專利名稱：：以rRNA為標的的微生物定量分析方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種以rRNA為標的進行的對微生物，特別是處于生存狀態(tài)的微生物進行定量、檢測的方法。
背景技術：
：以往，微生物的定量方法主要使用在預先預測的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，計測菌數的方法、在選擇性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，測定混濁度或吸光度的方法。此外，在檢測樣本中的微生物時需要的微生物鑒定操作中，能夠使用通過形態(tài)觀察、革蘭氏染色、需氧性、糖同化特性、在培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等細菌學性質進行鑒定的方法、通過DNA-DNA同源性試驗進行判斷、通過微生物表面抗原的單克隆抗體進行檢測的方法等。這些方法需要時間并要求熟練，從迅速性和簡便性的觀點出發(fā)尚存在問題。近年，以PCR法為首的基因擴增方法作為用于檢測微量核酸的技術而在廣泛的領域中使用，該方法不以樣本中的微生物培養(yǎng)為必要條件，此外，能夠將樣本直接作為試樣進行處理等，具有能夠提供迅速化和簡便化的優(yōu)點，因此，正在討論將其應用于微生物的定量、檢測中。作為在微生物分析中應用PCR法的例子，己知將總DNA作為標的序列，通過使用通用引物的PCR法進行細菌定量的方法(專利文獻1)。此外，也實現了使用16SrDNA作為標的的方法，例如，己知通過以16SrDNA為標的序列的PCR法進行的定量分析方法(專利文獻2)、通過以16SrDNA為標的序列的PCR法進行的腸內細菌分析方法(專利文獻3)、作為啤酒混濁菌的乳酸桿菌屬菌種的檢測方法(專利文獻4)等。但是，由于為這些方法得不到以往使用的培養(yǎng)法那樣的檢測靈敏度，所以存在不能作為以往方法的替代方法而使用的問題。例如，專利文獻2中提出的定量性分析方法，為了其實施，需要相當于微生物數為105個^1以上的大量的模板DNA，這樣的方法是不實用的。此外，靈敏度低可以認為是由于作為PCR反應模板的總DNA或16SrDNA在微生物中所占拷貝數(模板量)少的緣故。此外，已知DNA在微生物死亡后也殘留存在，這些方法無非是將死亡后的微生物和生存狀態(tài)的微生物加在一起進行定量、檢測而已，也存在難以準確地定a、檢測生存狀態(tài)的微生物的問題(非專利文獻1)。此外，作為在微生物分析中應用PCR法的例子，也出現了將mRNA作為標的序列進行的試驗，例如，已知將mRNA作為標的序列對糞便中乳酸菌進行的定量分析(非專利文獻2)等。此外，也已知以樣本中的癌細胞特異的mRNA作為標的序列對癌細胞進行檢測的方法(專利文獻5、6)。但是，即使是這些方法，作為定量法，也不能得到能夠代替以往方法那樣的檢測靈敏度。即，在非專利文獻2中表示的定量分析的檢測限度僅為1()3'5個以上/g，糞便而已，從檢測靈敏度的觀點出發(fā)，不能作為以往的培養(yǎng)法的替代來使用。此外，這些方法是以各微生物中特有基因的mRNA作為標的的方法，從引物設計的煩雜程度、特異性低等問題出發(fā)，不適于檢測含有多種微生物的被檢測休。因此，期待開發(fā)出雖然為使用PCR法等的迅速方法，但是能夠同時得到和以往的檢測方法同樣程度的檢測靈敏度，而且能夠更準確地定量、檢測生存狀態(tài)的微生物的方法。為了改善靈敏度，也可以考慮將標的向細胞內更穩(wěn)定的或者更大量存在的物質進行設計變更。但是，如果考慮到懷疑這種穩(wěn)定的標的在死亡后的細胞中也長期殘留，則認為對用于僅以檢測生存狀態(tài)的微生物為目的是不理想的。因此，不容易同時達到充分的高度檢測靈敏度和僅檢測生存細胞。另一方面，己知rRNA是占細胞內RNA含有率約85X左右的多拷貝，由于和蛋白質形成復合體，因此比mRNA的穩(wěn)定性高。此外，也有rRNA在死后48小時左右被檢測出的報告(非專利文獻3)，一般考慮不適于檢測處于生存狀態(tài)的微生物(非專利文獻1)。專利文獻1:日本專利特開2002—238585號公報專利文獻2:日本專利特開2003—259879號公報專利文獻3:日本專利特開2001—112485號公報專利文獻4:日本專利特開平10—210980號公報專利文獻5:日本專利特開平10—248600號公報專利文獻6:國際公開第00/17395號小冊子非專利文獻l:JFoodProt,vol.67,No.4,823-832.(2004)非專利文獻2:FEMSMicrobiologyLetters，vol.231,125-130(2004)非專利文獻3:Appl.Environ.Microbiol"vol.64，No.11，4264-4268(1998)
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種能夠實現可代替以往培養(yǎng)法那樣的檢測靈敏度，并更準確地檢測處于生存狀態(tài)的微生物的微生物定量分析方法。本發(fā)明的發(fā)明人進行了深入研究，結果發(fā)現，如果從穩(wěn)定性出發(fā)，將認為不適于檢測處于生存狀態(tài)的微生物的rRNA(在細菌中為5S、16S、23S,在真核生物中為5S、18S、26S或28S)用于標的，出人意料，能夠不反映死細胞而準確地定量、檢測處于生存狀態(tài)的微生物數量，并且發(fā)現，如果在定量、檢測時使用PCR法，則能夠實現可代替以往方法那樣的檢測靈敏度，從而完成本發(fā)明。艮P，本發(fā)明提供一種以被檢測體中的目的微生物rRNA量為指標的目的微生物定量方法。此外，本發(fā)明提供一種以被檢測體中的目的微生物rRNA的存在為指標的目的微生物檢測方法。此外，本發(fā)明提供一種能夠在上述方法中使用的核酸片段，是由序列號2、3或528記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或者是由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且功能上等價的核酸片段。此外，本發(fā)明還提供一種用于實施上述方法的試劑盒。發(fā)明的效果如果使用本發(fā)明的以rRNA為標的的檢測方法，由于標的大量存在，因此盡管相比于以往的標的能夠達到高靈敏度，但同時也能夠更準確地檢測、定量處于生存狀態(tài)的微生物。此外，如果在該檢測中使用PCR法，則能夠實現可成為以往培養(yǎng)法的代替那種程度的檢測靈敏度。而且，如果是使用PCR的方法，則相比于培養(yǎng)法等的以往方法，能夠實現格外的迅速和簡便。即，如果使用本發(fā)明的方法，則能夠同時實現高檢測靈敏度、更準確的定量、檢測處于生存狀態(tài)的微生物、和迅速簡便。