專利名稱：：可在腸桿菌科中自主復制的新質(zhì)粒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及新質(zhì)粒，其可在來自腸桿菌科(family五"&raZ)acfen'aceae)的微生物中自主復制，本發(fā)明還涉及使用該質(zhì)粒和含有該質(zhì)粒的微生物的方法。
背景技術：
：目前，正在進行通過DNA重組技術對來自腸桿菌科的微生物，包括大腸桿菌的培育和改進。為了通過DNA重組技術培育和改進微生物，常常使用源自不同屬樣史生物的質(zhì)粒和廣語宿主載體(broadhostspectrumvector)。然而，一般使用來自具有相似特性的微生物的質(zhì)粒。源自腸桿菌科的微生物的質(zhì)粒包括小質(zhì)粒例如pBR322、均源自大腸桿菌的RSF1010(Gene，vol.75，(2)pp.271-288，1989)和pUC(Gene，Oct.1982,19(3):259-68)、源自沙門氏菌屬OS"/附o"e〃a)細菌的pHCM2(Plasmid，May2002，47(3):159-71)、均源自耶爾森氏菌屬(Je/^m'a)纟曰菌的pCDl(Infect.Immun.,Mar.1986,51(3):788-94)和pMTl(J.Bacteriol.，Jul.2000,182(14):3924-8)等。盡管已知pS來自泛菌屬(Pawtoea)細菌(W098/59054)，然而當轉(zhuǎn)入微生物中時，能夠在酸性條件下改進微生物生長的質(zhì)粒是未知的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供新質(zhì)粒，其用于培育和改進屬于腸桿菌科的微生物。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)戶a"toeaa"a"a^AJ13601(FERMBP-7207)含有新質(zhì)粒，并且成功地鑒定了這種質(zhì)粒。因此，他們完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個目的是提供源自微生物的基因，所述樣i生物選自下組泛菌屬細菌、歐文氏菌屬(五nW"/:a)細菌和腸桿菌屬(五wterakzcter)細菌，并且其中所述基因編碼具有氨基酸序列的Rep蛋白，所述氨基酸序列選自下組SEQIDNO:2和與SEQIDNO:2至少80%同源的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供質(zhì)粒，其包含如上定義的基因，并且其中所述質(zhì)粒在腸桿菌科細菌中可自主復制。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒還包含標記基因。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的質(zhì)粒，其中該質(zhì)粒來自選自下組的泛菌屬細菌尸awtoeaa"awa他FERMBP-7207、BP-6614和BP-6615,并且該質(zhì)粒為大約320kbs。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的質(zhì)粒，其中該質(zhì)粒是pEA320，并且具有選自圖l、2、3、4和5中所示的限制酶圖譜。本發(fā)明的另一個目的是提供腸桿菌科微生物，已將其用包含基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，該基因分離自選自下組的微生物泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌和腸桿菌屬細菌，并且其中所述基因編碼具有氨基酸序列的Rep蛋白，所述氨基酸序列選自下組SEQIDNO:2和與SEQIDNO:2至少80%同源的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的微生物，其中所述質(zhì)粒來自選自下組的泛菌屬細菌a"a"afeFERMBP-7207、BP-6614和BP-6615,并且該質(zhì)粒為大約320kbs。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的微生物，其中該質(zhì)粒是pEA320,并且具有選自圖l、2、3、4和5中所示的限制酶圖譜。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的微生物，其中所述質(zhì)粒還包含標記基因，并且該質(zhì)粒在腸桿菌科微生物中可自主復制。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的微生物，其中所述腸桿菌科微生物選自下組埃希氏菌屬細菌、.