專利名稱：：用于在真菌細(xì)胞中表達(dá)基因的曲霉啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及DNA序列(特別是經(jīng)分離的啟動(dòng)子)和DNA構(gòu)建體、載體和包含與編碼序列可操作連接的這些啟動(dòng)子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于表達(dá)基因和/或制造生物學(xué)化合物的方法。
背景技術(shù)：
：在宿主細(xì)胞中對(duì)重組生物學(xué)化合物的生產(chǎn)通常通過構(gòu)建表達(dá)盒完成，在所述表達(dá)盒中，編碼生物學(xué)化合物的DNA和適用于宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子可操作地連接。表達(dá)盒可通過質(zhì)粒介導(dǎo)或載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化引入宿主細(xì)胞。然后可通過在下述誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞完成對(duì)生物學(xué)化合物的制造，所述誘導(dǎo)條件是表達(dá)盒中所含啟動(dòng)子適當(dāng)發(fā)揮功能所必需的。對(duì)于每種宿主細(xì)胞而言，通過轉(zhuǎn)化被引入宿主細(xì)胞的編碼序列的表達(dá)和對(duì)由該編碼序列編碼的重組生物學(xué)化合物的制造需要功能啟動(dòng)子的可用性。已知能在多種宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的大量啟動(dòng)子。真菌宿主細(xì)胞中存在啟動(dòng)子跨物禾中(cross-species)使用的實(shí)例是Ay;erg/〃MmWw/ww啟動(dòng)子(X.m'(iw/a似gpdA基因已知在^ype/^g/〃1^(Am'ger)中發(fā)揮作用(JBiotechnol.1991Jan;17(1):19-33.IntracellularandextracellularproductionofproteinsinJ5perg/〃twunderthecontrolofexpressionsignalsofthehighlyexpressedAw/tMcmsgpdAgene.PuntPJ,ZegersND,BusscherM,PouwelsPH,vandenHondelCA.)。另一實(shí)例為用在」.m'ger和Am'c/w/aw中的AP-木糖苷酶xlnD啟動(dòng)子，TranscriptionalregulationofthexylanolyticenzymesystemofAspergillus,vanPeij，NNME，PhD-thesisLandbouwuniversiteitWageningen，theNetherlands,ISBN90-5808-154-0禾口Eyc/^n.c/n^co/z'P-葡糖醛酸糖苷酶基因在Aw'ger、AmWw/a朋和C/flAwpohwm/w/vwm中的表達(dá)，如CurrGenet.1989Mar;15(3):177-80:4RobertsIN,OliverRP,PuntPJ,vandenHondelCA."ExpressionoftheEscherichiacolibeta-glucuronidasegeneinindustrialandphytopathogenicfilamentousfungi"所述。然而，仍然需要經(jīng)改進(jìn)的啟動(dòng)子，用于控制引入的基因的表達(dá)、用于控制內(nèi)源基因的表達(dá)水平、用于控制對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的調(diào)節(jié)或用于介導(dǎo)內(nèi)源基因的失活，或用于制造多肽，或用于前述應(yīng)用的組合。這些經(jīng)改進(jìn)的啟動(dòng)子可例如比先前己知的啟動(dòng)子更強(qiáng)。它們還可被特定的便利的底物或化合物誘導(dǎo)。當(dāng)期望在單種宿主細(xì)胞中同時(shí)過量表達(dá)多種基因時(shí)，知道若干功能性啟動(dòng)子也是有利的。為了防止噪音抑制(squelching)(特定專利因子的效價(jià)(titration))，優(yōu)選使用多種不同的啟動(dòng)子，每個(gè)待表達(dá)的基因一個(gè)特定的啟動(dòng)子。圖l描述了pGBTOPGLA的質(zhì)粒圖譜，其為整合型葡萄糖淀粉酶表達(dá)載體。圖2描述了pGBTOPGLA-2的質(zhì)粒圖譜，其為帶有多克隆位點(diǎn)的整合型葡萄糖淀粉酶表達(dá)載體。圖3描述了pGBTOPGLA-6的質(zhì)粒圖譜，其為含有與葡萄糖淀粉酶編碼序列可操作連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的整合型表達(dá)載體。該圖還闡釋了在這些實(shí)施例中構(gòu)建的其它五個(gè)pGBTOPGLA載體的結(jié)構(gòu)，其為pGBTOPGLA-8、pGBTOPGLA-11、pGBTOPGLA-12、pGBTOPGLA-13或pGBTOPGLA-14。圖4描述了通過單同源重組整合的圖示。圖5:WT1、WT2和不同pGBTOPGLA載體的轉(zhuǎn)化體的葡萄糖淀粉酶活性。顯示標(biāo)準(zhǔn)化的活性，其中WT1第3天的活性設(shè)為100%。圖6描述了pGBDEL-PGGLAA的質(zhì)粒圖譜，其為置換型載體。圖7描述了啟動(dòng)子置換的圖示。圖8描述了通過同源重組的整合的圖示。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了啟動(dòng)子DNA序列，例如(a)以下列表示出的DNA序列SEQIDNO:l、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6，(b)能夠與(a)的DNA序列雜交的DNA序列，(c)與(a)的DNA序列至少50X同源的DNA序列，(d)(a)到(c)的任何DNA序列的變體，或(e)(a)到(d)的任何DNA序列的亞序列。在本發(fā)明上下文中，啟動(dòng)子DNA序列為下述DNA序列，所述DNA序列與編碼序列可操作連接時(shí)能夠調(diào)控所述編碼序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"可操作連接"在本文定義為一種構(gòu)型，在其中啟動(dòng)子DNA序列適當(dāng)?shù)刂糜谂c編碼序列相關(guān)的位置，使得啟動(dòng)子DNA序列指導(dǎo)對(duì)由所述編碼序列編碼的產(chǎn)物的制造。術(shù)語(yǔ)"編碼序列"在本文定義為轉(zhuǎn)錄為mRNA的核酸序列，所述RNA置于適當(dāng)調(diào)控序列調(diào)控下時(shí)被翻譯為多肽。編碼序列的邊界通常由ATG起始密碼子(其通常為mRNA5'端的開放讀碼框的起點(diǎn))和位于mRNA3'端開放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列確定。編碼序列可包括但不僅限于基因組DNA、cDNA、半合成的、合成的和重組的核酸序列。更特別地，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"在本文中定義為下述DNA序列，所述DNA序列與RNA聚合酶結(jié)合，并指導(dǎo)所述聚合酶至編碼多肽的編碼序列下游正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以起始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶能有效催化與編碼區(qū)適當(dāng)DNA鏈互補(bǔ)的信使RNA的裝配。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"還應(yīng)被理解為包括用于轉(zhuǎn)錄為mRNA后翻譯的5'非編碼區(qū)(在啟動(dòng)子和翻譯起點(diǎn)之間)、順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如增強(qiáng)子)和能夠與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的其它核苷酸序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列為示于以下列表中的DNA序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列為能夠與示于以下列表中的DNA序列雜交，并仍然保持啟動(dòng)子活性的DNA序列SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6。在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選通過測(cè)量編碼序列表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)濃度來(lái)確定啟動(dòng)子活性，所述編碼序列與所述啟動(dòng)子可操作地連接?；蛘咄ㄟ^測(cè)量由編碼序列編碼的蛋白質(zhì)的酶活性來(lái)確定啟動(dòng)子的活性，所述編碼序列與所述啟動(dòng)子可操作地連接。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方案，通過測(cè)量lacZ報(bào)告基因編碼序列的表達(dá)來(lái)確定啟動(dòng)子活性(及其強(qiáng)度)(InLuo(Gene163(1995)127-131)。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，通過使用綠色熒光蛋白作為編碼序列確定啟動(dòng)子的活性(InMicrobiology.1999Mar;145(Pt3):729-34.SanterreHenriksenAL,EvenS,MullerC，PuntPJ，vandenHondelCA,NielsenJ.Study)。另外，可通過測(cè)量在啟動(dòng)子調(diào)控下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的mRNA水平確定啟動(dòng)子活性。MRNA水平可例如通過Northern印跡來(lái)測(cè)量(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,N.Y.)。所述所有用于確定啟動(dòng)子活性的測(cè)定法中，可將啟動(dòng)子活性與另一啟動(dòng)子活性相比較，這例如通過將相同的報(bào)告基因或編碼序列置于不同啟動(dòng)子調(diào)控下并在相同條件下測(cè)量啟動(dòng)子活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明包括(經(jīng)分離的)在下述條件下與下述核酸探針雜交的啟動(dòng)子DNA序列，所述條件為非常低嚴(yán)格度條件，優(yōu)選低嚴(yán)格度條件，更優(yōu)選中嚴(yán)格度條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)格度條件，進(jìn)一步更優(yōu)選高嚴(yán)格度條件，并最優(yōu)選非常高嚴(yán)格度條件；所述核酸探針對(duì)應(yīng)于a:SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的核苷酸l到2000，優(yōu)選核苷酸100到1990，更優(yōu)選200到1980，進(jìn)一步更優(yōu)選300到1970，進(jìn)一步更優(yōu)選350到1950和最優(yōu)選360到1900，或b:SEQIDNO:3的核苷酸1到1490，優(yōu)選100到1480，更優(yōu)選200到1470，進(jìn)一步更優(yōu)選300到1460，進(jìn)一步更優(yōu)選350到1440和最優(yōu)選360到1400，或c:SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的核苷酸1到1997，優(yōu)選核苷酸100到1987，更優(yōu)選200到1977，進(jìn)一步更優(yōu)選300到1967，進(jìn)一步更優(yōu)選350到1950和最優(yōu)選360到1900，或d:SEQIDN0:6的核苷酸1到937，優(yōu)選50到927，更優(yōu)選100到917，進(jìn)一步更優(yōu)選150到907，進(jìn)一步更優(yōu)選200到887和最優(yōu)選250到867，或e:(a)、(b)、(c)或(d)的亞序列，或f:(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的互補(bǔ)鏈。術(shù)語(yǔ)互補(bǔ)鏈為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并描述于J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,N.Y中。SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的亞序列可以為至少100個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸和最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的核酸序列或其亞序列可用于設(shè)計(jì)核酸探針，所述核酸探針用于從不同屬或種的菌株中根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法鑒定和克隆DNA啟動(dòng)子。具體地，這類探針可用于與目的屬或種的基因組或cDNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序雜交，從而鑒定并分離其中相應(yīng)的基因。這類探針可顯著短于整個(gè)序列，但是應(yīng)為至少15個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)并更優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。另外，這類探針可用于通過PCR擴(kuò)增DNA啟動(dòng)子。通過PCR克隆啟動(dòng)子的實(shí)例描述于本文(參閱實(shí)施例1.3)。也可使用更長(zhǎng)的探針?？墒褂肈NA、RNA和肽核酸(PNA)探針。探針被典型地標(biāo)記用于檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如用@32P、@33P@3H、@35S、生物素或抗生素蛋白或熒光標(biāo)記物)。這類探針包括在本發(fā)明中。因此可篩選從這類生物制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)，得到與上述探針雜交并編碼多肽的DNA。來(lái)自這類其它生物的基因組或其它DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)分離。來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移至或固定在硝酸纖維素上或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或其亞序列同源的克隆或DNA，可在Southern印跡中使用載體材料。就本發(fā)明的目的而言，雜交指核酸序列與經(jīng)標(biāo)記的核酸探針在非常低到非常高嚴(yán)格度條件下雜交，所述經(jīng)標(biāo)記的核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6中所示核酸序列、它們的互補(bǔ)鏈或其亞序列。在這些條件下與核酸探針雜交的分子使用例如X射線膠片檢測(cè)。也可使用其它雜交技術(shù)，例如使用熒光用于檢測(cè)和使用玻璃片和/或DNA微陣列作為支持物的技術(shù)。