因此，能夠在腸道菌群的分析和在來自食品、生物體的試樣中生存的微生物的檢測、定量等要求檢測、定量微生物的實際應用情況中使用。圖1是表示各種微生物的增殖和rRNA轉錄量的關系的圖。圖2是表示由定量RT-PCR法產生的標準曲線和定量PCR法的檢測范圍的比較的圖。圖3是表示來自人糞便的綠膿桿菌的檢測范圍的圖。圖4是針對人糞便大腸菌群的定量值，比較由定量RT-PCR求出時和由培養(yǎng)法求出時的圖。圖5是表示來自牛奶的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿直的檢測靈敏度的圖。圖6是表示來自血液的綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度的圖。圖7是表示來自發(fā)酵乳制品的iliffl的檢測靈敏度的圖。具體實施方式本發(fā)明的目的微生物的定量、檢測方法，其特征在于以在被檢測體中的目的微生物rRNA的存在量和存在為指標。所謂目的微生物rRNA，指的是以定量、檢測為目的的微生物能夠具有的rRNA，作為rRNA，例如，可以列舉在原核生物中的5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，在真核生物中的5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、26SrRNA、28SrRNA，從作為現在的微生物分類可靠的指標而主要被使用的方面出發(fā)，特別優(yōu)選16SrRNA、23SrRNA、18SrRNA和26SrRNA。此外，所謂目的微生物，指的是作為定量、檢測目的的微生物，沒有特別的限定，例如，可以列舉腸桿菌科、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、韋榮氏球菌屬、假單胞菌屬、梭菌懇、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、梭形桿菌屬、丙酸桿菌屬、消化鏈球菌屬、弧菌屬、芽胞桿菌屬、亶曲桿菌屬、不動桿菌屬、乳球菌屬、片球菌屬、魏斯菌屬、明串珠菌il人酒球菌屬、螺桿菌屬、奈瑟球菌屬、李斯特菌屬、豬嗜血桿菌屬、分枝桿菌屬、加德納菌屬、軍團菌屬、氣單胞菌屬、莫拉菌屬、念珠菌屬等微生物和后述表2、表3記載的微生物。此外，本發(fā)明的目的微生物的概念不僅包含由1種菌種構成的微生物，而且還包含由共有某種性質的2種以上菌種的集合構成的群、屬和科。所謂被檢測體，指的是微生物的存在或存在量等的調査對象。作為被檢測體，例如，可以列舉結膜拭子、牙石、牙斑、咳出的痰、啊拭子、唾液、鼻涕、支氣管肺泡灌洗液、胸水、胃液、洗胃液、尿、子宮頸管粘液、陰道分泌物、皮膚損傷、糞便、血液、腹水、組織、腦脊髓液、關節(jié)液、患處沖洗液等來自生物的試樣、食品、藥品、化妝品、食品藥品*化妝品的中間處理物、微生物培養(yǎng)液、植物、土壤、活性污泥、排水等可能含有微生物的對象。此外，所謂被檢測體試樣，指的是以被檢測體為基礎攝取或制作的試樣，只要是能夠反映被檢測體微生物存在或存在量的試樣，則沒有特別的限定，例如，可以列舉含有被檢測體中所含的核苷酸的混合物和含有RNA的混合物，但從在PCR法中使用的觀點出發(fā)，優(yōu)選含有被檢測體中所含RNA的混合物。被檢測體試樣，例如，能夠從全部或一部分被檢測體，根據需要，在通過提取、分離、精制方法進行前處理后，通過適當的公知方法取得。例如，含有RNA的混合物，根據需要，在通過過濾、離心分離、色譜法等公知的方法進行前處理后，例如，能夠通過使用"異硫氰酸胍一氯化銫超速離心法"、"酸性異硫氰酸胍—苯酚氯仿法(AGPC法)"、"磁珠法"、"二氧化硅柱法"等通用方法的提取而得到，此外，也能夠使用市售的試劑盒(QIAGENRNeasyKIt、TRIZOL等)進行。此外，作為被檢測體試樣，從防止分解、維持高檢測靈敏度的觀點出發(fā)，優(yōu)選使用在微生物中處于固定狀態(tài)的RNA。這樣的固定，例如，能夠通過市售的固定劑(RNAprotectBacterialRegent、RNAlater等)進行。此外，從避免微生物內的RNA量變化的觀點山發(fā)，同定優(yōu)選在采取樣本后立即進行。本發(fā)明中的目的微生物的定量以在被檢測體中的目的微生物rRNA量為指標。這里，被檢測體中的目的微生物rRNA量，例如，能夠通過(1)使用能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測體試樣，通過PCR法求出擴增產物量；(2)求出能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測體試樣的雜交效率；或(3)以使用其它公知方法的定量方法求出。這里，(1)在使用PCR法時，"能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段"的設計能夠通過比較目的微生物具有的堿基序列和其它微生物具有的堿基序列，在目的微生物能夠具有的rRNA中選擇特異的序列而進行。這里，微生物能夠具有的rRNA的堿基序列，例如，能夠通過參考數據庫(DDBJ、Genbank等)而得到。此外，能夠使用軟件(ClustalX等)対-堿基序列進行比對，通過目測等手段發(fā)現特異的序列。此外，目的微生物中特異性序列，優(yōu)選參考作為定量對象的微生物所包含范圍的廣度。即，例如，如果以特異性定量某菌種為目的，則優(yōu)選選擇該菌種的特異序列，此外，如果以特異性定量某屬為目的，則優(yōu)選選擇該屬的特異序列。這樣的選擇能夠使用公知的方法適當地進行。作為能夠與目的微生物rRNA雜交的核酸片段，不僅能夠使用這樣設計的序列，而且也能夠按照公知的技術常識適當估計，使用與該堿基序列互補的堿基序列和能夠在目的微生物的定量中同樣使用的同源的堿基序列，例如，由a)該堿基序列中的1個或多個，優(yōu)選1至10個堿基取代、添加或缺失的堿基序列；b)與該堿基序列具有90。^以上、優(yōu)選95%以上、更優(yōu)選99%以上同一性的堿基序列；c)在嚴格條件下與和該堿基序列互補的堿基序列構成的DNA雜交的堿基序列構成的核酸片段等。此外，這樣的核酸片段，也可以是在其兩端或一端，優(yōu)選在5'端添加任意數，優(yōu)選100個，更優(yōu)選20個，進一步優(yōu)選10個以下堿基的核酸片段的一部分。該核酸片段的長度沒有特別的限制，優(yōu)選由550個堿基構成的核酸片段，更優(yōu)選由1235個堿基構成的核酸片段。這樣設計的核酸片段，例如，能夠按照其堿基序列以DNA合成機進行人工合成。作為該片段，優(yōu)選在合成后確認其特異性的片段，這里，作為特異性的確認，例如，當以目的rRNA為模板吋，通過和適當的對照相比，確認得到特異的PCR擴增產物而進行。