(fù)制)的轉(zhuǎn)移效率.這可以通過(guò)在所述DNA前體中包含內(nèi)含子而實(shí)現(xiàn)， 特別是如在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP05/000492，公布為WO2005〃10卯中詳 細(xì)描述的病毒載體的復(fù)制酶ORF中，其在這里被引入作為參考。
可以將本發(fā)明的方法用于其中存在或在今后可以作出植物病毒表達(dá)系 統(tǒng)的任何植物。所述植物可以是單子葉或雙子葉。在雙子葉中，優(yōu)選茄科、
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十字花科、藜科和豆科。在茄科中，優(yōu)選煙草屬，如普通煙草(N. tabacum) 或本氏煙草。其它優(yōu)選的植物是紫苜蓿(# //0^^她^)和甜菜種，如甜菜 (Beta vulgaris),
使用本發(fā)明的方法在植物系統(tǒng)中產(chǎn)生異源寡聚蛋白質(zhì)。優(yōu)選的異源寡 聚蛋白質(zhì)是免疫球蛋白，如以下類型的免疫球蛋白免疫球蛋白G、免疫 球蛋白A、免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白E。這些免疫球蛋 白可以包含至少抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)域部分。如情況所需，如果根據(jù)本發(fā)明產(chǎn) 生的這些免疫球蛋白包含至少兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)亞基，其可以相對(duì)于天然 動(dòng)物的免疫球蛋白被修飾。該免疫球蛋白可以包含與免疫球蛋白重^目連 的保護(hù)蛋白質(zhì)，其中該保護(hù)蛋白質(zhì)包含多聚免疫球蛋白受體部分。另一優(yōu) 選的異源寡聚蛋白質(zhì)是胰島素。
按照情況需要，可以以多種不同的方式，相對(duì)于天然蛋白質(zhì)#^本發(fā) 明的異源寡聚蛋白質(zhì)。在異源寡聚蛋白質(zhì)中，可以用植物特異性的信號(hào)肽 代替天然異源寡聚蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)亞基的形成分泌信號(hào)的前導(dǎo) 序列.所述植物特異性信號(hào)肽可以衍生自煙草鈣網(wǎng)蛋白和/或稻ct淀粉酶。 所述異源寡聚蛋白質(zhì)的至少一個(gè)或至少兩個(gè)或多個(gè)亞基可以含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯 留信號(hào)KDEL以提高植物細(xì)胞中所述異源寡聚蛋白質(zhì)從所述亞基的組裝。 此外，可以突變編碼所述蛋白質(zhì)亞基的所述異源序列以從所述異源寡聚蛋 白質(zhì)中部分或全部地除去糖基化位點(diǎn)。而且，可以例如通過(guò)^tit植物糖基 化機(jī)制的組分，例如一個(gè)或多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，改變要表達(dá)的異源寡聚蛋白 質(zhì)的糖JMt方式。
可以在表達(dá)之后根據(jù)/^的操作^物、植物組織或植物細(xì)胞分離本 發(fā)明的異源寡聚蛋白質(zhì)。接著可以純化所述異源寡聚蛋白質(zhì)至基本同質(zhì)， 該狀態(tài)可以被定義為，所述異源寡聚蛋白質(zhì)在考馬斯染色的SDS-PAGE上 的條帶占據(jù)由常規(guī)凝膠讀取器測(cè)定的染色條帶的至少70%，優(yōu)選至少80 %和最優(yōu)選至少90%。


圖l(A)顯示在浸潤(rùn)的本氏煙草葉中來(lái)自兩個(gè)不同的基于TMV的載體 GFP和DsRed的表達(dá)分布。左圖左側(cè)上部的亮點(diǎn)是用plCH17272浸潤(rùn) 區(qū)域的GFP熒光。下面的弱的亮點(diǎn)是用載體plCH18505浸潤(rùn)區(qū)域的紅色 熒光。在左圖右側(cè)底部的亮點(diǎn)是用plCH17272 + plCH18505浸潤(rùn)的區(qū)域。 右側(cè)圖顯示從葉區(qū)域分離的原生質(zhì)體，用兩個(gè)不同的載體共浸潤(rùn)(上部在 GFP熒光檢測(cè)^^下的原生質(zhì)體；下欄在DsRed熒光檢測(cè)4Hf下的相 同原生質(zhì)體)。(B)plCH17272和pICH18505的T-DNA區(qū)的示意圖。P-轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；T —轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；RdRP —病毒RNA依賴的RNA聚合酶； MP-病毒移動(dòng)蛋白；3，NTR-病毒3，非翻譯區(qū)；Cr-sgp-crTMV菌林的 CP亞基因組啟動(dòng)子區(qū)；GOI-目的基因。(C)是plCH17272和plCH18505 的T-DNA區(qū)限制圖鐠的示意圖。
圖2描述了病毒載體T-DNA區(qū)的示意圖，該病毒栽體設(shè)計(jì)由不同的 亞基因組啟動(dòng)子共表達(dá)兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因(GOI-l和GOI-2)。 P 一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng) 子；T-轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；RdRP-病毒RNA依賴的RNA聚合酶；MP-病毒 移動(dòng)蛋白；3，NTR -病毒3，非翻譯區(qū)；Cr-sgp - crTMV菌林的CP亞基因 組啟動(dòng)子區(qū)；3PK _三重假結(jié)區(qū)；U5sgp - TMV-U5菌抹的CP亞基因組啟 動(dòng)子；GOI-目的基因。
圖3 (A)描述了 plCH17388、 plCH17123、 plCH15933、 plCH7410、 plCH10580、 plCH10881和plCH10745構(gòu)建體的T-DNA區(qū)的示意圖。RS -由PhiC31整合酶識(shí)別的重組位點(diǎn)。灰色豎條表示內(nèi)含子。(B)描述了 plCH 17388、 plCH17123、 plCH 15933的T-DNA區(qū)的限制圖語(yǔ)。(C)描述 了 pICH7410、 plCH10580、 plCH10881和plCH10745的T-DNA區(qū)的限 制圖鐠。
圖4在(A)中顯示在對(duì)DNA前體plCH17388和plCH15933與重組酶 來(lái)源一起進(jìn)行農(nóng)桿菌傳遞之后6天，本氏煙草葉區(qū)域的熒光顯微照相。RS -由PWC31整合酶識(shí)別的重組位點(diǎn)，
圖5描述了不同栽體系統(tǒng)的T-DNA區(qū)示意圖，該栽體系統(tǒng)用于表達(dá) 抗體的重鏈和輕鏈。RS -由PhiC31整合酶識(shí)別的重組位點(diǎn)。
圖6顯示使用病毒前栽體系統(tǒng)(provector system)在本氏煙草葉中IgG 表達(dá)的Western印跡。
在非還原a下的12。/。^上進(jìn)行TSP的電泳分離。使用來(lái)自兔的 綴合HRP (Sigma)的抗人IgG片段(稀釋6xl03倍)檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)。
1道-未感染的葉組織；2道-細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的IgG重鏈(plCH17388); 3道-IgG重鏈和輕鏈，用35S啟動(dòng)子構(gòu)建體(plC0123+pICH19846)共表達(dá)； 4道-與3遵^目同的IgG重鏈和輕鏈，用P19 (plCH6692)表達(dá)；5道-用 35S啟動(dòng)子構(gòu)建體和P19 (plCH5290+plCH6692)表達(dá)的GFP; 6道-IgG 重鏈和輕鏈，用雙順?lè)醋訕?gòu)建體plCH19860共表達(dá)；7道-IgG重鏈和輕 鏈，用XMS反子構(gòu)建體plCH19860 (MP缺陷的5'前載體plCH17123， ^ MPplCH 10745)共表達(dá)；8道-在細(xì)胞質(zhì)中共表達(dá)GFP和dsRED，提 供A式MP (pICH17123 + plCH19919 + plCH10745)。
圖7描述了編碼非竟?fàn)幮圆《驹泽w的T-DNA區(qū)示意圖，該栽體設(shè)計(jì) 用于在相同植物細(xì)胞中共表達(dá)不同的目的蛋白質(zhì)亞基。P-轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；T -轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；TMV RdRP _煙草花葉病毒的依賴病毒RNA的RNA聚合 酶；PVXRdRP-馬鈴薯病毒X的依賴病毒RNA的RNA聚合酶；MP-病毒移動(dòng)蛋白；3，NTR-病毒3，非翻譯區(qū)；Cr-sgp - crTMV菌林的CP亞 基因組啟動(dòng)子區(qū)；GOI-編碼目的蛋白質(zhì)亞基的目的基因。
圖8描述了雙元栽體plC0130的T-DNA區(qū)示意圖.
圖9顯示使用TMV (plCH17388+plCH10580)和基于PVX (plC0130) 栽體在植物細(xì)胞中對(duì)GFP和dsRED的共表達(dá)M桿菌接種的本氏煙草 葉中分離的原生質(zhì)體的GFP和dsRED觀測(cè)。
圖10 (A)描述了雙元栽體plCH17620、 plCH20431、 plCH21240、 plCH20421和plCH21370的T-DNA區(qū)示意圖.