DNA微陣列雜交檢測(cè)的實(shí)例描述于FEMSYeastRes.2003Dec;4(3):259-69(Daran-LapujadeP,DaranJM,KotterP，PetitT，PiperMD,PronkJT."ComparativegenotypingoftheSaccharomycescerevisiaelaboratorystrainsS288CandCEN.PK113-7Dusingoligonucleotidemicroarrays".另夕卜，PNA微陣列用于雜交的用途描述于NucleicAcidsRes.2003Octl;31(19):el19(BrandtO,FeldnerJ,StephanA,SchroderM,SchnolzerM，ArlinghausHF,HoheiselJD，JacobA.PNAmicroarraysforhybridisationofunlabelledDNAsamples.)在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸探針為SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的核酸序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸探針為具有以下的序列a.SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的核苷酸20到1980，更優(yōu)選SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的核苷酸500到1950，進(jìn)一步更優(yōu)選SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的核苷酸800到1920，最優(yōu)選SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的核苷酸900到1900，或b.SEQIDNO:3的核苷酸20到1470，更優(yōu)選SEQIDNO:3的核苷酸500到1440，進(jìn)一步更優(yōu)選SEQIDNO:3的核苷酸700到1430，最優(yōu)選SEQIDNO:3的核苷酸800到1400，或c.SEQIDN0:6的核苷酸20到917，更優(yōu)選SEQIDNO:6的核苷酸200到907，進(jìn)一步更優(yōu)選SEQIDNO:6的核苷酸300到897，并最優(yōu)選SEQIDNO:6的核苷酸400到887。另一優(yōu)選的探針為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前緊挨的DNA序列的部分。對(duì)于至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)探針而言，非常低到非常高嚴(yán)格度條件被定義為依照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，在42"下5倍SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml經(jīng)剪切且變性的鮭精DNA和甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，所述甲酰胺對(duì)于非常低和低嚴(yán)格度而言為25%，對(duì)于中和中-高嚴(yán)格度而言為35%或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格度而言為50%。對(duì)于至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)探針而言，最后用2倍SSC、0.2%SDS，在至少45"C(非常低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選至少5(TC(低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選至少55°C(中嚴(yán)格度)，更優(yōu)選至少60°C(中-高嚴(yán)格度)，進(jìn)一歩更優(yōu)選至少65°C(高嚴(yán)格度)和最優(yōu)選至少70°C(非常高嚴(yán)格度)下對(duì)載體材料洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于約15個(gè)核苷酸到約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短探針而言，嚴(yán)格度條件定義為在比使用BoltonandMcCarthy(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)算法計(jì)算的Tm低5。C到l(TC下，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、1倍Denhardfs溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0.1mMATP禾n0.2mg/ml酵母RNA中依照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌。對(duì)于約15個(gè)核苷酸到約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短探針而言，在6倍SCC加上0.1%SDS中15分鐘對(duì)載體材料洗滌一次，并使用6倍SSC在低于所計(jì)算的Tm5。C到l(TC下洗滌兩次，每次15分鐘。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，首先用SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6克隆與其可操作連接的天然基因、編碼序列或其部分。這可從SEQIDNOl、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或先前定義的其亞序列開始并使用該序列作為探針完成。將所述探針與給定宿主的cDNA或基因組文庫(kù)雜交，所述宿主為^45/erg77/wsw/ger或本申請(qǐng)文本中定義的任何其它宿主。一旦天然基因或其部分被克隆，可隨后使用其自身作為探針，通過本文所述雜交實(shí)驗(yàn)克隆來(lái)自其它真菌的它的同源基因。在本發(fā)明上下文中，同源基因是指與天然基因至少50%同源(同一)的基因。優(yōu)選地，同源基因與天然基因至少55%同源，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少75%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選約90%，進(jìn)一步更優(yōu)選約95%，進(jìn)一步更優(yōu)選約97%，進(jìn)一步更優(yōu)選約98%，進(jìn)一步更優(yōu)選約99%，和最優(yōu)選約99.5%同源。同源基因編碼序列上游的序列為本發(fā)明包含的啟動(dòng)子?；蛘?，與本發(fā)明啟動(dòng)子可操作連接的天然基因、編碼序列或其部分的序列可通過使用SEQIDNOl、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或如前定義的其亞序列，用例如如本文所述的比對(duì)或BLAST算法搜索基因組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定。隨后可使用該經(jīng)鑒定的序列鑒定本申請(qǐng)中定義的任何其它宿主細(xì)胞中的直向同源基因或同源基因。經(jīng)鑒定的直向同源基因或同源基因編碼序列上游的序列為本發(fā)明所包括的啟動(dòng)子。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列為下述(經(jīng)分離的)DNA序列，其與SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6至少50%同源(同一)。優(yōu)選地，所述DNA序列與SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6至少55%同源，更優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少75%，優(yōu)選約80%，更優(yōu)選約90%，進(jìn)一歩更優(yōu)選約95%，進(jìn)一步更優(yōu)選約97%，進(jìn)一步更優(yōu)選約98%，進(jìn)一步更優(yōu)選約99%和最優(yōu)選約99.5%同源。就本發(fā)明目的而言，程度優(yōu)選通過BLAST程序確定兩個(gè)核酸序列之間的同源性(同一性)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(htttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對(duì)的敏感性和速度。BLAST程序使用11的字長(zhǎng)(W)、50的BLOSUM62評(píng)分矩陣(參閱Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))比對(duì)(B)、10的期望值(E)、M=5、N=-4和雙鏈比較作為默認(rèn)值。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為SEQIDNO1、SEQIDN0:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的仍然具有啟動(dòng)子活性的亞序列。亞序列優(yōu)選含有至少約100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少約200個(gè)核苷酸和最優(yōu)選至少約300個(gè)核苷酸。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，亞序列除5，和/或3，端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失外為由SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6所包含的核酸序列，所述DNA序列仍然具有啟動(dòng)子活性。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子亞序列為"經(jīng)修剪的(trimmed)"亞序列(即序列片段)，其在翻譯起始點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游。修剪啟動(dòng)子并對(duì)其功能性分析的實(shí)例描述于Gene.1994Aug5;145(2):179-87:theeffectofmultiplecopiesoftheupstreamregiononexpressionofthej，rg/〃tm'gerglucoamylase-encodinggene.VerdoesJC,PuntPJ,StouthamerAH,vandenHondelCA).在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子DNA序列為SEQIDNOl、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的變體。術(shù)語(yǔ)"變體"或"變體啟動(dòng)子"在本文定義為具有下述核苷酸序列的啟動(dòng)子，所述核苷酸序列包含母體啟動(dòng)子的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失和/或插入，其中所述變體啟動(dòng)子具有大于或小于相應(yīng)母體啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性。術(shù)語(yǔ)"變體啟動(dòng)子"應(yīng)包括天然變體和使用本領(lǐng)域公知方法(例如經(jīng)典誘變、定向誘變和DNA改組(shuffling))體外產(chǎn)生的變體。變體啟動(dòng)子可具有一個(gè)或多個(gè)突變。各突變?yōu)楹塑账岬莫?dú)立取代、缺失和/或插入。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方案，變體啟動(dòng)子為下述啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與最初鑒定的啟動(dòng)子序列(SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6)相比具有至少一個(gè)經(jīng)修飾的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。這類調(diào)節(jié)位點(diǎn)可被整體去除或如上所述特異地突變。修飾這類啟動(dòng)子變體的調(diào)節(jié)使其例如不再被葡萄糖誘導(dǎo)。這類啟動(dòng)子變體和獲得它們的技術(shù)的實(shí)例描述于EP673429或WO94/04673中。所述啟動(dòng)子變體可以是等位變體。等位變體是指占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的基因的任兩種或更多可選擇的形式。等位變體通過突變天然發(fā)生，并可由種群中的多態(tài)性引起。可通過以下步驟獲得變體啟動(dòng)子(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)格度條件下將DNA與(i)SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6，(ii)(i)的亞序列或(iii)(i)、(ii)的互補(bǔ)鏈雜交，和(b)從所述DNA中分離變體啟動(dòng)子。嚴(yán)格度和洗滌條件如本文定義。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以是下述啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的序列可用接頭提供，所述接頭用于引入特異限制性位點(diǎn)的目的，所述限制性位點(diǎn)便于連接啟動(dòng)子序列和編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)。本文提供的序列信息不應(yīng)狹義地解釋為要求包括錯(cuò)誤鑒定的堿基。本文所公開的序列可容易地用于分離最初的DNA序列，優(yōu)選從有絲真菌(特別是^4^erg"/1^m'ger)中分離，并進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析從而鑒定測(cè)序錯(cuò)誤。除非另有說明，所有通過測(cè)序本文DNA分子確定的核苷酸序列使用自動(dòng)DNA測(cè)序儀確定。因此，如本領(lǐng)域已知，對(duì)于通過該自動(dòng)途徑確定的任何DNA序列而言，本文確定的任何核苷酸序列可含有一些錯(cuò)誤。通過自動(dòng)化確定的核苷酸序列通常與經(jīng)測(cè)序DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少約90%相同，更典型地至少約95%相同到至少約99.9%相同。可通過其它手段更為精確地確定實(shí)際序列，包括本領(lǐng)域公知的手工DNA本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定這類被錯(cuò)誤鑒定的堿基，并知道如何改正這類錯(cuò)誤。本發(fā)明包含典型地含有下述突變的功能性啟動(dòng)子等效物，所述突變不改變啟動(dòng)子所涉及的生物學(xué)功能。術(shù)語(yǔ)"功能性等效物"還包括ADNA序列的直向同源物。Am'g^DNA序列的直向同源物為能夠從其它生物、其它真菌物種或菌株中分離，并具有類似或相同生物學(xué)活性的DNA序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可從任何屬的微生物中獲得。就本發(fā)明目的而言，本文與給定來(lái)源結(jié)合使用術(shù)語(yǔ)"得自"是指多肽由該來(lái)源產(chǎn)生，或由來(lái)自該來(lái)源基因的被插入的細(xì)胞產(chǎn)生。