作為這樣的核酸片段，例如，可以列舉序列號130記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段。這里，作為由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，例如，可以列舉在以下表示的(a)(c)中表示的，在目的微生物rRNA的定量、檢測中能夠使用的核酸片段。(a)在由以序列號130表示的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段中，l個或多個堿基缺失、取代或添加的核酸片段。(b)由與以序列號130表示的堿基序列或與其互補的堿基序列具冇90%以上，優(yōu)選95%以上，更優(yōu)選99%以上同一性的堿基序列構成的核酸片段。(c)由在嚴格的條件下與以序列號130表示的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的DNA雜交的堿基序列構成的核酸片段。此外，在這里，堿基序列的同一性，可以通過使用GENETYX(R)的同源性分析程序算出。此外，作為"嚴格的條件"，例如，可以列舉在含有50%甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt's溶液和250mg/mL鮭魚精子DNA的溶液中，以42"C恒溫1624小時使其雜交的條件。能夠在目的微生物rRNA的定量、檢測中使用的核酸片段，例如，能夠通過進行PCR法，選擇以目的微生物rRNA作為模板時能夠得到擴增產物，而以其它標的，例如其它微生物rRNA或mRNA作為模板時不能得到擴增產物的核酸片段而得到。這樣，(1)由序列號1或2記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測蠟樣芽胞桿菌的用途中使用，(2)由序列號3或4記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測產氣莢膜梭菌的用途中使用，(3)由序列號5或6記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測腸桿菌科的川途屮使川，(4)由序列號7或8記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢觀lj葡萄球菌屬的用途中使用，(5)由序列號9或10記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測假單胞菌屬的用途中使用，(6)由序列號11或12記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測腸球菌屬的用途中使用，(7)由序列號13或14記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或山與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測嗜酸乳桿菌亞群的用途中使用，(8)由序列號15或16記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測瘤胃乳桿菌亞群的用途中使用，(9)由序列號17或18記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測植物乳桿菌亞群的用途中使用，(10)由序列號19或20記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測羅伊乳桿菌亞群的用途中可以使用，(11)由序列號21或22記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測清酒乳桿菌亞群的用途中使用，(12)由序列號23或24記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測干酪乳桿菌亞群的用途中可以使用，(13)由序列號25或26記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測短乳桿菌亞群的用途中可以使j-l]，(14)由序列號27或28記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測食果糖乳桿菌的用途屮使用，(15)由序列號29或30記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測發(fā)酵乳酸桿菌的用途中使用。此外，在這里，由序列號1記載的堿基序列構成的核酸片段是在FEMSMicrobiologyLetters,vol.202,209-213(2001)中記載的公知的核酸片段。此外，由序列號4記載的堿基序列構成的核酸片段是在Microbiol.Immunol.,vol.46，No.5，353-358(2002)中記載的公知的核酸片段。此外，由序列號29或30記載的堿基序列構成的核酸片段是在曰本專利特開平U—151097號公報中記載的公知的核酸片段。另一方面，由序列號2、3或528記載的堿基序列構成的核酸片段是木發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現的核酸片段。使用這樣制作的核酸片段和被檢測體試樣的PCR法，能夠通過"以該核酸片段作為引物使用，在含有被檢測體試樣的反應體系中，以目的微生物rRNA為模板的PCR反應"而進行。作為這樣的PCR法，只要為特異性擴增來自目的微生物rRNA的核苷酸片段的反應，則沒有特別的限制，但優(yōu)選包含將目的微生物rRNA作為模板，通過酶，優(yōu)選逆轉錄酶等制作cDNA的工序的方法，此外，更優(yōu)選在該工序以外，包含以這樣制作的cDNA作為模板擴增核苷酸的工序的方法。這樣的PCR法，例如，能夠通過使用公知的RT-PCR反應而進行。這里，RT-PCR反應能夠使用Two-StepRT-PCR或One-StepRT-PCR等公知的方法進行，但是從簡便、并且從防止交叉污染的觀點出發(fā)，特別優(yōu)選One-StepRT-PCR。這樣的One-StepRT-PCR法，例如，可以使用市售的試劑盒(QIAGENOne-StepRT-PCRkit等)進行。作為在RT反應中使用的具有逆轉錄活性的酶，能夠使用M-MHVreversetranscriptase等各種逆轉錄酶。此外，在使DNA擴增的PCR反應中使用的DNA聚合酶優(yōu)選為具有9(TC以上耐熱性的酶。這樣的PCR反應，例如，能夠通過下述方法進行以在9098"C將雙鏈DNA變?yōu)閱捂湹臒嶙冃苑磻⒃?772TH吏引物與模板cDNA雜交的退火反應、在5075。C使DNA聚合酶發(fā)揮作用的延伸反應的溫度條件下，將此作為l個循環(huán)，進行1數十個循環(huán)。