專利名稱：：診斷膀胱癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及^r測(cè)和診斷膀胱癌的方法以及治療和預(yù)防膀胱癌和膀胱癌轉(zhuǎn)移的方法。本發(fā)明還涉及與膀胱癌相關(guān)的基因和多肽。
背景技術(shù)：
：膀胱癌是人類群體中第二常見的泌尿生殖器腫瘤，全世界每年約有261,000例的新發(fā)病例。這其中約有1/3很可能在診斷時(shí)已成為侵入性疾病或轉(zhuǎn)移性疾病(ParkinDM,e,"/.,(1999)CACancerJClin;49:33-64)(非專利文獻(xiàn)1)。雖然對(duì)于那些僅發(fā)生肌肉侵入性膀胱癌的患者的治療，根治性膀胱切除術(shù)被視為"黃金標(biāo)準(zhǔn)"，然而這些患者中約有50%在接受膀胱切除術(shù)后2年出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，并隨后死于該疾病(SternbergCN.,(1995)AnnOncol;6:113-26)(非專利文獻(xiàn)2)。為了治療微小轉(zhuǎn)移和改善更大的新生物的可切除性，對(duì)于肌肉侵入性膀胱癌通常采取新輔助化療(neoadjuvantchemotherapy)的方法(FaggSL，a/.,(1984)BrJUrol;56:296-300,RaghavanD,a/.,(1984)MedJAust;140:276-8)(非專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)4)。首先采取涉及氨曱喋呤、長(zhǎng)春堿、多柔比星(doxombicin)和順鉑的治療方案(M-VAC)然后再進(jìn)行根治性膀胱切除術(shù)，與只進(jìn)行根治性膀胱切除術(shù)相比，這樣更可能徹底地除去殘余癌，從而改善患有局部進(jìn)行性膀胱癌患者的存活率((2003)Lancet;361:1927-34,GrossmanHB，"a/.，(2003)NEnglJMed;349:859-66)(非專利文獻(xiàn)5和非專利文獻(xiàn)6)。在一些臨床試驗(yàn)中顯示，在實(shí)施手術(shù)前采用藥物延緩腫瘤的進(jìn)展對(duì)于存活具有顯著益處(GrossmanHB,"fl/.，(2003)NEnglJMed;349:859-66,SplinterTA,"a/.，(1992)JUrol;147:606-8)(非專利文獻(xiàn)6和非專利文獻(xiàn)7);而且，對(duì)新輔助化療反應(yīng)良好的患者可以維持膀胱功能和享受生活品質(zhì)的改善。然而，尚沒有一種方法能夠預(yù)測(cè)每個(gè)患者對(duì)于M-VAC等化學(xué)療法的反應(yīng)，一些患者會(huì)遭受藥物的副作用帶來的痛苦而沒有獲得任何陽性效果的益處，而當(dāng)患者的健康狀況惡化時(shí)，常常失去了附加治療的機(jī)會(huì)。因此，鑒定適用于膀胱癌患者的新型藥物開發(fā)中的分子靶標(biāo)是非常重要的。最近的一些研究證實(shí)，通過人類腫瘤中的cDNA微陣列分析產(chǎn)生的基因表達(dá)信息可以提供鑒別明確腫瘤分類的分子表型，而這些腫瘤分類采用傳統(tǒng)的病理學(xué)方法是不容易闡明的(Armstrong,S.A,"a/.,(2002)NatGenet,30:41-47;Golub,T.R,"a/"(1999)Science,腐,531-537;Hofmann,W.K"a/"(2002)Lancet,，,481-486)(非專利文獻(xiàn)8、9、10)。進(jìn)一步，一些研究證實(shí)了這種方法對(duì)于鑒定新的癌癥相關(guān)基因的有效性。這樣的信息的希望在于改善腫瘤性疾病的臨床戰(zhàn)略的潛力。
發(fā)明內(nèi)容因此，在本文報(bào)道的研究中，本發(fā)明人使用在由27,648個(gè)轉(zhuǎn)錄元件組成的cDNA微陣列上由33例侵入性膀胱癌病例獲得的全基因組信息結(jié)合腫瘤的;敫光《鼓束顯樣i角f"剖(lasermicrobeammicrodissection,LMM)進(jìn)4亍了確斤分子靶標(biāo)的鑒定，以獲取用于分析的純的癌細(xì)胞群體。這些結(jié)果顯示這樣的信息可最終通向我們的"個(gè)性化治療"目標(biāo)。以開發(fā)新的治療靶標(biāo)為目的，為了表征與膀胱癌相關(guān)的詳細(xì)的分子機(jī)制，本發(fā)明人使用表示27,648個(gè)基因的cDNA微陣列結(jié)合激光微束顯微解剖(LMM)分析了33例癌細(xì)胞的基因表達(dá)才莫式(gene-expressionprofile)。通過比較來自診斷的膀胱癌的患者的癌細(xì)胞與正常人膀胱細(xì)胞(用作普遍對(duì)照)的表達(dá)圖式(expressionpattern),鑒定了在膀胱癌細(xì)胞中一般上調(diào)的(up-regulated)394個(gè)基因。這些基因中的288個(gè)是可以在功能上表征的(functionallycharacterized)在膀胱癌細(xì)胞中上調(diào)的基因，但余下的106個(gè)基因(包括51個(gè)EST)的功能至今不明。此外，鑒定了在膀胱癌細(xì)胞中一般下調(diào)的1272個(gè)基因，其中的1026個(gè)是可以在功能上表征的在膀胱癌細(xì)胞中下調(diào)的基因，而余下的246個(gè)基因(包括119個(gè)EST)的功能至今不明。代表性的44個(gè)上調(diào)基因的半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)中包含的基因支持我們微陣列分析的結(jié)果。因而，可以認(rèn)為本說明書中的數(shù)據(jù)提供了尋找候選基因的有用信息，這些候選基因的產(chǎn)物可以作為用于治療膀胱癌的分子靶標(biāo)。本發(fā)明基于與膀胱癌(BLC)關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)圖式的發(fā)現(xiàn)。在本說明書中，膀胱癌中差異性表達(dá)的基因統(tǒng)稱為"BLC核S交"或"BLC多核苦酸"，對(duì)應(yīng)的由其編碼的多肽稱為"BLC多肽"或"BLC蛋白質(zhì)"。通過膀胱癌的表達(dá)模式，本發(fā)明人鑒定了2個(gè)在膀胱癌細(xì)胞中顯著過表達(dá)的特異性基因，并將其分別標(biāo)示為C2093、B5860N和C6055。此外，本發(fā)明人分離了B5860N和C6055基因的新的轉(zhuǎn)錄變體(transcriptionalvariant)。進(jìn)一步證實(shí)了用siRNA處理膀胱癌細(xì)胞有效地抑制C2093、B5860N和C6055的表達(dá)、抑制膀胱癌的細(xì)胞/月中瘤生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)顯示C2093、B5860N和C6055在肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用，因此是用于開發(fā)抗癌藥的有希望的靶標(biāo)。C2093的全長(zhǎng)mRNA序列包含6319個(gè)核苷酸(SEQIDNO:1)，其編碼1780個(gè)氨基酸的多肽(SEQIDNO:2)。B5860N基因有兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄變體(圖3b),它們分別由12個(gè)外顯子和11個(gè)外顯子組成并對(duì)應(yīng)于B5860NV1(SEQIDNO:3、其編碼SEQIDNO:4)和B5860NV2(SEQIDNO:5、其編碼SEQIDNO:6)。VI的外顯子8中存在可替換的變異(altemativevariations),而其余的外顯子是兩個(gè)變體共有的。V2變體沒有VI的外顯子8，但在最后的外顯子內(nèi)產(chǎn)生相同的終止密碼子。B5860NV1和B5860NV2變體的全長(zhǎng)cDNA序列分別由5318個(gè)核苷酸和4466個(gè)核香酸組成。這些變體的ORF在各自的外顯子1中開始。V1和V2的轉(zhuǎn)錄物最終分別編碼812個(gè)和528個(gè)氨基酸的多肽。因此，本說明書中使用的術(shù)語"B5860N"指B5860NV1和B5860NV2的轉(zhuǎn)錄物中的任一個(gè)或兩者。即，在本發(fā)明的上下文中，顯示B5860N基因可表達(dá)為至少兩種轉(zhuǎn)錄變體。為了進(jìn)一步確定膀胱癌細(xì)胞系和正常人體組織，包括膀胱、心、肺、肝、腎、腦及胰中各變體的表達(dá)圖式，本發(fā)明人進(jìn)ff了Northern印跡分析(Northernblotanalysis)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種變體均在膀胱癌細(xì)胞中高度過表達(dá)，而在正常人體組織中其不表達(dá)或表達(dá)無法檢出(圖2f、下部)。具體地，V2轉(zhuǎn)錄物僅在睪丸中表達(dá)。C6055基因有4個(gè)不同的剪接變體(圖3c),它們由24個(gè)、25個(gè)、22個(gè)和22個(gè)外顯子組成，對(duì)應(yīng)于MGC34032(GeneBank登錄號(hào)N0.NMJ52697,SEQIDNO:133，其編碼SEQIDNO:134的多肽)、Genbank登錄號(hào)No.AK128063(SEQIDNO:135,其編碼SEQIDNO:136的多肽)、C6055V1(SEQIDNO:129，其編碼SEQIDNO:130的多肽)和C6055V2(SEQIDNO:131，其編碼SEQIDNO:132的多肽)(圖3c)。MGC34032的外顯子1、2、3和24存在可替換的變異，其它剩余的外顯子是4個(gè)轉(zhuǎn)錄物共有的。C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物中沒有MGC34032的外顯子1、2和3，但在最后的外顯子內(nèi)產(chǎn)生相同的終止密碼子。而且，C6055V1、C6055V2和Genbank登錄號(hào)No.AK128063轉(zhuǎn)錄物具有不同于MGC34032的外顯子24。Genbank登錄號(hào)No.AK128063具有新外顯子即外顯子4a。具體地，C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物的ORF均始于各自的外顯子4，這顯示C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物具有相同的ORF。MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055Vl和C6055V2轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)cDNA序列分別由2302、3947、3851和3819個(gè)核苷酸組成。MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物最終分別編碼719、587、675和675個(gè)氨基酸的多肽。因此，本說明書中使用的術(shù)語"C6055s"指MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2的轉(zhuǎn)錄物中的一個(gè)或多個(gè)。即，在本發(fā)明的上下文中，顯示C6055基因可表達(dá)為至少4種轉(zhuǎn)錄變體。為了進(jìn)一步確定膀胱癌細(xì)胞系和正常人體組織，包括膀胱、心、肺、肝、腎、腦及胰中各變體的表達(dá)圖式，我們進(jìn)行了Northern印跡分析。結(jié)果，約3.9kb的轉(zhuǎn)錄物在一些膀胱癌細(xì)胞(HT-1376、SW780和RT4)中高度過表達(dá)，而在正常人體組織中不表達(dá)或表達(dá)無法檢出(圖2g)。而且，7.5kb的轉(zhuǎn)錄物僅在HT-1376細(xì)胞中特異性表達(dá)，但我們尚未鑒定該轉(zhuǎn)錄物的完整mRNA序列。此外，當(dāng)使用這些轉(zhuǎn)錄物的共有區(qū)作為探針進(jìn)行Northern印跡分析，僅在正常睪丸中檢出對(duì)應(yīng)于MGC34032的2.3kb的轉(zhuǎn)錄物(圖2h)。因而，本發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了C6055V1基因產(chǎn)物的功能分析。許多抗癌藥不僅對(duì)癌細(xì)胞而且對(duì)正常生長(zhǎng)的細(xì)胞也是有毒的。然而，由于C2093、B5860Ns和C6055s的正常表達(dá)限于睪丸，抑制C2093、B5860Ns和C6055s的表達(dá)的物質(zhì)(agent)不會(huì)給其它器官造成不良影響，由此可方便地用于膀胱癌的預(yù)防和治療。因而，本發(fā)明提供新的轉(zhuǎn)錄變體B5860NV1,其可作為膀胱癌診斷標(biāo)記的候選物，還可作為用于開發(fā)膀胱癌診斷的新策略和有效抗癌劑的有希望的潛在靶標(biāo)。此外，本發(fā)明提供由該基因編碼的多肽及其產(chǎn)生和使用方法。更具體地說，本發(fā)明提供在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)提高的新的人多肽即B5860NV1或其功能等同物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，B5860NV1多肽包"l舌由SEQIDNO:3的開;j丈閱讀框編碼的811個(gè)氨基酸(SEQIDNO:4)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供分離的蛋白質(zhì)，其由B5860NV1多核苷酸序列的至少一部分或者與SEQIDNO:3所示的序列至少15%、更優(yōu)選至少25%互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼，直到這些多核普酸序列編碼B5860NV1蛋白質(zhì)或其功能等同物的程度。這樣的多核苷酸的例子是由SEQIDNO:3的序列編碼的B5860NV1的簡(jiǎn)并突變體及等位基因突變體。如本說明書中使用的，分離的基因是指一類多核苷酸，該多核苷酸的結(jié)構(gòu)不與任何天然存在的多核香酸的結(jié)構(gòu)相同，也不與任何跨越3個(gè)以上獨(dú)立基因的天然存在的基因組多核苷酸任何片段的結(jié)構(gòu)相同。