泛菌屬細菌、腸桿菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌、克雷伯氏菌屬(A7efo/e〃a)細菌、沙雷氏菌屬(5^//")細菌、沙門氏菌屬細菌和摩根氏菌屬(iW^ga"e/Za)纟田菌。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述的微生物，其能夠產(chǎn)生有用的物質(zhì)。本發(fā)明的另一個目的是提供用于產(chǎn)生有用的物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的微生物，并且從該培養(yǎng)基或微生物中收集所述有用的物質(zhì)。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述方法，其中有用的物質(zhì)是L-氨基酸。本發(fā)明的另一個目的是提供用于產(chǎn)生具有改進的耐酸性的微生物的方法，其包括用如上所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化腸桿菌科微生物。本發(fā)明的另一個目的是提供如上所述方法，其中具有改進的耐酸性的微生物與不含有該質(zhì)粒的菌抹相比，在pH3-5顯示改善的生長。附圖簡述圖1顯示質(zhì)粒pEA320的A^I限制酶圖譜。圖2顯示質(zhì)粒pEA320的&e8387I限制酶圖譜。圖3顯示質(zhì)粒pEA320的限制酶圖譜。圖4顯示質(zhì)粒pEA320的限制酶圖譜。圖5顯示質(zhì)粒pEA320的Acl限制酶圖語。圖6顯示用質(zhì)粒pEA320轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在中性和酸性條件下生長的圖。圖7顯示用質(zhì)粒pEA320轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在酸性條件下生長的圖。實施本發(fā)明的最佳方式以下，將詳細i兌明本發(fā)明。<1〉本發(fā)明的基因和質(zhì)粒本發(fā)明的基因是源自或分離自泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌或腸桿菌屬細菌的基因。這種基因(r印基因)編碼Rep蛋白，該蛋白具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，或與SEQIDNO:2至少80%同源的氨基酸序列。本發(fā)明的質(zhì)粒含有本發(fā)明的基因。通過分析pEA320質(zhì)粒鑒定本發(fā)明的基因。pEA320為大約320kbs并且源自或分離自選自下組的細菌Pa"/oefla"朋fl^AJ13601(FERMBP-7207)、尸a"/oeaa加"(5^AJ13355(FERMBP-6614)、尸"wtoeaAJ13356(FERMBP-6615),如后面所述。泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌和腸4干菌屬細菌是歸類于Y-proteobacteria的微生物，并且它們在分類學上彼此非常相似(J.Gen.AppLMicrobiol"Dec.1997，43(6)，355-361;InternationalJournalofSystematicBacteriology,1993，pp.162-173;和InternationalJournalofSystematicBacteriology,Oct.1997,pp.1061-1067)。近年來，基于16SrRNA的核香酸序列分析等，將一些來自腸桿菌屬的微生物重新歸類為成團泛菌agg7omerara)、P朋toea、斯氏泛菌(尸a"toea飾而W/)等，并且將某些來自歐文氏菌屬的微生物重新歸類于菠蘿泛菌CP朋toea朋朋a力或斯氏泛菌(參見InternationalJournalofSystematicBacteriology,Oct.1997，pp.賜l-1067)。此外，它們通常顯示以下生理學特性(美國專利編號6,331,419和6,197,559):(1)革蘭氏染色陰性(2)對氧氣特性兼性厭氧菌(3)氧化酶陽性(4)福格斯-普里斯考爾反應(voges-proskauerreaction):陽性(5)曱基紅試驗陰性C6)脲酶陰性G0吲哚產(chǎn)生陽性(8)TSI培養(yǎng)基中的硫化氫產(chǎn)生微弱活性(9)(3-半乳糖苷酶陽性(10)糖可同化性阿拉伯糖陽性蔗糖陽性乳糖陽性木糖陽性山梨糖醇陽性肌醇陽性海藻糖陽性麥芽糖陽性蜜二一唐(Melibiose):陽性側(cè)金盞糖醇(Adonitol):陰性棉子糖(Raffinose):陽性水楊苦(Salicin):陰性蜜二并唐陽性(11)檸檬酸可同化性陽性(12)精氨酸脫水酶陰性(13)鳥氨酸脫羧酶陰性(14)生長pH:在pH4.5-7良好生長因此，本發(fā)明的基因能夠從天然存在于泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌和腸桿菌屬細菌中的巨大質(zhì)粒(giantplasmid)獲得，所述巨大質(zhì)粒特別是從這些細菌的野生型菌抹獲得的巨大質(zhì)粒。