啟動(dòng)子序列可得自真菌來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自酵母菌株，例如OmA&、或yarravWaWra〖'打,更優(yōu)選來(lái)自Sacc/zara，c^scaW5^廠ge扁^、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列得自有絲真菌菌株，例如CTz/^^ospon.i/m、T^7/6^xs7(iz'Mm、^Fwsfln.ww、//wmz'co/fl、Mag"fl/oW/e、JMwcor、J/\^yce/Zo//^/7on2、iVeoca〃/mcwrix、7VeMraspo廠fl、Pae"'/cm_ycas、Pew/c/〃z'w附、i^yom少ces1、Sc/n'zo//^〃wm、ra/arow少c&s"、77zermoas"cw51、7Tn'e/(3vz'(2、Jb/j^oc/ac^ww或7Wc/zot/erwaWra/w，更"[尤選《尋自j^perg^/ws乂apom.c船、血，rg7'〃MSm'dw/a朋、y^e，'〃"51m'ger、y45pe廠g7'〃wso，"e、y^/e，'〃MS5咖e、C7z，as"po".t/m/wcA:wcwe朋e、//訓(xùn)!'co/(3/似o/e似、臉wms/wracra5s"、i^m'c/〃z'ww戶廠戸rage，m、JWc/ofiferwa/mrz/fl履m、或ZWc/zocfer柳av/n'cfe菌株。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列得自F船an'"m6a"n'fi^W^、應(yīng)當(dāng)理解對(duì)于上述物種而言，本發(fā)明包括完美和不完美的情況，和其它分類學(xué)等價(jià)物(例如無(wú)性型)，而無(wú)論其被己知的物種名如何。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地識(shí)別合適等價(jià)物的性質(zhì)。公眾可以在大量培養(yǎng)物收集中容易地得到這些物種的菌株，所述培養(yǎng)物收集如美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏單位(ATCC)、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM)、CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)禾卩AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)。此外，可使用上述探針從其它來(lái)源中鑒定或獲得根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，所述其它來(lái)源包括從自然(例如土壤、堆肥、水等)中分離的微生物。用于從天然生境中分離微生物的技術(shù)為本領(lǐng)域公知。然后可類似地篩選另一微生物地基因組DNA文庫(kù)得到核酸序列。一旦用探針檢測(cè)到了編碼啟動(dòng)子的核酸序列，則可通過使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員己知地技術(shù)分離或克隆該序列(參閱例如Sambrooketal.,1989，上文)。在本發(fā)明中，啟動(dòng)子DNA序列還可以是雜交啟動(dòng)子，其包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子的部分；本發(fā)明啟動(dòng)子的部分和另一已知啟動(dòng)子的部分(如一個(gè)啟動(dòng)子的前導(dǎo)序列和來(lái)自另一啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))；或本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的部分和一個(gè)或多個(gè)其它啟動(dòng)子的部分。其它啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何啟動(dòng)子序列，包括變體的、截短的和雜交啟動(dòng)子，并可得自編碼與所述宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。其它啟動(dòng)子序列對(duì)于編碼多肽的核酸序列來(lái)說可以是同源或異源的，并可對(duì)細(xì)胞來(lái)說是同源或異源的。作為優(yōu)選的實(shí)施方案，經(jīng)鑒定的啟動(dòng)子的重要調(diào)節(jié)亞序列可與其它"基本"啟動(dòng)子融合以增強(qiáng)它們的啟動(dòng)子活性(例如描述于MolMicrobiol.1994May;12(3):479-90.Regulationofthexylanase-encodingxlnAgeneofAspergillustubigensis.deGraaffLH,vandenBroeckHC,vanOoijenAJ,VisserJ.)適用于用本發(fā)明啟動(dòng)子構(gòu)建雜交啟動(dòng)子的其它啟動(dòng)子的其它實(shí)例包括得自下述基因的啟動(dòng)子A07加eTAKA淀粉酶、i/n'zwnwcorm/e/^天冬氨酸蛋白酶、A"/ger中性a-淀粉酶、A酸穩(wěn)定a-淀粉酶、Amger或fl而mo"'葡萄糖淀粉酶(glaA)、m.，gpdA、j.m'ger葡萄糖氧化酶goxC、施z謹(jǐn)腳rmZe/^'月旨酶、j.，薦堿性蛋白酶、A07認(rèn)磷酸丙糖異構(gòu)酶、AmV/w/ara乙酰胺酶和F^fln't/mox，pomm胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自Am'ger中性a-淀粉酶基因的啟動(dòng)子和Ao^yzae磷酸丙糖異構(gòu)酶的雜種)、SaccAaraw^c^cereWWflei:希醇化酶(ENO-l)、Sacc/zaromj/cacerev/w'ae半乳糖激酶(GAL1)、Sacc/(3ra"y;ce5C￡/^v/'"e醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶(ADH2/GAP)和Sacc/wrawyc^ce"v/5/ae3-磷酸甘油酸酯激酶，及其突變體、截短的啟動(dòng)子和雜交啟動(dòng)子。適用于酵母宿主細(xì)胞的其它啟動(dòng)子由Romanosetal.,1992，Yeast8:423-488描述。在本發(fā)明中，啟動(dòng)子DNA序列還可以是"串聯(lián)啟動(dòng)子"。"串聯(lián)啟動(dòng)子"在本文中被定義為兩個(gè)或更多啟動(dòng)子序列，其各與編碼序列可操作連接并介導(dǎo)編碼序列到mRNA的轉(zhuǎn)錄。串聯(lián)啟動(dòng)子包含兩個(gè)或更多本發(fā)明的啟動(dòng)子，或者一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子和一個(gè)或多個(gè)其它己知啟動(dòng)子，如上舉例適用于構(gòu)建雜交啟動(dòng)子的那些。串聯(lián)啟動(dòng)子的兩個(gè)或更多啟動(dòng)子序列可同時(shí)啟動(dòng)核酸序列的轉(zhuǎn)錄?；蛘叽?lián)啟動(dòng)子的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子序列可在細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段或菌絲體形態(tài)學(xué)上不同的部分啟動(dòng)核酸序列的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中，啟動(dòng)子對(duì)編碼生物學(xué)化合物的編碼序列來(lái)說可以是外源的，和/或啟動(dòng)子對(duì)宿主細(xì)胞來(lái)說可以是外源的。本發(fā)明的變體、雜交或串聯(lián)啟動(dòng)子應(yīng)理解為對(duì)編碼序列來(lái)說是外源的，即使野生型啟動(dòng)子對(duì)編碼序列或?qū)λ拗骷?xì)胞是天然的。本發(fā)明的變體、雜交或串聯(lián)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性為至少具有SEQIDNOl、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的啟動(dòng)子的約20%，優(yōu)選至少約40%，更優(yōu)選至少約60%，更優(yōu)選至少約80%，更優(yōu)選至少約90%，更優(yōu)選至少約100%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少約200%,最優(yōu)選至少約300%,和進(jìn)一步最優(yōu)選至少約400。啟動(dòng)子活性優(yōu)選如說明書中先前所述來(lái)確定。本發(fā)明還涉及下述DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含一個(gè)("一個(gè)"在本文中定義為"至少一個(gè)")如上所述的啟動(dòng)子DNA序列和與所述啟動(dòng)子DNA序列可操作連接的編碼序列，從而所述編碼序列可以在所述啟動(dòng)子DNA序列的調(diào)控下表達(dá)。這可在任何合適的宿主細(xì)胞中檢測(cè)。或者，這可在合適的體外表達(dá)和/或翻譯體系中檢測(cè)。編碼序列可從任何原核的、真核的或其它來(lái)源中獲得?；蛘呔幋a序列可以是合成的或部分合成的序列。合成基因的密碼子選擇已經(jīng)被最優(yōu)化來(lái)匹配宿主細(xì)胞物種的密碼子選擇，從而促進(jìn)所編碼的生物學(xué)物質(zhì)的表達(dá)和/或分泌。優(yōu)化密碼子選擇的實(shí)例描述于WO97/11086，其中植物多肽的密碼子選擇被優(yōu)化為在絲狀真菌細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，編碼序列編碼生物學(xué)化合物?；蛘呔幋a序列可編碼反義RNA和/或RNAi(RNA干擾)構(gòu)建體的表達(dá)。反義RNA表達(dá)的實(shí)例顯示于ApplEnvironMicrobiol.2000Feb;66(2):775-82.(Characterizationofafoldase,proteindisulfideisomeraseA,intheproteinsecretorypathwayofAspergillusniger.NgiamC,JeenesDJ,PuntPJ，VanDenHonddCA,ArcherDB)或(ZrennerR,WillmitzerL,SonnewaldU.Analysisoftheexpressionofpotatouridinediphosphate-glucosepyrophosphorylaseanditsinhibitionbyantisenseRNA.Planta.(1993);190(2):247-52.)?；虮磉_(dá)的完全失活適用于滅活例如調(diào)控不期望的代謝途徑分支的基因，例如從而提高特定次級(jí)代謝產(chǎn)物如(e-內(nèi)酰胺)抗生素或類胡蘿卜素的產(chǎn)生。完全失活也適用于減少毒素或不期望的化合物的產(chǎn)生(青霉菌中黃青霉素；曲霉中黃曲霉毒素MacDonaldKDetal,:heterokaryonstudiesandthegeneticcontrolofpenicillinandchrysogeninproductioninPenicilliumchrysogenum.JGenMicrobiol.(1963)33:375-83)。完全失活還適用于以改進(jìn)發(fā)酵過程和下游加工的方式改變生物的形態(tài)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及對(duì)宿主細(xì)胞廣泛的代謝程序重排或工程改造。引入全新的途徑和/或修飾不想要的途徑會(huì)提供特別適用于產(chǎn)生特定生物學(xué)化合物(如蛋白質(zhì)或代謝物)的細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)編碼序列編碼多肽時(shí)，所述多肽還可包括融合的或雜交的多肽，其中另一多肽與所述多肽或其片段的N-末端或C-末端融合。融合的多肽通過將編碼一個(gè)多肽的核酸序列(或其部分)與編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)融合制造。用于制造融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域已知，其包括連接編碼多肽的編碼序列，使得其符合讀碼框并且使得融合多肽的表達(dá)位于相同的啟動(dòng)子和終止子調(diào)控下。雜交多肽可包含得自至少兩個(gè)不同多肽的多肽序列的部分或全部的組合，其中一個(gè)或多個(gè)可以與真菌細(xì)胞異源。除啟動(dòng)子DNA序列外，DNA構(gòu)建體可包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列在合適宿主細(xì)胞中與調(diào)控序列一致的條件下表達(dá)。表達(dá)應(yīng)理解為包括多肽產(chǎn)生中涉及的任何歩驟，其包括但不僅限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可以對(duì)編碼序列或宿主是內(nèi)源的?；蛘咭粋€(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可以用一個(gè)或多個(gè)對(duì)核酸序列外源的調(diào)控序列代替，用于該善編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。"DNA構(gòu)建體"在本文中被定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或其經(jīng)修飾而含有以天然不存在的方式組合和并置的核酸片段。當(dāng)DNA構(gòu)建體含有編碼序列和編碼序列表達(dá)所需的全部調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)"DNA構(gòu)建體"與術(shù)語(yǔ)"表達(dá)盒"同義。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"在本文中被定義為包括編碼序列表達(dá)必需或有利的所有成分，包括本發(fā)明的啟動(dòng)子。各調(diào)控序列可以對(duì)編碼多肽的核酸序列是內(nèi)源的或外源的。這類調(diào)控序列包括但不僅限于前導(dǎo)序列、翻譯起始序列(如Kozak,1991，J.Biol.Chem.266:19867-19870中所述)、翻譯起始子編碼序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、上游激活序列、本發(fā)明的啟動(dòng)子(包括來(lái)自它的變體、片段和雜交和串聯(lián)啟動(dòng)子)、轉(zhuǎn)錄終止子和翻譯終止子。調(diào)控序列最少包括轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)和本發(fā)明啟動(dòng)子(部分)。調(diào)控序列可以與用于引入特異限制性位點(diǎn)目的的接頭一起提供，所述限制性位點(diǎn)便于連接調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)。調(diào)控序列可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即被宿主細(xì)胞識(shí)別終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的編碼序列3'末端可操作連接。