因此，該術(shù)語包括例如(a)在其天然存在的生物體基因組中具有天然基因組DNA分子基因組DNA中的多核苦酸，使得由此產(chǎn)生的分子不與任何天然存在載體或基因組DNA相同；(c)獨(dú)立的分子，如cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段或限制性片段；(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因即編碼融合多肽的基因的一部分。的多核苷酸。優(yōu)選地，分離的多核苷酸包含與SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，分離的核酸分子與SEQIDNO:3所示的核普酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上的同一性。當(dāng)分離的多核苷酸比參照序列，例如SEQIDNO:3更長(zhǎng)或與之等長(zhǎng)時(shí)，其與參照序列的全長(zhǎng)進(jìn)行比較。而當(dāng)分離的多核苷酸比參照序列短，例如短于SEQIDNO:3時(shí)，其與等長(zhǎng)(除去同源性計(jì)算所需的任何環(huán))的參照序列片段進(jìn)行比較。本發(fā)明還提供產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法通過用編碼B5860NV1蛋白質(zhì)的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并表達(dá)該多核苷酸序列。另外，本發(fā)明還提供含有編碼B5860NV1蛋白質(zhì)的核苷酸序列的載體，和攜帶編碼B5860NV1蛋白質(zhì)的多核苷酸的宿主細(xì)胞。這樣的載體和宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生B5860NV1蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供特異性識(shí)別B5860NV1蛋白質(zhì)的結(jié)合劑(bindingagent)。例如，結(jié)合劑可以是針對(duì)B5860NV1蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體?？蛇x地，結(jié)合劑可以是蛋白質(zhì)的特異性配體或與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的合成多肽(參見例如WO2004/044011)。本發(fā)明還提供B5860NV1基因的反義多核香酸(例如反義DNA)、核酶和siRNA(小干擾RNA)。因而，本發(fā)明提供通過檢測(cè)源自患者的生物樣品，如組織樣品中BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平，來診斷或確定受試者患膀胱癌的素因(predisposition)的方法。術(shù)語"BLC相關(guān)基因"是指其特征在于表達(dá)水平在BLC細(xì)胞和正常細(xì)胞之間有差別的基因。正常細(xì)胞是來源于膀胱組織的細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，BLC相關(guān)基因是表4-5中列出的基因(即基因BLCNos.1-1666)。與基因的正常對(duì)照水平相比，基因表達(dá)水平的改變例如上升或下降，表示該受試者患有BLC或處于發(fā)生BLC的危險(xiǎn)中。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"對(duì)照水平"是指在對(duì)照樣品中檢出的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，其包括正常對(duì)照水平和膀胱癌對(duì)照水平。對(duì)照水平可以是來自單個(gè)參照群體的單個(gè)表達(dá)圖式，也可以是來自多個(gè)表達(dá)圖式的值。例如，對(duì)照水平可以得自以前檢測(cè)的細(xì)胞的表達(dá)圖式數(shù)據(jù)庫(kù)。"正常對(duì)照水平"是指在正常健康個(gè)體中、或者在已知未患膀胱癌的個(gè)體的群組中檢出的基因表達(dá)水平。正常個(gè)體是沒有膀胱癌臨床癥狀的個(gè)體。另一方面，"BLC對(duì)照水平"是指在患有BLC的人群中發(fā)現(xiàn)的BLC相關(guān)基因的表達(dá)模式。與正常對(duì)照水平相比，在受試樣品中檢出的一個(gè)或多個(gè)表4中列出的BLC相關(guān)基因(即過表達(dá)或上調(diào)的基因BLCNos.l-394)的表達(dá)水平上升，表明(由其獲得樣品的)受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。相反，與正常對(duì)照水平相比，在受試樣品中檢出的一個(gè)或多個(gè)表5中列出的BLC相關(guān)基因(即低表達(dá)(underexpressed)或下調(diào)的基因BLCNos.395-1666)的表達(dá)水平下降，表明該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中?？蛇x地，可以將樣品中一系列BLC相關(guān)基因的表達(dá)與該系列基因的BLC對(duì)照水平相比較。樣品表達(dá)與BLC對(duì)照表達(dá)之間的相似性表明(由其獲得樣品的)受試者患有BLC或處于發(fā)生BLC的危險(xiǎn)中。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)基因的表達(dá)與對(duì)照水平相比上升或下降至少10%、優(yōu)選至少25%、更優(yōu)選50%或以上時(shí)，可認(rèn)為基因表達(dá)水平"發(fā)生改變"?？蛇x地，當(dāng)基因的表達(dá)與對(duì)照水平相比上升或下降至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或以上時(shí)，可認(rèn)為基因表達(dá)水平"上升"或"下降"?？梢岳缭陉嚵猩蠙z測(cè)BLC相關(guān)基因探針與源自患者的組織樣品的基因轉(zhuǎn)錄物之間的雜交，從而確定基因表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，源自患者的組織樣品可以是得自受試者，例如已知或懷疑患有BLC的患者的任何組織。例如，組織可以包含上皮細(xì)胞。更具體地，組織可以是來自膀胱導(dǎo)管癌(bladderductalcarcinoma)的上皮細(xì)胞。本發(fā)明還提供診斷膀胱癌的方法，該方法包括如下步驟在來自受試者的生物樣品中測(cè)定C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平，將該基因表達(dá)水平與正常樣品中的表達(dá)水平相比4交，并定義樣品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的高表達(dá)水平表示該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。本發(fā)明還提供BLC參照表達(dá)模式，其中包含兩個(gè)或兩個(gè)以上表4-5中列出的BLC相關(guān)基因的基因表達(dá)水平?？蛇x地，BLC參照表達(dá)模式可以包含兩個(gè)或兩個(gè)以上表4中列出的BLC相關(guān)基因或表5中列出的BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平。本發(fā)明還提供通過將表達(dá)BLC相關(guān)基因的受試細(xì)胞與受試化合物接觸，并測(cè)定BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性來鑒定物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)可抑制或增強(qiáng)BLC相關(guān)基因，例如表4-5中列出的BLC相關(guān)基因的表達(dá)或活性。受試細(xì)胞可以是上皮細(xì)胞，例如得自膀胱癌的上皮細(xì)胞。與上調(diào)的BLC相關(guān)基因或其基因產(chǎn)物的正常對(duì)照水平或活性相比，受試物質(zhì)能夠降低該基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物活性，則表明受試物質(zhì)是BLC相關(guān)基因的抑制劑，可用于減輕BLC的癥狀，例如一個(gè)或多個(gè)表4中列出的BLC相關(guān)基因的表達(dá)?？蛇x地，如果與下調(diào)的BLC相關(guān)基因或其基因產(chǎn)物的正常對(duì)照水平或活性相比，受試物質(zhì)能夠提高該基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物活性，則表明受試物質(zhì)是BLC相關(guān)基因表達(dá)或功能的增強(qiáng)劑，可用于減輕BLC的癥狀，例如一個(gè)或多個(gè)表5中列出的BLC相關(guān)基因的低表達(dá)。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法。該方法包括使C2093、B5860Ns或C6055s多肽與受試化合物相接觸；和選擇與C2093、B5860Ns或C6055s多肽結(jié)合或改變其生物活性的受試化合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法。該方法包括使受試化合物與細(xì)胞相接觸，所述細(xì)胞表達(dá)C2093、B5860Ns或C6055s多肽，或?qū)肓嗽趫?bào)告基因的上游含有C2093、B5860Ns或C6055s的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的載體；和選4奪抑制C2093、B5860Ns、C6055s多肽或才艮告基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或活性的受試化合物。本發(fā)明還提供試劑盒，其含有與一個(gè)或多個(gè)BLC核酸或BLC多肽結(jié)合的檢測(cè)試劑。本發(fā)明還提供與一個(gè)或多個(gè)BLC核酸結(jié)合的核酸陣列。本發(fā)明的治療方法包括治療或預(yù)防受試者中BLC的方法，該方法包括給受試者施用反義組合物的步驟。在本發(fā)明的上下文中，反義組合物能降低特定靶基因的表達(dá)。例如，反義組合物可以含有與BLC相關(guān)基因序列互補(bǔ)的核苷酸，所述BLC相關(guān)基因序列選自表4中列出的上調(diào)的BLC相關(guān)基因?？蛇x地，本發(fā)明的方法可以包括給受試者施用小干護(hù)bRNA(siRNA)組合物的步驟。在本發(fā)明的上下文中，siRNA組合物可降低選自表4中列出的BLC相關(guān)基因的BLC核酸的表達(dá)。在另一個(gè)方法中，通過給受試者施用核酶組合物來治療或預(yù)防受試者中的BLC。在本發(fā)明上下文中，核酸特異性核酶組合物可降低選自表4中列出的BLC相關(guān)基因的BLC核酸的表達(dá)。因此，在本發(fā)明中，表4中列出的BLC相關(guān)基因是膀胱癌的優(yōu)選治療靶標(biāo)。其它治療方法包括給受試者施用化合物，所述化合物可提高一個(gè)或多個(gè)表5中列出的下調(diào)的BLC相關(guān)基因的表達(dá)，或者提高由一個(gè)或多個(gè)表5中列出的BLC相關(guān)基因編碼的多肽的活性。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明提供的藥物組合物治療或預(yù)防膀胱癌的方法。而且，本發(fā)明提供治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括施用C2093、B5860Ns或C6055s多肽的步驟?？梢灶A(yù)期的是通過施用C2093、B5860Ns或C6055s多肽來誘導(dǎo)抗肺瘤免疫。因而，本發(fā)明還提供誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，該方法包括施用C2093、B5860Ns或C6055s多肽的步驟；本發(fā)明同時(shí)還4是供用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，該藥物組合物包含C2093、B5860Ns或C6055s多肽。本發(fā)明還包括疫苗和疫苗接種(vaccination)方法。例如，治療或預(yù)防受試者中BLC的方法可包括給受試者施用疫苗，所述疫苗含有由選自表4中列出的BLC相關(guān)基因的核酸編碼的多肽或所述多肽的免疫活性片段。在本其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相類似的多肽。例如，免疫活性片段的長(zhǎng)度應(yīng)為至少8個(gè)殘基，并能夠刺激免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞或B細(xì)胞。可通過4全測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子(如IL-2)生成(elaboration)或抗體產(chǎn)生來測(cè)定免疫細(xì)胞刺激。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防膀胱癌的藥物組合物。藥物組合物例如可以是抗癌劑。藥物組合物可包含針對(duì)分別在SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135所顯示和描述的C2093、B5860Ns或C6055s多核香酸的反義S-寡核苷酸、siRNA或核酶的至少一部分。適合的siRNA以SEQIDNO:21、25或144的序列為靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的siRNA包含選自SEQIDNO:21、25或144的核苦酸序列。它們可優(yōu)選作為根據(jù)本發(fā)明的用于治療和預(yù)防膀胱癌的靶標(biāo)。藥物組合物還可以包含通過本發(fā)明方法選4奪的化合物，所述方法是篩選用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，如膀胱癌的化合物的方法。