專利名稱：處理食品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制和預(yù)防有害微生物生長(zhǎng)的病毒以及使用上述病毒 的方法。本發(fā)明還涉及保護(hù)有益微生物免受病毒攻擊。特別是，本發(fā) 明的病毒缺乏毒力因子、毒素、抗生素抗性基因及其他不良基因，并 且包括對(duì)靶向微生物的野生型病毒抗性菌林具有特異性的宿主范圍 (h-突變型)病毒。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的病毒是裂解性的，因此它 們通過(guò)破壞感染動(dòng)物或植物的有害微生物來(lái)控制并預(yù)防這些微生物的 進(jìn)一步生長(zhǎng)。上述病毒還可用于培養(yǎng)并選擇抗野生型及h-突變型病毒 的有益微生物的菌林。
背景技術(shù)：
眾所周知，病毒可改變微生物群體，例如細(xì)菌、真菌、藻類以及 原生動(dòng)物。據(jù)估計(jì)，每天自然界中多至全部細(xì)菌的三分之一會(huì)遭受病 毒的攻擊。病毒對(duì)微生物的破壞導(dǎo)致環(huán)境中微生物群體的波動(dòng)，其被 稱為微生物群體的"循環(huán)"。例如，微生物群體的濃度增加直至病毒 接觸并感染被稱為宿主微生物或"宿主"的易感微生物。微生物的病 毒感染使可以得到的易感宿主微生物的數(shù)目減少，并相應(yīng)地使病毒的 數(shù)目增加。在沒有用于感染的宿主的情況下，許多病毒最終因接觸自
然因素而受到破壞，所述自然因素諸如來(lái)自太陽(yáng)的紫外線以及環(huán)境中 的酶。因此，病毒數(shù)目下降，而宿主微生物群體隨之增加。自然界中 微生物群體的這種循環(huán)非常普遍。雖然有點(diǎn)難以檢測(cè)并研究攻擊除了 細(xì)菌之外的微生物的病毒，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉所有微生物群體 (例如，藻類、立克次氏體、真菌、支原體、原生動(dòng)物)均以類似方 式受到病毒的控制并循環(huán)，所述病毒能夠感染并破壞這樣的微生物。
細(xì)菌病毒，也被稱為"細(xì)菌噬菌體"或"噬菌體"，普遍存在并 可以從所有細(xì)菌群體中分離，其中可以培養(yǎng)宿主并用于分離。噬菌體 是發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物(包括人類)、植物、土壤和水中或其上的天然存在的 個(gè)體。還已知感染藻類、霉菌、支原體、原生動(dòng)物、立克次氏體、酵 母及其他微生物的病毒。
通常使用兩種方法測(cè)定自然環(huán)境中病毒的濃度，也被稱為"定量"。 首先，可以使用電子顯微鏡檢查法觀測(cè)并計(jì)數(shù)已知大小的樣品中的總 病毒顆粒。其次，可以培養(yǎng)活病毒或使其生長(zhǎng)并計(jì)數(shù)。通過(guò)培養(yǎng)并計(jì) 數(shù)來(lái)定量的示范性方法包括通常稱為噬菌斑測(cè)定的技術(shù)。在噬菌斑測(cè) 定中，將待定量的病毒與預(yù)先確定濃度的宿主細(xì)胞混合，并轉(zhuǎn)移到液 體(例如緩沖液，無(wú)機(jī)鹽稀釋液，或肉湯)中。然后將混合物轉(zhuǎn)移至 半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基。宿主細(xì)胞的濃度必須足夠大，以隨著細(xì)胞生長(zhǎng)在 半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中形成匯合層，其通常被稱為"菌苔"。孵育噬菌 體-宿主混合物期間，許多活病毒感染宿主細(xì)胞。隨后，受感染宿主細(xì) 胞內(nèi)部產(chǎn)生新病毒，宿主細(xì)胞最終被破壞，或"裂解"，以便可以從 中釋放新病毒。然后新病毒攻擊并最終裂解與從中釋放新病毒的宿主 細(xì)胞鄰近的細(xì)胞。只要宿主細(xì)胞發(fā)生代謝變化，這種感染就會(huì)繼續(xù)蔓 延，導(dǎo)致在宿主細(xì)胞菌莒中形成透明區(qū)域，其通常被稱為"噬菌斑"。 通過(guò)計(jì)數(shù)宿主細(xì)胞菌莒中形成的噬菌斑數(shù)目來(lái)確定最初混合物中存在 的病毒數(shù)目。因此，通過(guò)該方法定量的病毒被稱為噬斑形成單位
("PFU")。
為了通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞并計(jì)數(shù)PFU來(lái)定量環(huán)境樣品中所有的各種 類型的病毒，必須分別培養(yǎng)樣品中不同病毒的宿主細(xì)胞。給定環(huán)境樣 品中的許多類型的微生物是未知的。 一些已知的微生物無(wú)法培養(yǎng)。因 此，當(dāng)通過(guò)培養(yǎng)和計(jì)數(shù)進(jìn)行定量時(shí)，可能低估給定環(huán)境中存在的病毒 數(shù)目。雖然據(jù)估計(jì)1克土壤含有多至108~109個(gè)微生物，諸如直接平 板計(jì)數(shù)，選擇性分離，顯微鏡方法，以及從土壤分離的總DNA的再聯(lián) 合動(dòng)力學(xué)等技術(shù)表明，可以培養(yǎng)的微生物僅占很小的百分比。因此， 直接電子顯微鏡計(jì)數(shù)方法的發(fā)展和應(yīng)用使人們對(duì)各種環(huán)境中存在的病 毒數(shù)目以及病毒對(duì)減少微生物群體的影響有了更好的了解。
已經(jīng)定量了水中的噬菌體。Bergh等人(1989 ) ， High abundance of viruses found in aquatic environments, Nature 340:467使用 電子顯微鏡檢查法測(cè)定了天然的，未受污染的挪威湖水中的細(xì)菌病毒 的總濃度。發(fā)現(xiàn)水中的噬菌體濃度高達(dá)2. 5xl()8噬菌體/毫升。細(xì)菌計(jì) 數(shù)高達(dá)約l. 5xl(T細(xì)胞/毫升。根據(jù)該噬菌體和細(xì)菌的相對(duì)濃度，估計(jì) 多至三分之一的細(xì)菌群體每天經(jīng)歷一次或多次噬菌體攻擊。同樣， Demuth等人(1993 ) Direct electron microscopy study on the morphological diversity of bacteriophage populations in Lake Plussee， Appl. Environ. Microbiol. 59: 3378測(cè)得無(wú)污物影響的德 國(guó)湖水中的噬菌體水平高達(dá)約108噬菌體/毫升湖水。在水樣品中鑒定 出多至ll種在形態(tài)學(xué)上不同的噬菌體。
還定量了土壤中的噬菌體。Reanny， D. C.和Marsh S. C. N. ( 1973 ) 使用嗜熱脂肪芽孢桿菌作為宿主細(xì)胞，采用了培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法。The ecology of viruses attacking "ac///us stearc^Aer邊op力/7us in soil, Soil. Biol. Biochem. 5: 399報(bào)道，平均l克土壤中存在約 4. Oxl(T可以感染嗜熱脂肪芽孢桿菌的PFU。然而，在Reanny和Marsh的 研究中僅僅定量了針對(duì)單個(gè)宿主的噬菌體。因此，將其它細(xì)菌宿主與
嗜熱脂肪芽孢桿菌一起進(jìn)行測(cè)試，或者使用電子顯微鏡檢查法定量技 術(shù)時(shí)，噬菌體計(jì)數(shù)可能更高。