任何在所選宿主細(xì)胞中有功能的終止子可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子得自Ao^yzaeTAKA淀粉酶、Am'gw葡萄糖淀粉酶、Am'^/^w鄰氨基苯甲酸合酶、Am'gera-葡萄糖苷酶、trpC基因和Fi^ahwwax，;wram胰蛋白酶樣蛋白酶基因。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子得自以下基因Sflcc/^romFMcerev/Wae火希醇化酶、Sacc/zflraw少cescerev&ae細(xì)胞色素C(CYCl)禾口Sacc/wram;;ce5cewv^ae甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶。其它用于酵母宿主細(xì)胞的有用終止子由Romanosetal，1992,上文描述。調(diào)控序列還可為合適的前導(dǎo)序列，即mRNA的5'非翻譯區(qū)，其對(duì)宿主細(xì)胞翻譯是重要的。前導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列5'末端可操作地連接。任何在所選宿主細(xì)胞中有功能的前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列得自Aoo;zaeTAKA淀粉酶、J.m't/w/a"s磷酸丙糖異構(gòu)酶和Am'gerglaA基因。用于酵母宿主細(xì)胞的合適前導(dǎo)序列來(lái)自Sacc/wramj;c"cerev&'ae烯醇化酶(ENO-1)、Sacc/mrom少c"cewv/j/ae3-磷酸甘油酸酉旨激酶、Sacc/arom少cescerev&ae"-因子禾口》Sacc/zaram_ycascerev^7'ae酉享脫氧酉每/甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(ADH2/GAP)基因。調(diào)控序列還可以是聚腺苷酸化序列，所述序列與核酸序列3'末端可操作連接并且經(jīng)轉(zhuǎn)錄后被宿主細(xì)胞識(shí)別為向經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號(hào)。在所選宿主細(xì)胞中有作用的任何多腺苷酸化序列可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的聚腺苷酸化序列得自Aor_yzaeTAKA淀粉酶、Am'g^葡萄糖淀粉酶、A"W"/aw鄰氨基苯甲酸合酶、Fw鵬'薩胰蛋白酶樣蛋白酶和Am^z/a朋a-葡萄糖苷酶。用于酵母宿主細(xì)胞的有用聚腺苷酸化序列由GuoandSherman,1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽氨基端連接的氨基酸序列并指導(dǎo)被編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核酸序列編碼序列的5'端可固有地含有信號(hào)肽編碼區(qū)，所述信號(hào)肽編碼區(qū)與編碼被分泌的多肽的編碼區(qū)區(qū)段按翻譯讀碼框天然連接?；蛘呔幋a序列的5'端可含有對(duì)編碼序列是外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列天然不含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，需要外源信號(hào)肽編碼區(qū)。或者外源信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替換內(nèi)源信號(hào)肽編碼區(qū)，從而增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)為得自AoryzaeTAKA淀粉酶、Am'ger中性淀粉酶、A力cmwz植酸酶、Am'gw葡萄糖淀粉酶、A木聚糖內(nèi)切酶、7/n'zomwcorm/e/^'天冬氨酸蛋白酶、//wm/co/a/似o/e朋#7^隹素酶和//wwz'co/a/a麗g/"wa脂酶基因的信號(hào)肽編碼區(qū)。用于酵母宿主細(xì)胞的有用信號(hào)肽得自Sflcc/wram少c"cmv&aea-因子和Sacc/wramycMcwev&'ae轉(zhuǎn)化酶基因。其它有用的信號(hào)肽編碼區(qū)描述于Romanosetal.,1992,上文。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列。得到的肽稱為原酶或前多肽(或一些情況下為酶原)。前多肽通常是無(wú)活性的，并可通過將前肽從前多肽上催化或自身催化切除轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可得自Ba"7/w5^Mfc堿性蛋白酶(aprE)、^"7/w5^Zrifo中性蛋白酉每(nprT)、SaccAara附少cescerev^s7'aea-因子、i/n'zomi/corm/e/^天冬氨酸蛋白酶、iKycWop/^oraAewzo;/^7a漆酶(WO95/33836)和Am'gw木聚糖內(nèi)切酶(endol)基因。當(dāng)信號(hào)肽和前肽區(qū)均出現(xiàn)在多肽氨基端時(shí)，前肽區(qū)處在與多肽的氨基端相鄰的位置，而信號(hào)肽處在與前肽區(qū)氨基端相鄰的位置。還可期望添加調(diào)節(jié)序列，其允許多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)。調(diào)節(jié)體系的實(shí)例為響應(yīng)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)引起基因的表達(dá)被打開或關(guān)閉。原核體系中的調(diào)節(jié)體系包括lac和trp操縱子體系。在酵母中可使用ADH2體系或GAL1體系。在絲狀真菌中，可使用如US5,503,991中所述的TAKAa-淀粉酶啟動(dòng)子、Am'gw葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子、Aoo;zae葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子、Aft^'"ge"i木聚糖內(nèi)切酶(x/nA)啟動(dòng)子、vl硝酸鹽還原酶(niaD)啟動(dòng)子、7WcAocfermflre"e/纖維二糖水解酶啟動(dòng)子和A醇和醛脫氫酶(分別為alcA和aldA)作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例為允許基因擴(kuò)增的調(diào)節(jié)序列。在真核體系中，這些調(diào)節(jié)序列包括二氫葉酸還原酶基因(其在存在甲氨喋呤時(shí)被擴(kuò)增)和金屬硫蛋白基因(其在有重金屬時(shí)被擴(kuò)增)。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列應(yīng)與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。去除creA結(jié)合位點(diǎn)(如早先在EP673429中所述的碳分解代謝物阻遏)改變/^cC和""A(用于pH和氮調(diào)節(jié))是重要的。優(yōu)選地，DNA構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列、與所述啟動(dòng)子DNA序列可操作連接的編碼序列和翻譯調(diào)控序列，如-選自以下序列列表的依照5'到3'方向的翻譯終止序列TAAG、TAGA禾口TAAA，{尤選TAAA，禾口/或-選自以下序列列表的依照5'到3'方向的翻譯起始編碼序列GCTACCCCC;GCTACCTCC;GCTACCCTC;GCTACCTTC;GCTCCCCCC;GCTCCCTCC;GCTCCCCTC;GCTCCCTTC;GCTGCCCCC;GCTGCCTCC;GCTGCCCTC;GCTGCCTTC;GCTTCCCCC;GCTTCCTCC;GCTTCCCTC;和GCTTCCTTC，優(yōu)選GCTTCCTTC，禾口/或-選自以下序列列表的翻譯起始序列5'-mwChkyCAAA-3'、5'-mwChkyCACA-3'或5'-mwChkyCAAG-3'，其中采用針對(duì)核苷酸的不確定編碼m(A/C);w(A/T);y(C/T);k(G/T);h(A/C/T)，優(yōu)選5'-CACCGTCAAA-3'或5'-CGCAGTCAAG層3'。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)"翻譯起始編碼序列"被定義為DNA編碼序列開放讀碼框的起始子或起始密碼子緊鄰上游的九個(gè)核苷酸。起始子或起始密碼子編碼AA甲硫氨酸。起始密碼子典型為ATG，但是也可以是任何功能性起始密碼子如GTG。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)"翻譯終止序列"被定義為從開放讀碼框或核苷酸編碼序列3，端翻譯終止密碼子開始的，并依照5，到3'方向的三個(gè)或四個(gè)核苷酸。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)"翻譯起始序列"被定義為編碼多肽的DNA序列開放讀碼框起始子或起始密碼子緊鄰下游的十個(gè)核苷酸。起始子或起始密碼子編碼甲硫氨酸這種氨基酸。起始密碼子典型為ATG，但是也可以是任何功能性起始密碼子，如GTG。本領(lǐng)域公知在RNA中尿嘧啶U代替脫氧核苷酸胸腺嘧啶T。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明啟動(dòng)子、編碼多肽的編碼序列和轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。上述多種編碼和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起，產(chǎn)生下述重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制性位點(diǎn)，所述限制性位點(diǎn)允許在這類位點(diǎn)處插入或取代啟動(dòng)子和/或編碼多肽的編碼序列?；蛘呖赏ㄟ^例如Gene.1989Apr15;77(1):51-9.HoSN，HuntHD,HortonRM,PullenJK，PeaseLR"Site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction")中所述的使用PCR的序列重疊延伸(SOE-PCR),或通過使用GatewayTM克隆體系(Invitrogen)克隆完成編碼序列和啟動(dòng)子的融合?；蛘呖赏ㄟ^將編碼序列或包含啟動(dòng)子和/或編碼序列的DNA構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體來(lái)表達(dá)編碼序列。創(chuàng)建表達(dá)載體時(shí)，編碼序列以下述方式位于載體中編碼序列與本發(fā)明啟動(dòng)子和一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作連接。重組表達(dá)載體可以是下述任何載體(例如質(zhì)?；虿《?，所述載體可便利地進(jìn)行重組DNA操作并可完成編碼序列的表達(dá)。對(duì)載體的選擇典型地會(huì)取決于載體與其被引入的宿主細(xì)胞間的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體(即作為染色體外實(shí)體存在時(shí)其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制)例如質(zhì)粒、染色體外因子、微型染色體或人工染色體。對(duì)自主復(fù)制而言，載體可以包含允許載體在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)實(shí)例為2微米復(fù)制起點(diǎn)、ARSl、ARS4、ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。復(fù)制起點(diǎn)可以是具有下述突變的復(fù)制起點(diǎn)，所述突變使宿主細(xì)胞中復(fù)制起點(diǎn)的功能對(duì)于》顯度每夂感(參閱例如Ehrlich,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1433)。絲狀真菌中自主修復(fù)克隆載體的實(shí)例為包含AMA1序列的克隆載體。AMA1為分離自AwV/w/a似的6.0-kb基因組22DNA頻段，其能夠在^s^rg纟〃w中自主修復(fù)(參閱例如AleksenkoandClutterbuck(1997),FungalGenet,Biol.21:373-397)?；蛘咻d體可以是引入宿主細(xì)胞時(shí)被整合進(jìn)基因組，并與其被整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制的載體。另外，可以使用包含要引入宿主細(xì)胞基因組中全部DNA或轉(zhuǎn)座子的單個(gè)載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多的載體或質(zhì)粒。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記，所述可選擇標(biāo)記允許容易地選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。宿主可以用至少兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)化，其中一個(gè)包含可選擇標(biāo)記。可選擇標(biāo)記是下述基因，所述基因的產(chǎn)物提抗微生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、針對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原營(yíng)養(yǎng)等。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記包括但不僅限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清苷-51-磷酸鹽脫羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)及其等效物。也可使用提供針對(duì)例如腐草霉素、潮霉素B或G418抗性的標(biāo)記。優(yōu)選用于爿^erg/〃ws細(xì)胞的為AmV/wAms或A0/7z"e的amdS禾口pyrG基因禾口5V/^tom少ces1/^groscoy^ci^的bar基因。amdS牛示記基因"[尤選應(yīng)用EP635574或WO97/0626中所述技術(shù)使用。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因?yàn)榕cAm'^/a朋gpdA啟動(dòng)子融合的Am'^/a朋編碼序列(EP635574)。也可使用來(lái)自其它絲狀真菌的amdS基因(WO97/06261)。就整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組而言，載體可依賴于啟動(dòng)子序列和/或編碼多肽的編碼序列或載體的任何其它元件，用于通過同源重組或非同源重組將載體穩(wěn)定整合進(jìn)基因組。或者載體可含有用于指導(dǎo)通過同源重組整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的額外的核酸序列。所述額外的核酸序列使得載體能夠在染色體中預(yù)先確定的靶位點(diǎn)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組。為了提高精確位點(diǎn)整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，例如30到1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選100到1,500個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選400到1,500個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選800到1,500個(gè)堿基對(duì)并最優(yōu)選至少2kb，所述核酸與相應(yīng)的靶序列高度同源，以提高同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。