含有這種巨大質(zhì)粒的泛菌屬細菌的典型菌才朱包括尸a"toeaa"a"ato、斯氏泛菌和成團泛菌。此夕卜，這些歐文氏菌屬細菌的典型菌才朱包括菠蘿歐文氏菌(EnWm'a和草生歐文氏菌/ze/^/co/a)。此外，這些腸桿菌屬細菌的典型菌林包括成團腸桿菌(五WeraZac^"a欲/owera"力和產(chǎn)氣腸軒菌(五"/eraZ)"Ceraeroge"&s)。另外，基于16SrRNA的核苷酸序列分析等，最近將成團腸桿菌的一些菌抹重新分類為成團泛菌、尸awtoeaa"a"afe、斯氏泛菌等。在本發(fā)明中，所述基因和質(zhì)?？稍醋曰蚍蛛x自腸桿菌屬、泛菌屬和歐文氏菌屬之一，只要該微生物歸類為腸桿菌科。當通過遺傳工程技術培育菌抹時，能夠使用a"G"a^AJ13355茵抹(FERMBP隱6614)、AJ13356菌抹(FERMBP-6615)、AJ13601菌抹(FERMBP-7207)和它們的衍生物。當將它們分離并且作為成團腸桿菌保藏時，將這些菌抹鑒定為成團腸桿菌。然而，基于16SrRNA的核苦酸測序等，最近將它們重新歸類為Pa"toea朋a"a&。具體來說，本發(fā)明的基因能夠從AJ13601(FERMBP-7207)菌抹獲得(EP1078989A)。將AJ13601菌抹于1999年8月18日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(NationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofEconomy,TradeandIndustry)(目前為,獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許微生物保藏中心(theInternationalPatentOrganismit:TsukubaCentral6，1-1,Higashi1—Chome，Tsukuba-shi,Ibaraki-ken，305-8566，Japan)并且給予保藏號FERMP-17516。根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定將該保藏于2000年7月6日轉(zhuǎn)為國際保藏并且給予保藏號FERMBP-7207。此外，本發(fā)明的基因還能夠從菠蘿歐文氏菌和草生歐文氏菌獲得。菠蘿歐文氏菌的實例包括菠蘿歐文氏菌ATCC33244和草生歐文氏菌IAM1595。ATCC33244菌抹能夠使用指定登記號從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得(地址P.O.Box1549，Manassas，VA20108,UnitedStatesofAmerica)(參見www.atcc.org/)。每個菌抹的登記號列于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中。IAM1595儲存在IAMCultureCollection,LaboratoryofBioresources,InstituteofMolecularandCellularBiosciences,TheUniversityofTokyo,并且能夠通過登記號訂購該菌林。每個菌株的登記號列于IAM目錄(IAMCatalogueofStrain,ThirdEdition,2004)中。此外，本發(fā)明的基因還能夠從成團腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌獲得。成團腸桿菌的實例是ATCC12287,產(chǎn)氣腸桿菌的實例是ATCC13048。發(fā)現(xiàn)前述尸a"toea含有大約320kbs的質(zhì)粒，將其鑒定并且命名為pEA320。這種質(zhì)粒作為雙鏈環(huán)狀DNA存在于的細胞中。pEA320中所含"p基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，并且該氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。當用典型限制酶消化時，從pEA320獲得的片段的數(shù)目和大小示于表1。