此外，優(yōu)選的反應條件的一個例子為，熱變性95。C30秒，退火6(TC30秒、延伸反應72"C60秒。此外，在PCR反應時，優(yōu)選將2種引物作為1組使用，此時，兩者必須使引導鏈和后隨鏈進行組合。由于本發(fā)明提供的核酸片段將在RT-PCR反應中的退火溫度設定為幾乎固定的溫度，因此能夠同時測定多個微生物的核酸片段。此外，既能夠作為探針使用，也能夠和其它公知的通用引物、寡聚核苷酸等組合使用。此外，作為含有作為該RT-PCR反應模板的rRNA的被檢測體試樣，優(yōu)選含有RNA總量為lpgl|ig的RNA的物質，更優(yōu)選含有10pgO.lpg的物質。在進行適當的PCR反應時，通常，在"PCR擴增產物量"、"PCR循環(huán)數"和"PCR的模板量"之間有相關關系。因此，如果參考通過這樣進行的PCR反應而擴增的擴增產物量和PCR循環(huán)數而適當計算，就能夠求出目的微生物rRNA量。此外，正如后述的實施例圖1所示，可知在求出的"目的微生物rRNA量"和"目的微生物的菌數"之間也存在良好的相關關系。因此，如果參考這樣求出的"目的微生物rRNA量"而計算，就能夠求出目的微生物的菌數。此外，即使不經過計算"目的微生物rRNA量"的過程，通過參考如上述操作進行的"通過PCR反應而擴增的擴增產物量"和"PCR循環(huán)數"而適當計算，也能夠求出目的微生物的菌數。PCR擴增產物量和PCR循環(huán)數的得知沒有特別的限定，能夠通過所有的方法進行，例如，能夠通過確定在到達任意設定的一定量的DNA量時的PCR循環(huán)數而進行。這樣的確定，例如，能夠通過使用"并用標記PCR產物的PCR法，經時地計測標記而進行的PCR法"，確定在到達設定的一定熒光強度時的PCR循環(huán)數而進行。這里，一定的熒光強度，從能夠反映適當的相關關系出發(fā)，優(yōu)選以"擴增產物在對數擴增時能夠達到的熒光強度的范圍內"而設定。這樣的范圍通過公知的方法能夠適當理解。此外，在這里，作為標記，例如，可以列舉以熒光色素產生的標記，作為標記的計測，例如，可以列舉熒光強度的計測。此外，在這里，作為以熒光色素產生的標記，例如，可以列舉以嵌入性熒光色素產生的標記，作為嵌入性熒光色素，例如，可以列舉SYBR(R)GreenI。嵌入性色素因嵌入在雙鏈核酸中而具有熒光強度增強的性質，因此發(fā)出反映擴增的PCR產物的強度的熒光。此外，以熒光色素產生的標記，也能夠通過使用以熒光色素標記的TaqMan探針和分子信標(MoleculerBeacon)等而進行。TaqMan探針和分子信標是使熒光色素和猝滅劑結合在與通過PCR擴增的區(qū)域的內部序列具有同源性的寡聚核苷酸中的探針，使其共存在PCR反應中而使用。通過結合在探針中的熒光色素和猝滅劑的相互作用，發(fā)出與PCR擴增反應相應的熒光，因此，通過測定在各PCR階段的熒光強度，能夠對被擴增的PCR產物進行經時地觀察。但是，TaqMan探針和分子信標等，必須找出適應于探針的細菌中特異的互補序列，有時根據對象不同而存在困難。如果參考這樣得知的"PCR擴增產物量和PCR循環(huán)數"和適當的比較實驗的結果，就能夠求出rRNA量。即，例如，如果參考"使用其量已知的rRNA進行的比較實驗的結果"，與如上述得知的"PCR擴增產物量和PCR循環(huán)數"進行適當的對比，通過公知的方法就能夠計算目的微生物rRNA量。這樣，如果參考這樣計算的"目的微生物rRNA量"和適當的比較實驗的結果，就能夠求出目的微生物的菌數。即，例如，如果參考"使用對應的其菌數己知的被檢測體試樣進行的比較實驗的結果"，與這樣計算的"目的微生物rRNA量"進行適當的對比，通過公知的方法就能夠計算目的微生物的菌數。此外，在這樣的對比中，從簡便性出發(fā)；優(yōu)選使用表示作為PCR模板的"被檢測體微生物的菌數"和到達一定的PCR擴增產物量時的"PCR循環(huán)數"(以下有時也稱為CT值)的相關關系的標準曲線。這樣的標準曲線，通常是將作為標的的微生物菌數標繪在橫軸，將Cr值標繪在縱軸而制成(參照圖2)。在標準曲線制成時使用的微生物也可以使用模式株等公知的菌株。此外，如果適當對比"使用對應的其菌數己知的被檢測體試樣進行的比較實驗的結果"和如上述操作而得知的"PCR擴增產物量和PCR循環(huán)數"，不經過具體計算rRNA量的過程，也能夠直接計算目的微生物的菌數。具體而言，適用將來自被檢測體試樣的CT值導入上述標準曲線中即可。此外，如上所述，在被檢測體中的目的微生物rRNA量，例如，也能夠通過(2)得知能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測體試樣的雜交效率而求出。這里，能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段，例如，能夠使用如上述設計和制作的核酸片段。此外，作為這樣的核酸片段，優(yōu)選形成標記的核酸片段。這里，作為標記，可以列舉酶、順磁性離子、生物素、熒光色素、發(fā)色團、重金屬或放射性同位素，作為更優(yōu)選的標記，可以列舉酶，這里，作為酶，可以列舉辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。這樣的標記能夠通過公知的方法進行。如果測定被檢測體試樣和這樣的核酸片段的雜交程度，通過公知的換算方法就能夠得知在被檢測體中的目的微生物rRNA量和/或目的微生物的菌數。這樣的雜交程度的計測沒有特別的限定，能夠以公知的方法為準進行，例如，能夠通過計測添加在核酸片段的標記而進行。即，例如，當使用以熒光色素標記的核酸片段時，能夠通過計測熒光強度而進行。這樣的計測優(yōu)選為和適當的對照平行進行的計測。這里，作為適當的對照，例如，可以列舉"已知不與使用的核酸片段特異雜交的試樣"、"來自所含目的微生物菌數已知的被檢測體的被檢測體試樣""從目的微生物rRNA量己知的被檢測體攝取或制作的被檢測體試樣"等。通過參考這樣的對照，以公知的換算方法能夠得知目的微生物rRNA量或目的微生物菌數。此外，微生物菌數的得知也能夠參考這樣計算的目的微生物rRNA量和適當的比較實驗結果，以公知的方法進行。此外，本發(fā)明的目的微生物的檢測方法，是以在被檢測體試樣中的目的微生物rRNA的存在為指標的方法。這里，所謂"微生物的檢測"包含微生物鑒定的含義。此外，也包含確認檢測對象微生物在樣本中存在，或確認檢測對象微生物在樣本中不存在的含義。當使用本發(fā)明的檢測方法確認目的微生物rRNA在被檢測體中存在時，通過下述方法進行即可(1)檢測使用被檢測體試樣和能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段的PCR產生的擴增產物；(2)檢測這樣的核酸片段和被檢測體試樣的雜交；(3)使用其它公知的方法檢測目的微生物rRNA等。該(1)(3)的方法能夠通過參考已經敘述的方法而容易地進行。