(B) 為雙元載體plCH11599、 plCH21910和plCH21920的T-DNA區(qū)示 意圖。
(C) 為雙元載體plCH21282、 plCH109卯、plCH22250和plCH22240 的T-DNA區(qū)示意圖。Lv和Lc-輕鏈的可變區(qū)和保守區(qū)；Hv和Hc-重鏈
的可變區(qū)和保守區(qū)。
(D)為PVX衍生的前栽體plCH21380的克隆方案示意圖。
圖11 (a)顯示使用PVX和crTMV載體確定IgG輕鏈和重鏈共表達(dá)水
平的ELISA檢測(cè)結(jié)果。左邊的組織培養(yǎng)板的孔數(shù)對(duì)應(yīng)于柱狀圖中柱的數(shù)
目。柱狀圖顯示這些孔在405 nm的OD值。 1，2-未感染的植物組織；
3， 4， 5-在PVX中的鉤網(wǎng)蛋白SP-重鏈(分別為plCH21240-l、 plCH21240-5和pICH21370-14克隆)
6， 7， 8-在PVX中的鉀網(wǎng)蛋白SP-IgG輕鏈(LC)(分別為 plCH21370-18、 plCH21370-19、 plCH21370畫(huà)31 ，在N端缺失)；
9， 10， 11 -在PVX中的鈣網(wǎng)蛋白SP - IgG輕鏈(分別為plCH21370-40、 plCH21370-44、 plCH21370-45);
12 -空白對(duì)照(沒(méi)有^^I植物蛋白質(zhì)提取物)；
13， 14， 15-在PVX中的鈣網(wǎng)蛋白SP-IgG重鏈(HC)(分別為 plCH21240-l、 plCH21240-5和plCH21240-14克隆)與crTMV中的鈞網(wǎng)蛋 白SP - IgG輕鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20431 )共表達(dá)；
16， n， 18 -在PVX中的鈣網(wǎng)蛋白-IgG的LC (分別為plCIK1370-18、 plCH21370-19、 plCH21370-31，在N端缺失)與crTMV中的釣網(wǎng)蛋白-HC (plCH 17620+plCH10881 +plCH20421 )共表達(dá)；
19， 20， 21 -在PVX中的鈣網(wǎng)蛋白-IgG的LC(分別為plCH21370-40、 plCH21370-44、 plCH21370-45)與基于crTMV的栽體中的鈞網(wǎng)蛋白SP-重鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20421 )共表達(dá)；
22 -用PVX表達(dá)的GFP(plC0130);
23 -用PVX表達(dá)的GFP(plCH20799);
24 -由crTMV單獨(dú)表達(dá)的鋦網(wǎng)蛋白SP - IgG輕鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20431);
25-由基于crTMV的栽體表達(dá)的鈣網(wǎng)蛋白SP - IgG重鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20421 );
26- 在PTGS阻抑基因P19存在下在強(qiáng)35S啟動(dòng)子控制下共表達(dá)的 IgG的輕鏈和重鏈；
27- 由基于crTMV的栽體共表達(dá)的IgG的輕鏈和重鏈(plCH17388 +plCH10881= plCH20241);
28- 由基于crTMV的栽體共表達(dá)的輕鏈和重鏈(plCH17388 +pICH10881= pICH20241)， MP (plCH10745)以^4'提供；
* - OD405值遠(yuǎn)超過(guò)可測(cè)量值。
圖11 (b)顯示在本氏煙草葉中表達(dá)的抗癌抗體的電泳和Western印跡 分析.
(A) 在用TMV和PVX前栽體共轉(zhuǎn)染的本氏煙草葉中的抗癌抗體的重 鏈和輕鏈的聚積。輕鏈由PVX表達(dá)，重鏈由TMV表達(dá)。在還原條件下以 12%聚丙烯,亂歐分離蛋白質(zhì)。上欄顯示考馬斯染色；中間欄顯示4吏用 HRP綴合的山羊抗人IgG (Y鏈特異性)抗體(Sigma)的Western印跡；下 欄顯示使用HRP綴合的兔^AlgG (入鏈特異性)抗體(Sigma)的Western 印跡。Uninf，未感染組織；2-11，接種后的天數(shù)；S，標(biāo)準(zhǔn)抗癌mab(單 克隆抗體)；LC，用TMV前栽體單獨(dú)表達(dá)的輕鏈(感染后6天)；HC，用 TMV前栽體單獨(dú)表達(dá)的重鏈(感染后6天)，
(B) 使用A蛋白磁珠(NEB)純化抗癌mab。在考馬斯染色凝膠上在非還 原條件下12%聚丙烯酰胺凝膠中遷移的植物衍生的(1道)和標(biāo)準(zhǔn)的(2 道)mab,
(C) 用表達(dá)HC的TMV前栽體和表達(dá)LC的PVX前栽體共感染的本 氏煙草葉中組裝的抗癌mab的積聚.在非還原條件下以10°/。聚丙烯^ MJi^分離蛋白質(zhì)'用山羊抗人IgG ( Y鏈特異性)抗體進(jìn)行探針的Western 印跡。Uninf，未感染組織；2-11，接種后的天數(shù)；S,標(biāo)準(zhǔn)抗癌mab; LC，用TMV前載體單獨(dú)表達(dá)的輕鏈(感染后6天)；HC，用TMV前栽體 單獨(dú)表達(dá)的重鏈(感染后6天)；H2L2:含有兩條重鏈和兩條輕鏈的IgG異 源四聚體，H2L-含有兩條重鏈和一條輕鏈的異源三聚體，112-重鏈同源 二聚體，L2 —輕鏈同源二聚體'
圖12顯示雙元載體plCH17620、 pICH-FSHA和pICH-FSHB的 T-DNA區(qū)示意圖。
圖13描述了雙元栽體plCH17388、 plCH-MLCJ和plCH-MHC的 T-DNA區(qū)示意圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明所述病毒栽體是其中單個(gè)栽體編碼形成所述異源寡聚蛋白質(zhì)所 需4^P蛋白質(zhì)亞基的病毒載體，或是至少兩個(gè)不同的非竟?fàn)幮圆《驹泽w， 其中，所述至少兩個(gè)病毒載體的每一個(gè)編碼形成所述異源寡聚蛋白質(zhì)所需 的不同蛋白質(zhì)亞基。每一個(gè)所述非竟?fàn)幮圆《驹泽w可以表達(dá)編碼重組異源 寡聚蛋白質(zhì)的多個(gè)亞基的多條異源核酸序列.可以將所述RNA病毒栽體 瞬時(shí)傳遞iiA植物細(xì)胞，或作為DNA前體穩(wěn)定#^^植物染色體DNA。
本發(fā)明提供在植物細(xì)胞中高產(chǎn)量生產(chǎn)異源寡聚蛋白質(zhì)的方法.這一方 法克服了現(xiàn)存的基于病毒栽體表達(dá)系統(tǒng)的局限性(例如對(duì)要表達(dá)異源序列 大小的局限)、所述栽體的高度不穩(wěn)定性以及在同一植物細(xì)胞中共表達(dá)不同 異源核酸的不穩(wěn)定性.此外，由于從系統(tǒng)除去病毒包被蛋白，阻止感染性 病毒顆粒的形成和回復(fù)為野生型病毒，所述方法提供更好的生物安全特性。 通過(guò)本發(fā)明的操作，為目的異源寡聚蛋白質(zhì)而設(shè)計(jì)的高產(chǎn)量表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于 實(shí)際上任何植物RNA病桊時(shí)生的復(fù)制子是可能的，所述復(fù)制子適于表達(dá) 目的異源序列，通過(guò)修飾所述復(fù)制子能夠表達(dá)編碼目的異源寡聚蛋白質(zhì)不 同亞基的至少兩個(gè)目的異源序列?；蛘?，可以發(fā)現(xiàn)另一非竟?fàn)幮圆《驹泽w 能夠與所述病毒栽體在同 一植物細(xì)胞中共復(fù)制.
屬于不同分類群的正義單鏈RNA病毒(這里也簡(jiǎn)稱為"RNA病毒") 適用于構(gòu)建本發(fā)明的正義單鏈RNA病毒栽體(這里也稱簡(jiǎn)為"病毒栽體")。 本文中，病毒栽體是能夠在植物細(xì)胞中復(fù)制的RNA栽體，即使用RNA病
優(yōu)選的，本發(fā)明的病毒栽體含有至少一個(gè)具有RNA病毒功能的病毒序列 元件，例如復(fù)制酶、亞基因組啟動(dòng)子、病毒顆粒組裝起點(diǎn)、包被蛋白ORF、
或移動(dòng)蛋白ORF。此外，病毒載體可以有RNA病毒IRES元件。
可以，例如通過(guò)向病毒中引入限制位點(diǎn)，從其衍生自的病毒構(gòu)建病毒 栽體，所述限制位點(diǎn)代表適用于引入本發(fā)明的異源序列的克隆位點(diǎn)。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是對(duì)RNA病毒或栽體的核酸改造通常分別使用所 述RNA病毒或栽體的DNA拷貝在DNA水平上完成。因此，更精確的說(shuō)， 可以通過(guò)向RNA病毒的DNA拷貝引入限制位點(diǎn)，從其衍生自的RNA病 毒的DNA拷貝構(gòu)建RNA病毒栽體的DNA拷貝，所述限制位點(diǎn)代表適于 在DNA水平引入本發(fā)明異源序列的DNA拷貝的克隆位點(diǎn)。這些問(wèn)題對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的并且在本文中通常不再?gòu)?qiáng)調(diào)。
如果RNA病毒的DNA拷貝天然地具有適于克隆的P艮制位點(diǎn)，該病毒
本身可以是病毒栽體。本文中，術(shù)語(yǔ)"病毒栽體"指其中在所述栽體中不 存在所述異源序列的情況，或者指其中在栽體中不存在本發(fā)明的蛋白質(zhì)亞 基的編碼序列的情況。通過(guò)清楚說(shuō)明存在這類插入片段從而鑒定其中編碼 本發(fā)明的蛋白質(zhì)亞基的所述異源序列或序列插入所述病毒栽體的情況。
本文中，在引入編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)亞基的所迷異源序列或序列之前， 如果兩個(gè)病毒栽體序列不同，則稱兩個(gè)病毒栽體為不同的.在引入編碼本 發(fā)明蛋白質(zhì)亞基的所述異源序列或序列之前，如果兩個(gè)病毒栽體具有相同 的序列，則稱兩個(gè)病毒栽體為相同的。因此，當(dāng)確定兩個(gè)病毒栽體是不同 或相同時(shí)，不考慮編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)亞基的所述異源序列或序列.