藥物組合物的作用過程優(yōu)選抑制癌細(xì)胞，如膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)?？蓪⑺幬锝M合物施用于哺乳動(dòng)物，包括人類和家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物。除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的普通技術(shù)人員所常規(guī)理解的意思相同。盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明時(shí)可使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧先绫緄^明書下面的描述。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)都全文并入本文作為參考。在存在沖突的情況下，以包括定義的本說明書為準(zhǔn)。另外，本文描述的材料、方法和實(shí)施例僅是為了說明而非限制本發(fā)明。本說明書記載的方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以在檢出膀胱癌的明顯臨床癥狀之前對(duì)疾病進(jìn)行鑒定。在結(jié)合附圖和實(shí)施例以及所附的權(quán)利要求書閱讀以下的詳細(xì)說明時(shí)，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將更加顯而易見。圖la為DNA瓊脂糖凝膠照片，顯示了使用由擴(kuò)增RNA制備的cDNA通過半定量RT-PCR考察的代表性的44個(gè)基因以及GAPDH的表達(dá)情況。開始的10個(gè)泳道顯示不同膀胱癌患者中的基因表達(dá)水平。接下來的2個(gè)泳道顯示來自正常個(gè)體的膀胱的正常轉(zhuǎn)移細(xì)胞和本體(bulk)中的基因表達(dá)水平。再接下來的4個(gè)泳道顯示正常人體組織的心、肺、肝和腎中的基因表達(dá)水平。圖lb和圖lc顯示來自21名膀胱癌患者的腫瘤細(xì)胞(IOOI,1009，1010,1012，1013，1014，1015,1016,1017,1018,1019，1020，1021，1022,1023，1024,2003，2014,3001,5001,5002)(上和中部)、膀胱癌細(xì)胞系(HT1197,UMUC3,J82,HT1376,SW780和RT4)(下部)及正常人體組織(正常本體；正常膀胱、TC;顯微解剖的轉(zhuǎn)移細(xì)胞、心、肺、肝、腎)中的C2093(b)和B5860N(c)。圖2顯示了膀胱癌細(xì)胞系和含有正常膀胱的正常人體組織的Northern印跡分析結(jié)果，所述Northern印跡分析使用DNA片段A0576N(a)、C5509(b)、F1653(c)、B9838(d)、C2093(e)、B5860N(f)和C6055(g,h)作為各自的探針。圖3顯示了(a)C2093、(b)B5860N和(c)C6055的基因組結(jié)構(gòu)。B5860N具有稱作VI和V2的兩個(gè)不同的變體。C6055具有稱作MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2的四個(gè)不同的變體。圖4顯示C2093、B5860Ns和C6055s的外源性表達(dá)和亞細(xì)胞定位。(a)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)通過Western印跡檢測(cè)的C2093蛋白質(zhì)的外源性表達(dá)；(b)C2093蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；(c)C2093的細(xì)胞周期依賴性定位；(d)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)通過Western印跡分析的B5860NVI(左部)和B5860NV2(右部)蛋白質(zhì)的外源性表達(dá)；(e)B5860NVl和(f)B5860NV2蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；(g)B^60NVI和(h)BS860NV2蛋白質(zhì)的細(xì)胞周期依賴性定位；(i)B5860NVI和B5860NV2共轉(zhuǎn)染入C0S7細(xì)胞；(j)細(xì)胞周期進(jìn)行過程中C2093的亞細(xì)胞定位；(k)細(xì)胞周期進(jìn)行過程中B5860N的亞細(xì)胞定位；(l)在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)通過Western印跡4全測(cè)的C6055蛋白質(zhì)的表達(dá)；(m)C6055蛋白質(zhì)的翻譯后修飾；(n)外源性C6O55蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。圖5顯示小干擾RNA(siRNA)的生長(zhǎng)抑制效果，所述小干擾RNA被"iS^計(jì)成可降低膀胱癌細(xì)胞中C2093的表達(dá)。(a)半定量RT-PCR，其結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞系UMUC3細(xì)胞中C2093的內(nèi)源性表達(dá)的抑制，GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照，EGFP:作為對(duì)照的EGFP序列，和SCR:作為對(duì)照的置亂序列(scramblesequence)(參見材料與方法)(b)集落形成試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除UMUC3細(xì)胞中的C2093導(dǎo)致集落數(shù)減少；(c)MTT試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除UMUC3細(xì)胞中的C2093導(dǎo)致集落數(shù)減少；(d)半定量RT-PCR，該結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞系J82細(xì)胞中C2093的內(nèi)源性表達(dá)的抑制，GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照；(e)集落形成試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除J82細(xì)胞中的C2093導(dǎo)致集落數(shù)減少；(f)MTT試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除J82細(xì)胞中的C2093導(dǎo)致集落數(shù)減少。圖6顯示小干擾RNA(siRNA)的生長(zhǎng)抑制效果，所述小干擾RNA一皮設(shè)計(jì)成可降低膀胱癌細(xì)胞中B5860N的表達(dá)。(a)半定量RT-PCR,該結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞系J82細(xì)胞中B5860N的內(nèi)源性表達(dá)的抑制，GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照，EGFP:作為對(duì)照的EGFP序列，SCR:作為對(duì)照的置亂序列(參見材料與方法)；(b)集落形成試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除J82細(xì)胞中的B5860N導(dǎo)致集落數(shù)減少；(c)MTT試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除J82細(xì)胞中的B5860N導(dǎo)致集落數(shù)減少。圖7顯示小干擾RNA(siRNA)的生長(zhǎng)抑制效果，所述小干擾RNA被設(shè)計(jì)成可降低膀胱癌細(xì)胞中C6055的表達(dá)。(a)半定量RT-PCR，該結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞系SW780細(xì)胞中C6055的內(nèi)源性表達(dá)的抑制，ACTB用作內(nèi)部對(duì)照，SCR:作為對(duì)照的置亂序列(參見材料與方法)；(b)集落形成試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除SW780細(xì)胞中的C6055導(dǎo)致集落數(shù)減少；(c)MTT試驗(yàn)，該結(jié)果證實(shí)敲除SW780細(xì)胞中的C6055導(dǎo)致集落數(shù)減少。圖8(a)由C2093-siRNA處理產(chǎn)生的多核(multi-nucleated)細(xì)胞；(b)使用抗-C2093抗體的Western印跡分析；(c)用顯微鏡方法得到的細(xì)胞形態(tài)。圖9(a)膀胱癌組織切片中C2093的表達(dá)(右部x200,左部xlOO);(b)膀胱癌組織切片中B5860N的表達(dá)(右部x200,左部xlOO);正常膀胱組織(下部)。具體實(shí)施例方式除非另有特定的說明，本說明書中使用的詞語"一個(gè)(a)"或"一種(an)"或"該(the)"是指至少一個(gè)或至少一種。膀胱癌細(xì)胞一般以實(shí)體(solidmass)的形式存在，其具有高度炎性反應(yīng)并含有多種細(xì)胞組分。因此，先前公開的微陣列數(shù)據(jù)可能反映異源模式(heterogenousprofile)?？紤]到這些問題，本發(fā)明人通過激光微束顯微解剖法(LMM)制備純化的膀胱癌細(xì)胞群，并使用表示27648個(gè)基因的cDNA微陣列分析了33例BLC的全基因組基因表達(dá)模式。這些數(shù)據(jù)不僅應(yīng)提供與膀胱致癌作用相關(guān)的重要信息，而且還應(yīng)該促進(jìn)候選基因的鑒定，這些候選基因的產(chǎn)物可作為診斷標(biāo)記和/或用于治療膀胱癌患者的分子靶標(biāo)，并提供臨床相關(guān)的信息。本發(fā)明部分地基于BLC患者的上皮細(xì)胞和癌之間的多個(gè)核酸的表達(dá)圖式變化的發(fā)現(xiàn)?；虮磉_(dá)的差異使用綜合cDNA微陣列系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。使用與激光顯微解剖聯(lián)合的表示27,648個(gè)基因的cDNA微陣列分析了來自33例BLC的癌細(xì)胞的基因表達(dá)模式。通過比較用激光顯微解剖完全選:澤的診斷為BLC的患者的癌細(xì)胞和正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞之間的表達(dá)圖式，鑒定出394個(gè)在BLC細(xì)胞中一般上調(diào)的基因(示于表4)。類似地，還可以鑒定出1272個(gè)在BLC細(xì)胞中一般下調(diào)的基因(示于表5)。此外，選擇有可能在患者的血清或痰(sputum)中檢測(cè)出癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)的候選分子標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)中，表4和5提供了在BLC和正常組織之間表達(dá)發(fā)生改變的基因的列表。的診斷用途，可改變所述BLC基因靶標(biāo)的表達(dá)以治療或減輕BLC的癥狀。在BLC患者中表達(dá)水平受到調(diào)節(jié)(即上升或下降)的基因列于表4-5，本說明書中將其統(tǒng)稱為"BLC相關(guān)基因"、"BLC核酸'，或"BLC多核苷酸"；對(duì)應(yīng)的由其編碼的多肽稱為"BLC多肽"或"BLC蛋白質(zhì)"。除非另外說明，術(shù)語"BLC"是指本說明書公開的任何序歹'j(例如表4-5中列出的BLC相關(guān)基因)。對(duì)于先前已經(jīng)描述的基因，同時(shí)給出其數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)。通過測(cè)定細(xì)胞樣品中各種基因的表達(dá)，可以診斷BLC。類似地，測(cè)定這些基因應(yīng)答于各種物質(zhì)的表達(dá)，可以鑒定用于治療BLC的物質(zhì)。本發(fā)明包括確定(例如測(cè)定)至少一種直至全部的表4-5中列出的BLC相關(guān)基因的表達(dá)。使用由已知序列的GenBankTM數(shù)據(jù)庫(kù)登錄項(xiàng)提供的序列信息，可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測(cè)和測(cè)定BLC相關(guān)基因。用于在例如Northern印跡雜交分析中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于BLC相關(guān)基因的RNA序列。探針通常包括參照序列的至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)或至少200個(gè)核普酸。作為另一個(gè)例子，可以使用序列構(gòu)建引物，用于在例如基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法，如基于逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中特異性擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)BLC核酸。然后，將受試細(xì)胞群體，例如源自患者的組織樣品中的一個(gè)或多個(gè)BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平與參照群體中相同基因的表達(dá)水平相比較。參照細(xì)胞群體包括一種或多種已知比較參數(shù)的細(xì)胞，即膀胱導(dǎo)管癌細(xì)胞(例如BLC細(xì)胞)或正常膀胱導(dǎo)管上皮細(xì)胞(例如非BLC細(xì)胞)。與參照細(xì)胞群體相比，受試細(xì)胞群體中的基因表達(dá)圖式是否能表示BLC或其素因取決于參照細(xì)胞群體的組成。