這樣，由于目的微生物rRNA的存在表示目的微生物在被檢測體中存在，因此能夠檢測目的微生物。但是，由于非特異的PCR產物擴增和非特異的雜交均能夠發(fā)生，因此優(yōu)選和適當的對照比較而進行。如后述的實施例所示，可知以rRNA量為指標的定量方法和以rRNA的存在為指標的檢測方法，相比于以往的以rDNA量為指標的方法，能夠達到很高的檢測靈敏度。此外，如在后述的實施例中所示，可知以rRNA量為指標的方法，能夠不將死細胞同時定量、檢測，而正確地定量、檢測處于生存狀態(tài)的微生物。因此，如果使用本發(fā)明的定量、檢測方法(以下也稱為"本發(fā)明的方法")，能夠以比以往方法更高的檢測靈敏度，并且特異地定量、檢測處于生存狀態(tài)的微生物。因此，本發(fā)明的方法，例如，能夠在下述用途等中使用(1)以比以往方法更高的檢測靈敏度定量、檢測在被檢測體中含有的處于生存狀態(tài)的目的微生物；(2)以比以往方法更高的檢測靈敏度定量、檢測在被檢測體中含有的死細胞數；(3)以比以往方法更高的檢測靈敏度計測在被檢測體中含有的死細胞數和處于生存狀態(tài)的微生物數的比例；(4)以比以往方法更高的檢測靈敏度"確認"處于生存狀態(tài)的微生物的存在或存在量。這里，作為確認，例如，可以列舉(a)在有必要更嚴格地正確把握處于生存狀態(tài)的微生物數時，為了把握處于生存狀態(tài)的微生物的存在或存在量而進行的定量、檢測；(b)在"處于生存狀態(tài)的微生物數"通過其它實驗系統被計算時，為了研究該實驗的精度和被計算的數值的正確度而進行的確認。此外，當定量死細胞時，例如，優(yōu)選通過已知同時檢測死細胞的公知的方法等，同吋計測死細胞數和生存細胞數的合計數而進行。能夠通過從合計數除去以本發(fā)明的方法計算的生存細胞數而求出。此外，本發(fā)明的方法，例如，也可以作為定量、檢測不形成菌落的微生物、不能液體培養(yǎng)的微生物等通過以往的培養(yǎng)法難以計測的微生物的方法而使用。此外，如后述的實施例所示，可知在這樣的定量、檢測方法中，當使用PCR法時，能夠實現和培養(yǎng)法同等程度的檢測靈敏度。因此，本發(fā)明的方法，也能夠以和培養(yǎng)法同等程度以上的檢測靈敏度，艮口，10G個以上/g'樣本，或l(^個以上/mL'樣本的檢測靈敏度，而作為定量、檢測微生物的方法使用。此外，當使用PCR法時，和培養(yǎng)法比較，能夠極其迅速而且簡便地進行微生物的定量、檢測。此外，如果通過使用PCR法的方法，則從樣本的RNA的提取到微生物的定量、檢測，能夠在約6小時以內完成。因此，本發(fā)明的方法也能夠作為能夠以短時間(6小時以內)檢測微生物的方法使用。在本發(fā)明的方法中，如果使用采用PCR法的方法，則能夠同吋實現高檢測靈敏度、更準確地定量、檢測處于生存狀態(tài)的微生物、和迅速及簡便。因此，本發(fā)明的方法，例如，能夠在特別要求迅速且靈敏度高的定量、檢測的醫(yī)療場所和食品工業(yè)中的"污染菌、有害菌、病原微生物等的檢查"的用途中使用。本發(fā)明的方法也能夠使用用于實施該方法的試劑盒而進行。這里，作為用于實施該方法的試劑盒，例如，可以列舉包含(1)能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段、(2)記載實施方法的實驗設計、禾口/或(3)在RNA提取、RNA固定或PCR反應中使用的試劑的試劑盒，但本發(fā)明的試劑盒不限定于這些，也指集合了進行該方法的全部或一部分工序所需物質的全部或一部分的試劑盒。這里，"進行工序所需的物質"能夠通過參考本說明書的記載而適當理解。實施例以下，通過實施例對本發(fā)明的內容進行更詳細地說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。實施例1引物的制作針對各種細菌菌種，從DNADataBankofJapan(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)入手16S禾卩23SrRNA的DNA序列。通過ClustalW程序將這些序列比對后，制成系統樹。以系統樹為基礎，將各菌種分類為科、屬、亞群，在每個分類中進行引物的設計。在表1中表示制成的引物序列和作為對象的rRNA種類。此外，表1的參考文獻欄表示記載該序列的文獻。此外，該欄為空欄的，表示該序列是由本發(fā)明發(fā)現的新序列。此外，非專利文獻4表示Microbiol.Immunol"vol.46，No.5,353-358(2002)，非專利文獻5表示FEMSMicrobiologyLetters,vol.202，209-213(2001)，專利文南犬7表示日本專利特開平11—151097號公報。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例2引物的特異性確認為了確認實施例1的引物在實際中是否具有特異性，研究對各種細菌的特異性。即，將在表2(28個菌屬57個菌種)和表3(18個菌屬60個菌種)中所示的各種細菌懸浮液50)il懸浮在2倍量的RNAprotectBacterialReagent(QIAGEN)屮，室溫孵育5分鐘。以5000g離心分離10分鐘，除去上清后，添加450ial溶菌緩沖液[346.5^1RLT緩沖液(QIAGEN)、3.5plJ3—巰基乙醇、100(alTE緩沖液]和300mg(直徑0.1mm)玻璃珠，通過FastPrepFP120(Bio101)以5000rpm激烈振蕩1分鐘，破碎菌體。向破碎液中添加500(il水飽和酚，在60。C下孵育10分鐘。添加lOOpl氯仿/異戊醇(CIA)攪拌后，以12000rpm、4°C、5分鐘的條件進行離心分離操作。向冋收的卜.清中加入等最的水飽酚(水飽和)/氯仿進行攪拌，再次以同樣條件進行離心分離操作。向回收的上清中加入等量的CIA進行振蕩，再次以同樣條件進行離心分離操作。向回收的400|il上清中添加等量的異丙醇和1/10量的3M醋酸鈉，顛倒混合后，以15000rpm、4°C、10分鐘的條件進行離心分離操作。向去除上清的物質中加入50(^1的75%乙醇，顛倒混合后，以15000rpm、4°C、2分鐘的條件進行離心分離操作。除去上清，使管內風干后，以5(Vl的無RNA酶水溶解沉淀物，將該溶液作為總RNA提取溶液。定量RT-PCR反應使用QIAGENOneStepRT-PCR試劑盒(QIAGEN)進行。反應液(總量25^1)的組成為，2^1的總RNA溶液(相當于2X105CFU)，和調整使得作為終濃度為1XQIAGENOneStepRT-PCRBuffer、0.5mMdNTPMix、1/25量的QIAGENOneStepRT-PCREnzymeMix、1/100000量的SYBR(R)GreenI(MolecularProbes)、0.75^iM各引物(在表1中記載)。