本文中，術(shù)語(yǔ)"復(fù)制子"或"病毒復(fù)制子"具有與"病毒栽體"相同 的含義.
以下列出可用于^t本發(fā)明的病毒栽體的RNA病毒表。引用的分類 名(并非斜體字體)表示該分類不具有ICTV國(guó)際認(rèn)可的名稱.種名(俗名) 以常規(guī)字體給出。不具有正式指定的屬或科的病毒被指出
RNA病毒
ssRNA病毒
科雀麥花葉病毒科CB/wn0W"V/ae)，
屬苜?；ㄈ~病毒屬04(/iiwoWf"s)，代表種苜?；ㄈ~病毒，
屬等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬(J/flrWnw)，代表種煙草條(斑)紋病毒， 屬雀麥鑲嵌病毒屬CBiYWwWr"s)，代表種雀麥鑲嵌病毒， 屬黃瓜花葉病毒屬(C"cM挑ov/r"s)，代;ft^種黃瓜花葉病毒；
科長(zhǎng)線形病毒科(C7仍teiYm'i7V/"e)，
屬黃化絲狀病毒屬(C7仍tewvi'nis)，代表種甜菜黃化病毒， 屬長(zhǎng)線狀病毒屬(CWw/v,'ms)，代表種萵苣傳染性枯黃病毒，
科St豆花葉病毒科(CVwiwviV7V/fle)， 屬虹豆花葉病毒屬(OwfitfVfV"s)，代表種tn豆花葉病毒， 屬蠶豆萎蔫病毒屬CFfl6flv!Vm)，代表種蠶豆萎蔫病毒l， 屬線蟲(chóng)傳多面體病毒屬(iVe/wv,'r"s)，代表種煙草環(huán)斑病毒；
科馬鈴薯Y病毒科(/V卿iV7V/fle)，
屬馬鈴薯Y病毒屬(i^0^'r"s)，代表種馬鈴薯Y病毒、李痘病毒、 煙草蝕紋病毒、三葉草黃脈病毒、煙草脈斑駁病毒；
屬黑麥草花葉病毒屬(i^挑oviV^),代表種黑麥草鑲嵌病毒， 屬大麥黃花葉病毒屬(外加卯i'i^)，代表種大麥黃色鑲嵌病毒；
科歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒科CS^"i'viWitee)，
屬伴生病毒屬CSq"i'w'f"s)，代表種歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒，
屬矮化病毒屬(l^i汰aw7w)，代表種稻東格魯球狀病毒；
科番癡叢矮病毒科(7Vi/wWWrfae)，
屬香石竹斑駁病毒屬(Gw挑(m'nw)，代表種香石竹斑駁病毒， 屬香石竹環(huán)斑病毒屬(i)i'fl/f^wv!'ras)，代表種香石竹環(huán)斑病毒， 屬玉米褪綠斑駁病毒屬(MacWwiwvi'fiis),代表種玉米褪綠斑駁病
屬壞死病毒屬(iVecfYmV""s)，代表種煙草壞死病毒屬， 屬番茄叢矮病毒屬(r0w6"svZ/^)，代表種番茄叢矮病毒，
未指定屬的ssRNA病毒，
屬線形病毒屬(Cfl/;淑ov/r"s)，代表種蘋果莖溝病毒；
屬香石竹潛隱病毒屬(Ow/flWnw)，代表種香石竹潛隱病毒；
屬耳突花葉病毒屬(五/m挑卵/ras)，代表種豌豆耳突花葉病毒，
屬真菌傳桿狀病毒屬(Fiiwv/nw)，代表種土傳小麥花葉病毒，
屬大麥病毒屬(^mfe,'Wi"ws)，代表種大麥條紋花葉病毒，
屬懸鉤子病毒屬(A/fl朋Wf"s)，代表種覆盆子叢矮病毒；
屬黃癥病毒屬(l"teov^"s)，代表種大麥黃矮病毒；
屬玉米細(xì)線病毒屬(M"rfl/ vi'f"s)，代表種玉米雷亞多非納病毒；
屬馬鈴薯X病毒屬(/VitocWrMs)，代表種馬鈴薯X病毒；
屬南方菜豆花葉病毒屬(5^6eimmVws)，代;^種南方菜豆花葉病毒，
屬纖細(xì)病毒屬(re"",'vi'r船)，代表種稻條紋病毒，
屬煙草花葉病毒屬(7V^a加卵i'f"s)，代表種煙草花葉病毒，
屬煙草脆裂病毒屬(7V^mW/m)，代表種煙草脆裂病毒，
屬發(fā)狀病毒屬(7Wc^Wrws)，代表種蘋果褪綠葉斑病毒；
屬蕪普黃花葉病毒屬(r戸柳'/""s)， >^^種蕪菁黃花葉病毒；
屬幽影病毒屬(r附6mvi'ws)，代表種胡蘿卜斑駁病毒；
負(fù)鏈ssRNA病毒目單股負(fù)鏈RNA病毒目(Afo朋"堪flWiYi/M)，科: 彈狀病毒科(及Afl6rfimi7V/fle)，屬胞質(zhì)彈狀病毒屬(Q加fA"6fltovinw)，代表 種萵苣壞死黃化病毒，
屬胞核彈狀病毒屬(iViic/wfAflMw/nw)，代表種馬鈴薯黃矮病毒。
RNA病毒栽體能夠?yàn)樵谥参锛?xì)胞中表達(dá)目的基因提供極高的異源 RNA拷貝數(shù)。然而，如果異源核酸序列的大小增加至某些限制之上，通常
在lkb以上，已知這樣的栽體會(huì)變得極不穩(wěn)定。由于這樣的限制，迄今為 止，對(duì)這類載體系統(tǒng)的應(yīng)用限制于相對(duì)簡(jiǎn)單的小蛋白質(zhì)至中型蛋白質(zhì)的表 達(dá)。表達(dá)大或復(fù)雜的異源寡聚蛋白質(zhì)的努力尚無(wú)成功結(jié)果。我們已驚奇地 發(fā)現(xiàn)可以成功地采用病毒載體高產(chǎn)量的表達(dá)復(fù)合異源寡聚蛋白質(zhì)，這在先 前是不可能的。由于在相同細(xì)胞中共表達(dá)目的蛋白所使用的病毒載體的不
相容性，對(duì)表達(dá)全長(zhǎng)單克隆抗體的早期努力(Verch等人，1998，/. /附挑《朋/.
Me仇，2M, 69-75)并未提供滿意的結(jié)果。在實(shí)施例1中，我們?cè)趩蝹€(gè)細(xì)胞
水平證明^目同植物RNA病毒(TMV)衍生的病毒復(fù)制子有效共表達(dá)兩個(gè)
不同基因(GFP和DsRed)是不可能的。在圖l(A-右欄)，我們不能檢測(cè)到
顯示出表達(dá)兩種報(bào)告基因DsRed和GFP的原生質(zhì)體。在右下欄一些原生
質(zhì)體中，DsRed的弱表達(dá)方式與強(qiáng)的GFP表達(dá)(右上欄)相一致，并且由于
用于DsRed檢測(cè)的過(guò)濾片漏光而呈現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。這一漏光產(chǎn)生^^有高濃
度GFP的原生質(zhì)體的明顯的弱DsRed熒光。因此即使當(dāng)RNA復(fù)制子帶有
編碼不同重組蛋白的不同異源核酸序列時(shí)，相同或共有廣泛同源區(qū)的RNA
復(fù)制子不能在一個(gè)植物細(xì)胞中共存。這一現(xiàn)象的原因目前尚未知，可能的 解釋為一個(gè)病毒復(fù)制子拷貝數(shù)的指數(shù)增加導(dǎo)致迅速勝過(guò)另一病毒復(fù)制子.