此外，pEA320的限制酶圖譜示于圖1-5。編碼rep蛋白的基因位于pEA320酶圖i普上的110606-109728。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將由本發(fā)明的基因編碼的Rep蛋白定義為具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，或其同源物(homologue)。將這種Rep蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:2)和已知的腸桿菌科細菌的質(zhì)粒的Rep蛋白的氨基酸序列進行比較以確定同源性。由此，通過比較所編碼的Rep蛋白的同源性，能夠?qū)⒈景l(fā)明的基因區(qū)別于已知的腸桿菌科細菌的基因。本發(fā)明的基因包括編碼Rep蛋白的同源物，其與SEQIDNO:2的整個氨基酸序列具有80。/?；蚋?，優(yōu)選90°/?；蚋撸鼉?yōu)選95%或更高，最優(yōu)選97%或更高的同源性，并且其中所述蛋白質(zhì)或同源物參與到質(zhì)粒的復制中。如本文中計算的同源性是使用基因分析軟件Genetyx(其能夠從Genetyx,Inc.購買)分析和計算的，并且顯示精確匹配的氨基酸殘基的比率。能夠通過使用，例如Karlin和Altschul(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90，5873(1993))的算法BLAST或FASTA(MethodsEnzymol.，183,63(1990))測定氨基酸序列和核苷酸序列的同源性(同一性)。已基于此算法BLAST開發(fā)了稱為BLASTN和BLASTX的程序(參考www.ncbi.nlm.nih.gov)。此外，取決于泛菌屬、歐文氏菌屬和腸桿菌屬細菌的菌種或菌抹，rep基因的核苷S臾序列中可能存在差別。因此，Rep蛋白可具有氨基酸序列，其包含取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸殘基，只要該Rep蛋白功能不因這種變化而改變。取代、缺失、插入或添加的氨基酸可為，例如，1-20個，優(yōu)選1-10個，更優(yōu)選l-5個。氨基酸殘基的上述取代、缺失、插入或添加是保守的，并且將不影響質(zhì)粒的正常復制。典型的保守氨基酸改變是保守取代。被認為是保守的取代包括用Ser或Thr取代Ala,用Gln、His或Lys取代Arg,用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取4戈Cys,用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln,用Asn、GIn、Lys或Asp取代Glu,用Pro取代Gly,用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His,用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用IIe、Leu、Val或Phe耳又4戈Met，用Trp、Tyr、Met、lie或Leu取代Phe,用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp,用His、Phe或Trp取代Tyr,和用Met、lie或Leu取代Val。此外，編碼Rep蛋白的基因還可以是在嚴緊條件下能夠與SEQIDNO:1的核苷酸序列或能夠從這種核苷S臾序列制備的探針雜交的DNA,只要其編碼的蛋白保持復制質(zhì)粒的功能。"嚴緊條件"包括那些在該條件下，形成所謂的特異性雜合體，而不形成非特異性雜合體的條件。嚴緊條件的實例包括，例如，那些在該條件下，例如，具有不少于80%同源性的DNA相互雜交，而顯示低于80%同源性的DNA不相互雜交。具體實例包括在1xSSC、0.1%SDS和60°C，優(yōu)選0.1xSSC、0.1%SDS和60。C，更優(yōu)選0.1xSSC、0.1%SDS和68。C的鹽濃度和溫度下洗滌一次，優(yōu)選兩次或三次，其為典型的Southern雜交洗滌條件。盡管取決于雜交條件合適地選擇探針的長度，但其通常為100bps-1kbps。本發(fā)明的質(zhì)粒天然存在于泛菌屬、歐文氏菌屬和腸桿菌屬細菌中，能夠在腸桿菌科微生物，例如泛菌屬和埃希氏菌屬細菌中自主復制。因此，如果將目標基因插入該質(zhì)?；蚱浔３肿灾鲝椭颇芰Φ男揎椥问降娜魏挝恢茫⑶矣眠@種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主微生物，那么在該宿主微生物中表達目標基因是可能的。