為了促進(jìn)靶向的整合，克隆載體優(yōu)選在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞之前線性化。線性化優(yōu)選以下述方式進(jìn)行克隆載體的至少一端(但是優(yōu)選兩端)側(cè)翼為與革E位點(diǎn)同源的序列。優(yōu)選地，克隆載體中與耙位點(diǎn)同源的整合元件來(lái)自高度表達(dá)的基因座，即它們來(lái)自能夠在真菌宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)的基因。能夠有高表達(dá)水平的基因(即高表達(dá)的基因)在本文中定義為下述基因，所述基因的mRNA可占據(jù)總細(xì)胞mRNA的至少0.5。Z(w/w)(例如在經(jīng)誘導(dǎo)的條件下)，或可選地，所述基因的基因產(chǎn)物可占據(jù)總細(xì)胞蛋白質(zhì)的至少1%(w/w)，或在經(jīng)分泌的基因產(chǎn)物情況下，所述基因的基因產(chǎn)物可分泌至至少0.1g/l的水平(如EP357127Bl中所述)。大量?jī)?yōu)選的高表達(dá)真菌基因以實(shí)例的方式給出淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、醇脫氫酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脫氫酶或來(lái)自A^，7/Z或7Hc/w&，"的纖維二糖水解酶基因。用于這些目的的最優(yōu)選的高表達(dá)基因?yàn)槠咸烟堑矸勖富?，?yōu)選Am'gw葡萄糖淀粉酶基因、Awj加eTAKA-淀粉酶基因、Aw^w/fl朋gpdA基因、SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6基因座、SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的Am^er基因座或rn'c/zofifermaread纖維二糖水解酶基因。另一方面，載體可以通過非同源重組整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組?？蓪⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的編碼生物學(xué)化合物的核酸序列插入宿主細(xì)胞中，以促進(jìn)基因產(chǎn)物的制造。這可通過優(yōu)選將數(shù)拷貝DNA序列整合進(jìn)其基因組中，更優(yōu)選通過將DNA序列的整合靶向高表達(dá)基因座(優(yōu)選葡萄糖淀粉酶基因座或SEQIDNO1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的基因座)中完成。或者這可通過在核酸序列中包含可擴(kuò)增的可選擇標(biāo)記基因，使細(xì)胞含有經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的可選擇標(biāo)記基因，并從而可通過例如在存在適當(dāng)可選擇劑時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞用于選擇額外拷貝的核酸序列。為了進(jìn)一步提高要過表達(dá)的DNA序列的拷貝數(shù)，可使用如W098/46772中所述的基因轉(zhuǎn)換技術(shù)。核酸構(gòu)建體通過同源重組進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的靶向整合(即在預(yù)先確定的耙位點(diǎn)整合)的效率優(yōu)選通過宿主細(xì)胞增強(qiáng)的同源重組能力提高。細(xì)胞的這類現(xiàn)象優(yōu)選涉及如W02005/095624中所述的缺陷的M/A或M/B基因。WO2005/095624公開了獲得包含經(jīng)提高的靶向整合效率的絲狀真菌細(xì)胞的優(yōu)選方法。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(參閱例如Sambrooketal.,1989,上文)。本發(fā)明還涉及包含與編碼序列可操作連接的本發(fā)明啟動(dòng)子DNA序列的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞有利地用于制造生物學(xué)化合物。將包含與編碼序列可操作連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的載體引入宿主細(xì)胞，使得載體作為染色體整合體或作為前文所述的自主復(fù)制染色體外載體存在。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括親本細(xì)胞的任何后代，所述后代由于復(fù)制中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于編碼序列的來(lái)源和本發(fā)明啟動(dòng)子的來(lái)源。技術(shù)人員會(huì)明白如何選擇最合適的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及重組的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含多于一個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列，各啟動(dòng)子與一個(gè)編碼序列可操作連接。這類宿主細(xì)胞可有利地用于至少一種生物學(xué)化合物的重組產(chǎn)生?；蛘弑景l(fā)明的重組宿主細(xì)胞可包含與本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子組合的一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域已知的這類啟動(dòng)子包括但不僅限于得自下述基因的啟動(dòng)子A/w^ge"w'5x/"爿、Ao^zaeTAKA淀私、酶、W/n'zowwco廠/w.e/e/天冬氨酸蛋白酶、Am'ger中性a-淀粉酉每、A酸性穩(wěn)定a-淀粉酉每、Aw'ger或Asperg〃/船avwmo"'葡萄、糖淀粉酶(glaA)、Am'gergpdA、Am'ger葡萄糖氧化酶goxC、飾zom腳rw/e/7d月旨酶、A(，fle堿性蛋白酶、Aw戸e磷酸丙糖異構(gòu)酶、Am'c/w/fl似乙酰胺酶和」Fkran'"mox"pomm胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自Am'ger中性a-淀粉酶和Ao，ae憐酸丙糖異構(gòu)酉每的啟動(dòng)子的雜父物)、iS"acc/mra，ces1cerev&fle烯醇化酶(ENO-1)、Sacc/ara"^ceyc"ev^'ae半乳糖激酶(GAL1)、Sacc/^romj;cMcerev/^e醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)禾口Sacc/^ramycMcereWw'fle3-磷酸甘油酸酯激酶，及其突變的、截短的和雜交的啟動(dòng)子。用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用啟動(dòng)子描述于Romanosetal.，1992,Yeast8:423-488。優(yōu)選地，載體中存在至少一個(gè)啟動(dòng)子和與其相連的編碼序列。將載體引入宿主細(xì)胞使其作為染色體整合體和/或如前所述的自主復(fù)制染色體外載體存在。本發(fā)明的宿主細(xì)胞和本發(fā)明方法中使用的宿主細(xì)胞可以是任何宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為真菌細(xì)胞。本文使用"真菌"包括子囊菌亞門(Ascomycota)、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycota)、Chytridiomycota禾口接合菌衙門(Zygomycota)(如由Hawksworthetal.,In，AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,她edition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義的)以及Oomycota(如Hawksworthetal.，1995,上文，page171所述)禾口所有的mitosporicftmgi(Hawksworthetal.,1995，上文)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。本文使用"酵母"包括產(chǎn)子囊酵母(酵母目)、basidiosporogenous酵母和屬于Fungilmperfecti(芽生真菌)的酵母。由于酵母的分類將來(lái)可變化，就本發(fā)明的目的而言，酵母應(yīng)如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,andDavenport,R.R.,eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述定義。在進(jìn)一歩更優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞為Omt/Wfl、或7a廠ro稱'a細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞為&cC/mram_yc"或&cc/^ram_yce5ow/orm^細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞為《/wjn^w^c"/fl",'5細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞為//po(yrica細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞為絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌和Oomycota亞門的所有絲狀體(如Hawksworthetal"1995所定義)。絲狀真菌表征為由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)合多糖組成的菌絲體壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過菌絲伸長(zhǎng)，并且碳分解代謝專性需氧。相反的，酵母如Sacc/mramyc&scerev&ae的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過單細(xì)胞原植體出芽且碳分解代謝可以是發(fā)酵的。優(yōu)選地，絲狀真菌宿主細(xì)胞為爿crewom'wm、爿^erg"/t^、選J^/7wg7Y/m5、C^^^as/on'ww、尸6/^'c/〃/m附或7Wc/ofiferma屬白勺細(xì)胞。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為^^erg,7/船m'ger、Aw乂ae或Aw^加e細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為C77505/or/t/附/wcA:wowe/we、jFksan'i/附6acfn.(i/oz'(ias1、^Fw-s"an'w附ce廠ea/k、Fwsa〃'wmcroo^we〃ewse、F船腦'Mmcw/附orww、Fwsa"'i/mwegww(i/、i^M5an'wmoxjAsporwm、^Fwsan'i/m^60.cm/o/mw、/^wsarz'w"/-o^ewm、Fw5fl".w;w5w/jD/mreM/w、Fms腦'm肌torw/o認(rèn)附、F"5a"'m附/"'cAo決ec/o/fifes、或Awan'wmvewewa&m細(xì)胞。在另一更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為//:w脂-co/az'朋o/e朋、//wm/co/a/a腦g7'wo《fl、w/e/ez'、/zarzz'awwm、rn'c/ocfermaA:om7g7'7:、7V/c/zofiferma/owg7'ferac/n'a^m、7Wc/o^CT7warew^或7Wc/^fifewwv/n'fife細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為選自^sperg7'〃wjw/ger、y4j/w^〃m5wjzae、As7ew'〃ws勿ae、C，05/ohw/w/McAwowe/we、7Wc/ioc/e環(huán)areese/或Pew/c/〃z'w附c/o^oge腦m的種。最優(yōu)選的m'ger宿主細(xì)胞為CBS513.88或其衍生物。公眾可以在大量培養(yǎng)物收集中容易地得到若干絲狀真菌的菌株，所述培養(yǎng)物收藏如美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏單位(ATCC)、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM)、CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)禾口AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)，所述菌株為卻一腸mgerCBS513.88、~一腸o"認(rèn)ATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892、P.cA，ogewwmCBS455.95、尸e"/"Wwmc"rZ麗mATCC38065、尸ew/c/〃/wmcA/^^ogewwmP2、Jcremow/wmcA/3^0gewwmATCC36225或ATCC48272、7Wc/ioc/ermareese/ATCC26921或ATCC56765或ATCC26921、As7e，'〃w5"sojaeATCC11906、C/，o5po"'簡(jiǎn)/wc^wo置似eATCC44006。宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或變體、突變體或經(jīng)遺傳修飾的絲狀真菌宿主細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為蛋白酶缺陷或蛋白酶負(fù)型菌株。這可以是稱為"alp"的堿性蛋白酶基因被缺失的蛋白酶缺陷菌株AspergillusoryzaeJaL125(描述于WO97/35956或EP429490)或公開于WO96/14404中的A.niger三肽基氨基肽酶(TRAP)缺陷菌株。另外，根據(jù)本發(fā)明也考慮WO01/68864中描述的轉(zhuǎn)錄激活子(prtT)產(chǎn)生減少的宿主細(xì)胞。另一特別考慮的宿主菌株為AspergillusoryzaeBECh2，其中出現(xiàn)在親本菌株IF04177中的三個(gè)TAKA淀粉酶基因被滅活。另外，兩個(gè)蛋白酶(堿性蛋白酶和中性金屬蛋白酶11)通過基因破壞被破壞。通過突變破壞了形成代謝產(chǎn)物環(huán)并偶氮酸和曲酸的能力。BECh2描述于WO00/39322并來(lái)自JaL228(描述于WO98/12300)，所述JaL228也是US5，766,912中公開為A1560的IF04177的突變體。任選地，絲狀真菌宿主細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比包含提高的解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)以增強(qiáng)目的多肽的生產(chǎn)能力。UPR可通過US2004/0186070A1禾口/或US2001/0034045A1禾口/或WOO1/72783A2和/或WO2005/123763中描述的技術(shù)提高。