例如，如果參照細(xì)胞群體由非BLC細(xì)胞組成，受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間基因表達(dá)圖式的相似性表示受試細(xì)胞群體是非BLC。反之，如果參照細(xì)胞群體由BLC細(xì)胞組成，受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間的基因表達(dá)模式的相似性表示受試細(xì)胞群體含有BLC細(xì)胞。如果受試細(xì)胞群體中BLC標(biāo)記基因的表達(dá)水平與參照細(xì)胞群體中相應(yīng)BLC標(biāo)記基因的表達(dá)水平相差大于1.1倍、大于1.5倍、大于2.0倍、大于5.0倍、或大于10.0倍或更多，即可認(rèn)為其"發(fā)生改變"。受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間的差異基因表達(dá)可以相對(duì)于對(duì)照核酸，例如持家基因(housekeepinggene)進(jìn)行歸一化。例如，對(duì)照核酸是已知在細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)中不存在差異的核酸?？梢岳脤?duì)照核酸的表達(dá)水平對(duì)受試和參照群體中的信號(hào)水平進(jìn)行歸一化。例示性的對(duì)照基因包括但不限于例如(3-肌動(dòng)蛋白、甘油醛3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl?？梢詫⑹茉嚰?xì)胞群體與多個(gè)參照細(xì)胞群體相比較。其中每個(gè)參照群體的已知參數(shù)可以不同。因此，可將受試細(xì)胞群體與已知含有例如BLC細(xì)胞的第一參照細(xì)胞群體和已知含有例如非BLC細(xì)胞(例如正常細(xì)胞)的第二參照細(xì)胞群體相比較。受試細(xì)胞可以包含在來自受試者的組織類型或細(xì)胞樣品中，所述組織類型或細(xì)胞樣品已知含有或疑似含有BLC細(xì)胞。受試細(xì)胞優(yōu)選得自身體組織或體液，例如生物液體(如血液、痰或尿液)。例如，受試細(xì)胞可以純化自膀胱組織。優(yōu)選受試細(xì)胞群體含有上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞優(yōu)選來自已知或疑似為膀胱導(dǎo)管癌的組織。參照細(xì)胞群體中的細(xì)胞應(yīng)來自與受試細(xì)胞類似的組織類型。任選地，參照細(xì)胞群體是細(xì)胞系，例如BLC細(xì)胞系(即陽性對(duì)照)或正常非BLC細(xì)胞系(即陰性對(duì)照)?；蛘撸瑢?duì)照細(xì)胞群體可源自分子信息數(shù)據(jù)庫(kù)，所述分子信息來源于已知檢測(cè)參數(shù)或條件的細(xì)胞。優(yōu)選受試者為哺乳動(dòng)物。例示性的哺乳動(dòng)物包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、犬、貓、馬或牛?？蒦f吏用本領(lǐng)域已知的方法，在蛋白質(zhì)或核酸水平上測(cè)定本說明書公開的基因的表達(dá)。例如，可以使用Northern雜交分析測(cè)定基因表達(dá)，所述Northern雜交分析使用特異性識(shí)別這些核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)序列的4笨針?？蛇x地，可以使用例如差異表達(dá)基因序列的特異性引物，采用基于逆轉(zhuǎn)錄的PCR檢測(cè)法測(cè)定基因表達(dá)。還可以在蛋白質(zhì)水平上測(cè)定表達(dá)，即通過測(cè)定由本說明書所述基因編碼的多肽水平或其生物活性來測(cè)定表達(dá)。這樣的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于例如免疫測(cè)定法，該方法利用了針對(duì)所述基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體。由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的生物活性一般是公知的。為了闡明膀胱癌的機(jī)制并鑒定用于治療和預(yù)防這些腫瘤的新診斷標(biāo)記和/或藥物靶標(biāo)，本發(fā)明人使用全基因組cDNA微陣列結(jié)合激光微束顯微解剖分析了膀胱癌中的基因表達(dá)模式。結(jié)果，鑒定出在膀胱癌細(xì)胞中特異性過表達(dá)的C2093、B5860N和C6055。此外，用小干擾RNA(siRNA)抑制C2093、B5860N和C6055基因的表達(dá)導(dǎo)致顯著的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。這些發(fā)現(xiàn)顯示，C2093、B5860N和/或C6055爿武予癌細(xì)"包致癌活性，而抑制這些蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)的活性可以成為治療或預(yù)防增殖性疾病如膀胱癌的有希望的策略。脂6匿才艮據(jù)本發(fā)明，鑒定了具有相似序列的cDNA，它們編碼B5860N的變體。較長(zhǎng)的變體的cDNA由5318個(gè)核苷酸組成，其中包含2436個(gè)核苦酸的開放閱讀框(SEQIDNO:3)。目前已知的B5860N的開放閱讀框由1584個(gè)核苦酸組成，其編碼527個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(GeneBank登錄號(hào)NM—017779)。因此，由5318個(gè)核香酸組成的較長(zhǎng)的變體是本發(fā)明最新發(fā)現(xiàn)的。而且，編碼527個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的B5860NcDNA的已知序列由3338個(gè)核苷酸組成。然而，在本發(fā)明中，分離了由4466個(gè)核苦酸組成的B5860N的全長(zhǎng)cDNA。與已知的核苷酸序列相比，這個(gè)較短的變體的核苷酸序列包含新的3'-UTR序列，但由此編碼的兩個(gè)氨基酸序列相同。本說明書中，編碼已知的527個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的較短的變體和編碼新的811個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的較長(zhǎng)的變體的4爭(zhēng)錄物分別描述為B5860NV2和B5860NV1。B5860NV2和B5860NV1的核芬酸序列及由其編碼的氨基酸序列列于以下的SEQIDNOs。核苷酸序列氨基酸序列B5860NV1SEQIDNO:3SEQIDNO:4B5860NV2SEQIDNO:5SEQIDNO:6因此，本發(fā)明提供由較長(zhǎng)的變體B5860NV1以及其其功能等同物(以它們編碼B5860NV1蛋白質(zhì)為P艮)編碼的基本上純的多肽，其包括含有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。與B5860NV1在功能上等同的多肽的例子包括例如對(duì)應(yīng)于人B5860NV1蛋白質(zhì)的其它生物體的同源蛋白質(zhì)，以及人B5860NV1蛋白質(zhì)的突變體。C柳5根據(jù)本發(fā)明，鑒定了具有相似序列的cDNA,它們編碼C6055的變體。根據(jù)NCBI^:據(jù)庫(kù)，C6055位于染色體lp31.3,由24個(gè)外顯子組成，稱作MGC34032。由于C6055不包含在數(shù)據(jù)庫(kù)中的MGC34032的最后一個(gè)外顯子(外顯子24)中，所以本發(fā)明人使用膀胱癌細(xì)胞系SW780作為^^莫板完成RT-PCR,從而進(jìn)行EST-步移(EST-walking)、5'RACE和3，RACE實(shí)驗(yàn)，以獲得C6055的全長(zhǎng)cDNA序列(參見材料與方法)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了》個(gè)新轉(zhuǎn)錄物即C6055V1和C6055V2。最后，該基因具有4個(gè)不同的剪接突變體，它們分別由24、25、22和22個(gè)外顯子組成，對(duì)應(yīng)于MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2(圖3c)。MGC34032的外顯子l、2、3、4和24存在可替換的剪接，其余的外顯子是4個(gè)轉(zhuǎn)錄物共有的。C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物中沒有MGC34032的外顯子1、2和3，但在最后的外顯子內(nèi)產(chǎn)生相同的終止密碼子。具體地，C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物的ORF均始于各自的外顯子4,這顯示C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物具有相同的ORF。MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)cDNA序列分別由2302、3947、3851和3819個(gè)核芬酸組成。最終，MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物分別編碼719、587、675和675個(gè)氨基酸的多肽。C6055V1和C6055V2的核苷酸序列及由其編碼的氨基酸序列列于以下的SEQIDNOs。核芬酸序列氨基酸序列C6055V1SEQIDNO:129SEQIDNO:130C6055V2SEQIDNO:131SEQIDNO:132因此，本發(fā)明提供由較長(zhǎng)的變體C6055V1或C6055V2以及其功能等同物(以它們編碼Genbank登錄號(hào)No.AK128063的蛋白質(zhì)為限)編碼的基本上純的多肽，其包括含有SEQIDNO:130和SEQIDNO:132的氨基酸序列的多肽。與C6055V1或C6055V2在功能上等同的多肽的例子包括例如對(duì)應(yīng)于人C6055V1或C6055V2蛋白質(zhì)的其它生物體的同源蛋白質(zhì)及人C6055V1或C6055V2蛋白質(zhì)的突變體。在本發(fā)明中，術(shù)語"功能上等同的"是指對(duì)象多肽具有如B5860NV1蛋白的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性及賦予癌細(xì)胞致癌活性的活性。將編碼對(duì)象多肽的DNA導(dǎo)入細(xì)胞并表達(dá)各種多肽，然后檢測(cè)細(xì)胞增殖的促進(jìn)或集落形成活性的提高，可以判斷對(duì)象多肽是否具有細(xì)胞增殖活性。這樣的細(xì)胞例如包括NIH3T3，COS7和HEK293。用于制備與給定的蛋白質(zhì)功能上等同的多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括在蛋白質(zhì)中導(dǎo)入突變的已知方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過定點(diǎn)誘變(Hashimoto-Gotohetal.,Gene152:271-275(1995);ZollerandSmith,MethodsEnzymol100:468-500(1983);Krameretal.,NucleicAcidsRes.12:9441-9456(1984);KramerandFritz,MethodsEnzymol154:350-367(1987);Kunkel,ProcNatlAcadSciUSA82:488-492(1985);Kunkel,MethodsEnzymol,204:125-39)在人B5860NV1蛋白質(zhì)的氨基酸序列中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)耐蛔儯瑥亩苽渑c所述的蛋白質(zhì)功能上等同的多肽。氨基酸突變也可自然發(fā)生。只要獲得的突變多肽與人B5860NV1蛋白質(zhì)功能上等同，本發(fā)明的多肽包括具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生了突變的人B5860NV1蛋白質(zhì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，突變數(shù)一般為全部氨基酸的35%以下，優(yōu)選30%以下，更優(yōu)選為25%、20%、10%、5%、2%或1%以下。具體地，這樣的突變體中發(fā)生突變的氨基酸的數(shù)目一般為200個(gè)或100個(gè)氨基酸或更少，通常為10個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選6個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選3個(gè)氨基酸或更少。已知經(jīng)突變或修飾的蛋白質(zhì)能保留原始的生物活性，其中所述蛋白質(zhì)具有通過在某一氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而修飾的氨基酸序歹寸(Mark"a/.,ProcNatlAcadSciUSA81:5662-5666(1984);ZollerandSmith,NucleicAcidsRes10:6487-6500(1982);Dalbadie-McFarlandetal.,ProcNatlAcadSciUSA79:6409-6413(1982))。因此，優(yōu)選將待突變的氨基酸殘基突變?yōu)楸Ａ舭被醾?cè)鏈性質(zhì)的不同氨基酸(該過程稱為保守氨基酸取代)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的例子為疏水氨基酸(A,I，L,M,F,P,W，Y,V)、親水氨基酸(R,D，N,C,E，Q,G,H，K,S,T)以及具有以下官能團(tuán)或共有特性的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(GA，V，L,I,P);含羥基側(cè)鏈(S，T,Y);含硫原子側(cè)鏈(C，M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D,N,E，Q);含堿性基團(tuán)側(cè)鏈(R,K,H)和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn),Y，W)。