因此在選擇的細(xì)胞中第二個(gè)開(kāi)始復(fù)制的復(fù)制子不能趕上第一個(gè)，其中，這
些事件確定"第一"復(fù)制子具有統(tǒng)計(jì)特征的顯著性。
在我們解決此問(wèn)題的研究中，我們改造了病毒復(fù)制子使在所述復(fù)制子 中存在兩個(gè)不同的異源核酸序列，其在兩個(gè)不同的亞基因組啟動(dòng)子控制下 編碼不同的蛋白質(zhì)。在圖2中顯示編碼這樣的RNA復(fù)制子的T-DNA區(qū)概 圖。我們使用先前專利申請(qǐng)(WO02088369;又見(jiàn)Marillonnet等人，2004， iV< c. Wflrf. Jcad: 5W. i7&4， 1M， 6852-6857)所述的前栽體方法作為設(shè)計(jì)和 優(yōu)化這樣栽體的便宜方法。該方法使能夠經(jīng)由位點(diǎn)特異性重組在植物中從 預(yù)制的構(gòu)件組裝最終的栽體，因此顯著的加速了載體設(shè)計(jì)和載體優(yōu)化。在 實(shí)施例2中描述了該構(gòu)建體的設(shè)計(jì)并且在圖3中顯示了示意圖。
我們驚奇的發(fā)現(xiàn)盡管在最終復(fù)制子中插入大的片段且由存在兩個(gè)強(qiáng)亞 基因組啟動(dòng)子導(dǎo)致的載體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，獲得的RNA復(fù)制子在植物中顯示
出高穩(wěn)定性和在相同植物細(xì)胞中提供兩種不同重組蛋白(GFP和DsRed)共 表達(dá)的能力。如圖4所示，在感染區(qū)域內(nèi)，共表達(dá)的頻率可以達(dá)到幾乎所 有細(xì)胞的100%。例如在這樣的構(gòu)建體中用IgG的輕鏈和重鏈代替報(bào)告基 因(GFP和DsRed)(圖5)在浸潤(rùn)的本氏煙草葉中進(jìn)一步的表達(dá)，產(chǎn)生令人 驚奇的結(jié)果。如在實(shí)施例3中所述，Western印跡分析顯示了令人印象深 刻的高濃度的組裝的單克隆抗體(6和7道；圖6)。由我們的系統(tǒng)提供的組 裝的單克隆抗體的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于由現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)產(chǎn)生的產(chǎn)量(圖6， 4道)。 據(jù)我們所知，這是使用基于植物病毒栽體的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)復(fù)合異源寡聚蛋 白質(zhì)(例如抗體)的第一次證明.所有先前的公開(kāi)局限于表達(dá)單克隆抗體的 簡(jiǎn)單的人工衍生物，例如使用TMV病毒栽體(McCormick等人1999， /Vw iVflrf爿cfld Sd 1/5^4， 2^， 703-708; McCormick等人，2003， / /挑附《朋/: Afe狄oflb， 22§， 95-104)和基于PVX的栽體(Smolenska等人，1998， F五AS i:e汰，巡，379-382; Franconi等人，1999， /挑挑MwotecA朋/tf^;，丄189-201 ; Hendy等人，1999， / /附加""o/. Me幼o(hù)必，211， 137-146; Roggero等人，2001 ， /VtftoVi五jc/w.戶"《>:， 21， 70-74)表達(dá)單鏈抗體(scFv)。
在本發(fā)明中，我們優(yōu)選不使用系統(tǒng)病毒栽體。代替系統(tǒng)病毒栽體，我
的系統(tǒng)移動(dòng)能力.這使我們可以用要表達(dá)的異源序列代替病毒的包被蛋白. 這一方法有助于增加病毒栽體對(duì)異源序列的可能的容量。同時(shí)，該方法消 除了病毒栽體由于自發(fā)的缺失異源序列而轉(zhuǎn)化為野生型病毒的可能性，所 述轉(zhuǎn)化可能損害系統(tǒng)的產(chǎn)量，
盡管我們基于病毒復(fù)制子系統(tǒng)產(chǎn)生的單克隆抗體產(chǎn)量顯著優(yōu)于現(xiàn)有技 術(shù)系統(tǒng)，我們檢測(cè)了通過(guò)減少病毒復(fù)制子的大小進(jìn)一步增加產(chǎn)量的可能性。 考慮到減少表達(dá)分泌型抗體雙鏈的病毒復(fù)制子大小的有限的可能性，我們 嘗試從兩個(gè)不同的病毒復(fù)制子表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈?？紤]到基于相同病
毒的復(fù)制子不能在相同植物細(xì)胞中共表達(dá)兩條不同的異源序列(見(jiàn)以上實(shí) 施例1)，我們檢測(cè)了通過(guò)將DsRed和GFP基因分別克隆進(jìn)入由非同源的 植物病毒煙草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯病毒X (PVX)衍生的病毒栽體從而
在相同植物細(xì)胞中共表達(dá)兩種不同基因的可能性(見(jiàn)實(shí)施例4)。在圖7和8 顯示了含有所述病毒栽體的cDNA的T-DNA區(qū)示意圖(僅PVX)。在實(shí)施 例4中，出于方便，我們使用基于TMV的病毒栽體，所述載體在植物中 經(jīng)由位點(diǎn)特異性重組從栽體構(gòu)件組裝。我們令人驚奇的發(fā)現(xiàn)從共浸潤(rùn)的植 物葉區(qū)分離的原生質(zhì)體顯示出幾乎100%的DsRed和GFP報(bào)告基因的共 表達(dá)頻率(圖9).
近來(lái)，由Dietrich和Maiss提出關(guān)于不同標(biāo)記病毒的空間分離的研究 (2003，/. F,/vto^， M， 2871-2876)。在這一研究中，作為報(bào)告基因表達(dá) 熒光蛋白。未提到產(chǎn)生異源寡聚蛋白質(zhì)。此外，沒(méi)有在分離的原生質(zhì)體水 平上對(duì)共表達(dá)的研究。由于報(bào)告基因產(chǎn)物能夠經(jīng)由胞間連絲擴(kuò)散至相鄰細(xì)
信息。、更早的公布涉及在感染植物時(shí)野1^病毒彼此之間的協(xié)同作;，但 不涉及異源寡聚蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中的表達(dá)(Rochow和Ross， 1955， FiVv/柳，1， 10-27; Goodman和Ross， 1974， Wiv/柳，迅16-24; Goodman 和Ross, 1974， KiiY togy，絲，314-318; Goodman和Ross， 1974， Kiwto砂，絲， 263-271)。關(guān)于病毒在共感染植物中的協(xié)同相互作用的這些早期研究 (Vance等人，1995， K/i^<^y，里，583-590; Pruss等人1997，尸/aW Ce//， 2， 859-868)^iUl導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的阻抑基因.重組蛋白 表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)一步JOL定向于研究這類PTGS阻抑基因以增加重組蛋白的 產(chǎn)量，在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)沒(méi)有使用基于協(xié)同病毒的病毒表達(dá)系統(tǒng) 的暗示.
本發(fā)明證明非竟?fàn)幮圆《驹泽w為在植物細(xì)胞或植物中生產(chǎn)異源寡聚蛋 白質(zhì)提供有效工具.如果兩個(gè)或多個(gè)病毒栽體能夠在相同植物細(xì)胞中復(fù)制 并且在所述復(fù)制和其它細(xì)胞的轉(zhuǎn)染中不彼此稀釋，所述病毒栽體是彼此非 竟?fàn)幮缘?沒(méi)有稀釋意指至少10 % ，優(yōu)選50 % ，更優(yōu)選卯％和最優(yōu)選100 %的轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞是共轉(zhuǎn)染的，例如含有所述兩個(gè)或多個(gè)不同的病毒栽 體。優(yōu)選所述病毒載體能夠復(fù)制和表達(dá)異源核酸序列.更優(yōu)選所述異源核 ,列編碼不同蛋白質(zhì).甚至更優(yōu)選所述不同的蛋白質(zhì)為異源寡聚蛋白質(zhì)
的亞基。為了確定病毒載體究竟是竟?fàn)幮曰蚍蔷範(fàn)幮缘?，可以測(cè)量植物細(xì)
胞的共轉(zhuǎn)染頻率。這可以通過(guò)以下方案完成用兩種不同的報(bào)告基因，例 如DsRed和GFP標(biāo)記兩種病毒載體。將所述不同標(biāo)記的載體共傳遞(例如 經(jīng)由農(nóng)桿菌浸潤(rùn))i^A植物葉組織，并且在3-6天之后對(duì)從感染區(qū)域分離
報(bào)告基因的原生質(zhì)體數(shù)的比率。在實(shí)施例2和4中描述了證明這樣的測(cè)量 的實(shí)驗(yàn)(也見(jiàn)圖1A和9)。通常，非竟?fàn)幮圆《据d體可以衍生自協(xié)同的病毒， 例如能夠成功的共轉(zhuǎn)染相同植物宿主的病毒。這樣的協(xié)同的RNA病毒對(duì) 的實(shí)例包括
馬鈴薯病毒X (PVX)/煙草花葉病毒(TMV);
PVX/煙草脈斑駁病毒(TVMV);
PVX/煙草蝕紋病毒(TEV);
PVX/三葉草黃脈病毒(CIYW);
PVX/李痘病毒(PPV); PVX/馬鈴薯病毒Y (PVY),
病毒載體的竟?fàn)幓蚍蔷範(fàn)幮詸C(jī)制的原因未知。 一個(gè)可能的解釋是由協(xié)
(VRC) (Kawakami等人，2004，戶腦7Vfl汰爿cd Sci t/5^， 101 ， 6291-6296)，因此它們不彼此竟?fàn)幮纬蒝RC所需的空間。如實(shí)驗(yàn)所確定， 非竟?fàn)幍牟《驹泽w可以衍生自在其核酸序列水平上顯著不同的不同病毒 種。所述非竟?fàn)幮圆《驹泽w可以衍生自能夠成功共感染相同植物宿主的協(xié) 同性植物病毒，協(xié)同性病毒通常屬于不同的屬。例如PVX屬于馬鈴薯X 病毒屬，而與其協(xié)同的病毒例如TVMV、 TEV、 PPV和CIEW屬于馬鈴 薯Y病毒屬。與PVX病毒協(xié)同的其它病毒(非竟?fàn)幮?例如TMV、 TVCV 和crTMV屬于煙草花葉病毒屬。顯然，在不同屬的代表之間基因組同源 性相當(dāng)?shù)?，通常在RNA水平上低于50 %同 一性。
在實(shí)施例5中描述了將單克隆抗體的重鏈和輕鏈克隆進(jìn)不同病毒栽體 (例如基于PVX和TMV的病毒載體)，接著在共感染的植物組織中進(jìn)一步