更具體地，HAC1和/或IRE1和/或PTC2的蛋白質(zhì)水平被調(diào)節(jié)，和/或SEC61蛋白質(zhì)被設(shè)計(jì)從而獲得具有提高的UPR的宿主細(xì)胞?；蛘撸蚺c提高的UPR—起，宿主細(xì)胞通常被遺傳修飾以獲得下述表型，所述表型與野生型細(xì)胞相比顯示更低的蛋白酶表達(dá)和/或蛋白酶分泌，從而增強(qiáng)目的多肽的制造能力。這類表型可通過缺失和/或修飾和/或滅活蛋白酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子獲得。這類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子為例如prtT。通過調(diào)節(jié)prtT降低蛋白酶的表達(dá)可通過US2004/0191864A1和EP2005/055145中所述技術(shù)進(jìn)行。或者，或與提高的UPR和/或顯示更低蛋白酶表達(dá)和/或蛋白酶分泌的表型一起，宿主細(xì)胞顯示草酸鹽缺陷表型，從而增強(qiáng)目的多肽的制造量。草酸鹽缺陷表型可通過WO2004/070022A2和WO2000/50576中描述的技術(shù)獲得。或者，或與提高的UPR和/或顯示更低蛋白酶表達(dá)和/或蛋白酶分泌和/或草酸鹽缺陷的表型一起，宿主細(xì)胞顯示與野生型細(xì)胞相比表型差異的組合，從而提高目的多肽的制造量。這些差異可包括，但不僅限于降低的葡萄糖淀粉酶和/或a-淀粉酶A和/或中性a-淀粉酶B、a-1、6轉(zhuǎn)葡萄糖基酶蛋白酶和草酸水解酶的表達(dá)。所述由宿主細(xì)胞顯示的表型差異可根據(jù)US2004/0191864A1中所述技術(shù)通過遺傳修飾獲得?；蛘撸蚺c上述表型組合，核酸構(gòu)建體通過同源重組靶向整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組(即整合進(jìn)預(yù)先確定的靶位點(diǎn))的效率優(yōu)選通過宿主細(xì)胞的增強(qiáng)的同源重組能力提高。細(xì)胞的這類表型優(yōu)選涉及WO2005/095624中描述的缺陷或A^/S基因。WO2005/095624公開了獲得具有提高的靶向整合能力的絲狀真菌細(xì)胞的優(yōu)選方法。真菌細(xì)胞可通過下述方法轉(zhuǎn)化，所述方法涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和以本身已知的方式再生細(xì)胞壁。用于轉(zhuǎn)化A^erg///^宿主細(xì)胞的合適方法描述于EP238023和Yeltonetal"1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474。使用jgra/acte"'簡(jiǎn)&w2e/flc&"5轉(zhuǎn)化A^erp7/^和其它絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適方法描述于例如NatBiotechnol.1998Sep;16(9):839-42.Erratumin:NatBiotechnol1998Nov;16(11):1074.y4groZacfen'wwft/me/a"'ews-mediatedtransformationoffilamentousfungi,deGrootMJ,BundockP,HooykaasPJ,BeijersbergenAG.UnileverResearchLaboratoryVlaardingen,TheNetherlands。用于轉(zhuǎn)化Fw廳'麵種的合適方法描述于Malardieretal.，1989,Gene78:147-156和WO96/00787。可使用BeckerandGuarente，InAbelson,J.N.andSimon,M.toYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194，pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;ltoetal.，1983,JournalofBacteriology153:163;禾口Hinnenetal.,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。本發(fā)明的另一方面提供用于在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼序列的方法，包括(a)提供DNA構(gòu)建體，其包含與如上所述編碼序列可操作連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列，(b)用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，和(c)在有助于表達(dá)編碼序列的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)合適的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供用于在合適的宿主細(xì)胞中制造生物學(xué)化合物的方法，包括(a)提供DNA構(gòu)建體，其包含與如上所述編碼序列可操作連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列，(b)用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，和(c)在有助于表達(dá)編碼序列的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)合適的宿主細(xì)胞，和任選地(d)從培養(yǎng)基中回收生物學(xué)化合物。"生物學(xué)化合物"可以是任何生物多聚體或代謝物。生物學(xué)化合物可由單個(gè)編碼序列或組成生物合成或代謝途徑的一系列編碼序列編碼，或可以是單一編碼序列的直接產(chǎn)物或一系列編碼序列的產(chǎn)物。生物學(xué)化合物對(duì)宿主細(xì)胞可以是同源的或異源的。術(shù)語(yǔ)"異源生物學(xué)化合物"在本文定義為下述生物學(xué)化合物，其與給定宿主細(xì)胞或天然生物學(xué)化合物不同源，其中進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾以改變天然生物學(xué)化合物。術(shù)語(yǔ)"生物多聚體"在本文定義為相同、相似或不相似亞單元(單體)的鏈(或多聚體)。生物多聚體可以是任何生物多聚體。生物多聚體可以是例如，但不僅限于核酸如RNA、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，產(chǎn)生的生物學(xué)化合物為多肽。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，產(chǎn)生的多肽由DNA構(gòu)建體中存在的編碼序列編碼，所述DNA構(gòu)建體包含與所述編碼序列可操作連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子。多肽可以是具有目的生物學(xué)活性的任何多肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"在本文并非意指特定長(zhǎng)度的被編碼的產(chǎn)物，并因此包含肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"多肽"還包括組合以形成所編碼的產(chǎn)物的兩個(gè)或更多多肽。多肽還包括雜交多肽，其包含得自至少兩個(gè)不同多肽的部分或全部多肽序列的組合，其中之一或更多可對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。多肽還包括上述多肽和雜交多肽的天然存在的等位和設(shè)計(jì)的變異。多肽對(duì)給定的宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)"異源多肽"在本文定義為對(duì)給定宿主細(xì)胞并非天然的多肽。或者異源多肽為其中進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然多肽，或其表達(dá)在數(shù)量上被改變的天然多肽，所述改變是是通過重組DNA技術(shù)操作真菌細(xì)胞的結(jié)果。例如，可通過以下方式重組產(chǎn)生天然多肽，例如將編碼多肽的序列置于本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控下以增強(qiáng)多肽表達(dá)，通過使用信號(hào)序列加速目的天然多肽輸出細(xì)胞外，和提高通常由細(xì)胞產(chǎn)生的多肽的編碼基因的拷貝數(shù)。多肽可以是膠原或明膠，或其變體或雜種。多肽可以是抗體或其部分、抗原、凝固因子、酶、激素或激素變體、受體或其部分、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、分泌過程涉及的蛋白質(zhì)、折疊過程涉及的蛋白質(zhì)、伴侶分子、肽氨基酰轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖基化因子、轉(zhuǎn)錄因子、合成肽或寡肽、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)可以是酶，例如蛋白酶、神經(jīng)酰胺酶、環(huán)氧化物水解酶、氨基肽酶、?；D(zhuǎn)移酶、醛縮酶、羥化酶、氨基肽酶、脂酶。多肽可以是細(xì)胞外分泌的酶。這類酶可以屬于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、連接酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶。酶可以是糖酶，例如纖維素酶如內(nèi)切葡聚糖酶、P-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或P-葡萄糖苷酶、半纖維素酶或膠質(zhì)水解酶如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果膠甲基酯酶、果膠裂合酶、果膠酶、內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶、外多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯木聚糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂合酶或淀粉酶；水解酶、異構(gòu)酶或連接酶，磷酸酶如植酸酶，酯酶如脂酶，蛋白水解酶，氧化還原酶如氧化酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。酶可以是植酸酶。酶可以是氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、內(nèi)切蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶過氧化氫酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶脫氧核糖核酸酶、脂酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、ci-葡萄糖淀粉酶、e-葡萄糖苷酶、鹵素過氧化物酶、蛋白水解酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、變構(gòu)水解酶(mutanase)、氧化酶、膠質(zhì)水解酶、過氧化物酶、磷脂酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、單加氧酶?？蛇x地，與本發(fā)明啟動(dòng)子可操作連接的編碼序列可編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，例如陪伴分子或轉(zhuǎn)錄因子。其一實(shí)例描述于ApplMicrobiolBiotechnol.1998Oct;50(4):447-54("AnalysisoftheroleofthegenebipA,encodingthemajorendoplasmicreticulumchaperoneproteininthesecretionofhomologousandheterologousproteinsinblackAspergilli.PuntPJ，vanGemerenIA,Drint-KuijvenhovenJ,HessingJG,vanMuijlwijk-HarteveldGM,BeijersbergenA,VerripsCT，vandenHondelC.A)。如果該編碼序列(如陪伴分子或轉(zhuǎn)錄因子)已知是蛋白質(zhì)或代謝物產(chǎn)生的限制因子，則這可用于例如促進(jìn)宿主細(xì)胞作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)者或作為代謝物的效力。生物學(xué)化合物可以是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不僅限于粘多糖(例如肝素和透明質(zhì)酸)和含氮多糖(例如殼多糖)。在更優(yōu)選的選擇中，多糖為透明質(zhì)酸?？蛇x地，生物學(xué)化合物可以是代謝物。術(shù)語(yǔ)"代謝物"包括初級(jí)和次級(jí)代謝物；所述代謝物可以是任何代謝物。優(yōu)選的代謝物為檸檬酸。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，產(chǎn)生的生物學(xué)化合物為代謝物。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，DNA構(gòu)建體中存在的編碼序列編碼涉及代謝物產(chǎn)生的酶，所述DNA構(gòu)建體包含與所述編碼序列可操作連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子。可選地，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中可存在若干編碼序列。各編碼序列可編碼涉及引起代謝物產(chǎn)生的代謝或生物合成途徑的不同的酶。初級(jí)代謝物是細(xì)胞初級(jí)或一般代謝的產(chǎn)物，其涉及能量代謝、生長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)。次級(jí)代謝物是次級(jí)代謝(參閱例如R.B.Herbert,TheBiosynthesisofSecondaryMetabolites,ChapmanandHall,NewYork,1981)的產(chǎn)物。初級(jí)代謝物可以是，但不僅限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯或維生素。優(yōu)選的初級(jí)代謝物為檸檬酸。次級(jí)代謝物可以是，但不僅限于生物堿、香豆素、黃酮類、聚酮化合物、奎寧、類固醇、肽或萜。次級(jí)代謝物可以是抗生素、抗飼育劑、引誘劑、殺菌劑、殺真菌劑、激素、殺蟲劑或殺鼠劑。優(yōu)選的抗生素為頭孢菌素和內(nèi)酰胺。生物學(xué)化合物還可以是可選擇標(biāo)記?？蛇x擇標(biāo)記為提供針對(duì)抗微生物劑或病毒的抗性、對(duì)重金屬抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷的原營(yíng)養(yǎng)等的產(chǎn)物?？蛇x擇標(biāo)記包括，但不僅限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清苷-51-磷酸鹽脫羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白)及其等效物。在本發(fā)明的制造方法中，細(xì)胞使用本領(lǐng)域已知方法在適于制造生物學(xué)化合物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述生物學(xué)化合物可以是，但不僅限于多肽或代謝物。