噬菌體還存在于食品中。Kennedy等人(1986 ) Distribution of coliphages in various foods, J. Food Protect. 49: 944發(fā)現(xiàn)12種 受檢的食品中有l(wèi)l種帶有大腸桿菌和攻擊大腸桿菌的噬菌體("大腸 桿菌噬菌體")，每種食品均在許多零售市場(chǎng)中有售。例如，Kennedy 等人檢測(cè)的全部10種牛肉末樣品均被大腸桿菌噬菌體污染。大腸桿菌 噬菌體還存在于鮮雞肉、鮮豬肉、鮮蠔、鮮蘑菇、萵苣、雞肉蔬菜餡 餅、餅干面團(tuán)、熟食面包、熟食烤火雞和包裝烤雞樣品中。相似地， Gautier 等人 (1995 ) Occurrence of 尸ro;7/0/7/6a"eW咖 /Vet/(/e/3i"e/c力// bacteriophages in Swiss cheese, Appl. Environ. Microbiol. 61: 2572在瑞士硬干酪中檢測(cè)到的費(fèi)氏丙酸桿菌噬菌體濃 度為約7xl05 PFU/g。
環(huán)境中既存在不良微生物，也存在有益微生物。病毒同時(shí)感染并 破壞有益微生物和不良微生物。環(huán)境中典型的有益微生物是促進(jìn)植物 生長(zhǎng)的土壤微生物和降解有毒物質(zhì)的微生物。不良微生物包括致病微 生物和引起藻類過(guò)度生長(zhǎng)和魚類死亡的藻類。
除天然存在的微生物群體之外，近幾十年來(lái)，許多醫(yī)院中開始流 行對(duì)抗生素具有抗藥性的致病微生物，并且眾所周知是難以控制的。 過(guò)去的五十年或更多年間，抗生素的普遍使用已經(jīng)導(dǎo)致了對(duì)抗生素抗 性細(xì)菌菌林的選擇。金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、糞 鏈球菌、傷寒沙門氏菌、杜克雷氏嗜血菌、流感嗜血菌、結(jié)核分枝桿 菌、淋病奈瑟氏菌、銅綠假單胞菌、各種志賀氏菌屬菌種、腸桿菌科 以及假單胞菌科的成員及其它細(xì)菌菌種對(duì)許多通常使用的抗生素具有 抗藥性。住院治療期間獲得的感染一般稱為醫(yī)院感染，估計(jì)每年引起 60， 000例死亡，并且需要治療，據(jù)估計(jì)最近每年耗費(fèi)約45億美元。疾病控制和預(yù)防中心(CDC)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，大部分醫(yī)院感染是 由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸道球菌、肺 炎球菌、和假單胞菌類引起的。此外，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 1996 年的年度報(bào)告，"耐藥微生物菌抹可以躲避肺結(jié)核、霍亂和肺炎的普 通療法"。
因此，自四十年代以來(lái)，在抗生素首次用于治療細(xì)菌感染之后不 久，全世界的醫(yī)院，地方社區(qū)，以及易感人群中由抗生素抗性細(xì)菌引 起的感染的出現(xiàn)持續(xù)增加。例如，1941年，全世界幾乎所有金黃色葡 萄球菌菌林均對(duì)青霉素G敏感。然而，到1944年時(shí)，某些金黃色葡萄 球菌菌林能夠產(chǎn)生降解青霉素的青霉素酶， 一般也稱為P-內(nèi)酰胺酶。 1996年，某些金黃色葡萄球菌菌抹不僅對(duì)各種形式的青霉素，而且對(duì) 7種常用于治療金黃色葡萄球菌("staph")感染的其它抗生素中的 6種具有抗藥性。
1) 自1988年以來(lái)，由于已經(jīng)在革蘭氏陽(yáng)性菌中鑒定出對(duì)萬(wàn)古霉素 的抗藥性，例如萬(wàn)古霉素抗性糞鏈球菌或者屎鏈球菌("VREP，)， 選擇出萬(wàn)古霉素抗性突變種的可能性令人關(guān)注；由于VREF具有抗生素 抗性、傳播迅速以及VREF相關(guān)感染病人高死亡率的致命性組合特征， 因此其對(duì)于健康護(hù)理人員而言也是非常重要的。
2) 曱氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌("MRSA")引起的感染對(duì) 公共衛(wèi)生造成特別嚴(yán)重的威脅。MRSA通常顯示各種形式的多重抗藥性
(即，對(duì)多種類型的抗生素具有抗藥性)。許多MRSA菌林僅僅對(duì)抗生 素萬(wàn)古霉素敏感。
3) 雖然已經(jīng)研制并發(fā)現(xiàn)了用于治療抗生素抗性細(xì)菌菌林的感染 的新的替代性藥物，但是許多細(xì)菌對(duì)上述新的替代性藥物也產(chǎn)生了抗藥性。例如，某些MRSA菌林迅速產(chǎn)生了對(duì)抗生素環(huán)丙沙星的抗藥性。 而且，1997年，從抵抗29天的萬(wàn)古霉素治療的感染中分離出金黃色葡 萄球菌菌抹。為了正確地估計(jì)由該金黃色葡萄球菌菌林造成的威脅， CDC將該金黃色葡萄球菌菌林分類為具有中等抗藥性，稍微缺乏完全抗 藥性，并且被標(biāo)記為醫(yī)療緊急警報(bào)。據(jù)報(bào)道，如果產(chǎn)生對(duì)萬(wàn)古霉素具 有抗藥性的MRSA菌林，那么所有外科手術(shù)，包括選擇性外科手術(shù)的死 亡率可能增加。
4) 2001年，從猶他州奧格登的McKay - Dee醫(yī)院的3位心臟病人中 分離出MRSA導(dǎo)致該醫(yī)院的心臟外科手術(shù)用設(shè)備對(duì)除緊急情況之外的所 有外科手術(shù)關(guān)閉。隨后，從密歇根(2002 )，賓夕法尼亞(2003 )和 紐約(2004 )的臨床病人中分離到萬(wàn)古霉素抗性金黃色葡萄球菌 (VRSA)。
同樣，大約一半的已知肺炎鏈球菌菌林對(duì)青霉素具有抗藥性，青 霉素通常用于肺炎鏈球菌感染的初期以及初級(jí)治療。某些肺炎鏈球菌 菌株對(duì)頭孢菌素具有抗藥性，頭孢菌素通常用于肺炎鏈球菌感染的二 級(jí)治療?？梢允褂萌f(wàn)古霉素治療青霉素和頭孢菌素抗性肺炎鏈球菌菌 抹。然而，由于萬(wàn)古霉素對(duì)許多病人具有嚴(yán)重的副作用以及可能出現(xiàn) 萬(wàn)古霉素抗性肺炎鏈球菌菌株，所以使用萬(wàn)古霉素是不理想的。
抗生素抗性的問題由于微生物可以傳遞遺傳信息的事實(shí)而更加復(fù) 雜，遺傳信息被稱為"基因"，或?yàn)楹?jiǎn)單起見稱為"DNA"。微生物諸 如細(xì)菌可以轉(zhuǎn)移DNA乃至全部基因的方法包括接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)。各種 基因，包括賦予細(xì)菌抗生素抗性的基因，可以從第一或供體微生物轉(zhuǎn) 移至第二或受體微生物。除轉(zhuǎn)移抗生素抗性基因之外，微生物還可以 轉(zhuǎn)移能使微生物產(chǎn)生毒素的基因，毒素一般對(duì)受感染宿主是有害的。 決定微生物可以感染的宿主和宿主細(xì)胞類型的毒力因子也可以從一種 微生物轉(zhuǎn)移至另一種微生物。
接合過(guò)程中，通過(guò)特化的菌毛或"性絲"使質(zhì)粒或染色體DNA直接 從供體微生物轉(zhuǎn)移至受體微生物，菌毛是細(xì)小的、中空的、絲狀附器， 其可結(jié)合并穿透受體微生物的細(xì)胞膜。接合是"供體"微生物中編碼 抗生素抗性的基因傳遞給受體微生物，使受體轉(zhuǎn)變?yōu)榭股乜剐晕⑸?物的過(guò)程。
轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)移由供體微生物釋放到環(huán)境中并被受體微生物納入的 DNA。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)在接種了兩種具有不同標(biāo)記或標(biāo)志的DNA的親代枯草芽 孢桿菌菌林的無(wú)菌土壤中進(jìn)行。分離攜帶兩種親代菌林的標(biāo)記的細(xì)菌。 然而，即使在最好的實(shí)驗(yàn)室條件下，轉(zhuǎn)化也是相對(duì)無(wú)效的，并且需要 高密度的供體DM和受體細(xì)胞。在許多微生物中允許轉(zhuǎn)化的條件一般 不存在于自然或不受控制的環(huán)境中。因此，轉(zhuǎn)化一般被理解為是實(shí)驗(yàn) 室現(xiàn)象。
轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)病毒諸如噬菌體，將宿主基因轉(zhuǎn)移至受體微生物。存 在兩種噬菌體，烈性或裂解噬菌體和溫和噬菌體。當(dāng)烈性喧菌體感染 宿主細(xì)胞時(shí)，通常稱為子代的新噬菌體在宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)，并且隨后 裂解或破壞宿主細(xì)胞，以便可以釋放子代。相反，溫和噬菌體一般感 染宿主細(xì)胞而不破壞其宿主。感染宿主細(xì)胞之后，溫和逸菌體一般使 其遺傳信息并入宿主細(xì)胞的DM中。隨后可以通過(guò)紫外線、謙變劑或其 他方式誘導(dǎo)許多受溫和噬菌體感染的宿主細(xì)胞進(jìn)入裂解循環(huán)，其中溫 和噬菌體的遺傳信息產(chǎn)生隨后裂解宿主細(xì)胞的子代。
宿主DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以是"特異性"轉(zhuǎn)導(dǎo)或"普遍性"轉(zhuǎn)導(dǎo)。特異性 轉(zhuǎn)導(dǎo)中，溫和噬菌體的基因組被整合入宿主供體微生物的染色體中， 而不裂解宿主。插入宿主染色體的噬菌體基因組被稱為"原病毒"或 "原噬菌體"，并且隨宿主細(xì)胞及其染色體復(fù)制而被動(dòng)地復(fù)制。攜帶 原病毒的細(xì)菌被認(rèn)為是溶源性的。某些情況，諸如使宿主微生物和原
病毒暴露于紫外線，可以使原病毒起烈性噬菌體的作用，由此原病毒 被從細(xì)菌染色體中切除。上述被切除的原病毒可以攜帶細(xì)菌基因，或 "供體"基因。感染新宿主或受體微生物時(shí)，這些"供體"基因可以 被表達(dá)，其可以改變受體微生物的表型或物理基因表達(dá)。
溫和噬菌體和也許某些烈性噬菌體可以實(shí)現(xiàn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。病毒復(fù)
制期間，被稱為"供體"基因的供體微生物的一段DM，而不是噬菌體 基因組被包封在噬菌體頭部?jī)?nèi)。僅包括宿主微生物DNA的噬菌體被稱為 轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子。然而，典型的噬菌體只能含有大約百分之一的宿主或"供 體"微生物的染色體。因此，由單個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子同時(shí)轉(zhuǎn)移一個(gè)以上基因 是不可能的。由于轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子不包括噬菌體基因組，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子感染 受體微生物時(shí)無(wú)法產(chǎn)生子代。取而代之的是，供體基因不得不摻入受 體微生物的染色體中。如果受體微生物僅被一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子感染，其可 以存活并且被整合的供體基因可以改變其表型。非常重要的是，應(yīng)記 住如果每個(gè)受體微生物的轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子的感染復(fù)數(shù)("M0r，)較高，那么 細(xì)胞可能會(huì)受到破壞，其通常被稱為"從外面裂解"。
從一種微生物向另一種微生物傳遞遺傳信息可能具有有益的或不 良的效果。例如，Chakrabarty， A.M. ( 1996 ) Microbial degradation of toxic chemicals : Evolutionary insights and practical considerations, ASM News 62: 130公開了有益的遺傳信息傳遞。將 富含微生物的土壤引入含有單一工業(yè)污染物作為營(yíng)養(yǎng)物的恒化器。在 不到一年時(shí)，從土壤中分離出獲得了降解該污染物所需的全部酶的假 單胞菌類。
同樣，也可以轉(zhuǎn)移顯示不良性狀的基因。上述有害基因轉(zhuǎn)移的例 子包括轉(zhuǎn)移攜帶抗生素抗性的基因，以及編碼毒素，諸如shiga、白喉 以及肉毒桿菌毒素產(chǎn)生的基因。已經(jīng)追查到毒素相關(guān)疾病的爆發(fā)起因 于溫和噬菌體對(duì)毒素基因的轉(zhuǎn)移，例如1980年的中毒性休克綜合癥、1994年的食肉性鏈球菌以及由未熟透的漢堡包中大腸桿菌0157:H7引 發(fā)的疾病。還報(bào)道了編碼霍亂毒素的基因被溫和噬菌體傳遞，其又產(chǎn) 生了另一種流行性菌抹，霍亂弧菌0139。
病毒已經(jīng)被分離并用于治療各種類型的細(xì)菌感染。于1983年3月8 日授予Kozloff等人的美國(guó)專利4， 375， 734 ( "Kozloff")公開了使用 野生型噬菌體Erhl保護(hù)植物對(duì)抗由促冰核形成細(xì)菌草生歐文氏菌引起 的霜害。使用Erhl處理玉米植物可以使冰核形成損害的發(fā)生率降低約 20%~ 25%。 Kozloff等人還公開了Erhl僅殺死約90。/。培養(yǎng)的草生歐文氏 菌，這表明剩余10y。中的一些對(duì)野生型Erhl具有抗性。
于1989年5月9日授予本發(fā)明人之一Jackson的美國(guó)專利4， 828， 999 ("Jackson")公開了宿主范圍或"h-突變型，，噬菌體，其攻擊各種 植物細(xì)菌的噬菌體抗性菌株，以及治療受細(xì)菌感染植物的方法。然而， Jackson公開的h-突變型噬菌體，含有上述噬菌體的組合物以及治療方 法局限于植物細(xì)菌噬菌體和對(duì)受上述細(xì)菌感染的植物的治療。
同樣，已經(jīng)釆取某些措施解決人類細(xì)菌性疾病的問題，以及以另 外的方式控制和預(yù)防細(xì)菌生長(zhǎng)。1995年10月12日以WO 95/27043公開的 專利申請(qǐng)序號(hào)08/222， 956 ( ""56申請(qǐng)")公開了一種噬菌體療法， 其中將噬菌體突變林引入受細(xì)菌感染的宿主。噬菌體突變林被認(rèn)為可 攻擊感染宿主的有害細(xì)菌，認(rèn)為所述噬菌體突變林對(duì)由受細(xì)菌感染宿 主的防御系統(tǒng)，特別是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的器官所致的降解作用具有抗性。 因此，"56申請(qǐng)的噬菌體被認(rèn)為在體內(nèi)起抗菌劑的作用，并且可以單 獨(dú)使用或者作為抗生素療法的輔助劑使用。
雖然將'956申請(qǐng)公開的噬菌體引入受細(xì)菌感染的宿主的目的是攻 擊不良的細(xì)菌，但是這些噬菌體不僅包括裂解噬菌體，而且包括能夠 將供體細(xì)菌DNA片段轉(zhuǎn)移至受體細(xì)菌的溫和病毒。此外，'956申請(qǐng)沒有
公開其中公開的噬菌體能夠攻擊，并且由此預(yù)防或控制噬菌體抗性菌 林的進(jìn)一步生長(zhǎng)。