用本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的腸桿菌科微生物的實例包括埃希氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、沙門氏菌屬或摩根氏菌屬細菌。具體而言，能夠使用根據(jù)NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫中描述的分類法的腸桿菌科細菌。具體而言，能夠使用Neidhardt等(Neidhardt,F.C.etal.,j&c/zen'A/aco//and2)^/2/附,'Mm,AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.，1029,表l)提到的埃希氏菌屬細菌。在這些之中，例如能夠使用大腸桿菌。大腸桿菌的實例具體包括大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等，和源自原型(prototype)野生型菌抹K12菌抹的那些菌抹。腸桿菌屬細菌的實例包括成團腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等。具體而言，能夠使用在歐洲專利PublicationNo.952221A中例示的菌抹。如上所述，基于16SrRNA的核香酸序列分析等，將成團腸桿菌的一些菌4朱最近重新歸類為成團泛菌、尸a"toe"a"G"加^、斯氏泛菌等。泛菌屬細菌的典型菌抹包括戶朋/0eflm7朋afe、斯氏泛菌、成團泛菌和檸檬泛菌(尸^7toeac,'/re")。具體地，能夠使用在歐洲專利PublicationNo.955368A中例示的菌抹。歐文氏菌屬細菌的典型菌林包括菠蘿歐文氏菌和草生歐文氏菌，而克雷伯氏菌屬細菌的典型菌株包括植生克雷伯氏菌(^7^wW/ap/""/co/a)。具體而言，能夠使用歐洲專利PublicationNo.955368A中例示的菌株。沙雷氏菌屬細菌的典型菌纟朱包括液化沙雷氏菌(5^ra,/a/&we/ac^w)，沙門氏菌屬細菌的典型菌林包括鼠傷寒沙門氏菌(5"a/wo"e^0^"'wwn'ww)，而摩根氏菌屬的典型菌抹包括摩氏摩根氏菌0^0^2恥//。worgam7)。具體而言，作為屬于沙雷氏菌屬的細菌，能夠使用在歐洲專利PublicationNo.952221A中例示的菌抹。本發(fā)明的質(zhì)粒包括天然存在于泛菌屬、歐文氏菌屬和腸桿菌屬細菌中的巨大質(zhì)粒的部分，和該巨大質(zhì)粒本身，或其部分，以及另外的DNA序列，只要在該質(zhì)粒中包含本發(fā)明的基因。如果僅使用巨大質(zhì)粒的部分，那么必須包括對于質(zhì)粒自主復制關鍵的區(qū)域。即使將除了對質(zhì)粒自主復制關鍵的區(qū)域(復制控制區(qū)域)之外，例如，除了含有復制起點和對復制必需的區(qū)域之外的部分或全部區(qū)域去除，而且該質(zhì)粒由于這種去除而變得較小，該質(zhì)粒也能夠在宿主微生物中自主復制。所以，優(yōu)選將它用作載體。此外，如果將標記基因例如藥物抗性基因并入(incorporate)本發(fā)明的質(zhì)粒，其變得易于通過利用在轉(zhuǎn)化體中的標記基因的表型來檢測轉(zhuǎn)化體。能夠在宿主中使用的這種標記基因的實例包括氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、紅霉素抗性基因、氨千青霉素抗性基因、壯觀霉素(spectinomycin)抗性基因等。對于抗生素抗性基因，可僅將對于上述巨大質(zhì)粒復制必需的區(qū)域分離并且連接于抗生素抗性基因，或可將該抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移入不參與復制的巨大質(zhì)粒的部分。作為將抗生素抗性基因引入這種質(zhì)粒的方法，可使用Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.,"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中描述的方法等。這些方法是本領域技術人員熟知的。例如，可使用Datsenko和Wanner開發(fā)的使用單鏈DNA的方法，其被稱為"Red-驅(qū)動整合"(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，vol.97,No.12，pp.6640-6645)，以及將抗生素抗性基因引入轉(zhuǎn)座子并且轉(zhuǎn)移該轉(zhuǎn)座子的方法，如日本專利申請公開(Kokai)No.2-109985中所述。盡管將巨大質(zhì)粒的實例pEA320通過圖1-5所示的限制酶圖語表征，但本發(fā)明的質(zhì)粒不必具有這些限制酶圖譜，可將任何限制酶位點缺失，只要不影響自主復制能力。