需說明的是括號(hào)中的字母表示氨基酸的單字母符號(hào)。在人B5860NV1蛋白質(zhì)的氨基酸序列中添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基所得多肽的例子是含有人B5860NV1蛋白質(zhì)的融合蛋白。本發(fā)明包括人B5860NV1蛋白質(zhì)與其它肽或蛋白質(zhì)的融合物即融合蛋白。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)可制備融合蛋白，例如可以將編碼本發(fā)明的人B5860NV1蛋白質(zhì)的DNA與編碼其它肽或蛋白質(zhì)的DNA連接以使讀碼框匹配，將融合DNA插入表達(dá)載體并在宿主中表達(dá)所述融合DNA。對(duì)于可與本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的肽或蛋白質(zhì)沒有限制?？梢杂米髋c本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的已知肽包括例如FLAG(Hoppetal.,(1988)Biotechnology6:1204-10)、含有6個(gè)His(組氨酸)殘基的6xHis、10xHis、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV片段、T7-標(biāo)簽、HSV-標(biāo)簽、E-標(biāo)簽、SV40T抗原片段、lck標(biāo)簽、a-微管蛋白片段、B-標(biāo)簽、蛋白C片段等。可以與本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)實(shí)例包括GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、(3-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結(jié)合蛋白)等。通過將編碼上述融合肽或蛋白質(zhì)的商業(yè)上可得到的DNA與編碼本發(fā)明的多肽的DNA融合，并表達(dá)所制備的融合DNA,即可制備出融合蛋白。可選地，可以采用本領(lǐng)域公知的方法，例如使用雜交技術(shù)來分離功能上等同的多肽(Sambrook"a/"(1989)MolecularCloning2nded.9,47-9.58，ColdSpringHarborLab.Press)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地分離出與編碼人B5860NV1蛋白質(zhì)的DNA序列(即SEQIDNO:3)的全部或部分具有高度同源性的DNA,并且由分離的DNA分離與人B5860NV1蛋白質(zhì)功能上等同的多肽。本發(fā)明的多肽包括由DNA編碼的多肽，所述DNA與編碼人B5860NV1蛋白的DNA序列的全部或部分雜交，并且本發(fā)明的多肽功能上等同于人B5860NV1蛋白。這些多肽包括對(duì)應(yīng)于源自人的蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物同源物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因編碼的多肽)。在從動(dòng)物中分離與編碼人B5860NV1蛋白質(zhì)的DNA高度同源的cDNA時(shí)，特別優(yōu)選使用來自睪丸的組織或膀胱癌組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按常規(guī)選擇雜交條件，用于分離編碼與人B5860NV1蛋白質(zhì)功能上等同的多肽的DNA。例如雜交可通過如下方式進(jìn)或更長(zhǎng)時(shí)間，加入標(biāo)記的探針，并在68。C保溫1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。其后的洗滌步驟，例如可以在低度嚴(yán)緊條件下進(jìn)行。低度嚴(yán)緊條件為，例如42Tl、2xSSC、0.1%SDS,或優(yōu)選50。C、2xSSC、0.1%SDS。更優(yōu)選使用高嚴(yán)緊條件。高嚴(yán)緊條件為，例如室溫下用2xSSC、0.01。/。SDS洗滌3次、每次20分鐘，然后于37。C用lxSSC、0.1。/。SDS洗滌3次，每次20分鐘，再于50。C用lxSSC、0.1。/。SDS洗滌2次、每次20分鐘。然而，幾種因素，如溫度和鹽濃度會(huì)影響可以采用基因擴(kuò)增法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法代替雜交來分離編碼與人B5860NV1蛋白質(zhì)功能上等同的多肽的DNA，所述基因擴(kuò)增法使用基于編碼蛋白質(zhì)的DNA的序列信息(SEQIDNO:3)合成的引物。由通過上述雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)分離的DNA編碼的、與人B5860NV1蛋白質(zhì)功能上等同的多肽一般與人B5860NV1蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有高度同源性。本說明書中使用的術(shù)語"高同源性"一般指多肽或多核苷酸序列與其參照序列之間的同源性為40%或更高，優(yōu)選為60%或更高，更優(yōu)選為80%或更高，甚至更優(yōu)選85%、90%、93%、95%、98%、99%或更高。百分比同源性(百分比同一性)通常在兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)的序列之間測(cè)定。為較可例如葉吏用"WilburandLipman，(1983)ProcNatlAcadSciUSA80:726-30"中的算法進(jìn)行。本發(fā)明的多肽在氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、存在或不存在糖鏈或形式等方面可以存在差異，這取決于用于產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞或宿主或者采用的純化方法。無論如何，只要該多肽具有等同于本發(fā)明的人B5860NV1蛋白質(zhì)的功能，就落入本發(fā)明的范圍。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可以以重組蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)的形式制備本發(fā)明的多肽。采用下述方法可以制備重組蛋白質(zhì)將編碼本發(fā)明多肽的DNA(例如含有核苷酸序列SEQIDNO:3的DNA)插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，將載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，獲得提取物，然后對(duì)提取物進(jìn)行層析以純化多肽，所述層析包括例如離子交換層析、反相層析、凝膠過濾、或利用固定有抗本發(fā)明蛋白質(zhì)抗體的柱子的親和層析，或多于一種所述柱的組合。此外，當(dāng)在宿主細(xì)胞(例如動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌)中以與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白的形式、或者以添加了多個(gè)組氨酸的重組蛋白的形式表達(dá)本發(fā)明的多肽時(shí)，可以使用谷胱甘肽柱或鎳柱純化所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)?；蛘?，當(dāng)以用c-myc、多個(gè)組氨酸或FLAG標(biāo)記的蛋白質(zhì)的形式表達(dá)本發(fā)明的多肽時(shí)，可以分別使用針對(duì)c-myc、His或FLAG的抗體進(jìn)行檢測(cè)和純化。純化融合蛋白之后，根據(jù)需要也可以通過用凝血酶或Xa因子切割融合蛋白來除去目的多肽之外的區(qū)域?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法分離出天然蛋白質(zhì)，所述方法例如使下述的結(jié)合有可與B5860NV1蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的親和柱與表達(dá)本發(fā)明的多肽的組織或細(xì)胞的提取物接觸。本發(fā)明還包括本發(fā)明的多肽的部分肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的部分肽包含選自氨基酸序列SEQIDNO:4的304-588位的氨基酸序列或其部分。與B5860NV2相比較，304-588位之間延伸的氨基酸序列是B5860NV1特異性區(qū)域。部分多肽具有本發(fā)明的多肽特有的氨基酸序列，并由至少7個(gè)、優(yōu)選至少8個(gè)或更多、更優(yōu)選至少9個(gè)或更多氨基酸組成。部分肽例如可以用于制備抗本發(fā)明的多肽的抗體、篩選與本發(fā)明的多肽結(jié)合的化合物以及篩選本發(fā)明的多肽的抑制劑。通過基因工程操作、通過已知的肽合成法或通過用適當(dāng)?shù)碾拿赶景l(fā)明的多肽，均可以產(chǎn)生本發(fā)明的部分肽。例如，肽合成可以采取固相合成或液相合成。本發(fā)明還提供編碼上述B5860NV1多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以用于體內(nèi)或體外產(chǎn)生上述本發(fā)明的多肽，或者可以用于由編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因的基因異常所致疾病的基因治療?？梢允褂帽景l(fā)明的多核苷酸的任何形式，只要其編碼本發(fā)明的多肽，其包括mRNA、RNA、cDNA、基因組DNA和化學(xué)合成的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列的DNA,只要所得的DNA能夠編碼本發(fā)明的多肽?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備本發(fā)明的多核香酸。例如可以采用以下方法制備本發(fā)明的多核苷酸由表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，然后以本發(fā)明的DNA(例如SEQIDNO:3)的部分序列為探針進(jìn)行雜交。采用Sambrookea/"MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中所述的方法可以制備cDNA文庫(kù)；或者可以使用商業(yè)上可得到的cDNA文庫(kù)。還可以采用下述方法制備cDNA文庫(kù)從表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞中提取RNA，基于本發(fā)明DNA的序列(例如SEQIDNO:3)合成寡聚DNA,以寡聚DNA為引物進(jìn)行PCR，并擴(kuò)增編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的cDNA。另夕卜，通過對(duì)所得cDNA的核普酸進(jìn)行測(cè)序，可以常規(guī)地確定由cDNA編碼的翻譯區(qū)，這樣就可以容易地獲得本發(fā)明的多肽的氨基酸序列。而且，通過以所得cDNA或其部分作為.'探針篩選基因組DNA文庫(kù)，可以分離出基因組DNA。更具體地，可以從表達(dá)本發(fā)明的對(duì)象多肽的細(xì)胞、組織、器官(例如睪丸)或膀胱癌細(xì)胞系中首次制備mRNA?？梢圆捎霉姆椒ǚ蛛xmRNA。例如，總RNA的制備可以采用胍超離心法(Chirgwin"a/.,(1979)Biochemistry18:5294-9)或AGPC法(ChomczynskiandSacchi,(1987)AnalBiochem162:156-9)。另外，可以使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等由總RNA純化mRNA?；蛘?，可以使用QuickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化mRNA。獲得的mRNA可用于使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA?？梢允褂蒙虡I(yè)上可得到的試劑盒，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈合成試劑盒(SeikagakuKogyo)等合成cDNA?；蛘?，可以采用使用本說明書所述引物等、5，-AmpliFINDERRACE試劑盒(Clontech)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，按照5，-RACE法(Frohman"a/.,ProcNatlAcadSciUSA85:8998-9002(1988);Belyavsky"a/.,NucleicAcidsRes17:2919-2932(1989))合成和擴(kuò)增cDNA。由PCR產(chǎn)物制備所需DNA片段，并與載體DNA連接。使用重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，由選出的菌落制備所需的重組載體。采用常規(guī)方法，如雙脫氧核芬酸鏈終止法驗(yàn)證所需DNA的核苷酸序列。考慮到待用于表達(dá)的宿主中密碼子使用的頻率，本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列可以設(shè)計(jì)成能夠更有效地表達(dá)的形式(Grantham"/.，NucleicAcidsRes9:43-74(1981))?？梢允褂蒙虡I(yè)上可得到的試劑盒或常規(guī)方法改變本發(fā)明的多核苷酸的序列。例如，可以通過用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或適當(dāng)?shù)亩嗪丝嗨崞巍⑻砑咏宇^或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA,TGA或TAG)的方式改變序列。