共表達(dá)所述鏈。在圖10中顯示了載體的示意圖。在該栽體幫助下產(chǎn)生的單 克隆抗體產(chǎn)量與其它表達(dá)系統(tǒng)相比較的ELISA測(cè)量表明基于兩個(gè)非竟?fàn)?性病毒載體的所述系統(tǒng)的最佳執(zhí)行(圖11)。現(xiàn)有技術(shù)中在病毒載體幫助下 在植物細(xì)胞中有^達(dá)重組異源寡聚蛋白質(zhì)尚未知。
根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，病毒栽體的病務(wù)時(shí)生的序列應(yīng)該不呈現(xiàn)使所述病毒 與其它病毒之間的顯著需要考慮的同源性。這樣病毒的實(shí)例是病毒對(duì)TMV 和PVX以及基于其的病毒載體。這些病毒栽體并未呈現(xiàn)這樣的同源性。 選擇可接受的病毒對(duì)的另一要求可以是在共感染植物宿主期間原始野生型 病毒的協(xié)同性。
使用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)將DNA前體傳遞i^A植物細(xì)胞來(lái) 完成以上討論的實(shí)驗(yàn)。然而，本發(fā)明備選的應(yīng)用是用于以所述RNA復(fù)制 子的DNA前體穩(wěn)定摻入植物核染色體的轉(zhuǎn)基因植物。這使能夠克服基于 植物病毒栽體系統(tǒng)的許多局限，例如對(duì)病毒栽體可容忍的異源序列最;U^ 寸的限制。由于DNA前體將存在于轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)細(xì)胞中，RNA復(fù)制 子的系統(tǒng)移動(dòng)或細(xì)胞至細(xì)胞的移動(dòng)(復(fù)制子擴(kuò)^t)不是必需的。這可以由高 效率的形成本發(fā)明的RNA復(fù)制子和轉(zhuǎn)運(yùn)其^01&質(zhì)而得到##.然而， 由于RNA復(fù)制子的形成并非總是發(fā)生在全部細(xì)胞中，栽體的細(xì)胞-至-細(xì)胞移動(dòng)的能力可以有額外的價(jià)值。
可以使用不同方法向植物、植物組織或植物細(xì)胞提供異源DNA.可以 通過(guò)由農(nóng)桿菌攜帶的Ti-質(zhì)粒栽體(US 5，591，616; US 4,940,838; US 5,464,763)或顆粒或微粒轟擊(US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616Bl)將所述載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞。還可以使用其它植物轉(zhuǎn)化方 法，例如顯微注射(WO 09209696; WO 09400583A1 ; EP 175966B1)、電穿 孔(EP00564595B1 ; EP002卯395B1 ; WO 08706614Al)或PEG介導(dǎo)的原生 質(zhì)體轉(zhuǎn)化等。可以由要轉(zhuǎn)化的植物物種決定選擇栽體傳遞的方法.例如， 通常優(yōu)選微粒轟擊用于單子葉轉(zhuǎn)化，而對(duì)于雙子葉，通常農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 化效果^^好。
在本發(fā)明的實(shí)例中，我們使用瞬時(shí)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的傳遞使栽體(所述異源
DNA)ii^煙草細(xì)胞。然而，可以根據(jù)適于目的植物物種的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時(shí) 轉(zhuǎn)化的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將所述載體穩(wěn)定的導(dǎo)入植物。雙子葉的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本 領(lǐng)域眾所周知的，且包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng) 桿菌技術(shù)涉及由原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。這些技術(shù)包括 PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、顆粒轟擊介導(dǎo)的傳遞和顯微注射。這些技術(shù)的 實(shí)例描述在Paszkowski等人，^Afl 0/2， 2717-2722 (1984)， Potrykus等人， MoT. (7ewet !22a 169-177 (1985)， Reich等人，Biotechnology
4:1001-1004 (1986),和Klein等人iVa似w gl， 70-73 (1987).在各個(gè)情況下 使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為整個(gè)植物。
因?yàn)檗r(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)具有高轉(zhuǎn)化效率且廣泛的適用于多種不同 物種，優(yōu)選用該技術(shù)轉(zhuǎn)化雙子葉植物?？梢酝╥t^桿菌常規(guī)轉(zhuǎn)化多種作物 物種，包括煙草、番癡、向日葵、棉、油菜、馬鈴薯、大豆、苜蓿和楊樹(shù) (EP 0 317 511 (棉)、EP 0 249 432 (番茄)、WO 87/07299 (白菜)、美國(guó)專利 4,795,855 (楊樹(shù)))。
在本發(fā)明的實(shí)例中，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA傳遞用于目的基因的 瞬時(shí)表達(dá)。這一方法不僅對(duì)于小，至中規(guī)模的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，而且 對(duì)于大MJI表達(dá)都是非常有用的工具。
使用可誘導(dǎo)的或伶阿其它受調(diào)節(jié)的(例如發(fā)育調(diào)節(jié)的)啟動(dòng)子可以達(dá)到 對(duì)穩(wěn)定摻入植物染色體DNA的病毒復(fù)制子前體的釋放。根據(jù)其誘導(dǎo)條件， 可以將可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子分為兩類由非生物因子(溫度、光、化學(xué)物質(zhì))誘 導(dǎo)的那些和由生物因子，例如病原體或害蟲(chóng)侵襲誘導(dǎo)的那些.第一類的實(shí) 例為熱誘導(dǎo)(US 05187287)和冷誘導(dǎo)(US05847102)的啟動(dòng)子、銅誘導(dǎo)系統(tǒng) (Mett等人，1993， iVfl汰爿caw/. Sd，巡，4567- 4571)、類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng) (Aoyama和Chua， 1997，尸/fl"f / ， U， 605-612; McNellis等人1998， iV"W丄， 14， 247-257; US06063985)、乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)(Caddick等人，1997， iVfl似w J5iV tecA.，仏177-180; WO09321334)和四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Wdnmami等人， 1994，尸/flW /.，五559-569)。在植物的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)領(lǐng)域，最近的;SLH之一 是嵌合啟動(dòng)子，其可以由糖皮質(zhì)激素地賽米松開(kāi)啟并且由四環(huán)素關(guān)閉 (Bohner等人，1999，外flW/.， 19， 87-95)。關(guān)于化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)的綜述見(jiàn)Zuo 和Chua， (2000， O/w".必fW"/r/K /" 11， 146-151)和Padidam， M
(2003，O/w". /，to"/丑iW.， & 169-177)?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子的其它實(shí)例是控制 植物中的致病相關(guān)(PR)基因表達(dá)的啟動(dòng)子?？梢酝ㄟ^(guò)用水楊酸(其為植物信 號(hào)通路中應(yīng)答病原體攻擊的重要組分)或能夠引起PR基因表達(dá)的其它化合 物(1，2，3-苯并噻二唑或異煙酸)(US05942662)處理植物來(lái)誘導(dǎo)這些啟動(dòng)子。 本發(fā)明不限于在實(shí)施例中所逸基于TMV和基于PVX的栽體，而是可 以應(yīng)用于衍生自其它植物RNA病毒的復(fù)制子，使建立由所述病毒復(fù)制子 衍生的表達(dá)系統(tǒng)。已知對(duì)于病毒對(duì)PVX/PVY在共感染植物中的協(xié)同性研 究得最好(Rochow和Ross， 1955， FiVyi/o^, L_10-27; Goodman和Ross， 1974， 柳,58,16-24)。很可能那些病毒許多可以在相同植物細(xì)胞中共復(fù)制， Dietrich和Maiss (2003， <7ew. Fiiv/:，払2871-2876)已表明不同標(biāo)記的病 毒對(duì)，例如李痘病毒(PPV)和馬鈴薯病毒X (PVX)、煙草脈斑駁病毒(TVMV) 和PVX、三葉草黃脈病毒(CIYW)和PVX可以在植物組織的相同感染區(qū)
共表達(dá)不同的報(bào)告基因.可以使用本發(fā)明所述策略itJL重組異源寡聚蛋白
質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，用于能夠在相同植物細(xì)胞中共復(fù)制的幾乎任何植物正義單鏈
RNA病毒衍生的復(fù)制子對(duì).例如，在本發(fā)明中可以使用基于苜?；ㄈ~病毒 屬的苜蓿花葉病毒(AMV)的病毒栽體。
可以使用本發(fā)明在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)編碼復(fù)合(異源寡聚)蛋白的 目的基因、其片段(功能性或非功能性)及其人工衍生物和融合。使用本發(fā) 明可以產(chǎn)生并純化多種有商業(yè)價(jià)值的異源寡聚蛋白質(zhì)類群.那些類群包括
然而，最優(yōu)選免疫應(yīng)答蛋白類群，特別是選自不同類免疫球蛋白(IgG、IgM、 IgA和IgD)的單克隆抗體和它們的合成衍生物(如突變體類型以及與其它 蛋白質(zhì)或其部分的不同類型的融合).