此外，對于RT-PCR反應，使用相當于2X105CFU的RNA作為模板。反應液首先在50'C下進行30分鐘的逆轉錄反應，此后，為了使逆轉錄酶失活，在95'C下加熱15分鐘。接著，以94。C20秒、55。C或6(TC20秒、72°C50秒進行4045個循環(huán)，每次循環(huán)中，測定作為SYBR(R)GreenI的熒光強度的擴增產物量。這些一系列反應通過ABIPRISM(R)7900HT(AppliedBiosystems)進行。其結果如在表2中所示，可知引物En-lsu3F/3'R(腸桿菌科)、g-Staph-F/R(葡萄球菌屬)、PSD7F/R(假單胞菌屬)、s-Clper-F/ClPER-R(產氣莢膜梭菌)、S-S-Bc-200-a-S-18/Bc2R(蠟樣芽胞桿菌)、g-EncocF/R(腸球菌屬)，僅能夠特異地檢測目的菌屬或菌種。此外，如在農3中所示，可知引物sg-Laci-F/R(嗜酸乳桿菌亞群)、sg-Lsak-F/R(清酒乳桿菌亞群)、sg-Lcas-F/R(干酪乳桿菌亞群)、sg-Lmm-F/R(瘤胃乳桿菌亞群)、sg-Lreu-F/R(羅伊乳桿菌亞群)、sg-Lpla-F/R(植物乳桿菌亞群)、s冒Lbre-F/R(短乳桿菌亞群)、s-Lfru-F/R(食果糖乳桿菌)、LFer-1/2(發(fā)酵乳酸桿菌)僅能夠特異地檢測目的亞群或菌種。此外，在表2、表3中，十表示能夠進行特異的檢測(Gr值為130)，一表示Gr值為31以上或完全不能得到擴增產物。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>[表2—2]<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表3—1]__<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例3各種微生物的生長狀況與rRNA轉錄量的相關性的研究使用大腸桿菌(大腸桿菌)、金黃色葡萄球菌(金黃色葡萄球菌)、綠膿桿菌(綠膿桿菌)的各培養(yǎng)期的菌體，調查以培養(yǎng)法測定的活菌數和從以定量RT-PCR法測定的rRNA轉錄量導出的具有菌落形成能力的細菌數的關系。即，使用BHI培養(yǎng)基，在37"C下開始好氧振蕩培養(yǎng)后，使用經時采取的菌液，通過使用BHI瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)法(37°C，24小時)測定菌數。另一方面，從同樣采取的樣品中提取RNA，進行定量RT-PCR分析。使用從菌數已知的對數增殖后期菌株提取的RNA，以在實施例4中記載的要點制成的標準曲線，基于該標準曲線算出各樣品中的菌數。另外，總RNA提取和定量RT-PCR如實施例2所述進行。其結果表示在圖1中。在圖1中，將從rRNA轉錄量算出的菌數以《(黑點)表示，由培養(yǎng)法得出的菌數以O(白點)表不。對于川于分析的全部菌株，從對數增殖期到死亡期，確認由菌液中的培養(yǎng)法得出的活菌數和從rRNA轉錄量算出的菌數各自的變化曲線具有高相關性。由此可知，通過測定rRNA的轉錄量，在任意狀態(tài)下都能夠測定處于生存狀態(tài)的微生物數。實施例4標準曲線的制成和與定量PCR法的比較使用綠膿桿菌YIT61087(模式株)和金黃色葡萄球菌YIT6075T(模式株)的對數增殖后期的培養(yǎng)菌體，通過本發(fā)明的方法(定量RT-PCR法)進行標準曲線的制成。此外，通過定量PCR法制成標準曲線，和本發(fā)明方法進行比較。分別取得使用BHI培養(yǎng)基的各自的純培養(yǎng)菌株，使得菌數為105、104、103、102、10'、100，和實施例2同樣地提取RNA。使用在表1中記載這些的引物，按照實施例2進行定量RT-PCR。調査得到的CT值和以實施例3中記載的培養(yǎng)法求出的菌數的相關性。此外，同時也通過以下所示的方法，對由相同樣品得到的DNA研究通過以rDNA作為標的序列的PCR法進行的定量。具體而言，向分別取得的菌數為105、104、〗03、102、IO1、10°的菌液中加入lmL的PBS，攪拌后，以15000rpm、4°C、5分鐘的條件進行離心分離，除去上清。重復進行2次向沉淀物中加入lmL的PBS、攪拌、離心、除去上清的操作。向該片狀沉淀物中添加300pl溶菌緩沖液(lOOmMTris-HCl,40mMEDTA，1%SDS，pH9.0)、500|ilTE飽和酚和300mg玻璃珠(直徑O.lmm)，通過FastPrepFP120以5000rpm激烈振蕩30秒鐘，破碎菌體。以15000rpm、4°C、5分鐘的條件進行離心分離，回收上清。向上清中加入酚(TE飽和)/氯仿/異戊醇，通過FastPrepFP120以4000rpm激烈振蕩45秒鐘后，以15000rpm、4°C、5分鐘的條件進行離心操作。使用分離、回收的上清進行醇沉淀后，溶解在50(il的TE緩沖液中，制成DNA溶液。接著，以得到的DNA溶液作為模板進行PCR反應。PCR反應在總量為25^1，含有2(^1DNA溶液和作為最終濃度，為10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKC1、2.5mMMgCl2、0.45%TritonX-100、200pMdNTP混合物、1/100000量的SYBR(R)GreenI、11ng/(ilTaqStart(R)抗體(ClonTech)、0.05U/|ilTaqDNApolymerase(TaKaRa)、0.25pM各引物(PSD7F/R、g-Staph-F/R)的反應液中進行。反應液在94'C加熱5分鐘后，以94'C20秒、60°C20秒、72°C50秒進行40個循環(huán)，然后，以72。C反應10分鐘。在每個循環(huán)屮，測定作為SYBR(R)GreenI的熒光強度的擴增產物量。這些一系列的反應通過ABIPRISM(R)7900HT進行。此外，將RNA禾卩DNA提取量的1/25用于反應。該結果如在圖2中所示，在兩種方法中，微生物數的對數值和C-r值均顯示出非常良好的相關性。圖2是將CT值標繪在縱軸，將以培養(yǎng)法中測定的用于樣品的各菌種的個數/提取標繪在橫軸的圖。定量RT-PCR以爭(黑點)表示，定量PCR以〇(白點)表示。由于通過定量RT-PCR法得到的近似曲線中的相關系數W值，在綠膿桿菌中為0.9955，在金黃色葡萄球菌中為0.9961，因此可知，能夠利用該標準曲線從Or值算出菌數。此外，定量RT-PCR法即使在提取的樣品中微生物數為1(^個也能夠檢測，具有和以往使用的培養(yǎng)法同等的檢測靈敏度，因此可知，能夠作為培養(yǎng)法的替代而用于微生物的定量、檢測。相比較于將rDNA作為標的序列的PCR法比較，本發(fā)明方法的檢測靈敏度高至約1000倍，相比較于以往研究的使用基因擴增法的微生物定量手段，可知具有格外高的檢測靈敏度。