此外，可將不存在于pEA320的限制酶位點引入本發(fā)明的質(zhì)粒。能夠以與常規(guī)已知制備克隆載體、表達載體等相同的方式制備如上所述的這種質(zhì)粒。為了制備修飾的質(zhì)粒，優(yōu)選已測定該巨大質(zhì)粒的核苷酸序列?？赏ㄟ^已知的方法例如雙脫氧法(dideoxymethod)測定核苷酸序列。為了將目標基因插入本發(fā)明的質(zhì)粒中，將其插入到該質(zhì)?；蚱鋇f;t生物的限制酶位點是方便的。選擇的限制酶位點對于該質(zhì)粒應該是唯一的，并且應通過相應的限制酶切割。為了插入目標基因，可用這些限制酶部分或全部地消化作為目標基因來源的質(zhì)粒和基因組DNA等而留下相應的粘端，其與例如相同的限制酶是相容的，并且能夠?qū)⑺鼈冊诤线m的條件下連接?；蛘呖蓪⑺鼈兤蕉诉B接?？墒褂肈NA的消化和連接、轉(zhuǎn)化等，和本領域技術人員熟知的常規(guī)方法制備質(zhì)粒DNA。這些方法在Sambrook,J.,Fritsch,E.RandManiatis,T.，"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)等中描述。為了提取巨大質(zhì)粒，能夠使用J.Bacteriol，Mar.1981,Vol.145,No.3,pp.1365-1373中所述的方法。還能夠通過接合轉(zhuǎn)移(conjugativetransfer)將本發(fā)明的質(zhì)粒從舍有本發(fā)明質(zhì)粒的微生物轉(zhuǎn)入另外的微生物。能夠通過使用通常適于轉(zhuǎn)化腸桿菌科微生物的系統(tǒng)進行質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。通常，制備含有質(zhì)粒的供體微生物，所述質(zhì)粒具有oriT、fra基因和wW基因，或經(jīng)修飾以含有這些。隨后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至受體微生物。此外，如果該質(zhì)粒具有oriT,但不包含/ra和/或基因，則能夠通過使用確實含有這些基因的輔助質(zhì)粒(helperplasmid)將該質(zhì)粒從供體微生物轉(zhuǎn)移至受體微生物。即，具有fra基因和/或moZ)基因的輔助質(zhì)?？煞謩e包含于供體微生物，并且與oriT質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化(參考J.Bacteriol.,Aug.1995;177(15):4350-5)。oriT是轉(zhuǎn)移的起點。Mob蛋白是在oriT產(chǎn)生切口(nick)的核酸酶。Tra蛋白是通過使用在oriT的切口將DNA接合轉(zhuǎn)移至另一個細胞的蛋白質(zhì)。在下文中，將舉例說明用本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化腸桿菌科微生物的方法。本發(fā)明所述質(zhì)粒天然存在于泛菌屬、歐文氏菌屬或腸桿菌屬細菌中，其通常非常大(例如，pEA320具有大約320kbs的大小)，并因此優(yōu)選使用接合轉(zhuǎn)移方法以將其轉(zhuǎn)移至另外的微生物。為方便起見，將天然含有本發(fā)明所述質(zhì)粒的泛菌屬、歐文氏菌屬或腸桿菌屬細菌在本文中稱為供體菌抹，而將用本發(fā)明所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的腸桿菌科細菌稱為受體菌抹。優(yōu)選使用本發(fā)明所述質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒進行接合轉(zhuǎn)移，該輔助質(zhì)粒能夠促進接合轉(zhuǎn)移。通過這種操作，能夠?qū)⒈景l(fā)明的質(zhì)粒的修飾最小化，即使修飾可以是或可以不是必需的。輔助質(zhì)粒優(yōu)選含有mo6基因和fra基因，其均為接合轉(zhuǎn)移所必需的。具體地，pRK2013(可從CLONTECH和Biomedal獲得)或其衍生物優(yōu)選作為輔助質(zhì)粒(參考Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76:1648-1652:1979,該序列可從NCCB質(zhì)粒^:據(jù)庫獲得)。此外，本發(fā)明的質(zhì)粒優(yōu)選攜帶原先不存在于受體菌抹中的標記基因，從而在其轉(zhuǎn)移至受體菌株中時能夠進行顯性選擇(dominantselection)。才示記基因如上所述。如果本發(fā)明的質(zhì)粒不具有標記基因，能夠?qū)⒁环N標記基因通過常規(guī)方法例如同源重組插入其中。