具體地說，本發(fā)明的多核苦酸包括含有SEQIDNO:3的核苷酸序列的DNA。此外，本發(fā)明提供可在嚴(yán)緊條件下與具有SEQIDNO:3的核苷酸序列的多核苷酸雜交、并且編碼上述本發(fā)明的與B5860NV1蛋白質(zhì)功能上等同的多肽的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜地選擇合適的嚴(yán)緊條件。例如，可以采用低嚴(yán)緊條件。優(yōu)選采用高嚴(yán)緊條件。這些條件與前述的條件相同。上述的雜交DNA優(yōu)選為cDNA或染色體DNA。本發(fā)明還提供與編碼人B5860NV1蛋白質(zhì)的多核苷酸(SEQIDNO:3)或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)的、并含有至少15個(gè)核苷酸的多核苦酸，其中所述多核苷酸可與SEQIDNO:3的988-1842位之間延伸的核苷酸序列雜交。本發(fā)明的多核苦酸優(yōu)選與編碼本發(fā)明的B5860NV1多肽的DNA特異性雜交的多核苷酸。如本文使用的術(shù)語"特異性雜交"指在通常的雜交條件下、優(yōu)選在嚴(yán)緊的雜交條件下不與編碼其它蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生明顯的交叉雜交(cross-hybridization)。這樣的多核苷酸包括與編碼本發(fā)明的多肽的DNA或其互補(bǔ)鏈特異性雜交的探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如，反義寡核苷酸和核酶)。此外，這樣的多核苷酸可以用于制備DNA芯片。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供導(dǎo)入了本發(fā)明的多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體可以用于在宿主細(xì)胞中維持本發(fā)明的多核苷酸、尤其是DNA,以表達(dá)本發(fā)明的多肽，或者施用本發(fā)明的多核苷酸用于基因治療。當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌，并且在大腸桿菌(如JM109,DH5a,HB101或XLlBlue)中大量擴(kuò)增和制備載體時(shí)，載體應(yīng)具有用于在大腸桿菌中擴(kuò)增的"ori"和用于選擇轉(zhuǎn)化大腸桿菌的標(biāo)記基因(例如通過藥物，如氨千青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另夕卜，與上述載體相同，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用于亞克隆和提耳又cDNA。當(dāng)使用載體制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，表達(dá)載體是特別有用的。例如，在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體須具備上述特征，以便在大腸桿菌中擴(kuò)增。當(dāng)將大腸桿菌，如JM109,DH5ot,HB101或XLlBlue用作宿主細(xì)胞時(shí)，載體應(yīng)具有在大腸桿菌中有效表達(dá)所需基因的啟動(dòng)子，例如lacZ啟動(dòng)子(Wardetal.，Nature341:544-546(1989);FASEBJ6:2422-2427(1992))、araB啟動(dòng)子(Betteretal.,Science240:1041-1043(1988))、T7啟動(dòng)子等。在這方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、"QIAexpress系統(tǒng)，，(Qiagen)、pEGFP和pET(此時(shí)，宿主優(yōu)選為表達(dá)T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體也可以含有用于多肽分泌的信號(hào)序列。指導(dǎo)多肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號(hào)序列為pe舊信號(hào)序列(Leiefa/.，JBacteriol169:4379(1987))。將載體導(dǎo)入耙宿主細(xì)胞的方法包括例如氯化4丐法和電穿孔法。除大腸桿菌外，可以使用下述載體制備本發(fā)明的多肽例如源自哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEF-BOS(MizushimaSandNagataS,(1990)NucleicAcidsRes18(17):5322)、pEF、pCDM8),源自昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體(例如"Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)"(GIBCOBRL),pBacPAK8)，源自植物的表達(dá)載體(例如pMHl，pMH2)，源自動(dòng)物病毒的表達(dá)載體(例如pHSV,pMV,pAdexLcw),源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如pZIpneo),源自酵母的表達(dá)載體(例如"畢赤酵母表達(dá)試劑盒"(Invitrogen),pNVll,SP-Q01)以及源自枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體(如pPL608，pKTH50)。為了在動(dòng)物細(xì)胞，如CHO,COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)載體，載體應(yīng)具有在所述細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)所必需的啟動(dòng)子，例如SV40啟動(dòng)子(Mulligan"Nature277:108(1979))、MMLV-LTR啟動(dòng)子、EFlot啟動(dòng)子(Mizushima"a/.,NucleicAcidsRes18:5322(1990))、CMV啟動(dòng)子等，和優(yōu)選用于選4奪轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因(例如通過藥物(例如新霉素、G418)進(jìn)行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。產(chǎn)生多肽另外，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法。通過培養(yǎng)攜帶表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可以制備多肽，其中所述表達(dá)載體含有編碼所述多肽的基因。根據(jù)需要，可以采用一些方法穩(wěn)定地表達(dá)基因的同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增基因的拷貝數(shù)。例如，可以將含有補(bǔ)償性(complementary)DHFR基因的載體(例如pCHOI)導(dǎo)入核酸合成途徑缺陷的CHO細(xì)胞，然后利用氨曱蝶呤(MTX)擴(kuò)增該載體。另外，當(dāng)瞬時(shí)表達(dá)基因時(shí)，可以采用如下方法用含有SV40復(fù)制起點(diǎn)的載體(pcD等)轉(zhuǎn)化入染色體上含有SV40T抗原表達(dá)基因的COS細(xì)胞。按上述方法獲得的本發(fā)明多肽可分離自宿主細(xì)胞的內(nèi)部或外部(如培養(yǎng)基)，并被純化成基本上純的均質(zhì)多肽。本說明書中使用的與給定多肽有關(guān)的術(shù)語"基本上純的"是指多肽基本上不含有其它生物大分子?；旧霞兊亩嚯氖且愿芍乇硎镜闹辽?5%(例如至少80%、85%、95%或99%)的純度?？刹捎萌魏芜m當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)定純度，所述方法例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。多肽的分離和純化方法并不局限于任何特定的方法，實(shí)際上可以采用任何標(biāo)準(zhǔn)方法。例如，可以適當(dāng)選擇和組合柱層析、過濾、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳、透析和重結(jié)晶等方法，進(jìn)行多肽的分離與純化。層析的例子包括例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.Ed.DanielR.Marshaketal"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996)》通過液相色謙，如HPLC和FPLC即可進(jìn)行這些層析。因此，本發(fā)明提供通過上述方法制備的高純度多肽。在純化前和/或純化后用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)修飾酶處理本發(fā)明的多肽，可對(duì)其進(jìn)行任意修飾或部分缺失。有用的蛋白質(zhì)修飾酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、賴氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。膀胱癌的診斷在本發(fā)明的上下文中，通過測(cè)定受試細(xì)胞群體(即源自患者的生物樣品)中一種或多種BLC核酸的表達(dá)水平來診斷BLC。優(yōu)選受試細(xì)胞群體含有上皮細(xì)胞，例如由膀胱組織獲得的細(xì)胞。還可以由血液或其它體液(如尿液)測(cè)定基因表達(dá)。其它生物樣品可用于測(cè)定蛋白質(zhì)水平。例如，可采用免疫測(cè)定法或其它常規(guī)生物學(xué)試驗(yàn)測(cè)定來自待診斷受試者的血液或血清中的蛋白質(zhì)水平。在受試細(xì)胞或生物樣品中測(cè)定一種或多種BLC相關(guān)基因，例如表4-5中所列基因的表達(dá)，并將其與受試的一種或多種BLC相關(guān)基因有關(guān)的正常對(duì)照表達(dá)水平進(jìn)行比較。正常對(duì)照水平是通常在已知未患BLC的人群中存在的BLC相關(guān)基因的表達(dá)模式。在源自患者的組織樣品中，一種或多種BLC相關(guān)基因表達(dá)水平的改變(例如上升或下降)表示該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。例如，與正常對(duì)照水平相比，受試群體中一種或多種列于表4中的上調(diào)的BLC相關(guān)基因的表達(dá)上升，表示該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。與之相對(duì)，與正常對(duì)照水平相比，受試群體中一種或多種列于表5中的下調(diào)的BLC相關(guān)基因的表達(dá)下降，表示該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。與正常對(duì)照水平相比，受試群體中一種或多種BLC相關(guān)基因表達(dá)水平的改變表示該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。例如，一系列BLC相關(guān)基因(表4-5列出的基因)的至少1%、至少5%、至少25%、至少50%、至少60%、至少80%、至少90%或更多發(fā)生改變，表示該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。而且，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的基因表達(dá)水平為診斷標(biāo)記，診斷細(xì)胞增殖性疾病如膀胱癌的方法。該診斷方法包括如下步驟(a)檢測(cè)C2093、B5860N和C6055基因中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平；和(b)將表達(dá)水平的上升與膀胱癌相聯(lián)系。在本發(fā)明的上下文中，B5860N基因的轉(zhuǎn)錄物包括B5860NV1和B5860NV2。在本發(fā)明的上下文中，C6055基因的轉(zhuǎn)錄物包括MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2。通過定量分析對(duì)應(yīng)于C2093、B5860Ns或C6055s基因的mRNA或者由這些基因編碼的蛋白質(zhì)，可以評(píng)估生物樣品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平。mRNA的定量分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，可以通過Northern印跡分析或RT-PCR來評(píng)估對(duì)應(yīng)于C2093、B5860Ns或C6055s基因的mRNA的水平。C2093基因的全長(zhǎng)核苦酸序列示于SEQIDNO:1?？蛇x地，B5860N基因轉(zhuǎn)錄物的2個(gè)變體形式的全長(zhǎng)核苷酸序列也示于SEQIDNO:3和5。可選地，C6055基因轉(zhuǎn)錄物的4個(gè)變體形式的全長(zhǎng)核苷酸序列也示于SEQIDNO:129、131、133和135。因此，任4可本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出用于定量分析C2093、B5860N或C6055基因的4笨針或引物的核芬酸序列。此外，基于由C2093、B5860Ns或C6055s基因編碼的蛋白質(zhì)的活性或量(quantity),可以分析這些基因的表達(dá)水平。測(cè)定C2093、B5860N或C6055蛋白質(zhì)的量的方法顯示如下。例如，免疫測(cè)定法在測(cè)定生物材料中的蛋白質(zhì)方面是十分有效的。只要膀胱癌患者的樣品中表達(dá)標(biāo)記基因(即C2093、B5860Ns或C6055s基因)，可以將任何生物材料用作測(cè)定蛋白質(zhì)或其活性的生物樣品。