在Twort于1915年和d'Herelle于1917年發(fā)現(xiàn)噬菌體作為細(xì)菌的裂 解劑之后不久，開始了對(duì)噬菌體用于治療細(xì)菌感染的應(yīng)用的研究，其 一般被稱為噬菌體療法。各種噬菌體具有對(duì)抗許多植物和動(dòng)物例如哺 乳動(dòng)物疾病的致病菌的活性。對(duì)于引起人類疾病的細(xì)菌具有活性的噬 菌體是已知的，所述人類疾病諸如炭疽，支氣管炎，腹瀉，猩紅熱， 斑瘆傷寒，霍亂，白喉，淋病，副斑滲傷寒，腺鼠疫，骨髄炎，及其 他細(xì)菌引發(fā)的疾病。雖然許多本領(lǐng)域技術(shù)人員最初確信噬菌體療法的 功效，特別是在控制霍亂方面，但是許多噬菌體對(duì)于體內(nèi)治療無(wú)效。 人們相信這種無(wú)效性歸因于胃腸外給藥時(shí)宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)噬菌體的 滅活，口服時(shí)由胃液引起的變性，以及迅速出現(xiàn)噬菌體抗性細(xì)菌突變 林。
隨著抗生素的推廣和使用，以及其最初控制細(xì)菌性疾病的有效性， 許多使用噬菌體作為治療劑的研究停止了。最近，噬菌體療法被成功 地用于治療由抗生素抗性細(xì)菌和某些機(jī)會(huì)致病菌引起的醫(yī)院感染，也 就是化膿性感染和敗血病，特別是葡萄球菌引起的，還有假單胞菌類， 腸細(xì)菌(大腸桿菌，克雷伯氏桿菌屬，變形桿菌屬，普羅威登斯菌屬， 沙雷氏菌屬)引起的，損傷(感染的創(chuàng)傷和燒傷，手術(shù)后感染，骨髓 炎)，皮膚和皮下組織疾病(療瘡，膿肺，急性淋巴管炎，褥瘡)， 泌尿系統(tǒng)感染(慢性膀胱炎和腎盂腎炎)，呼吸系統(tǒng)疾病(鼻竇炎， 粘膿性支氣管炎，胸膜炎)及其他疾病，例如由腸致病性大腸桿菌(7， 8) 引起的幼兒腹瀉。治療細(xì)菌感染時(shí)，噬菌體可以通過(guò)液體，片劑和膠 嚢口服給藥，通過(guò)氣霧劑和直接涂用局部給藥，以及靜脈給藥。噬菌 體療法單獨(dú)進(jìn)行以及與抗生素聯(lián)合使用。噬菌體還用作抗菌防腐劑， 包括用于例如為手術(shù)室，手術(shù)器械和病人身體上的傷痕，以及醫(yī)護(hù)人 員消毒。
然而，諸如細(xì)菌等微生物可以產(chǎn)生噬菌體抗性菌林。因此，由于 微生物的靶菌抹的病毒抗性菌林可以在接受治療的受感染宿主中或在 任何其它治療環(huán)境中存活，所以噬菌體療法(或?qū)τ诜羌?xì)菌微生物的 病毒療法)有些不合乎需要。
相反，許多有益微生物群體受到病毒的威脅，所述病毒干擾上述 微生物的有益性能。微生物促進(jìn)的典型有益過(guò)程包括工業(yè)發(fā)酵(例如 在制造食品中)，有毒化學(xué)品、污染物及其他不良物質(zhì)的生物清除， 從貧礦石中浸取金屬，從頁(yè)巖中抽提石油和相關(guān)產(chǎn)品，以及藥品生產(chǎn)。 許多有益過(guò)程的效率被許多病毒的普遍存在性所降低，所述病毒攻擊 促進(jìn)這些過(guò)程的微生物。
因此，需要一種控制、減少或消除微生物群體的替代性方法，所 述方法針對(duì)不斷增加的微生物的抗微生物劑抗性和病毒抗性的出現(xiàn)。 還需要一種選擇并破壞不良微生物，同時(shí)允許有益微生物存活的療法。 還需要提供病毒抗性有益微生物。

發(fā)明內(nèi)容
雖然如前所述已將病毒用于控制微生物群體，但是許多微生物可 以輕易產(chǎn)生對(duì)病毒感染的抗性。而且，由于溫和病毒未必都可在受感 染宿主微生物中增殖并將其裂解，所以使用溫和病毒控制微生物群體 經(jīng)常無(wú)效。
"野生型"此處被定義為從野外或自然界分離得到的那些病毒， 其顯示最經(jīng)常觀察到的表型或物理特征，并且與"突變型"對(duì)比一般 被稱為"正常的"。"野生型病毒"顯示正常的宿主范圍毒性。"野 生型微生物"不能抵抗由對(duì)特定微生物的靶菌林具有特性異的野生型
病毒引起的感染。
"宿主范圍突變型病毒"也被稱為"h-突變型病毒"，此處被定 義為與正常宿主范圍毒性相比，顯示更廣泛毒性的病毒。h-突變型病 毒不但能感染野生型微生物而且還能感染微生物的靶菌林的病毒抗性 變種。
因此，本發(fā)明包括一種或多種不攜帶有害的基因并且對(duì)微生物的 一種或多種靶菌抹特異的病毒。所述病毒是裂解病毒，其可以用于包 括控制、減少或消除微生物的靶菌株群體的方法中。優(yōu)選，本發(fā)明的 病毒或病毒混合物包括一種或多種h-突變型病毒。 一種或多種h-突變 型病毒和一種或多種野生型病毒的混合物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。野 生型和h-突變型病毒"識(shí)別"靶菌林表面上的受體并感染這些病毒抗 性變種，所述靶菌林包括其一種或多種病毒抗性變種。由于本發(fā)明的 病毒包括裂解病毒，受感染的宿主細(xì)胞將被該病毒裂解。優(yōu)選能夠感 染乾菌林的野生型以及乾菌林的各種病毒抗性變種的病毒。
可以通過(guò)分離微生物的靶菌林的野生型，并且在對(duì)靶菌林具有特 異性的野生型病毒存在情況下培養(yǎng)這種野生型，以產(chǎn)生本發(fā)明的h-突 變型病毒。靶菌林的病毒抗性變種可以在野生型病毒存在情況下生長(zhǎng)。 分離靶菌林的病毒抗性變種，然后在野生型病毒存在情況下進(jìn)行培養(yǎng) 以便產(chǎn)生h-突變型病毒。可以用與產(chǎn)生靶菌林的病毒抗性變種相似的 方法得到耙菌林的h-突變型病毒抗性變種。然后，可以在h-突變型病 毒存在情況下培養(yǎng)這些h-突變型病毒抗性變種以便產(chǎn)生第二h-突變 型，所述第二h-突變型可以感染靶菌林的一種或多種病毒抗性變種， 把比其前代更廣泛的宿主范圍賦予這些h-突變型。
本發(fā)明還包括微生物的病毒抗性和h-突變型病毒抗性變種，其產(chǎn) 生方法如前所述并在下文中進(jìn)一步描述。
然后，本發(fā)明的病毒可以用于控制、減少或消除耙菌林微生物群 體的方法。所述方法包括將基本上無(wú)不良基因的裂解病毒引入存在不 良靼菌林微生物的環(huán)境中。在使靶菌林微生物接觸病毒時(shí)，其被病毒
感染并最終裂解。由于h-突變型病毒優(yōu)選感染靶菌林的野生型和病毒 抗性變種，這取決于h-突變型病毒的濃度，所以在本發(fā)明方法中優(yōu)選 使用h-突變型病毒可以有效地控制、減少或消除引入病毒的環(huán)境中的 靶菌林微生物。
控制微生物群體方法的另一方面包括將微生物的病毒抗性或h-突 變型病毒抗性變種引入需要該微生物存在的環(huán)境中。在微生物促進(jìn)有 益過(guò)程的情況下，引入上述病毒抗性微生物和h-突變型病毒抗性微生 物是理想的。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式
本發(fā)明優(yōu)選包括感染并破壞微生物的病毒抗性菌林的宿主范圍突 變型裂解病毒，其還稱為h-突變型烈性病毒，或簡(jiǎn)稱為h-突變型病毒。 本發(fā)明還可以包括野生型裂解病毒或烈性病毒，為簡(jiǎn)單起見其統(tǒng)稱為 "病毒，，。優(yōu)選病毒基本上無(wú)不良基因。本發(fā)明還包括一種產(chǎn)生h-突 變型病毒或h-突變型和野生型病毒的混合物的方法，所述病毒無(wú)不良 基因，諸如把感染多細(xì)胞生物的能力賦予病毒的基因、把向受感染的 宿主微生物轉(zhuǎn)移不良基因的能力賦予病毒的基因和把從裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)變 為溫和狀態(tài)的能力賦予病毒的基因； 一種使用h-突變型病毒或h-突變 型和野生型病毒的混合物來(lái)減少、消除或控制微生物群體生長(zhǎng)的方法； 以及一種使用h-突變型病毒或h-突變型和野生型病毒的混合物產(chǎn)生微 生物的病毒抗性和h-突變型病毒抗性菌林的方法。通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn) 生的微生物的病毒抗性和h-突變型病毒抗性菌林也在本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。
h-突變型病毒