具體實(shí)施例方式
提出下列實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明?？梢宰龀鲂薷暮妥兓槐畴x本發(fā)明
的精神和范圍。 實(shí)施例1
eM^f孩參i A^ 7MK辨J AL4病毒裁舉犮,
G尸尸々/)s及"付^4這
用由相同植物RNA病4^f生的但是含有兩個(gè)不同目的基因的兩個(gè)基 于TMV的RNA病毒栽體感染葉組織(圖1)。我們4吏用克隆在基于TMV 病毒栽體中的可視標(biāo)記基因GFP和DsRed來(lái)測(cè)試這一方法。第一構(gòu)建體， plCH17272 (見(jiàn)Marillonnet等人2005， 7V抓^ 718-723的圖 1)，含有GFP，并且除了在栽體的RdRP編碼序列含有9個(gè)而非14個(gè)植物 內(nèi)含子之外，與plCH18711 (見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP03/12530，作為 WO2005049839公布；Marillonnet等人，2005， iVflt J iofecA朋/:， 23,718-723) 相似，plCH18722 (MariUonnet等人2005， iVflt歷otecA朋/:， 718-723)構(gòu) 建在兩個(gè)密切相關(guān)的菌林TMV、 Cr-TMV(Dorokhov等人1994， FfAS1 ￡欲. 350,5-8)和TVCV (Lartey等人1994， J/ cA. Fi'iv/:逃287-298)的骨架上， 并且含有在植物啟動(dòng)子控制之下的病毒基因組，由異源序列代替包被蛋白 序列.在RdRP和MP中存在的11個(gè)內(nèi)含子增加了在農(nóng)桿菌介導(dǎo)栽體傳 遞進(jìn)入葉組織之后病毒復(fù)制的起始效率，并且因此增加了兩個(gè)栽體在相同 細(xì)胞中的共表達(dá)的概率。plCH18505與plCH17272相似，除了其GFP編 碼序列已經(jīng)由使用Xhol -Notl P艮制位點(diǎn)的DsRed的編碼序列代替(圖1)。 在圖1C中顯示plCH18505和plCH17272的T-DNA區(qū)詳細(xì)的限制圖諳. 在農(nóng)桿菌菌林GV3101中轉(zhuǎn)化plCH17272和plCH18505，并且如先前所述 (Marillonnet等人，2004， /Vvc. iVa汰5*" C/A4，巡，6852-6857)浸潤(rùn)本 氏煙草葉組織。從浸潤(rùn)后7天(dpi)的浸潤(rùn)區(qū)制備原生質(zhì)體并且在顯微鏡的 藍(lán)光或紅光下觀察.即使對(duì)于從數(shù)天之后的浸潤(rùn)區(qū)制備的原生質(zhì)體，很少 有原生質(zhì)體同時(shí)表達(dá)GFP和DsRed (圖1A).這說(shuō)明一旦細(xì)胞^于TMV 的第一病毒栽體感染，它不能故基于TMV的第二載體再次感染。
4々卓個(gè)4#復(fù)浙子^ G/T々Z)s及^/ ^兵4這
由RNA病毒栽體表達(dá)的兩個(gè)目的基因在兩個(gè)分別的亞基因組啟動(dòng)子 控制下(圖2)。兩個(gè)亞基因組啟動(dòng)子可以是相同的，但是為了避免在病毒復(fù) 制期間構(gòu)建體中重復(fù)序列之間缺失的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選使用來(lái)自相關(guān)TMV菌林 的亞基因組啟動(dòng)子；在這一情況下，第二亞基因組啟動(dòng)子和3，非翻譯區(qū)來(lái) 自TMGMV菌株U5 (Shivprasad等人，1999， F,Vvfegj，逛，312-323; MariHonnet等人，2004， ZVvc. Wfl汰爿cfli/. 5W. t/5^4， 1Mi 6852-6857)。而且， 為了克隆方便，在病毒前載體(如在WO02/088369所述和由Marillonnet 等人2004， 7Vfl汰Sd f/5L4， 6852-6857所述)而非完整組裝 的載體中克隆GFP和DsRed。通過(guò)在植物中前栽體構(gòu)件之間的位點(diǎn)特異 性重組，將兩個(gè)前栽體plCH17388和plCH15933 (圖3)轉(zhuǎn)化為完整功能的 基于TMV的病毒栽體。除了在病毒序列中存在11個(gè)內(nèi)含子(如在 plCH17272)， plCH17388與plCHNOP (Marillonnet等人2004，7Va汰 爿cflA <75^4， 101 , 6852-6857)相似.除了 TMGMV U5的編碼序列由 DsRed的編碼序列代替，plCH15933與plCHGFPSYS (MariHonnet等人 2004， iVY c. iVfl汰爿cflrf. 巡，6852國(guó)6857)相同，
在農(nóng)桿菌菌株GV3101中轉(zhuǎn)化plCH15933并且與plCH17388和 pICH10881(圖3)—起浸潤(rùn)本氏煙草葉.浸潤(rùn)5天之后，所有表達(dá)GFP的 焦點(diǎn)也表達(dá)DsRed，顯示出兩個(gè)基因在相同植物細(xì)胞中極好的共表達(dá)(圖 4)。
實(shí)施例3
^《卓個(gè)4毒度賴子好戎沐4這
在plCH15933中，GFP和DsRed的編碼序列分別由IgG抗體的輕鏈 和重鏈代替，產(chǎn)生構(gòu)建體plCH20241 (圖5).作為對(duì)照，將輕鏈和重鏈克 隆在基于TMV的前栽體代替plCH1740的編碼序列，產(chǎn)生構(gòu)建體 plCH20421和plCH20431 (圖5)。將plCH20241與plCH17388和 plCH10881(圖3)—起共浸潤(rùn)本氏煙草葉。
將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG兔抗體(Sigma)以1: 6000稀 釋用于對(duì)從浸潤(rùn)葉提取的可溶總蛋白質(zhì)執(zhí)行Western印跡分析。在圖6A 中顯示該分析的結(jié)果。顯然，使用單個(gè)病毒載體獲得的抗體表達(dá)水平(6和 7道，圖6)顯著高于使用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子甚至在PTGS阻抑基因P19的存 在下獲得的抗體水平(3 - 4道，圖6)。
實(shí)施例4
炎^差:f 7MK和P^Y病辜我沐W( /T^Z)si ^/
共表達(dá)兩個(gè)基因的其它策略是使用構(gòu)建在不同病毒上的分開(kāi)的病毒載 體，所述不同病毒可以共感染相同細(xì)胞并在其中復(fù)制。作為實(shí)例，基于馬 鈴薯病毒X (PVX)的病毒載體可以與TMV在相同細(xì)胞中共存。在圖7中 顯示兩個(gè)這樣的非竟?fàn)幮圆《驹泽w的示意圖。
從德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(DSMZ)獲得作為感染的干葉物質(zhì) 的PVX接種物(菌林PV0014)，并且用于接種本氏煙草植物。使用呈現(xiàn)病 毒癥狀的接種植物的體系葉制備總RNA.使用引物pvxpr2、 pvxpr4和 pvxpr6制備第 一鏈cDNA。使用Pfu-Taq聚合酶混合物，通過(guò)PCR從PVX cDNA擴(kuò)增三個(gè)cDNA片段
使用下列引物擴(kuò)增片段l:
Pvxprl : ttt ggtctc a tgaa gaaaactaaaccatacaccaccaacacaac (SEQ ID NO: 1)
Pvxpr2: ctttttccagcccggagaccatttctgtgatgg (SEQ ID NO: 2) 用Bsal消化片段l。
使用下列引物擴(kuò)增片段2:
Pvxpr3: ttt cgtctc a gggctggaaaaagaggacttccctgaagg (SEQ ID NO: 3) Pvxpr4: gagtcgtctcctgcataaacttgagcag (SEQ ID NO: 4) 用Esp31消化片段2。
使用下列引物擴(kuò)增片段3:
Pvx5: ttt gaagac aa tgcaggagacgactccgcactgg (SEQ ID NO: 5) Pvx6: eg gacgtc tttttt腦ttttttttttttt
atttatattattcatacaatcaaaccagaaaatac (SEQ ID NO: 6) 用BpilAatll消化片段3。
片段4含有擬南芥肌動(dòng)蛋白2基因啟動(dòng)子(An等人，1996， /V朋f 10, 107-121)，使用以下引物從擬南芥基因組DNA擴(kuò)增
Act2prl: ttt acgcgt ttcgacaaaatttagaacgaacttaattatg (SEQ ID NO: 7) Act2pr2: ttt ggtctc a ttca ttcaaagcggagaggaaaatatatg (SEQ ID NO: 8) 用Mlul和Bsal消4t片段4。
作為擬南芥肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子的^^選，也使用CaMV 35啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 基于PVX的病毒栽體的轉(zhuǎn)錄(見(jiàn)圖10D， plCH20788; plCH21380)。使用的 制備基于PVX載體的通用策略如Baulcombe及其同事所述(1995, /VflW /離wfl/， 2:1045-1053).
將全部四個(gè)片段一起克隆在使用Mlul和Aatll消化的雙元栽體中。在 ;Mt菌菌林GV3101中轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的構(gòu)建體的20個(gè)克隆，并且使用每個(gè)克隆 浸潤(rùn)本氏煙草植物的一個(gè)葉片. 一周之后，由表型篩選具有病毒感染癥狀 的本氏煙草，并且保留陽(yáng)性的質(zhì)?？寺?plCHPVX)。
從這一完整的功能性cDNA制備克隆栽體用于在CP亞基因組啟動(dòng)子 的下游克隆目的基因.克隆GFP基因作為實(shí)例。將在CP亞基因組啟動(dòng)子 區(qū)的ATG突變?yōu)锳GG (在Genbank登錄號(hào)M95516位置5651),將GFP 基因克隆在Nhel位點(diǎn)的3，(相當(dāng)于5662至5667)。 PVX的3，末端(相當(dāng)于 5618至6435)克隆在GFP序列的下游，并且接著該序列的是12至24個(gè)A 的一段序列。通it^桿菌浸潤(rùn)使此構(gòu)建體(plCH0130，圖8)進(jìn)入本氏煙草 葉。浸潤(rùn)二至三天之后在浸潤(rùn)區(qū)出現(xiàn)GFP熒光。幾天之后出現(xiàn)GFP的系 統(tǒng)移動(dòng)。
將plC0130與提供DsRed表達(dá)的栽體plCH17388、 plCH10580和 plCH10881 (圖3)—起共浸潤(rùn)進(jìn)入本氏煙草葉。共浸潤(rùn)6天之后，從浸潤(rùn)區(qū) 制備原生質(zhì)體并且在顯微鏡的藍(lán)光下觀察。幾乎全部的原生質(zhì)體同時(shí)表達(dá) GFP和DsRed，表現(xiàn)出極佳的共表達(dá)水平(圖9)。
實(shí)施例5
7MK付戎沐4這卓義發(fā)戎^
將IgG的重鏈和輕鏈克隆在PVX栽體中，代替在plC0130中的GFP 編碼序列，產(chǎn)生兩個(gè)構(gòu)建體，plCH21240和plCH21370，其分別含有重鏈 或輕鏈(圖10 A).還構(gòu)建了含有抗體輕鏈或重鏈的TMV前栽體部分的克 隆(plCH20431和plCH20421 ，圖10A).使用于>^于PVX和TMV的栽 體表達(dá)兩個(gè)不同鏈的農(nóng)桿菌混合物浸潤(rùn)本氏煙草葉并且在接種10天后通 過(guò)ELISA測(cè)量抗體的表達(dá)水平。結(jié)果(圖11 )顯示在基于PVX和TMV的 栽體共表達(dá)重鏈和輕鏈的情況下組裝的功能性抗體的極高水平。其水平顯 著高于從同時(shí)表達(dá)兩個(gè)鏈的TMV栽體所獲得的(實(shí)施例3).