在下文中，將舉例說明將抗生素抗性基因插入本發(fā)明的質(zhì)粒。盡管插入位置可以是不影響質(zhì)粒的復制和穩(wěn)定性的任何位置，具體而言，能夠使用鄰近3-羥基丁酮/丁二醇(acetoin/butanediol)生物合成基因6wd操縱子的區(qū)域。首先，可使用公知的重疊延伸PCR方法擴增和克隆突變的Zmd基因。這種方法使用來自供體菌林的染色體DNA作為模板，以及含有突變并且與目標區(qū)i或互補的PCR引物(Urban，A.,Neukirchen,S.andJaeger，K.E.,Arapidandefficientmethodforsite-directedmutagenesisusingone-stepoverlapextensionPCR，NucleicAcidsRes"25，2227-8,1997)。將克隆的突變型操縱子并入pUT399(pUT-Abud),并且用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有X-p>的S17-Upir菌抹(可從Biomedal獲得，參考R.Simon.,etal.,BIO/TECHNOLOGY,NOVEMBER1983,784-791(1983))。pUT399具有R6K復制起點、氯霉素抗性基因和mo6區(qū)域，該mo6區(qū)域是接合轉(zhuǎn)移所必需的。pUT399質(zhì)粒不能在不具有^V基因的菌抹中復制。接合轉(zhuǎn)移在所得菌抹和供體菌株之間進行，所得的菌4朱具有并入供體菌^^朱中的pEA320的質(zhì)粒(pUT-Abud)。在下文中，將舉例說明使用上述輔助質(zhì)粒和抗生素抗性基因的接合轉(zhuǎn)移。通過將四環(huán)素抗性基因插入質(zhì)粒pRK2013中的Tn5之內(nèi)獲得含有Tn5::Tet基因的pRK-Tet質(zhì)粒。質(zhì)粒pRK2013具有fra基因，其是接合轉(zhuǎn)移所必需的。這些方法使用Epicentre的TransposomicsTM&EZ::TNTM完成。進行pRK-Tet至供體菌林的接合轉(zhuǎn)移。將pRK-Tet從已用pRK-Tet轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌抹轉(zhuǎn)移至供體菌抹。隨后，將這種含有pRK-Tet的供體菌抹和腸桿菌科細菌(受體菌抹)接合，并且能夠基于氯霉素抗性進行選擇以獲得具有本發(fā)明的質(zhì)粒的受體菌抹。<2〉利用本發(fā)明質(zhì)粒的方法(2-l)作為載體使用當將目標基因插入本發(fā)明的質(zhì)粒的任何位置，并且用所得的重組質(zhì)粒以常規(guī)方式轉(zhuǎn)化宿主微生物時，在宿主微生物中表達目標基因是可能的。此外，可插入在另外的宿主中復制所必需的區(qū)域以制備穿梭載體(shuttlevector)。宿主微生物可以是任何微生物，只要其屬于腸桿菌科細菌，并且能夠產(chǎn)生有用的物質(zhì)。有用的物質(zhì)無具體的限制，只要其能夠由微生物產(chǎn)生。實例包括，例如，蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、維生素、糖、有機酸、脂質(zhì)等。此外，目標基因優(yōu)選與上述有用的物質(zhì)相關，并且包括，例如，編碼有用的物質(zhì)例如蛋白質(zhì)的基因，涉及氨基酸、核酸、維生素、糖、有機酸、脂質(zhì)等的生物合成系統(tǒng)的基因。L-氨基酸的實例包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-曱硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸，并且因此宿主微生物的例子包括產(chǎn)生L-氨基酸的腸桿菌科細菌，例如大腸桿菌和a"a"a^(歐洲專利PublicationNo.1078989A、美國專利No.6,331,419)。例如，產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌包括以下微生物尸a"f固a"畫feAJ13601(FE固BP-7207)植生克雷伯氏菌AJ13410(FERMBP-6617)尸awtoea畫"函AJ13355(FERMBP-6614)草生歐文氏菌IAM1595/RSFCPG(參考美國專利No.6,197,559)植生克雷伯氏菌AJ13399/RSFCPG(參考美國專利No.6,197,559)液化沙雷氏菌ATCC14460/RSFCPG(參考美國專利No.6,331,419)大腸桿菌AJ12628(日本專利申請發(fā)明者原吉彥,泉井裕,野口博美申請人:味之素株式會社