本發(fā)明的h-突變型病毒是感染宿主微生物的裂解病毒或烈性病 毒，利用宿主微生物的各種成分復(fù)制并裝配子代，并且破壞宿主，即 靼菌林微生物。優(yōu)選，本發(fā)明的h-突變型病毒無(wú)不良的特性，包括但 不限于，感染多細(xì)胞生物的能力，向受感染的宿主微生物轉(zhuǎn)移不良基 因的能力，以及從裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闇睾蜖顟B(tài)的能力。
病毒包括蛋白質(zhì)外殼或"衣殼"，其能夠"識(shí)別"靶菌林微生物 外表面上的受體或受體位點(diǎn)，包括已經(jīng)改變或"突變"的某些受體， 以把對(duì)野生型病毒的抗性或?qū)σ环N或多種h-突變型病毒的抗性賦予耙 菌林微生物。h-突變型病毒識(shí)別靶菌抹微生物的突變受體的能力使得 h-突變型病毒能夠感染靶菌抹微生物的病毒抗性變種。
由于其"識(shí)別"靶菌林微生物上的受體的能力，本發(fā)明的病毒特 異性地感染靶菌株，而不感染同種微生物的其它非靶向、其它非靼向 微生物或其它非靶向細(xì)胞。因此，本發(fā)明的病毒不可能象抗微生物藥 物一樣抑制有益微生物的活性，所述的抗微生物藥物缺乏病毒對(duì)靼微 生物的特異性。
如下所述，當(dāng)用于本發(fā)明的治療方法時(shí)，本發(fā)明的病毒在破壞耙 菌林微生物時(shí)增殖，減少了治療過(guò)程中對(duì)反復(fù)給藥的需求，所述治療 包括給予病毒。相比之下，由于抗微生物劑濃度在治療期間會(huì)降低， 所以抗微生物劑療法需要反復(fù)給藥。
在使靶菌株微生物群體減少或消除以致于病毒可以感染的靼菌林 不再存在之后，病毒失活并最終被降解。其降解后，其它生物體可以 利用該病毒的各種成分作為營(yíng)養(yǎng)素。
本發(fā)明產(chǎn)生h-突變型病毒的方法包括分離病毒抗性微生物，并在 野生型病毒存在情況下培養(yǎng)該病毒抗性微生物以便產(chǎn)生并分離h-突變 型病毒。
通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)分離微生物的靶菌抹。通過(guò)已知方法鑒定或 分析該耙菌林。然后，通過(guò)在促進(jìn)靶菌林生長(zhǎng)或增殖的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 該耙菌林來(lái)分離該靶菌林的病毒抗性成員。優(yōu)選，在滅菌的半固體培 養(yǎng)基如瓊脂上培養(yǎng)靶菌林微生物。在能夠感染靶菌林的野生型病毒存 在情況下，培養(yǎng)靶菌林。野生型病毒的濃度取決于所需MOI。優(yōu)選，靶 菌林微生物對(duì)野生型病毒的相對(duì)濃度約為l: 1， M0I約為1。由于其抵 抗野生型病毒感染或幸免于病毒感染的能力， 一些靶菌林微生物可以 在野生型病毒存在情況下生長(zhǎng)。這樣的微生物被稱為野生型病毒抗性 微生物，并且在瓊脂上生長(zhǎng)成"菌落"。因此，可以通過(guò)在感染靶菌 林或?qū)Π芯昃哂刑禺愋缘囊吧筒《敬嬖谇闆r下培養(yǎng)靶菌抹微生物 以菌落的形式分離得到野生型病毒抗性微生物。
其后，可以將該野生型病毒抗性微生物的樣品從瓊脂上的"菌落，， 轉(zhuǎn)移至包含高濃度野生型病毒的液體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生 并分離h-突變型病毒。因此，優(yōu)選M0I大于1。優(yōu)選野生型病毒抗性微 生物的濃度促進(jìn)匯合層在半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，匯合層一般也 稱為"菌苔"。雖然許多病毒對(duì)野生型病毒抗性微生物無(wú)效，但是某 些突變林可以感染并裂解病毒抗性微生物。這些病毒是h-突變林，并 且在一般稱為"噬菌斑"的菌苔的基本透明區(qū)內(nèi)分離得到。
可以重復(fù)這些分離病毒抗性靶菌林微生物以及產(chǎn)生、選擇并分離 h-突變型病毒的方法以便增大h-突變型病毒可以感染的靶菌林的病毒 抗性微生物的范圍?？梢酝ㄟ^(guò)在h-突變型病毒而不是野生型病毒存在 情況下培養(yǎng)病毒抗性微生物來(lái)進(jìn)行這種方法?；蛘?，可以通過(guò)將這些方法進(jìn)行幾個(gè)不同的次數(shù)來(lái)產(chǎn)生并分離各種具有不同宿主范圍的h-突 變型。
檢測(cè)不良基因
分離病毒之后，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的比較技術(shù)來(lái)確定存在或缺 乏不良基因(例如毒力因子、毒素和抗生素抗性基因)，所述技術(shù)例 如為常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，脈沖交變電場(chǎng)凝膠電泳，或使用核酸雜
交探針。這類技術(shù)包括使任何不良基因與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的 DNA互補(bǔ)鏈雜交，所述互補(bǔ)鏈包括已知的不良基因(例如，賦予病毒感 染多細(xì)胞生物能力的基因、向受感染的宿主微生物轉(zhuǎn)移不良基因能力 的基因和從裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闇睾蜖顟B(tài)能力的基因)。然后可以通過(guò)已 知技術(shù)諸如放射性分析來(lái)檢測(cè)雜合體。
作為上述比較性檢測(cè)的 一個(gè)例子，由于本發(fā)明的病毒僅包括裂解 病毒，通過(guò)將這些病毒的基因與賦予病毒溫和特性的已知基因相比較， 可以篩選溫和病毒。然后，可以從本發(fā)明的病毒混合物中和從本發(fā)明 的治療方法中排除溫和h-突變型病毒。
可以按照類似方式從本發(fā)明的病毒和病毒混合物中篩選并排除溫 和野生型病毒。如前面所鑒定，溫和病毒可以將不良的特征轉(zhuǎn)移至微 生物的宿主乾菌林。而且，溫和病毒不容易破壞靶菌林微生物。因此， 使用溫和病毒控制、減少或消除微生物群體不如使用裂解病毒達(dá)到上 述目的令人滿意。
可以按照相似方式檢測(cè)前述方法中產(chǎn)生的病毒抗性微生物的其它 不良的特性，例如抗生素抗性。
檢測(cè)不良基因之后，可以使本發(fā)明的無(wú)不良特性的病毒增殖并將其用于本發(fā)明的病毒混合物和本發(fā)明的方法中。
使h-突變型和野生型病毒增殖
使本發(fā)明的病毒增殖的方法包括培養(yǎng)大量的靶菌林微生物，包括 一種或多種其病毒抗性變種。然后以所需的MOI將所需的一種或多種病 毒引入微生物的乾菌林存在之處，所述病毒為諸如每種所需病毒的一 種或多種h-突變型變種或一種或多種野生型變種。典型的培養(yǎng)箱包括 生物反應(yīng)器，可以連續(xù)地向其中引入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并可以連續(xù)地從其中移 出微生物和/或病毒。還可以使所述病毒在大培養(yǎng)瓶中的滅菌液體生長(zhǎng) 培養(yǎng)基中增殖，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法增殖。
濃縮并貯存h-突變型病毒，野生型病毒和病毒抗性微生物
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，諸如化學(xué)沉淀和超濾濃縮病毒或病 毒混合物。另一種濃縮h-突變型病毒的方法包括分離和濃縮稱為"載 體"的受感染的、未裂解的靶菌林宿主微生物。使用栽體是令人滿意 的，這是因?yàn)閱蝹€(gè)載體最終被其中生長(zhǎng)的病毒裂解，并且裂解期間釋 放大量病毒。此外，與通過(guò)許多常規(guī)方法濃縮病毒相比，通過(guò)常規(guī)方 法如離心濃縮載體微生物更加容易。優(yōu)選，載體是粑菌林微生物的無(wú)