另夕卜，將屬于IgGl亞類的另一人肺瘤特異性單克隆抗體，抗癌mab 亞克隆在基于TMV和PVX的載體中，步驟如下將含有抗癌mab輕鏈 編碼序列的730 Ncol-Notl片段在Notl位點(diǎn)平端化并且連接在基于TMV 的3，構(gòu)件克隆栽體plCH11599 (圖10B)(該栽體用Ncol-Xbal切開(kāi)并Xi Xbal位點(diǎn)平端化)，連接后產(chǎn)生plCH21910 (圖10B).使用相同的策 M^ 1421 bp的Ncol-Notl片段與抗癌mab重鏈編碼序列亞克隆進(jìn)入pICH11599 (圖IOB)產(chǎn)生pICIMlMO (圖IOB)構(gòu)建體.在基于TMV的3，構(gòu)件克隆栽體 plCH10990 (圖IOC)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生表達(dá)GFP的基于PVX 3，構(gòu)件的 plCH21282(圖IOC)。通過(guò)將GFP編碼序列插入plCH109卯(圖IOC)和接 著用PVX的3，非翻譯區(qū)代替TMV的3，非翻譯區(qū)完成幾個(gè)克隆步驟。類 似的，通過(guò)使用PVX的3，非翻譯區(qū)代替TMV的3，非翻譯區(qū)將基于TMV 的3，前栽體構(gòu)件plCH21920 (圖10B)轉(zhuǎn)化i^v基于PVX的3，前栽體構(gòu)件 plCH22250 (圖IOC)。將在HindlH位點(diǎn)平端化的plCH21282 (圖IOC)的575
bp Hindlll-Ndel片段與Sail位點(diǎn)平端化的plCH21920的Sall-Ndel片段連 接。將含有抗癌mab輕鏈編碼序列的723 bp Ncol-EcoRI片段亞克隆在使 用Ncol-EcoRI消化的plCH22250 (圖IOC)中，產(chǎn)生plCH22240 (圖IOC)。 5，前載體piCH21380 (圖IOD)按照以下方法制備使用構(gòu)建體 plCH17388 (圖3B)作為模板，在引物pv5p5F (SEQ ID NO: 9) (5， cagctagcaa caaacaagaa aggtaagttt c-3')和pv5p5R (SEQ ID NO: 10) (5'醫(yī) tctgagctctgcatgctacgcccccaactgagag-3')幫助下PCR擴(kuò)增該片段，用Nhel 和Sacl限制內(nèi)切酶消化，并與plCH20788的大的Nhel-Sacl片段連接， 用內(nèi)含子的5，端和AttP重組位點(diǎn)代替PVX栽體的3，部分。在圖10D中顯 示克隆的示意圖。使用5，前栽體和3，前載體的策略在植物中經(jīng)由位點(diǎn)特異 性重組組裝病毒栽體在先前已有描述(Marilloniiet等人2004， 7Vfl汰 爿caA Sd U5^4， 101 :6852-6857)。
訪絲與靜
使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔方案將所有產(chǎn)生的構(gòu)建體在農(nóng)桿菌菌林GV3101中轉(zhuǎn) 化并且進(jìn)一步用于本氏煙草葉的農(nóng)桿菌浸潤(rùn).將過(guò)夜生長(zhǎng)的4Uf菌培^ (OD咖范圍從1.8至2.5)等量混合并且在6000g離心3分鐘獲得沉淀。將沉 淀重懸浮于含有10 mM MES (pH 5.5)和10 mM MgS04的溶液中，產(chǎn)生對(duì) 于每種單獨(dú)的培養(yǎng)物的10"稀釋。通過(guò)使用無(wú)針頭的注射器使溫室生長(zhǎng)的 本氏煙草植物的6-8周齡葉受到浸潤(rùn).在使用前載體用于農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的情 況下，；Mf菌混合物通常帶有5種不同的農(nóng)桿菌菌抹，每種提供下列組分 之一重組酶(整合酶)來(lái)源(plCH10881); 5'PVX前栽體(plCH21380);提 供IgG鏈之一的一個(gè)3， PVX前栽體(由TMV前栽,供的互^h^決定， 或者提供重鏈的plCH22250或者揭_供輕鏈的plCH22240); 5， TMV前栽體 (plCH17388); —個(gè)3'TMV前栽體(編碼輕鏈的plCH21910或編碼重鏈的 plCH21920)
X/XS-^丙雄^t^^泳養(yǎng)『gsfew伊逐
將以農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的100 mg本氏煙草葉樣品在液氮中研磨，使用300 p 1蛋白質(zhì)提M^沖液((U M Tris、 150 mM NaCl和0.1 %吐溫20， pH 8.0)。 使用SDS-聚丙烯酰胺皿電泳的緩沖液系統(tǒng)將葉的粗提物在10%(非還原 IH中)或12%(還原條件)的聚丙烯酰胺:^中分離，接著通過(guò)考馬斯亮蘭染 色。對(duì)于Western印跡分析，使用印跡緩沖液(25 mM Tris、 192mM甘氨 酸、20%曱醇，pH 8.3)將來(lái)自SDS-聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至 Hybond P膜(Amersham Biosciences,英國(guó))。在TBST (50 mM Tris、 100 mMNaCl、 0.05 %吐溫20， pH7.4)中用5%脫脂牛奶封閉膜，并且用山羊抗 人入輕鏈HRP綴合抗體(Sigma，英國(guó))或山羊抗人IgG y鏈特異性HRP綴 合抗體(Sigma，英國(guó))作為探針檢測(cè)，所述抗體在2.5%脫脂牛奶/188中以 1: 10000和1: 5000分別稀釋。使用ECL檢測(cè)試劑(Amersham Biosciences, 英國(guó))檢測(cè)結(jié)合的抗體.在圖11B中顯示電泳分離和Western印跡分析的 結(jié)果。與標(biāo)準(zhǔn)IgG的比^明在植物組織中單克隆抗體的產(chǎn)量達(dá)到每克新 鮮葉生物量0.2-0.35 mg。
遂浙射"做Mg6好為、岸
使用含有100 mM磷酸鈉、150 mM NaCl和0.05 %吐溫20 (pH8.0)的 緩沖液從接種農(nóng)桿菌的本氏煙草葉區(qū)提取總可溶蛋白質(zhì)。根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)， 使用A蛋白^ t珠(New England Biolabs，美國(guó))對(duì)蛋白粗提物進(jìn)行一步親和 純化，小M分離抗癌mab。在圖11B (B欄)顯示了帶有純化的植物衍生 Mab的考馬斯染色皿.
實(shí)施例6
炎^差于W戎琳4這爽伊遂潑,r^s^)
合成編碼牛FSH的a多肽(對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)No. NMj73卯l 的101-463編碼序列的核苷酸)和P多肽(對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)No. NM_174060的70-459編碼序列的核苷酸)的基因(cDNA)，所述基因側(cè)翼帶 有限制位點(diǎn)(對(duì)于FSH-ct和FSH- P亞基為5， Ncol- 3，EcoRl)，并將所g因代替IgG的重鏈和輕鏈編碼序列克隆在TMV前載體(由plCH11599衍 生的plCH20431，圖10B)和PVX載體(plCH21240)產(chǎn)生分別含有oc亞基和 P亞基編碼序列的兩個(gè)構(gòu)建體，plCH-FSHA和plCH-FSHB(圖12)。制備 從基于PVX和基于TMV的載體表達(dá)兩種不同亞基的農(nóng)桿菌混合物并如上 所述浸潤(rùn)本氏煙草葉，接種10天之后使用可商購(gòu)的FSH 二聚體特異性 (FSH 117)抗體通過(guò)ELISA測(cè)量異二聚體FSH的表達(dá)水平并且使用Tropix 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Tropix， Bedford, MA)檢測(cè)。
實(shí)施例7
炎l差:f rMK和PKY時(shí)戎琳4這JgM
使用編碼IgM輕鏈和J鏈的序列分別代替plCH 15933中GFP和 DsRed的編碼序列，產(chǎn)生plCH-MLCJ構(gòu)建體(圖13)。將編碼IgM重鏈的 基因克隆在PVX栽體(plCH21240)代替IgG重鏈的編碼序列并且產(chǎn)生 plCH-MHC構(gòu)建體(圖13)。使用從基于PVX和TMV的栽體表達(dá)IgM的 三個(gè)不同鏈的農(nóng)桿菌混合物浸潤(rùn)本氏煙草葉,接種10天之后使用可商購(gòu)的 IgM特異性抗體通過(guò)ELISA測(cè)量異二聚體復(fù)合物的表達(dá)水平。
本發(fā)明要求其優(yōu)先權(quán)的歐洲專利申請(qǐng)No, 05 001 819.1和美國(guó)專利申 請(qǐng)No. 60/593,606的內(nèi)容在此被完整引入作為參考。
權(quán)利要求
1.在植物、植物組織或植物細(xì)胞中產(chǎn)生包含至少第一和第二蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在植物細(xì)胞中通過(guò)以下方式表達(dá)至少所述第一和第二蛋白質(zhì)亞基(i)向所述植物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞提供第一和第二正義單鏈RNA病毒載體，所述第一病毒載體編碼至少所述第一蛋白質(zhì)亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質(zhì)亞基，其中所述第一病毒載體和所述第二病毒載體是不同的病毒載體；或(ii)向所述植物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基的正義單鏈RNA病毒載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，接著從所逸法物、所M物組織或所ii^ 物細(xì)胞分離所述異源寡聚蛋白質(zhì).