例如可以在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中，在合適培養(yǎng)基中和允許編碼序列被表達(dá)和/或生物學(xué)化合物被分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括持續(xù)的、分批的、分批進(jìn)料或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞。在含有碳和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域己知方法進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可來(lái)自商業(yè)供貨商或可通過(例如在美國(guó)模式培養(yǎng)物培養(yǎng)所的產(chǎn)品目錄中)公開的構(gòu)成制備。如果生物學(xué)化合物分泌進(jìn)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，所述生物學(xué)化合物可直接從培養(yǎng)基中回收。如果生物學(xué)化合物(其可以是，但不僅限于多肽或代謝物)不分泌，那么可從細(xì)胞裂解物中回收?？赏ㄟ^本領(lǐng)域己知方法回收產(chǎn)生的生物學(xué)化合物(其可以是，但不僅限于多肽或代謝物)。例如，可通過常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽或代謝物，所述常規(guī)方法包括但不僅限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。多肽可通過本領(lǐng)域已知的多種方法純化，所述方法包括，但不僅限于色譜法(例如離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和尺寸排除)、電泳方法(例如準(zhǔn)備的等電位聚焦)、差異的溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(參閱例如ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。多肽可使用本領(lǐng)域已知的對(duì)于多肽特異的方法檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可包括特異抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。本發(fā)明還涉及用于改變編碼多肽的編碼序列表達(dá)的DNA構(gòu)建體，所述多肽對(duì)于真菌宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。該構(gòu)建體可含有改變內(nèi)源基因表達(dá)所需的最少數(shù)量的成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體優(yōu)選含有(a)靶序列，(b)本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列，(c)外顯子，和(d)剪接供體位點(diǎn)。將所述核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞時(shí)，構(gòu)建體通過同源重組在內(nèi)源基因位點(diǎn)處整合進(jìn)細(xì)胞基因組。靶序列指導(dǎo)元件(a)-(d)進(jìn)入內(nèi)源基因的整合，使得(b)-(d)與內(nèi)源基因可操作連接。在另一實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體含有(a)靶序列，(b)本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA序列，(c)外顯子，(d)剪接供體位點(diǎn)，(e)內(nèi)含子，和(f)剪接受體位點(diǎn)，其中靶序列指導(dǎo)元件(a)-(f)的整合，使得(b)-(f)與內(nèi)源基因可操作連接。然而，所述構(gòu)建體可含有額外的成分，如可選擇標(biāo)記?？墒褂玫目蛇x擇標(biāo)記先前已描述。在兩個(gè)實(shí)施方案中，這些成分的引入引起新轉(zhuǎn)錄單位的產(chǎn)生，其中內(nèi)源基因的表達(dá)被改變。事實(shí)上，新的轉(zhuǎn)錄單位是通過靶向構(gòu)建體引入的序列和內(nèi)源基因的融合產(chǎn)物。在一個(gè)內(nèi)源基因被改變的實(shí)施方案中，該基因被激活。在該實(shí)施方案中，使用同源重組置換、破壞或滅活下述調(diào)節(jié)區(qū)，所述調(diào)節(jié)區(qū)通常通過調(diào)節(jié)序列的插入與親本細(xì)胞的內(nèi)源基因結(jié)合，這引起與相應(yīng)的親本細(xì)胞中的跡象相比所述基因以更高水平表達(dá)。靶向序列可以在內(nèi)源基因內(nèi)部、緊鄰該基因、在上游基因內(nèi)部或在上游并與內(nèi)源基因有段距離。可使用一個(gè)或多個(gè)靶向序列。例如環(huán)形質(zhì)?；駾NA片段優(yōu)選使用單個(gè)靶向序列，而線性質(zhì)?；駾NA片段優(yōu)選使用兩個(gè)耙向序列。構(gòu)建體還含有內(nèi)源基因的一個(gè)或多個(gè)外顯子。外顯子定義為下述DNA序列，所述DNA序列拷貝為RNA并存在于成熟的mRNA分子中，使得外顯子序列與內(nèi)源基因的編碼區(qū)是符合讀碼框的。外顯子可任選地包含DNA，所述DNA編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或部分地編碼氨基酸。可選地，外顯子含有對(duì)應(yīng)于5'非編碼區(qū)的DNA。當(dāng)外源外顯子編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或氨基酸部分時(shí)，核酸構(gòu)建體以以下方式涉及轉(zhuǎn)錄和剪接時(shí)，讀碼框與內(nèi)源基因是符合讀碼框的，從而來(lái)自第二個(gè)外顯子的mRNA部分的合適讀碼框不被改變。構(gòu)建體的剪接供體位點(diǎn)指導(dǎo)一個(gè)外顯子剪接為另一外顯子。典型地，第一個(gè)外顯子位于第二個(gè)外顯子的5'，與第一個(gè)外顯子3'側(cè)重合并位于其3'側(cè)翼的剪接供體位點(diǎn)識(shí)別位于第二個(gè)外顯子5，側(cè)翼的第二個(gè)外顯子側(cè)翼的剪接受體位點(diǎn)。剪接受體位點(diǎn)(如剪接供體位點(diǎn))是指導(dǎo)一個(gè)外顯子到另一個(gè)外顯子剪接的序列。與剪接受體位點(diǎn)一同作用的剪接裝置用剪接受體位點(diǎn)來(lái)影響內(nèi)含子的去除。用于改變給定DNA序列表達(dá)的優(yōu)選策略包括缺失給定DNA序列和/或用經(jīng)修飾的啟動(dòng)子DNA序列(如本發(fā)明的啟動(dòng)子)代替給定DNA序列的內(nèi)源啟動(dòng)子序列。缺失和置換優(yōu)選通過EP0357127中所述基因置換技術(shù)進(jìn)行。基因和/或啟動(dòng)子序列的特異缺失優(yōu)選如EP635574中所述使用amdS基因作為選擇性標(biāo)記進(jìn)行。通過在如EP635574中所述在氟乙酰胺培養(yǎng)基上反選擇的手段，得到的菌株不含選擇性標(biāo)記并可用于進(jìn)一步的基因修飾?？蛇x地，或與其它提到的技術(shù)一起，可使用基于在五.co/Z中體內(nèi)重組的技術(shù)，如ArapidmethodforefficientgenereplacementinthefilamentousfungusA.nidulans(2000)Chaveroche，M-K.,Ghico，J-M.andd'EnfertC;NucleicacidsResearch,vol28，no22所述。該技術(shù)可應(yīng)用于其它絲狀真菌，如J.m'ger。本文描述和要求的發(fā)明并不受限于本文公開的特定實(shí)施方案的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在說明本發(fā)明的若干方案。任何等效的實(shí)施方案旨在包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。事實(shí)上，除本文顯示和描述的以外，本發(fā)明的多種修飾對(duì)前述說明書領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是明顯的。這類修飾也旨在落入附加的權(quán)利要求書范圍內(nèi)。在沖突的情況下，以包括定義的本公開文件為準(zhǔn)。本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)信息菌株WT1:該Aw/ger菌株用作野生型菌株。該菌株以保藏號(hào)CBS513.88保藏于CBS中心。WT2:該Am'gw菌株為包含編碼葡萄糖淀粉酶(g/aJ)基因缺失的WT1菌株。WT2通過使用如EP0635574所述的"MARKER-GENEFREE"方法構(gòu)建。該專利廣泛地描述了如何在CBS513.88基因組中缺失的特異DNA序列。該步驟得到了MARKER-GENEFREEAg/a^重組Am'gerCBS513.88菌株，最終完全不含任何外源DNA序列。葡萄糖淀粉酶活性測(cè)定如WO98/46772所述使用p-硝基苯基a-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma)確定葡萄糖淀粉酶活性。實(shí)施例1構(gòu)建含有與編碼序列可操作連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體該實(shí)施例描述了構(gòu)建含有與編碼序列可操作連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體。此處使用的編碼序列或報(bào)告構(gòu)建體為編碼Am'ger葡萄糖淀粉酶的g/^4基因。葡萄糖淀粉酶用作報(bào)告酶，其能夠測(cè)量本發(fā)明啟動(dòng)子的活性。1.1對(duì)整合的葡萄糖淀粉酶表達(dá)載體(pGBTOPGLA;)的描述將葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子和編碼來(lái)自Am'gw的葡萄糖淀粉酶編碼基因g/aj克隆進(jìn)表達(dá)載體pGBTOP-8中，所述載體描述于W099/32617?？寺「鶕?jù)己知原則和常規(guī)克隆技術(shù)進(jìn)行，并得到質(zhì)粒pGBTOPGLA(參閱圖1)。事實(shí)上，該表達(dá)載體包含葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子、編碼序列和終止區(qū)，側(cè)翼為五.co"載體中3'和3"g/aJ靶向位點(diǎn)。1.2構(gòu)建有多克隆位點(diǎn)的整合的葡萄糖淀粉酶表達(dá)載體(pGBTOPGLA-2)使用識(shí)另!J為SEQIDNO7的ATgCggCCgCCTCgAgTTAATTAAggCCAggCCggCCggCgCgCCTCAgCAATgTCgTTCCgA-3'禾口識(shí)另U為SEQIDNO8的5'-AGCCATTGACTTCTTCCCAG-3'禾H1ng載體pGBTOPGLA作為模板，產(chǎn)生含有部分g/"J編碼序列的PCR片段。用Iol和Sg/II消化該片段并引入屈ol和Sg/II消化的載體pGBTOPGLA內(nèi)，得到載體pGBTOPGLA-2(參閱圖2)。通過序列分析確認(rèn)下述經(jīng)引入的PCR片段的序列，所述序列包含多克隆位點(diǎn)(MCS)和部分g/^4編碼序列。1.3構(gòu)建帶有與葡萄糖淀粉酶編碼序列可操作連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的整合表達(dá)載體測(cè)序并分析菌株CBS513.88的基因組DNA。使用如下文表1所列的寡核苷酸及其各自的SEQIDNO，并使用菌株CBS513.88的基因組DNA作為模板通過PCR擴(kuò)增將適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)附加在本發(fā)明啟動(dòng)子上。如SEQIDNO1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所識(shí)別的序列包含在1.5和2kb之間的得到的片段的序列，如下文表1所示。用和oI消化所有三個(gè)得到的片段并引入經(jīng)血cl和Iol消化的載體pGBTOPGLA-2中，分別得到載體pGBTOPGLA-6、pGBTOPGLA-8或pGBTOPGLA-3711，如下文表(載體名稱)中所示。通過序列重疊延伸PCR(SOE-PCR，asdescribedinGene,1989Apr15;77(l):51-9.HoSN,HuntHD,HortonRM,PullenJK,PeaseLR"Site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction")將本發(fā)明的其它啟動(dòng)子與葡萄糖淀粉酶編碼序列融合。使用被稱為SEQIDNO:9禾卩SEQIDNO:13的寡核苷酸，禾口Am'gwWT1的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增本發(fā)明的識(shí)別為片段A的啟動(dòng)子。另外，在片段A的5'末端附著^Y7wI限制性位點(diǎn)。使用被稱為SEQIDNO:8和SEQIDNO:14，和載體pGBTOPGLA作為模板，制造含有部分g/^4編碼序列的PCR片段，識(shí)別為片段B。使用識(shí)別為SEQIDNO:9和SEQIDNO:8的寡核苷酸和片段A和片段B，通過SOE-PCR將得到的片段A和片段B融合，產(chǎn)生片段C。該片段C含有如SEQIDNO:4所識(shí)別的本發(fā)明的啟動(dòng)子，和部分g/^4編碼序列。用Sg/II和loI消化片段C并引入經(jīng)和Iol消化的載體pGBTOPGLA-2內(nèi)，得到載體pGBTOPGLA-12。得到的本發(fā)明啟動(dòng)子序列識(shí)別為SEQIDNO:4,其與葡萄糖淀粉酶編碼序列可操作連接。以類似于上述的方式，使用如下文表1所述引物組合，通過序列重疊延伸PCR將本發(fā)明的兩個(gè)其它啟動(dòng)子與葡萄糖淀粉酶編碼序列融合。再用和^ol消化這些啟動(dòng)子-葡萄糖淀粉酶片段并引入經(jīng)Sg/II和消化的載體pGBTOPGLA-2內(nèi)，分別得到載體pGBTOPGLA-13或pGBTOPGLA-14。得到的本發(fā)明啟動(dòng)子序列可識(shí)別為SEQIDNO5或6(參閱表l)，其與葡萄糖淀粉酶編碼序列可操作連接。圖3描述了說明所構(gòu)建的所有六個(gè)pGBTOPGLA載體結(jié)構(gòu)的載體。通過序列分析確認(rèn)包含本發(fā)明啟動(dòng)子的多種經(jīng)引入的PCR片段的序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>17/138/14pGBTOPGLA-146表1:經(jīng)分離的啟動(dòng)子序列綜述。列出啟動(dòng)子序列(SEQIDNO1到6)、包含啟動(dòng)子序列的各載體和用于分離啟動(dòng)子序列的各PCR引物(OligoSEQIDNO's)實(shí)施例2用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真菌宿主細(xì)胞為了將pGBTOPGLA、pGBTOPGLA-6、pGBTOPGLA-8、pGBTOPGLA-ll、pGBTOPGLA-12、pGBTOPGLA-13或pGBTOPGLA-14載體引入WT2，如W098/46772和W099/32617所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化和隨后的轉(zhuǎn)化體選擇。基本上在用M^I消化后分離所有載體的線性DNA，并與含有amdS選擇性標(biāo)記基因的載體共轉(zhuǎn)化，后者稱為pGBAAS-l(如EP635574中所述構(gòu)建)。載體均包含兩個(gè)與Am'ger宿主菌株的g/^4基因座同源的DNA結(jié)構(gòu)域以指導(dǎo)對(duì)WT2中截短的g/aJ基因座的尋靶作用。