例如，在本發(fā)明的上下文中，膀胱組織是優(yōu)選的生物樣品，而體液，如血液及尿液同樣可以用于分析。另一方面，為了測(cè)定由C2093、B5860Ns或C6055s基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，可根據(jù)待分析的蛋白質(zhì)的活性選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。?duì)生物樣品中的C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估，并與正常樣品(例如源自非患病受試者的樣品)中的表達(dá)水平相比較。當(dāng)這樣的比較顯示目標(biāo)基因的表達(dá)水平比正常樣品中的表達(dá)水平高，則可以判定該受試者患有膀胱癌?？梢酝瑫r(shí)測(cè)定來自正常受試者和待診斷受試者的生物樣品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平?；蛘呖梢圆捎媒y(tǒng)計(jì)學(xué)方法，基于通過分析從對(duì)照組預(yù)先采集的樣品中基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果，確定出表達(dá)水平的正常范圍。通過將受試者樣品獲得的結(jié)果與正常范圍進(jìn)行比較而獲得結(jié)果，當(dāng)該結(jié)果未落入正常范圍時(shí)，可以判定受試者患有(affectedwith)膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。在本發(fā)明中，還提供診斷細(xì)胞增殖性疾病，如膀胱癌的診斷試劑。本發(fā)明的診斷試劑包括與C2093、B5860Ns或C6055s基因轉(zhuǎn)錄物或由其編碼的多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，可與含有選自SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135的核苷酸序列的多核苦酸雜交的寡核普酸，或者可與由選自SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136的氨基酸序列組成的多肽結(jié)合的抗體可用作這樣的化合物。鑒定抑制或增強(qiáng)BLC相關(guān)基因表達(dá)的物質(zhì)使表達(dá)BLC相關(guān)的上調(diào)基因的受試細(xì)胞群與受試物質(zhì)接觸，然后測(cè)定BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性，可以鑒定抑制BLC相關(guān)基因的表達(dá)或其基因產(chǎn)物的活性的物質(zhì)。與不存在受試物質(zhì)條件下的表達(dá)或物的活性水平下降，表明該物質(zhì)是BLC相關(guān)的上調(diào)基因的抑制劑并可用于抑制BLC?；蛘撸贡磉_(dá)BLC相關(guān)的基因的受試細(xì)胞群與受試物質(zhì)接觸，然后測(cè)定BLC相關(guān)的下調(diào)基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性，可以鑒定增強(qiáng)BLC相關(guān)基因的表達(dá)或其基因產(chǎn)物活性的物質(zhì)。與不存在受試物質(zhì)條件下的表達(dá)或活性水平相比，存在受試物質(zhì)條件下BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性水平上升，表明該受試物質(zhì)可增加(augment)BLC相關(guān)的下調(diào)基因的表達(dá)或其基因產(chǎn)物的活性。受試細(xì)胞群可以是表達(dá)BLC相關(guān)基因的任何細(xì)胞。例如，受試細(xì)胞群可包含上皮細(xì)胞，如源自膀胱組織的細(xì)胞。而且，受試細(xì)胞還可以是源自癌細(xì)胞的無限增殖細(xì)胞系?；蛘撸茉嚰?xì)胞還可以是用BLC相關(guān)基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或者是用來自BLC相關(guān)基因的、與報(bào)告基因可操作相連的調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。評(píng)價(jià)受試者中BLC治療的有效性在本說明書中鑒定的差異表達(dá)的BLC相關(guān)基因，用于監(jiān)測(cè)BLC的治療過程。在該方法中，由接受BLC治療的受試者提供受試細(xì)胞群體。必要時(shí)，在治療前、治療中和/或治療后的不同時(shí)間點(diǎn)由受試者獲取受試細(xì)胞群體。然后測(cè)定細(xì)胞群體中一種或多種BLC相關(guān)基因的表達(dá)，并與包含BLC狀態(tài)已知的細(xì)胞的參照細(xì)胞群體相比較。在本發(fā)明的上下文中，參照細(xì)胞應(yīng)未接受所述的治療。如果參照細(xì)胞群體不含有BLC細(xì)胞，那么受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中BLC相關(guān)基因表達(dá)的相似性表示所述的治療是有效的。而受試細(xì)胞群體和正常對(duì)照參照細(xì)胞群體中BLC相關(guān)基因表達(dá)的差異，表示臨床效果或預(yù)后較不理想。類似地，如果參照細(xì)胞群體含有BLC細(xì)胞，那么受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中BLC相關(guān)基因表達(dá)之間的差異表示所述的治療是有效的，而受試細(xì)胞群體和膀胱癌對(duì)照參照細(xì)胞群體中BLC相關(guān)基因表達(dá)的相似性則表示臨床效果或預(yù)后較不理想。另外，可將在治療后得到的源自受試者的生物樣品中測(cè)定的一種或多種BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平(即治療后的水平)與在治療開始之前得到的源自受試者的生物樣品中測(cè)定的一種或多種BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平(即治療前的水平)相比較。如果BLC-相關(guān)基因是上調(diào)基因，那么治療后樣品中表達(dá)水平的降低表示所述的治療是有效的，而治療后樣品中表達(dá)水平的增加或維持則表示臨床效果或預(yù)后較不理想。相反地，如果BLC-相關(guān)基因是下調(diào)基因，那么治療后樣品中表達(dá)水平的上升表示所述的治療是有效的，而治療后樣品中表達(dá)水平的下降或維持則表示臨床效果或預(yù)后較不理想。如本文中所使用的，術(shù)語"有效的"表示治療引起受試者體內(nèi)病理性上調(diào)的基因的表達(dá)下降，病理性下調(diào)的基因的表達(dá)上升或膀胱導(dǎo)管癌妁大小、流行性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力降低。當(dāng)預(yù)防性施用所述的治療時(shí)，術(shù)語"有效的，，指治療能夠延遲或防止膀胱腫瘤的形成，或者能延遲、防止或減輕BLC的臨床癥狀。膀胱腫瘤的評(píng)價(jià)可以使用標(biāo)準(zhǔn)的臨床規(guī)程進(jìn)行。此外，可以與任何.已知的診斷或治療BLC的方法相關(guān)4關(guān)來判別有效性。例如，通過確定癥狀性異常(symptomaticanomalies)可以進(jìn)行BLC的診斷，所述癥狀性異常例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲減退、惡心、嘔吐和全身不適(generalizedmalaise)、虛弱和黃疰。診斷膀胱癌的本方法可以用于評(píng)價(jià)受試者中膀胱癌治療的有效性。根據(jù)本方法，由接受膀胱癌治療的受試者獲得生物樣品，如受試細(xì)胞群。評(píng)價(jià)方法可以按診斷膀胱癌的常規(guī)方法進(jìn)行。必要時(shí)，在治療前、治療中和/或治療后的不同時(shí)間點(diǎn)由受試者獲取生物樣品。然后測(cè)定生物樣品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平，并與對(duì)照水平進(jìn)行比較，所述對(duì)照水平源自例如包含膀胱癌狀態(tài)(即癌細(xì)胞或非癌細(xì)胞)已知的細(xì)胞的參照細(xì)胞群體。所述對(duì)照水平在未接受所述治療的生物樣品中進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)對(duì)照水平源自不含癌細(xì)胞的生物樣品時(shí)，源自受試者的生物樣品中的表達(dá)水平與對(duì)照水平之間的相似性，表明治療是有效的。而在源自受試者的生物樣品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平與對(duì)照水平的差異，表示臨床效果或預(yù)后較不理想。術(shù)語"有效的，，指治療引起受試者體內(nèi)病理性上調(diào)的基因(例如C2093、B5860Ns或C6055s基因)的表達(dá)下降，或者膀胱癌細(xì)胞的大小、流行性或增殖潛力降^f氐。當(dāng)預(yù)防性地施用治療時(shí)，術(shù)語"有效的"表示治療可延遲或防止膀胱癌的發(fā)生。膀胱癌的評(píng)價(jià)可以使用標(biāo)準(zhǔn)的臨床規(guī)程進(jìn)行。此外，可以采用診斷或治療膀胱癌的任何已知方法來確定治療的有效性。此外，通過將源自患者的生物樣品，如受試細(xì)胞群中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平與對(duì)照水平進(jìn)行比較，診斷膀胱癌的本方法還用于評(píng)價(jià)膀胱癌患者的預(yù)后?；蛘?，可在疾病階段譜(spectrumofdiseasestage)中測(cè)定源自患者的生物樣品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平，以評(píng)價(jià)患者的預(yù)后。與正常對(duì)照水平相比，C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平上升，則表示預(yù)后較不理想；而C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平相似，則表示患者預(yù)后良好。選j奪適于具體個(gè)體的用于治療BLC的治療劑個(gè)體基因組成(geneticmakeup)的差異可導(dǎo)致其代謝多種藥物的相對(duì)能力出現(xiàn)差異。在受試者體內(nèi)代謝從而起到抗BLC劑作用的物質(zhì)，可以通過在受試者的細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)癌癥狀態(tài)特征性基因表達(dá)圖式向非癌癥狀態(tài)特征性基因表達(dá)圖式的轉(zhuǎn)變而自己顯現(xiàn)出來。因此，本說明書公開的差異表達(dá)的BLC相關(guān)基因用于在來自選定受試者的受試細(xì)胞群體中測(cè)試推定的具有治療效果或預(yù)防效果的BLC抑制劑，從而確定該物質(zhì)在所述受試者中是否是合適的BLC抑制劑。為了鑒定出適于具體受試者的BLC抑制劑，可將來自受試者的受試細(xì)胞群體暴露于治療劑中，然后測(cè)定一種或多種表4-5的BLC相關(guān)基因的表達(dá)。在本發(fā)明方法的上下文中，受試細(xì)胞群體含有表達(dá)BLC相關(guān)基因的BLC細(xì)胞。優(yōu)選受試細(xì)胞是上皮細(xì)胞。例如，可以在存在候選物質(zhì)的條件下保溫受試細(xì)胞群體，測(cè)定受試細(xì)胞群體的基因表達(dá)圖式，并與一種或多種參照模式，例如BLC參照表達(dá)模式或非BLC參照表達(dá)模式進(jìn)行比較。相對(duì)于含有BLC的參照細(xì)胞群體而言，一種或多種表4中所列的BLC相關(guān)基因表達(dá)下降，或者一種或多種表5中所列的BLC相關(guān)基因表達(dá)上升，表示該物質(zhì)具有治療的潛力。在本發(fā)明的上下文中，受試物質(zhì)可以是任何化合物或組合物。例示性的受試物質(zhì)包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑。鑒定治療劑的篩選試驗(yàn)本說明書公開的差異表達(dá)的BLC相關(guān)基因也可以用于鑒定治療BLC的候選治療劑。本發(fā)明的方法包括篩選候選治療劑，以確定該候選治療劑是否能夠?qū)LC狀態(tài)特征性的一種或多種表4-5中所列的BLC相關(guān)基因的表達(dá)模式轉(zhuǎn)變非BLC狀態(tài)特征性基因表達(dá)圖式。在本發(fā)明的方法中，將細(xì)胞暴露于一種或多種受試物質(zhì)(依次或組合)，并測(cè)定細(xì)胞中一種或多種表4-5中所列的BLC相關(guān)基因的表達(dá)。將在受試群體中測(cè)定的BLC相關(guān)基因的表達(dá)模式與未暴露于受試物質(zhì)的參照細(xì)胞群體中相同BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。的臨床益處?？梢栽趧?dòng)物或受試者中進(jìn)一步驗(yàn)證該物質(zhì)防止膀胱導(dǎo)管癌生長(zhǎng)的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選候選物質(zhì)的方法，所述候選物質(zhì)在BLC治療中作用于潛在靶標(biāo)。正如上文所詳細(xì)討論的，控制標(biāo)記基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性，可以控制BLC的發(fā)生和發(fā)展。因此，通過采用將所述表達(dá)水平和活性作為癌或非癌狀態(tài)指標(biāo)的篩選方法，可以鑒定出在BLC治療中作用于潛在靶標(biāo)的候選物質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，所述篩選可包括例如下述步驟a)使受試化合物與多肽接觸，其中所述多肽由選自表4或5中所列的基因的多核苷酸編碼；c)選擇與多肽結(jié)合的受試化合物。