致病力變種，因此將烈性靶菌林引入病毒處理部位的風(fēng)險(xiǎn)很小或沒有 風(fēng)險(xiǎn)。
用于本發(fā)明的方法之前，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法(例如通過(guò)在 約4"C冷藏，冷凍或凍干方法)貯存病毒和病毒的載體微生物?；蛘?， 可以根據(jù)本發(fā)明的方法和/或其濃度使用本發(fā)明的病毒和攜帶病毒的 載體。
可以使用與濃縮并貯存病毒相似的方法濃縮和/或貯存本發(fā)明的
病毒抗性微生物o
然后，可能將貯存或未貯存的病毒和病毒混合物，以及病毒抗性
微生物用于本發(fā)明的控制微生物群體的方法，下面詳細(xì)描述其實(shí)施例。 控制微生物群體的方法
A.使用烈性病毒控制微生物群體
本發(fā)明方法的第一個(gè)實(shí)施方案包括使用本發(fā)明的病毒或病毒混合 物控制靶菌林微生物的群體。該第一個(gè)實(shí)施方案包括將本發(fā)明的病毒 引入處理部位以便裂解耙菌林微生物。
食物或食品，諸如生肉和禽類是典型的處理部位。生肉和禽類處 理部位中通常存在的不良微生物包括但不限于，沙門氏菌屬、彎曲桿 菌屬和埃希氏桿菌屬(例如大腸桿菌)。典型的大腸桿菌靼菌林是聲 名狼藉的菌林0157:H7。將感染并裂解不良微生物的病毒引入生肉和禽 類處理部位包括但不限于，將病毒引入活動(dòng)物的食物和水，將病毒施 用于上述動(dòng)物的生存空間，將病毒施用于并引入動(dòng)物尸體、肉以及肉 類加工廠的表面、貯藏和運(yùn)輸容器、市場(chǎng)和家庭。將病毒施用于肉類 和禽類減少或消除不良微生物群體，其被認(rèn)為減少或消除由上述微生 物引起的疾病和食物腐敗的發(fā)生。同樣，可以用本發(fā)明的病毒處理植 被及其他食品，以控制其上不良微生物群體的增加。
另 一個(gè)可以引入病毒的典型處理部位包括活動(dòng)物(諸如哺乳動(dòng)物， 例如人類)，或"受試者"。本發(fā)明病毒可以用于預(yù)防(即預(yù)防法) 或治療(即療法)由微生物的靶菌林引起的疾病。治療和預(yù)防均包括 通過(guò)已知方法將病毒引入受試者。病毒優(yōu)選通過(guò)已知的腸內(nèi)劑型口服 給藥。病毒可以采用各種已知形式，諸如氣霧劑，液體，霜?jiǎng)?，洗液?br> 肥皂，粉劑和油骨劑局部給藥。還可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法給予本
發(fā)明的病毒，已知的方法諸如W095/27043所公開的方法，其公開內(nèi)容 全部引入本文作為參考。
當(dāng)用于微生物感染的治療時(shí)，可以單獨(dú)引入本發(fā)明的病毒或與一 種或多種抗生素聯(lián)合使用，抗生素此處還稱為"抗微生物劑"或"細(xì) 菌素"。術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌素"定義為由細(xì)菌合成的并且需要靶微生物上的 特異性受體的抗微生物劑。本領(lǐng)域已知各種抗生素及其他抗微生物劑 (參見例如Handbook of Antimicrobial Therapy, The Medical Letter ( 1984 )，其公開內(nèi)容全部引入本文作為參考)。本發(fā)明的病 毒對(duì)預(yù)防和治療由細(xì)菌的抗生素抗性菌林引起的感染特別有用。
本發(fā)明的病毒還可以用于殺滅物品上的微生物的乾菌林。消毒時(shí)， 將包括病毒的組合物施用于物品，該病毒則裂解性地感染耙菌株?？?以通過(guò)這種方式消毒的典型物品包括但不限于，醫(yī)療保健設(shè)施的受感 染區(qū)域、醫(yī)療保健設(shè)施中的手術(shù)室和醫(yī)療室以及健康護(hù)理人員使用的 設(shè)備。
也可以本根據(jù)方法的第一個(gè)實(shí)施方案處理由微生物引起的植物病 害。可以通過(guò)噴霧或引入植物的水源將病毒施用于被感染或污染的植 物、秧苗、種子或土壤或其它有利于上述者的物質(zhì)，所述病毒可感染 引起植物病害或有害的，例如冰核形成微生物的靼菌抹。作為處理植 物的一個(gè)例子，可以用病毒或病毒混合物處理豆莢種子，所述病毒或 病毒混合物感染并裂解土壤中存在的根瘤菌的不良菌林，而不會(huì)感染 根瘤菌的有益菌林。優(yōu)選包括h-突變型病毒的病毒可以減少或消除根 瘤菌的不良菌林，而有利的根瘤菌菌林當(dāng)植物生長(zhǎng)時(shí)將有益于植物。
本發(fā)明方法的第 一個(gè)實(shí)施方案還可以用于控制對(duì)環(huán)境有害的微生 物群體。例如，本發(fā)明的病毒可以用于減少消耗水域中的氧氣的微生
物群體，并使得這些水域中的氧含量增加。被引入池塘，河水，或海 水的污物和肥料中的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)可使藻類大量繁殖。藻類最終死亡并隨后 被各種微生物分解，所述微生物增殖并繼續(xù)分解死亡的藻類。在上述 微生物增殖期間，消耗水中的氧氣，這抑制了其中大多數(shù)其它生物的 生長(zhǎng)。引入感染并裂解特定藻類物種(所述藻類可以在特定地點(diǎn)大量 繁殖)的病毒可以控制上述藻類微生物群體以及藻類大量繁殖，由此 允許水中的氧含量增加，并促進(jìn)將其它種類的生物再引入這些先前消 耗氧氣的處理部位。
作為本方法的另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的病毒可以用于減少"酸性 礦水排水"的發(fā)生，這是與煤礦開采有關(guān)的環(huán)境問題。 一種氧化硫化 鐵的細(xì)菌菌種氧化亞鐵硫桿菌是酸性礦水排水的主要原因。由于酸性 礦水排水污染附近湖泊、河流和溪流中的水，這些水體的質(zhì)量惡化。 酸性礦水排水中溶解的酸和金屬對(duì)水生生物有毒，并且使得這些水對(duì) 飲用和人類活動(dòng)是不安全的。因此，引入感染并裂解氧化亞鐵硫桿菌
的病毒對(duì)于減少或根除來(lái)自煤礦的這類細(xì)菌是有效的，并且將會(huì)減少 酸性礦水排水的發(fā)生。
本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施例是控制、減少并消除病原體。典型的 病原體包括但不限于，各種類型的細(xì)菌(例如炭疽桿菌、傷寒沙門氏 菌、霍亂弧菌、鼠疫耶爾森氏菌、白紋黃單胞菌、野油菜黃單胞菌柑 橘病原變種、和野油菜黃單胞菌水稻致病變種)，立克次氏體(例如 伯氏考克斯氏體和普氏立克次氏體)，和真菌。將感染并裂解上述病 原體的本發(fā)明的病毒散布于上述病原體存在的處理部位可以控制、減 少并可能消除上述病原體群體。
本發(fā)明方法的第一個(gè)實(shí)施方案還可以用于選擇性地控制、減少或 消除不良微生物群體，所述不良微生物抑制有益微生物進(jìn)行有益過(guò)程 的能力。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，稱為有益微生物或有益因子的幾
種類型的微生物使其宿主受益。然而，有益微生物使其宿主受益的能 力可以受到不良微生物的干擾。根據(jù)本方法的第一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)處 理不良微生物的靶菌林有用的優(yōu)選的病毒或病毒混合物可以感染并裂 解該靼菌林，而不會(huì)感染或裂解任何有益微生物。
同樣，微生物的不良的靶菌株可以干擾有益微生物對(duì)有毒化學(xué)品 的生物清除。例如，生物除污微生物的混合物中可能存在產(chǎn)生各種抗 微生物物質(zhì)的假單胞菌類。然而，上述混合物中抗微生物物質(zhì)的存在 是不理想的，這是由于其可以破壞許多微生物生物除污有毒化學(xué)品的 能力。因此，本發(fā)明的病毒在本方法中可以用于控制上述混合物中不 良的抗微生物劑產(chǎn)生微生物的數(shù)目。