在乙酰胺培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序純化菌落。將孢子涂布于氟-乙酰胺培養(yǎng)基上選擇丟失"m^S標(biāo)記的菌株。判斷生長(zhǎng)的菌落在glaA基因座上的整合和拷貝數(shù)。選擇有相似的評(píng)估拷貝數(shù)的PGBTOPGLA、pGBTOPGLA-6、pGBTOPGLA-8、pGBTOPGLA-11、pGBTOPGLA-12pGBTOPGLA-13或pGBTOPGLA-14轉(zhuǎn)化體。優(yōu)選地，選擇具有單拷貝或低拷貝數(shù)(IA、1B、1C)的轉(zhuǎn)化體。另外，選擇性標(biāo)記基因和由本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因被構(gòu)建為存在于一個(gè)表達(dá)載體中。這類載體的實(shí)例顯示于圖4中。實(shí)施例3在真菌宿主細(xì)胞中制造由位于本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控下的daA編碼序列編碼的葡萄糖淀粉酶多肽在100ml如EP635574所述的培養(yǎng)基中于34。C和170rpm下在培養(yǎng)搖床中使用500ml帶擋板搖瓶，用如上所述選擇的大量WT2轉(zhuǎn)化體和WT1和WT2菌株進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵3和4天后取樣，如上所述確定葡萄糖淀粉酶活性。將葡萄糖淀粉酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為第3天時(shí)WT1的活性。WT1、WT2和大量為pGBTOPGLA、pGBTOPGLA-6、pGBTOPGLA-8、pGBTOPGLA-ll、pGBTOPGLA-12pGBTOPGLA-13或pGBTOPGLA-14選擇的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)準(zhǔn)化的活性在圖5中顯示。從經(jīng)測(cè)量的葡萄糖淀粉酶報(bào)告基因的活性推斷本發(fā)明提供用于在真菌細(xì)胞中高表達(dá)目的基因的強(qiáng)啟動(dòng)子和啟動(dòng)子變體。明顯地，可檢測(cè)出少數(shù)"異常值"菌株如pGBTOPGLA-lB或pGBTOPGLA-13-IC，其可能含有多于一個(gè)拷貝的經(jīng)引入的構(gòu)建體。pGBTOPGLA-6中使用的啟動(dòng)子明顯強(qiáng)于葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子(從WTl和pGBTOPGLA轉(zhuǎn)化體所推斷的)和例如pGBTOPGLA-8中包含的啟動(dòng)子。另夕卜，pGBTOPGLA-6中使用的啟動(dòng)子變體例如pGBTOPGLA-13(其具有改變的轉(zhuǎn)錄起始子序列5'-CACCGTCAAA-3')明顯顯示經(jīng)進(jìn)一步改進(jìn)的性能。類似地，本發(fā)明的啟動(dòng)子提供用于在宿主細(xì)胞中高表達(dá)目的基因的可選擇的和額外的啟動(dòng)子。實(shí)施例4構(gòu)建包含本發(fā)明啟動(dòng)子的啟動(dòng)子置換構(gòu)建體pGBDEL-PGLAA為了改變給定基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，本發(fā)明的啟動(dòng)子可代替所述給定基因的內(nèi)源啟動(dòng)子。在該實(shí)施例中，本發(fā)明的啟動(dòng)子在真菌宿主細(xì)胞中代替編碼葡萄糖淀粉酶的glaA基因的啟動(dòng)子。實(shí)施例4、5和6描述該方法中大量不同的步驟。用于葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子的置換啟動(dòng)子根據(jù)已知原則設(shè)計(jì)并常規(guī)克隆操作構(gòu)建(參閱圖6)。事實(shí)上，通過在預(yù)先確定的基因組靶位點(diǎn)上的同源充足，g/"A啟動(dòng)子置換型載體pGBDEL-PGLAA包含將被本發(fā)明啟動(dòng)子(在本實(shí)驗(yàn)中啟動(dòng)子由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6組成)置換的glaA啟動(dòng)子序列的約1000bp側(cè)翼區(qū)域。此處使用的側(cè)翼序列(參閱圖6)是g/flA啟動(dòng)子的5'上游區(qū)域和部分glaA編碼序列。另外，置換型載體在同向重復(fù)間含有AmWw/fl似雙向flwdS選擇標(biāo)記。該實(shí)施例中使用的同向重復(fù)為g/A編碼序列的部分。這些缺失載體的一般設(shè)計(jì)先前描述于EP635574和WO98/46772。實(shí)施例5在真菌宿主細(xì)胞中用本發(fā)明啟動(dòng)子置換啟動(dòng)子分離經(jīng)A^fl消化的缺失載體pGBDEL-PGLAA的線性DNA并用于轉(zhuǎn)化WT1(CBS513.88)。該線性DNA可在g/aA基因座整合進(jìn)基因組，從而用含有"mdS和本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)建體取代g/aA啟動(dòng)子區(qū)(參閱圖7)。在乙酰胺培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作純化菌落。生長(zhǎng)的菌落通過PCR判斷在g/aA基因座上的整合。G/"A啟動(dòng)子的缺失可通過擴(kuò)增下述條帶檢測(cè)，所述條帶具有對(duì)本發(fā)明啟動(dòng)子特異的大小并缺失對(duì)g/"A啟動(dòng)子特異的條帶。將孢子涂布于氟-乙酰胺培養(yǎng)基上選擇丟失"/m/S標(biāo)記的菌株。使用Southern分析檢測(cè)葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子的適當(dāng)缺失和被本發(fā)明啟動(dòng)子(如屬于SEQIDNO:1到SEQIDNO:6的)的置換。菌株dPGLAA被選擇為g/aA啟動(dòng)子被本發(fā)明啟動(dòng)子置換并具有經(jīng)修復(fù)的功能性g/"A編碼序列的代表性菌株(參閱圖7)。實(shí)施例6在真菌宿主細(xì)胞內(nèi)制造由位于經(jīng)置換的本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控下的gfaA編碼序列編碼的葡萄糖淀粉酶多肽在100ml如EP635574Bl所述的培養(yǎng)基中于34。C和170rpm下在培養(yǎng)搖床中使用500ml帶擋板搖瓶，用經(jīng)選擇的dPGLAA菌株(在實(shí)施例5中被分離的WT1的適當(dāng)pGBDEL-PGLAA轉(zhuǎn)化體)進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。其它條件和活性測(cè)量如實(shí)施例3中所描述。在發(fā)酵的各天，與從未轉(zhuǎn)化的WT1測(cè)量的活性相比，所選的pGBDEL-PGLAA轉(zhuǎn)化體中葡萄糖淀粉酶的活性提高。實(shí)施例7在真菌宿主細(xì)胞中添加額外的位于本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控下的g/flA基因?yàn)榱烁淖兘o定基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，可向內(nèi)源的給定基因中添加多份額外拷貝的與本發(fā)明啟動(dòng)子可操作連接的所述基因。在該實(shí)施例中，本發(fā)明的啟動(dòng)子(如SEQIDNO:1至USEQIDNO:6所包含的和與g/aA編碼序列可操作連接的)鄰近真菌宿主細(xì)胞中內(nèi)源存在的葡萄糖淀粉酶編碼g&A基因被引入。實(shí)施例7和8描述該方法中的步驟。分離如圖8所示的載體構(gòu)建體并用于轉(zhuǎn)化WT1(CBS513.88)。載體構(gòu)建體具有在g/"A編碼序列處整合進(jìn)基因組的能力，從而鄰近選擇性標(biāo)記amdS加入位于本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控下的另一g/"A基因(參閱圖8)。在乙酰胺培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟純化菌落。生長(zhǎng)的菌落通過PCR判斷g/aA基因座上的整合。G/"A基因座上的整合通過Southern印跡分析確認(rèn)。菌株P(guān)2GLAA被選擇為在g/flA基因座上整合了至少一個(gè)位于本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控下的另一g/"A基因的代表性菌株。實(shí)施例8在真菌宿主細(xì)胞中制造由位于本發(fā)明啟動(dòng)子和內(nèi)源g/aA啟動(dòng)子調(diào)控下的g/aA編碼序列編碼的葡萄糖淀粉酶多肽在實(shí)施例7中構(gòu)建并分離的所選P2GLAA菌株和菌株WT1在100ml培養(yǎng)基中如實(shí)施例3所述進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵四和六天后，取樣確定培養(yǎng)物上清液中的葡萄糖淀粉酶活性。與發(fā)酵后四天或五天對(duì)WT1測(cè)量的活性相比，在所選的WT1的P2GLAA轉(zhuǎn)化體中的葡萄糖淀粉酶活性均提高。所觀察到的葡萄糖淀粉酶報(bào)告基因提高的活性指出本發(fā)明的啟動(dòng)子提供進(jìn)一步提高目的基因表達(dá)的手段，所述目的基因已經(jīng)在真菌細(xì)胞中強(qiáng)啟動(dòng)子下表達(dá)。另外，該結(jié)果提示本發(fā)明的啟動(dòng)子可與已知啟動(dòng)子組合使用。申請(qǐng)人或代理人文件參考編號(hào)24109WO國(guó)際申請(qǐng)?zhí)柵c被保藏的微生物相關(guān)的說明(PCTRule13te)A.下文說明涉及英文說明書第26頁(yè)9行提到的微生物B.保藏證明還有其它保藏記載于附頁(yè)上()保藏單位名稱CENTRAALBUREAUVOORSCHIMMELCULTURES保藏單位地址(包括郵政編碼和國(guó);P.O.Box85167NL-3508ADUtrechtTheNetherlands保藏日期10-08-1988編號(hào)CBS513.88C.其它說明G^^^^^^y歡空AJ該信息還有附頁(yè)繼續(xù)說明()我方通知貴方，根據(jù)Rule13bisPCT，在國(guó)家專利授權(quán)公告公開之前，上述微生物，僅可由請(qǐng)求人指定的專家獲得樣品，如果該申請(qǐng)被駁回、撤回或視為撤回，這條規(guī)定將從申請(qǐng)日起算二十年內(nèi)有效。D.說明適用的指定國(guó)家和地區(qū)0^菜說銜不是#/"對(duì)房家浙邀區(qū)游話9E.對(duì)說明的單獨(dú)補(bǔ)充07不適^W像f/^下述說明將隨后提交至國(guó)際局(指明說明的常見性質(zhì)，例如"保藏號(hào)")接收局專用()該表隨國(guó)際申請(qǐng)收到負(fù)責(zé)官員國(guó)際局專用()該表于下述日期被國(guó)際局到負(fù)責(zé)官員(簽名)權(quán)利要求1.啟動(dòng)子DNA序列，如(a)出現(xiàn)在以下列表中的DNA序列SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5或SEQIDNO6；(b)能夠與(a)的DNA序列雜交的DNA序列；(c)與(a)的DNA序列至少50％同源的DNA序列；(d)(a)到(c)的任何DNA序列的變體；或(e)(a)到(d)的任何DNA序列的亞序列。2.DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1的啟動(dòng)子DNA序列和與所述啟動(dòng)子DNA序列可操作連接的編碼序列，使得所述編碼序列可以在所述啟動(dòng)子DNA序列的調(diào)控下表達(dá)。3.包含根據(jù)權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選真菌宿主細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求所述3的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞來(lái)自v45/7e廠g7.〃1^、Pew/c/〃z'wm、C7廠j^c^/oWwm或TV/cAodez-ma屬。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞為A^wg/〃MJWc力c^ermareaez'或尸em'c/〃/:wmcA/^^ogewwm禾中。6.用于在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼序列的方法，包括(a)提供根據(jù)權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體，(b)用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，和(c)在有利于表達(dá)編碼序列的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述合適的宿主細(xì)胞。7.用于在合適的宿主細(xì)胞中制造生物學(xué)化合物的方法，包括(a)提供如權(quán)利要求2中所定義的DNA構(gòu)建體，(b)用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，和(c)在有利于編碼序列表達(dá)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)合適的宿主細(xì)胞，和任選地(d)從培養(yǎng)基中回收所述生物學(xué)化合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述生物學(xué)化合物為多肽。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中產(chǎn)生的所述多肽通過權(quán)利要求2所定義的DNA構(gòu)建體中的所述編碼序列編碼。10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中產(chǎn)生的所述生物學(xué)化合物為代謝物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中權(quán)利要求2中定義的DNA構(gòu)建體中存在的編碼序列編碼涉及所述代謝物的產(chǎn)生的酶。全文摘要本發(fā)明涉及經(jīng)分離的啟動(dòng)子DNA序列、DNA構(gòu)建體、載體和包含與編碼序列可操作連接的這些啟動(dòng)子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使用經(jīng)分離的新啟動(dòng)子用于表達(dá)基因和/或制造生物學(xué)化合物的方法。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的新啟動(dòng)子用于改變內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄水平和/或調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的方法。文檔編號(hào)C12N5/10GK101248181SQ200680007005公開日2008年8月20日申請(qǐng)日期2006年2月28日優(yōu)先權(quán)日2005年3月1日發(fā)明者蒂鮑特·喬斯·維恩策爾,諾林·尼古拉斯·瑪麗亞·艾里薩伯斯·佩伊·范,阿恩·斯達(dá)姆申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司