實施例5糞便中細菌的定量檢測向人糞便中添加各種濃度的綠膿桿菌，比較定量PCR法和本發(fā)明方法的檢測范圍。制作每20mg人大便菌數分別添加相當于10'、102、103、104、105、106、107、108個菌數的綠膿桿菌的添加綠膿桿菌的糞便樣品，從添加綠膿桿菌的糞便樣品中提取總RNA，將其作為模板進行本發(fā)明的定量RT-PCR。此外，從同樣的樣品中提取DNA，將其作為模板進行定量PCR。再以同樣的樣品通過培養(yǎng)法測定菌數?？俁NA的提取和定量RT-PCR法和實施例2同樣進行，培養(yǎng)法和實施例3同樣進行，DNA的提取和定量PCR法和實施例4同樣進行。此外，將得到的總RNA和總DNA中的1/2500用于定量RT-PCR和定量的PCR。該結果如在圖3中所示，在添加綠膿桿菌的糞便樣品中，通過本發(fā)明的方法，在每lg糞便為10"至l(T個/g，糞便的范圍內，能夠確認測定值的近似曲線的直線性。圖3是將Gr值標繪在縱軸，將以培養(yǎng)法測定的用于樣品的綠膿桿菌的個數/g糞便標繪在橫軸的圖。定量RT-PCR以參(黑點)表示，定量PCR以〇(白點)表示。本發(fā)明方法在人糞便樣品中的定量限度為10"個以上/g.糞便，與102個以上/g*糞便的培養(yǎng)法幾乎同等。此外，相對于以培養(yǎng)法中需要1天吋間的天數，以本發(fā)明的方法從樣本的RNA固定到定量約6小時完成。另-方面，在以定量PCR法的分析中，在從1058至10"個/g'糞便的范圍內，能夠確認測定值的近似曲線的直線性，檢測限度約為定量RT-PCR法的1/1000。實施例6以定量RT-PCR和培養(yǎng)法進行的人糞便大腸菌群的分析使用大腸菌群特異引物En-lsu3F/3，R，通過定量RT-PCR法進行人糞便菌群的分析。采取38名成人的新鮮排泄糞便，在厭氧條件下以運送培養(yǎng)基(甘油10%，半胱氨酸5%，lablemcopowderl%，NaCl0.045%，KH2P040.0225%，K2HP040.0225%，(NH4)2S040.0225%，CaCl20.00225%，MgS040.00225%)10倍稀釋。從該稀釋液中分別取得200W(相當于20mg糞便)，通過定量RT-PCR法提取使用的總RNA。以總RNA的1/2500量作為模板進行定量RT-PCR。此外，以同樣的稀釋液通過培養(yǎng)法(DHL選擇性培養(yǎng)基)進行CFU的定量。RNA的固定、總RNA的提取和定量RT-PCR按照實施例2的記載進行，培養(yǎng)法按照規(guī)定方法進行。在用于通過定量RT-PCR算出菌數的標準曲線使用從太腸桿菌YIT6044T(模式株)中提取的總RNA。該結果如在圖4中所示，可知本發(fā)明的以rRNA作為標的的定量RT-PCR法和培養(yǎng)法顯示出相關系數高達0.9255的相關關系。另夕卜，在縱軸表示以培養(yǎng)法得到的定量結果，在橫軸表示以本發(fā)明得到的定量結果。此外，相對于以培養(yǎng)法需要2天時間的天數進行全部操作，以本發(fā)明的方法以約6小時完成所有的操作。實施例7牛奶的微生物檢查在市售的牛奶中添加各種濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球齒、魈樣芽胞桿菌，比較傾注平板培養(yǎng)法和本發(fā)明方法的定量值。向市售的牛奶中添加大腸桿菌或金黃色葡萄球菌，使其為1(A101、102、103、104、105、1(^個/mL，將其作為樣品。在各樣品中，將lmL用于總RNA提取，lmL用于傾注平板培養(yǎng)法(大腸桿菌:去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌:一般瓊脂培養(yǎng)基，37°C，20±2小時)。對提取的總RNA，使用在表l中記載的引物，以定量RT-PCR法進行分析，求出CT值和以傾注平板培養(yǎng)法得到的菌數的相關性。此外，以在實施例2中記載的方法進行總RNA提取和定量RT-PCR法，將提取的總RNA中的1/25用于定量RT-PCR。該結果如在圖5中所示，任意菌種在每lmL牛奶10°106的范圍內，其Or值均和菌數相關。圖5是將C,-值標繪在縱軸，將以傾注平板培養(yǎng)法測定的用于樣品的大腸桿菌(圖5左上)、金黃色葡萄球菌(圖5右)和蠟樣芽胞桿菌(圖5右下)的個數/mL'牛奶標繪在橫軸的圖。此外，本發(fā)明方法的定量限度為10G個以上/ml^牛奶，由于和傾注平板培養(yǎng)法同等，因此明確，該方法能夠成為使用在乳品等省令中記載的法定培養(yǎng)基(去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，一般瓊脂培養(yǎng)基)的傾注平板培養(yǎng)法的替代。此外，相對于以傾注平板培養(yǎng)法需要1天時間的天數，以本發(fā)明的方法從樣本RNA固定到定量約6小時完成。實施例8血液中的細菌檢査向人血液中添加各種濃度的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌，比較傾注平板培養(yǎng)法(血液培養(yǎng)法)和本發(fā)明方法的定量值。向人血液中添加1/10量的3.8%檸檬酸鈉作為抗凝劑，向該血液中添加金黃色葡萄球菌或綠膿桿菌，使其為10。、10'、102、103、104、105個紋，將其作為樣品。在各樣品中，將0.5mL用于總RNA提取，0.5mL用于傾注平板培養(yǎng)法(Bffl瓊脂培養(yǎng)基)。對提取的總RNA通過定量RT-PCR法進行分析，求出得到的Ct信和以傾注平板培養(yǎng)法得到的菌數的相關性。另夕卜，以在實施例2中記載的方法進行總RNA提取和定量RT-PCR法。另外，將提取的總RNA中的1/25用于定量RT-PCR法。該結果如在圖6中所示，在1()0105個/0.5mL的范圍內能夠看到菌數和CT值相關。圖6是將Gr值標繪在縱軸，將以傾注平板培養(yǎng)法測定的用于樣品的綠膿桿菌(圖6左)和金黃色葡萄球菌(圖6右)的個數/0.5mL血液標繪在橫軸的圖。此外，本發(fā)明方法的定量限度為1()g個以上/0.5mL血液，由于和傾注平板培養(yǎng)法同等，因此顯小能夠成為傾注平板培養(yǎng)法的替代。進而，相對于在傾注平板培養(yǎng)法中需要1天吋間的天數，以本發(fā)明的方法從樣本RNA固定到定量約6小時完成。實施例9發(fā)酵乳制品的大腸桿菌檢査向市售的益力多((株)益力多本社生產)中添加大腸桿菌,使其為10。、10'、102、103、104、105個/mL菌數，將其作為樣品。在各樣品中，將lmL用于總RNA提取，lmL用于采用去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基的傾注平板培養(yǎng)法(37°C，20土2小時)。