其它微生物在某些場(chǎng)合是有益的，但是在其它方面可能是有害的。 一種上述微生物，銅綠假單胞菌天然存在于土壤中，并且可以用于許 多環(huán)境污染物的生物除污。然而，銅綠假單胞菌還引起各種植物和動(dòng) 物疾病。因此，在銅綠假單胞菌完成了其有益工作之后，本發(fā)明的方 法可以用于控制、減少或消除銅綠假單胞菌群體。
可以用類似方法控制、減少或消除基因工程微生物群體。由于許 多人擔(dān)心為了有益的目的使用基因工程微生物可能同時(shí)具有不良影 響，所以消除上述基因工程微生物可能是需要的。因此，可以根據(jù)本 發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案使用感染并裂解基因工程微生物的靶菌林的病 毒，以在基因工程微生物用于有益用途之后控制、減少或消除處理部 位的基因工程靼菌抹微生物群體。
B.使用病毒抗性微生物控制微生物群體的方法
如前所述，許多有益微生物或"有益因子"進(jìn)行有益的過(guò)程。然 而，這樣的微生物易受病毒感染并被其裂解。因此，本發(fā)明方法的第
二個(gè)實(shí)施方案包括有益微生物的病毒抗性菌林在有益過(guò)程中的應(yīng)用。
如前所述，通過(guò)在感染并裂解乾菌林微生物的野生型和/或h-突變 型病毒存在情況下，培養(yǎng)微生物的耙菌林產(chǎn)生病毒抗性微生物。然后， 可以如前所述分離病毒抗性微生物，并在基本上無(wú)菌并優(yōu)選受控的條 件下使其在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖。
作為使用本方法的第二個(gè)實(shí)施方案的實(shí)例，病毒抗性菠蘿泛菌可 用于控制小麥上銹菌的生長(zhǎng)，所述菠蘿泛菌是銹菌，柄銹菌屬菌種的 寄生菌。然而，攻擊菠蘿泛菌的噬菌體也存在于銹菌附近，并且對(duì)菠 蘿泛菌控制銹菌的能力具有不利影響。因此，將病毒抗性菠蘿泛菌菌 林施用于小麥可有效控制小麥上銹菌的生長(zhǎng)。同樣，將病毒抗性菠蘿 泛菌施用于受銹菌感染的小麥可有效防止銹菌向其它小麥植物傳播， 并且可有效處理受銹菌感染的小麥植物。
同樣，某些細(xì)菌，諸如嗜蟲沙雷氏菌控制昆蟲群體的增殖和蔓延， 諸如新西蘭草金龜，或CoWe/y"a zea/a/^//ca,并且可以用于處理 植物或防止上述昆蟲向其它植物的傳播。用于生物害蟲防治的其它病 毒抗性細(xì)菌也可用于本發(fā)明方法的第二個(gè)實(shí)施方案，諸如產(chǎn)氣腸桿菌 用于防治蝗蟲。
其它有益微生物可以用于進(jìn)行下列過(guò)程，該過(guò)程包括但不限于， 浸取以便使富硫化物礦物的硫化物氧化為硫酸而從貧礦石釋放并濃縮 貴重礦物諸如銅和鈾(即氧化亞鐵硫桿菌和嗜酸菌屬菌種)；從瀝青 頁(yè)巖中釋放石油和相關(guān)物質(zhì)(例如紅球菌屬菌種，硫化葉菌屬菌種， 和/或硫桿菌屬菌種)；酸化硫或其它物質(zhì)以酸化已選擇用于農(nóng)業(yè)的堿 性土壤(例如紅球菌屬菌種，硫化葉菌屬菌種，和/或硫桿菌屬菌種)； 分解輪胎及其他橡膠產(chǎn)品用于再循環(huán)(例如紅球菌屬菌種，硫化葉菌 屬菌種，和/或硫桿菌屬菌種)；危險(xiǎn)化學(xué)品及污染物的生物除污(例
如紅球菌屬菌種，硫化葉菌屬菌種，和/或硫桿菌屬菌種)；處理廢水 排放和淤泥，其中其它微生物產(chǎn)生污移的氣味(例如來(lái)自乳品廠和養(yǎng) 豬農(nóng)廠、陰溝、農(nóng)場(chǎng)等)；以及工業(yè)發(fā)酵過(guò)程(例如生產(chǎn)干酪的乳酸 菌)。根據(jù)本發(fā)明方法的第二個(gè)實(shí)施方案病毒抗性微生物在上述過(guò)程 中的應(yīng)用可降低有益微生物被對(duì)其具有特異性的病毒感染或裂解的可 能性。
雖然通過(guò)某些優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明的范圍由 所附的權(quán)利要求及其法律等同物所限定。
權(quán)利要求
1.一種控制微生物群體的組合物，包括病毒不能感染多細(xì)胞生物；和將不良基因轉(zhuǎn)移至受感染宿主微生物；以及能夠感染微生物的靶菌株的病毒抗性變種。
2. 權(quán)利要求1所述的組合物，其中病毒包括裂解病毒。
3. 權(quán)利要求2所述的組合物，其中裂解病毒不能從裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?溫和狀態(tài)。
4. 權(quán)利要求1所述的組合物，進(jìn)一步包括對(duì)于靶菌林具有特異性的 野生型病毒。
5. 權(quán)利要求4所述的組合物，其中野生型病毒包括裂解病毒。
6. 權(quán)利要求1所述的組合物，進(jìn)一步包括受病毒感染的栽體微生物。
7. 權(quán)利要求6所述的組合物，其中載體微生物包括無(wú)致病力的微生
8. 權(quán)利要求1所述的組合物，進(jìn)一步包括 對(duì)于微生物具有特異性的抗微生物劑。
9. 一種控制有益微生物群體的組合物，包括有益微生物的病毒抗性變種。
10. 權(quán)利要求9所述的組合物，其中病毒抗性變種包括對(duì)對(duì)于有益微 生物具有特異性的野生型病毒的抗性。
11. 權(quán)利要求9所述的組合物，其中病毒抗性變種包括對(duì)對(duì)于有益微 生物具有特異性的h-突變型病毒的抗性。
12. 權(quán)利要求9所述的組合物，進(jìn)一步包括對(duì)于不良微生物具有特 異性的h-突變型病毒。
13. 權(quán)利要求9所述的組合物，其中有益微生物包括下列的至少一 種'菱蘿泛菌(戶a"foea a/ / a/ ws )， 嗜蟲沙雷氏菌(5^rraf/a e/7fo/z70/7A/.//<2)， 產(chǎn)氣腸桿菌(^/7fro6s"er aeroge/7es)， 氧化亞鐵硫桿 菌(7: /"erroi2Va/^)，嗜酸菌屬C4c/f///7A///'://z7)的成員，紅球茵屬 (y 力油coc園)的成員，硫化葉菌屬(^i7尸o6i;s)的成員，以及硫桿菌屬 (7T i幽"'"^)的成員。
14. 一種控制微生物的耙菌抹群體的方法，包括 引入病毒，其不能感染多細(xì)胞生物或?qū)⒉涣蓟蜣D(zhuǎn)移至受感染宿主微生物；并且 能夠感染微生物的靶菌林的病毒抗性變種；以及 允許病毒感染靶菌林。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中引入包括引入裂解病毒。
16. 權(quán)利要求14所述的方法，其中引入包括引入h-突變型病毒。
17. 權(quán)利要求H所述的方法，其中引入包括引入野生型病毒。
18. 權(quán)利要求14所述的方法， 部位。
19. 權(quán)利要求14所述的方法，
20. 權(quán)利要求14所述的方法，
21. 權(quán)利要求20所述的方法，類。
22. 權(quán)利要求14所述的方法， 益微生物是選擇性的。進(jìn)一步包括將抗微生物劑引入處理其中處理食品包括處理生肉或生的禽 其中病毒對(duì)于微生物的靶菌林而非有其中引入包括向活動(dòng)物給予病毒。 其中引入包括使用病毒處理食品。
23. —種控制有益微生物群體的方法，包括將有益微生物的病毒抗 性變種引入處理部位。
24. 權(quán)利要求23所述的方法，其中引入包括使毒性化學(xué)品或其它污 染物接觸有益微生物的病毒抗性變種。
25. 權(quán)利要求23所述的方法，其中引入包括將下列的至少一種菠 蘿泛菌，嗜蟲沙雷氏菌，產(chǎn)氣腸桿菌，氧化亞鐵硫桿菌，嗜酸菌屬的成 員，紅球菌屬的成員，硫化葉菌屬的成員，和硫桿菌屬的成員引入處理 部位。
26. 權(quán)利要求23所述的方法，其中進(jìn)行引入以控制真菌的生長(zhǎng)。
27. 權(quán)利要求23所述的方法，其中進(jìn)行引入以控制昆蟲群體的增殖 或傳播。