3. 棉^據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中編碼至少所述第一和所述第二蛋 白質(zhì)亞基的所述RNA病毒栽體含有編碼所述第一蛋白質(zhì)亞基的第一異源 序列和編碼所述第二蛋白質(zhì)亞基的第二異源序列，其中所述第一和/或所述 第二蛋白質(zhì)亞基的表ii^亞基因組啟動(dòng)子的控制下.
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中編碼至少所迷第一和所述第二蛋 白質(zhì)亞基的所述RNA病毒栽體含有編碼所述第一蛋白質(zhì)亞基的第一異源 序列和編碼所述第二蛋白質(zhì)亞基的第二異源序列，其中所述第 一和/或所述 第二蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)在IRES元件的控制下.
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的方法，其中編碼至少所述第一和所 述第二蛋白質(zhì)亞基的所述RNA病毒栽體缺少編碼所述病毒載體系統(tǒng)移動(dòng) 功能性蛋白質(zhì)的ORF。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一病毒栽體含有編碼所述 第一蛋白質(zhì)亞基的第一異源序列，而所述第二病毒栽體含有編碼所述第二 蛋白質(zhì)亞基的第二異源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白質(zhì)亞基的表 ^亞基因組啟動(dòng)子的控制下。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一病毒載體含有編碼所述 第一蛋白質(zhì)亞基的第一異源序列，而所述第二病毒栽體含有編碼所述第二 蛋白質(zhì)亞基的第二異源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白質(zhì)亞基的表 MlRES元件的控制下。
8. 才艮據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)的方法，其中編碼至少所述第一和所 述第二蛋白質(zhì)亞基的所述病毒栽體、所述第 一病毒栽體和/或所述第二病毒 載體缺少功能性包被蛋白ORF、功能性移動(dòng)蛋白ORF和/或組裝病毒顆粒 的功能性起點(diǎn)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的方法，其中所述第一病毒載體衍生 自屬于馬鈴薯X病毒屬的病毒，而所述第二病毒栽體衍生自屬于馬鈴薯Y 病毒屬的病毒。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述第一病毒栽體衍生自馬鈴薯病 毒X，而所述第二病毒栽體衍生自馬鈴著病毒Y.
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的方法，其中所述第一病毒栽體衍 生自屬于馬鈴薯X病毒屬的病毒，而所述第二病毒栽體衍生自屬于煙草花 葉病毒屬的病毒.
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述第一病毒載體衍生自馬鈴薯病 毒X，而所述第二病毒栽體衍生自煙草花葉病毒。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12的任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和所述第二 病毒栽體具有至多60%的序列同源性。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13的任一項(xiàng)的方法，其中所述異源寡聚蛋白質(zhì) 是抗體，
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)的方法，其中向所述植物、植物組 織或植物細(xì)胞瞬時(shí)提供所述病毒載體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中通it^桿菌轉(zhuǎn)染向所迷植物、植物 組織或植物細(xì)胞瞬時(shí)提供所述病毒栽體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)的方法，其中將所述RNA病毒載 體作為所述RNA病毒栽體的DNA前體穩(wěn)定摻入植物染色體DNA。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中通過(guò)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子提供來(lái)自所述 DNA前體的所述RNA病毒載體的受控釋放。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)的方法，其中至少所述第一或所述 第二蛋白質(zhì)亞基具有植物特異性信號(hào)肽作為ER靶向信號(hào)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述植物特異性信號(hào)肽衍生自煙草 鉀網(wǎng)蛋白和/或稻oc淀粉酶。
21. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體是包含至少部分的抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白。
22. 根據(jù)權(quán)利要求14或21的方法，其中所述抗體包含與免疫球蛋白 重鏈締合的保護(hù)蛋白質(zhì)，其中該保護(hù)蛋白質(zhì)包含多IML疫球蛋白受體的部 分。
23. 根據(jù)權(quán)利要求14、 21或22的任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體或其 衍生物屬于免疫球蛋白G類、免疫球蛋白A類、免疫球蛋白M類、免疫 球蛋白D類或免疫球蛋白E類。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1至12的任一項(xiàng)的方法，其中所述異源寡聚蛋白質(zhì)
25. 根據(jù)權(quán)利要求1至24的任一項(xiàng)的方法，其中所述異源寡聚蛋白質(zhì) 的至少一個(gè)或至少兩個(gè)或多個(gè)亞基^^有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)KDEL。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1至25的任一項(xiàng)的方法，其中突變所述異源核^列從而部分或全部M所述異源寡聚蛋白質(zhì)除去糖基化位點(diǎn)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1至26的任一項(xiàng)的方法，其中改造所述植物、植物 組織或植物細(xì)胞以改變所述異源寡聚蛋白質(zhì)的糖基化方式。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1至27的任一項(xiàng)的方法，其中所迷植物是單子葉或 雙子葉植物。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬于茄科.
30. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是煙草物種。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是煙草或本氏煙草。
32. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬于十字花科。
33. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬于豆科。
34. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是紫苜蓿.
35. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬于藜科。
36. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是甜菜。
37. 在植物、植物組織或植物細(xì)胞中生產(chǎn)包含至少第一和第二蛋白質(zhì) 亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在植物細(xì)胞中從一個(gè)或多個(gè) 正義單鏈RNA病毒載體共表達(dá)至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基。
38. 在植物或植物組織中生產(chǎn)包含至少第一蛋白質(zhì)亞基和第二蛋白質(zhì) 亞基的抗體的方法，所述方法包括通過(guò)以下方式在植物細(xì)胞中表達(dá)至少所 迷第 一和所迷第二蛋白質(zhì)亞基(i) 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染向所逸法物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞 提供第一正義單鏈RNA病毒栽體的DNA前體和第二正義單鏈RNA病毒 載體的DNA前體，所述笫一病毒栽體編碼至少所述第一蛋白質(zhì)亞基，所 述第二病毒栽體編碼至少所述笫二蛋白質(zhì)亞基，其中至少所述第 一病毒栽 體或所述第二病毒栽體缺少編碼所述第一或所述第二病毒栽體在所i^i物 中系統(tǒng)移動(dòng)所需要的功能性蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框；或(ii) 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染向所迷植物、所述植物組織或所祖物細(xì) 胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基的正義單鏈RNA病毒栽 體的DNA前體，其中所述病毒栽體缺少編碼系統(tǒng)移動(dòng)需要的功能性蛋白 質(zhì)的ORF.
39. 在植物、植物組織或植物細(xì)胞中生產(chǎn)包含至少第一蛋白質(zhì)亞基和 第二蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括通過(guò)向所述植物、所i^物組織或所述植物細(xì)胞提供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒栽 體，在植物細(xì)胞中表達(dá)至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基，所述笫一病 毒栽體編碼至少所述第 一蛋白質(zhì)亞基，所述第二病毒栽體編碼至少所述第 二蛋白質(zhì)亞基，其中所述第一病毒載體和所述第二病毒載體衍生自不同的 正義單鏈植物RNA病毒。
40. 在植物、植物組織或植物細(xì)胞中生產(chǎn)包含至少第一蛋白質(zhì)亞基和 第二蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括通過(guò)向所述植物、所述植物組織或所#物細(xì)胞提供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒載 體在植物細(xì)胞中表達(dá)至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基，所述第一病毒 栽體編碼至少所述第 一蛋白質(zhì)亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質(zhì)亞基，其中所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體在除了編碼所述 第一和第二蛋白質(zhì)亞基的序列部分之外的序列部分不同。
41. 在植物、植物組織或植物細(xì)胞中生產(chǎn)包含至少第一蛋白質(zhì)亞基和 第二蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括通過(guò)向所述植物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞提供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒載 體在植物細(xì)胞中表達(dá)至少所述第 一和所述第二蛋白質(zhì)亞基，所述第 一病毒 栽體編碼至少所述第 一蛋白質(zhì)亞基，所述第二病毒栽體編碼至少所述第二 蛋白質(zhì)亞基，其中所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體衍生自屬于不同 種的正義單鏈RNA病毒。
42. 在植物、植物組織或植物細(xì)胞中生產(chǎn)包含至少第一和第二蛋白質(zhì) 亞基的抗體的方法，所述方法包括通過(guò)向所述植物、所述植物組織或所述 植物細(xì)J!&H供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒載體在植物細(xì)胞中表達(dá) 至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基，所述第 一病毒栽體編碼至少所述第 一蛋白質(zhì)亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質(zhì)亞基，其中所 述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體是不同的病毒栽體.
全文摘要
在植物、植物組織或植物細(xì)胞中產(chǎn)生包含至少第一和第二蛋白質(zhì)亞基的異源寡聚蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括通過(guò)以下方式在植物中表達(dá)至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基i)向所述植物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質(zhì)亞基的正義單鏈RNA病毒載體或ii)向所述植物、所述植物組織或所述植物細(xì)胞提供第一和第二正義單鏈RNA病毒載體，所述第一病毒載體編碼至少所述第一蛋白質(zhì)亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質(zhì)亞基，其中至少所述第一病毒載體和所述第二病毒載體是非競(jìng)爭(zhēng)的病毒載體。
文檔編號(hào)C12N15/67GK101115842SQ200680003264
公開(kāi)日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者A·吉里奇, S·馬里約內(nèi), V·克利姆克, Y·格萊巴 申請(qǐng)人:愛(ài)康遺傳有限公司