對提取的總RNA，使用大腸菌群特異的引物En-lsu3F/3'R，通過定量RT-PCR法進行分析，調查得到的CT值和以傾注平板培養(yǎng)法得到的菌數的相關性?？俁NA提取，除通過添加玻璃珠進行菌體破碎以外，以在實施例2中記載的方法進行，定量RT-PCR法以在實施例2中記載的方法進行。另外，將提取的總RNA中的1/25用于定量RT-PCR法。該結果如在圖7中所示，在1(^1()s個/mL的范圍內，Ct信和菌數高度相關。圖7是將CT值標繪在縱軸，將以傾注平板培養(yǎng)法測定的用于樣品的大腸桿菌的1og,。個數/mL'益力多標繪在橫軸的圖。本發(fā)明方法的定量限度為1()g個以上/ml^益力多，由于和傾注平板培養(yǎng)法同等，因此明確，該方法能夠成為使用在乳品等省令中記載的法定培養(yǎng)基(去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基)的傾注平板培養(yǎng)法的替代。另外，相對于在傾注平板培養(yǎng)法中需要1天時間的天數，以本發(fā)明的方法從樣本RNA固定到定量約6小時完成。實施例10通過定量RT-PCR和培養(yǎng)法進行的人糞便中的乳酸菌、腸球菌的分析^t人糞便中的乳酸桿菌屬、腸球菌屬的菌數，進行使用表l記載的引物的定量RT-PCR法和培養(yǎng)法的比較。采取48名健康正常成人的新鮮排泄糞便，以在實施例6中記載的方法處理糞便，以在實施例2中記載的方法進行RNA的固定、總RNA提取和定量RT-PCR法。將得到的總RNA中的1/20001/200000用于定量RT-PCR。此外，以同樣的糞便稀釋液，通過培養(yǎng)法(乳酸桿菌屬:LBS培養(yǎng)基，腸球菌屬:COBA培養(yǎng)基，均為37匸，48小時)進行CFU的定量。培養(yǎng)法按照常規(guī)方法進行，出現的菌落通過生物化學的性狀試驗(革蘭氏染色，過氧化氫酶試驗、APIStrep)進行菌種的鑒定。以定量RT-PCR法得出的ILMJiM屬的菌數值為通過合算使用sg-Laci-F/R(嗜酸乳桿齒亞群)、sg-Lsak-F/R(清酒乳桿菌亞群)、sg-Lcas-F/R(干酪乳桿菌亞群)、sg-Lmm-F/R(瘤胃乳桿菌亞群)、sg-Lreu-F/R(羅伊乳桿菌亞群)、sg-LpIa-F/R(植物乳桿菌亞群)、s-Lbre-F/R(短乳桿菌)、s-Lfru-F/R(盒果糖乳桿菌)、LFer-l/2(發(fā)酵乳酸桿菌)的各引物的定量RT-PCR法得到的菌數而算出。該結果如在表4中所示，人糞便中的乳酸桿菌屬、腸球菌屬的菌數，以本發(fā)明的方法和以培養(yǎng)法幾乎同等。另一方面，相比于培養(yǎng)法，兩菌屬均以本發(fā)明的方法的檢測頻率高。這推測是由于雖然屬于作為本次標的的乳酸桿菌屬、腸球菌屬，但是存在有因使用的選擇性培養(yǎng)基的選擇性強于必須以上而不能增殖的菌，或者因使用的選擇性培養(yǎng)基的選擇性弱，因此大量存在其它的屬于標的以外菌屬的菌在培養(yǎng)基中生長，而無法檢測標的菌屬。通過以上所述，本發(fā)明的方法不僅可能夠得到和培養(yǎng)法同等的菌數，而且也顯示能夠檢測、定量即使以培養(yǎng)法至今也不能檢測的菌。此外，相對于以培養(yǎng)法進行包括菌種鑒定在內的全部操作需要7天時間，以本發(fā)明的方法以約20小時完成全部操作。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>權利要求1.一種目的微生物的定量方法，其特征在于以被檢測體中的目的微生物rRNA量為指標。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于測定通過使用能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測體試樣進行的PCR反應得到的擴增產物。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于擴增產物的測定為確定擴增產物達到一定量吋的PCR循環(huán)數的測定。4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于經時地對擴增產物進行計測。5.—種目的微生物的檢測方法，其特征在于以被檢測體中的目的微生物rRNA的存在為指標。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于檢測出通過使用能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測體試樣進行的PCR反應得到的擴增產物。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于擴增產物的檢測為確定擴增產物達到一定量時的PCR循環(huán)數的檢8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于經時地對擴增產物進行計測。9.如權利要求18中任一項所述的方法，其特征在于:被檢測體為糞便、食品或來自活體的試樣。10.如權利要求19中任一項所述的方法，其特征在干被檢測體試樣中的目的微生物rRNA是固定在微生物中的rRNA。11.如權利要求24或610中任一項所述的方法，其特征在于能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段，是由序列號2、3或528記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或者是由與所述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段。12.—種核酸片段，可用于權利要求24或611中任一項所述的方法，其特征在于該核酸片段是由序列號2、3或528記載的堿基序列或與其互補的堿基序列構成的核酸片段，或者是由與所述堿基序列同源的堿基序列構成且在功能上等價的核酸片段。13.—種用于實施權利要求112中任一項所述的方法的試劑盒。14.如權利要求13所述的試劑盒，其特征在于，包括(1)能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段；(2)禾口/或用于RNA的提取、RNA的固定或PCR反應的試劑。全文摘要本發(fā)明提供一種能夠以高靈敏度并且更準確地進行檢測的微生物定量、檢測方法。是以在被檢測體中的目的微生物rRNA量為指標的目的微生物的定量方法。文檔編號C12Q1/68GK101111596SQ20068000360公開日2008年1月23日申請日期2006年1月30日優(yōu)先權日2005年1月31日發(fā)明者朝原崇,木脅真祐美,松田一乘,辻浩和,野本康二申請人:株式會社益力多本社