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中進(jìn)行引入以控制昆蟲群體，例如 新西蘭草金龜和蝗蟲的增殖或傳播。
29. 權(quán)利要求27所述的方法，其中引入包括將有益微生物的病毒抗 性變種施用于植物。
30. 權(quán)利要求23所述的方法，其中進(jìn)行引入以將硫化物氧化為硫酸。
31. 權(quán)利要求23所述的方法，其中進(jìn)行引入以從瀝青頁(yè)巖中釋放石 油和石油相關(guān)物質(zhì)。
32. 權(quán)利要求23所述的方法，其中進(jìn)行引入以酸化硫。
33. 權(quán)利要求23所述的方法，其中引入實(shí)現(xiàn)酸化堿性土壤，分解橡 膠產(chǎn)品，生物清除危險(xiǎn)化學(xué)品或污染物，處理污物或廢水，處理臭味或 惡臭源和發(fā)酵過(guò)程中的至少 一種。
34. —種產(chǎn)生h-突變型病毒的方法，包括 分離微生物的靶菌抹；在對(duì)于靶菌林具有特異性的野生型病毒存在情況下培養(yǎng)靶菌林，以 分離靶菌株的病毒抗性變種；在野生型病毒存在情況下培養(yǎng)病毒抗性變種，以分離h-突變型病毒；在h-突變型病毒存在情況下培養(yǎng)靶菌林的病毒抗性變種，以分離耙 菌林的h-突變型病毒抗性變種；以及在h-突變型病毒存在情況下培養(yǎng)h-突變型病毒抗性變種，以分離第 二h-突變型病毒。
35. 權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)靶菌抹和h-突變型病毒抗性變種中的至少一種中的不良基因。
36. 權(quán)利要求3.4所述的方法，其中分離第二h-突變型病毒包括分離 大多數(shù)對(duì)于靶菌抹的h-突變型病毒抗性變種具有特異性的h-突變型病 毒。
37. 權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包括 篩選并排除任何溫和病毒。
38. 權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)h-突變型病毒和第二h-突變型病毒中的至少一種中的不良基因。
39. —種產(chǎn)生微生物的病毒抗性變種的方法，包括 使野生型微生物接觸對(duì)于野生型微生物具有特異性的病毒，以分離h-突變型病毒；使野生型微生物接觸h-突變型病毒，以分離微生物的病毒抗性變種；使微生物的病毒抗性變種接觸至少一種h-突變型病毒，以分離至少一種第二h-突變型病毒；以及使至少一種野生型微生物和至少一種類型的微生物的病毒抗性變 種接觸至少一種第二h-突變型病毒，以分離微生物的至少一種笫二病毒抗性變種。
40. 權(quán)利要求39所述的方法，其中分離病毒抗性變種和分離至少一 種笫二病毒抗性變種中的至少一種包括在對(duì)于微生物具有特異性的h-突變型病毒存在情況下培養(yǎng)野生型微生物和病毒抗性變種中的至少一 種。
41. 權(quán)利要求40所述的方法，其中分離至少一種第二病毒抗性變種 包括分離至少一種第二病毒抗性變種，其對(duì)大多數(shù)h-突變型病毒的感 染具有抗性。
42. —種控制食品上的對(duì)哺乳動(dòng)物具有致病性的微生物群體的組合 物，包括對(duì)于微生物的靶菌抹的病毒抗性變種具有特異性并且能夠感染 所述變種的h-突變型病毒。
43. 權(quán)利要求42所述的組合物，其中微生物是腸道病原體，例如沙 門氏菌屬，彎曲桿菌屬，或大腸桿菌。
44. 權(quán)利要求42所述的組合物，其中靶菌林包括大腸桿菌0157: H7。
45. —種控制食品上的對(duì)哺乳動(dòng)物具有致病性的微生物的耙菌林群 體的方法，包括將裂解病毒施用于食品，所述裂解病毒對(duì)于靶菌林具有特異性并且 不能感染多細(xì)胞生物或?qū)⒉涣蓟蜣D(zhuǎn)移至宿主微生物；以及 允許裂解病毒感染靶菌林。
46. 權(quán)利要求45所述的方法，其中裂解病毒包括h-突變型病毒。
47. 權(quán)利要求45所述的方法，其中裂解病毒包括野生型病毒。
48. 權(quán)利要求45所述的方法，其中允許裂解病毒感染腸道病原體， 例如沙門氏菌屬，彎曲桿菌屬，或埃希氏菌屬的靼菌抹。
49. 權(quán)利要求45所述的方法，其中靶菌林包括大腸桿菌0157:H7。7\
50. —種處理受微生物感染的宿主的方法，包括 向宿主給予包含裂解病毒的組合物以使病毒接觸微生物，所述裂解病毒基本上無(wú)任何不良基因并且對(duì)微生物具有特異性；以及 允許裂解病毒感染微生物。
51. 權(quán)利要求50所述的方法，其中裂解病毒包括h-突變型病毒。
52. 權(quán)利要求50所述的方法，其中裂解病毒包括野生型病毒。
53. 權(quán)利要求50所述的方法，其中組合物進(jìn)一步包括抗微生物劑。
54. —種殺滅來(lái)自物品的微生物的靶菌林的方法，包括 使物品接觸包含裂解h-突變型病毒的組合物，所述裂解h-突變型病毒對(duì)耙菌株具有特異性；以及允許裂解h-突變型病毒感染靶菌林。
55. —種預(yù)防微生物感染潛在宿主的方法，包括 向潛在宿主給予包括h-突變型病毒的組合物，以使h-突變型病毒在感染潛在宿主的過(guò)程中接觸微生物。
56. —種預(yù)防不良基因從第一微生物轉(zhuǎn)移至第二微生物的方法，包括使第一微生物和第二微生物中的至少一種接觸裂解病毒，所述裂解 病毒基本上無(wú)任何不良基因并且對(duì)第 一微生物具有特異性；以及 允許裂解病毒感染第一微生物。
57. 權(quán)利要求56所述的方法，其中不良基因選自編碼毒力因子的基 因，產(chǎn)生毒素的基因，或抗生素抗性基因。
58. —種增加水中氧含量的方法，包括使降低水中氧含量的微生物接觸可以感染并裂解它們的病毒。
59. 權(quán)利要求58所述的方法，其中接觸包括使微生物接觸病毒，所 述病毒包括可以感染并裂解至少某些微生物的病毒抗性菌林的h-突變 型病毒。
60. 權(quán)利要求58所述的方法，其中接觸包括將病毒施用于藻類。
61. 權(quán)利要求58所述的方法，其中暴露包括將病毒引入水中。
62. —種增加水中氧含量的組合物，包括可以感染并裂解降低水中 氧含量的細(xì)菌的病毒和h-突變型病毒。
63. —種減少或預(yù)防酸性礦水排水的方法，包括將感染并裂解氧化亞鐵硫桿菌的病毒引入發(fā)生或可能發(fā)生酸性礦 水排水的環(huán)境。
64. 權(quán)利要求63所述的方法，其中引入包括將病毒引入煤礦。
65. 權(quán)利要求63所述的方法，其中引入包括將h-突變型病毒引入發(fā) 生或可能發(fā)生酸性礦水排水的環(huán)境，所述h-突變型病毒感染并裂解氧化 亞纟失石充桿菌的病毒抗性菌林。
66. —種減少或預(yù)防酸性礦水排水的組合物，包括感染并裂解氧化 亞鐵硫桿菌的h-突變型病毒。
全文摘要
裂解病毒可用于包括控制微生物群體的方法中，所述病毒對(duì)于微生物的靶菌株具有特異性并且基本上無(wú)不良基因。該病毒可以包括宿主范圍突變型或“h-突變”。一種產(chǎn)生病毒的方法包括在對(duì)于靶菌株具有特異性的病毒存在情況下，培養(yǎng)微生物的靶菌株的病毒抗性變種。只有h-突變型病毒可以增殖。還公開了微生物的野生型病毒抗性變種和微生物的病毒抗性變種，以及產(chǎn)生上述變種的方法?？刂瓢芯晡⑸锏姆椒ò▽⒉《疽胄枰刂莆⑸锏陌芯耆后w的處理部位，或?qū)⑽⑸锏牟《究剐宰兎N引入希望微生物存在的處理部位。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101115393SQ200680004450
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月10日
發(fā)明者L·E·杰克遜, R·S·斯班德拉夫 申請(qǐng)人:歐姆尼利蒂克斯公司