或者，本發(fā)明的篩選方法可以包括下述步驟a)使候選化合物與細(xì)胞接觸，其中所述細(xì)胞表達(dá)選自表4或5中所列的基因的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因；和b)選擇降低選自表4中所列的基因的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)水平、或者提高選自表5中所列的基因的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)水平的候選化合物。表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞包括例如由BLC建立的細(xì)胞系；所述細(xì)胞可以用于本發(fā)明的上述篩選。或者，本發(fā)明的篩選方法可包括下述步驟a)使受試化合物與多肽接觸，其中所述多肽由選自表4或5中所列的基因的多核苷酸編碼；b^全測(cè)步驟a)的多肽的生物活性；和c)與在不存在受試化合物時(shí)檢出的生物活性相比，選擇抑制多肽的生物活性的化合物，所述多肽由選自表4中所列的基因的多核苷酸編碼；或者選擇增強(qiáng)多肽的生物活性的化合物，所述多肽由選自表5中所列的基因的多核苷酸編碼?？梢允褂脴?biāo)記基因的核苷酸序列，以重組蛋白質(zhì)的形式獲得可用于本發(fā)明的薛選方法的蛋白質(zhì)。基于與標(biāo)記基因及其編碼的蛋白質(zhì)有關(guān)的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇蛋白質(zhì)的任何生物活性作為篩選指標(biāo)，并可以選擇任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)定方法來檢測(cè)選擇的生物活性?；蛘撸景l(fā)明的篩選方法可以包括以下步驟a)使候選化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，其中所述載體含有選自表4或5中所列的基因的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達(dá)的報(bào)告基因；b)測(cè)定該報(bào)告基因的表達(dá)或活性；和c)與在不存在受試化合物時(shí)檢出的該報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性相比，當(dāng)該報(bào)告基因?yàn)檫x自表4中所列的基因的上調(diào)標(biāo)記基因時(shí)，選擇降低該報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性的候選化合物；或者當(dāng)該報(bào)告基因?yàn)檫x自表5中所列的下調(diào)標(biāo)記基因時(shí)，選擇增強(qiáng)該報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性的候選化合物。合適的報(bào)告基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。通過使用標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)人員已知標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)時(shí)，可通過使用先前的序列信息來制備報(bào)告子構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)仍未鑒定時(shí)，可以基于標(biāo)記基因的核苷酸序列信息從基因組文庫(kù)中分離含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的核苷酸區(qū)段。利用C2093、B5860Ns或C6055s基因和/或由這些基因編碼的蛋白質(zhì)、或者利用這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，可以篩選能夠改變所述基因的表達(dá)或者能夠改變由所述基因編碼的多肽的生物活性的化合物。因此，本發(fā)明提供利用本發(fā)明的多肽篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法。該篩選方法的實(shí)施方案包括下列步驟a)使受試化合物與多肽或其等同物接觸，其中所述多肽由C2093、B5860N或C6055編碼；b)才企測(cè)多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇與多肽結(jié)合的化合物。在本發(fā)明中，由C2093、B5860Ns或C6055s編碼的多肽或其等同物可選自下組(l)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDN0:2、4、6、130、132、134和136;(2)多肽，其包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，或者與所述序列具有至少約80%同源性的序列；和(3)由多核普酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;用于篩選的本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，也可以是源自天然的蛋白質(zhì)，或其部分肽。與受試化合物相接觸的本發(fā)明的多肽例如可以是純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形態(tài)或與其它多肽融合的融合蛋白。作為蛋白質(zhì)的篩選方法，例如使用本發(fā)明的由C2093、B5860Ns或C6055s編碼的多肽篩選與本發(fā)明的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可使用本領(lǐng)域沖支術(shù)人員公知的許多方法。這樣的篩選可通過，例如免疫沉淀法，具體地以下述方式進(jìn)行。通過將編碼本發(fā)明的多肽的C2093、B5860Ns或C6055s基因插入外源基因表達(dá)載體，如pSV2neo，pcDNAI,pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8，使之在宿主(例如動(dòng)物)纟田胞等中表達(dá)。用于表達(dá)的啟動(dòng)子可以是通常使用的任何啟動(dòng)子，并包括，例如SV40早期啟動(dòng)子(RigbyinWilliamson(ed.),(1982)GeneticEngineering,vol.3.AcademicPress,London,83-141)、EF-a啟動(dòng)子(Kim"a/"Gene91:217-23(1990))、CAG啟動(dòng)子(NiwaW"/，(1991)Gene108:193-9)、RSVLTR啟動(dòng)子(Cullen，(1987)MethodsinEnzymology152:684-704)、SRa啟動(dòng)子(TakebeWa/.，(1988)MolCellBiol8:466-72)、CMV立即早期啟動(dòng)子(CMVimmediateearlypromoter)(SeedandAruffo,(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9)、SV40后期啟動(dòng)子(GheysenandFiers,(1982)JMolApplGenet1:385-94)、月泉病毒后期啟動(dòng)子(Adenoviruslatepromoter)(Kaufmanez1a/.,(1989)MolCellBiol9:946-58)、HSVTK啟動(dòng)子等?？梢愿鶕?jù)任何方法將基因?qū)胗磉_(dá)外源基因的宿主細(xì)胞，這些方法例如電穿孔法(Chu"a/.,(1987)NucleicAcidsRes15:1311-26)、磷酸釣法(ChenandOkayama,(1987)MolCellBiol7:2745-52)、DEAE葡聚糖法(Lopata&a/.,(1984)NucleicAcidsRes12:5707-17;SussmanandMilman,(1984)MolCellBiol4:1641-3)、月旨質(zhì)轉(zhuǎn)染(Lipofectin)法(DerijardB,"a/.，(1994)Cell76:1025-37;Lamb"a/.,(1993)NatureGenetics5:22-30:Rabindrane/^/.,(1993)Science259:230-4)等。通過將特異性已知的單克隆抗體的表位導(dǎo)入本發(fā)明的多肽的N末端或C末端，可以以包含單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)的融合蛋白的形式表達(dá)用于本發(fā)明的篩選的多肽。也可以使用商業(yè)上可得到的表位-抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。可以利用其多克隆位點(diǎn)表達(dá)與，例如P-半乳糖苷酶、麥芽糖-結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的融合蛋白的載體是商業(yè)上可得到的。還報(bào)道了通過僅引入由幾個(gè)到十幾個(gè)氨基酸組成的小表位而制備的融合蛋白，其中本發(fā)明的用于篩選的多肽的特性不會(huì)因融合而改變。表位，如聚組氨酸(His標(biāo)簽)、流感病毒聚集體(influenzaaggregate)HA、人c-myc、FLAG、7K泡'1"生口月莫炎病毒4唐蛋白(Vesicularstomatitisvimsglycoprotein)(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7標(biāo)簽)、人單純皰滲病毒糖蛋白(humansimpleherpesvimsglycoprotein)(HSV標(biāo)簽)、E標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等，以及識(shí)別它們的單克隆抗體都可以用作表位-抗體系統(tǒng)來篩選能結(jié)合用于本發(fā)明的篩選的多肽的蛋白質(zhì)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀法中，向用合適的洗滌劑(detergent)制備的細(xì)月包裂解物中添加這些抗體，可以形成免疫復(fù)合物。所述免疫復(fù)合物由用于本發(fā)明的篩選的多肽、具有與該多肽結(jié)合的能力的多肽和抗體組成。除使用抗上迷表位的抗體之外，還可以使用抗用于本發(fā)明的篩選的多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀，所述抗體可以如上所述制備。當(dāng)所述抗體是一種小鼠IgG抗體時(shí)，可以通過例如蛋白ASepharose或蛋白GSepharose沉淀免疫復(fù)合物。如果將用于本發(fā)明的篩選的多肽制備成帶有表位，如GST的融合蛋白，可使用與這些表位特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如谷胱甘肽-Sepharose4B,按照與使用抗用于本發(fā)明的篩選的多肽的抗體相同的方式形成免疫復(fù)合物。免疫沉淀可以根據(jù)或遵照，例如文獻(xiàn)(HarlowandLane,Antibodies,511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))中的方法進(jìn)行。通常使用SDS-PAGE對(duì)免疫沉淀的蛋白進(jìn)行分析，可以使用合適濃度的凝膠通過蛋白的分子量來分析結(jié)合的蛋白。由于采用常規(guī)染色法例如考馬斯(Coomassie)染色或銀染色難以檢測(cè)與用于本發(fā)明的篩選的多肽結(jié)合的蛋白，因而可以通過下述方法改進(jìn)所述蛋白的檢測(cè)靈敏度在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或"S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞中標(biāo)記蛋白，和檢測(cè)蛋白。在已知蛋白的分子量時(shí)，可以從SDS-聚丙烯酰胺凝膠直接純化目標(biāo)蛋白并測(cè)定其序列。作為使用多肽來篩選與本發(fā)明的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可以采用例如West-Western印跡分析(Skolnik&a/，Cell65:83-90(1991))。具體地i兌，可以通過下述方法獲得能夠結(jié)合用于本發(fā)明的篩選的多肽的蛋白質(zhì)使用噬菌體載體(例如ZAP),由期望表達(dá)與本發(fā)明的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織、器官(例如，組織如睪丸)或者培養(yǎng)的細(xì)胞(例如HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4PC3、DU145或HT1376)制備cDNA文庫(kù)；使該蛋白在LB-瓊脂糖(LB-agarose)上表達(dá)，將表達(dá)的蛋白固定在濾膜(filter)上，再使經(jīng)純化和標(biāo)記的本發(fā)明的多肽與上述濾膜反應(yīng)，然后根據(jù)標(biāo)記來片全測(cè)表達(dá)與本發(fā)明的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的噬菌斑。利用生物素與抗生物素蛋白之間的結(jié)合，或者利用與用于本發(fā)明的篩選的多肽或融合于本發(fā)明的多肽的肽或多肽(例如GST)特異性結(jié)合的抗體，均可以對(duì)用于本發(fā)明的篩選的多肽進(jìn)行標(biāo)記。也可以采用使用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘?，在本發(fā)明的篩選方法的另一實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜合系統(tǒng)(two-hybridsystem)("MATCHMAKER雙雜合系統(tǒng)'，、"哺乳動(dòng)物MATCHMAKER雙雜合測(cè)定試劑盒，，、"MATCHMAKER單雜合系統(tǒng)"(Clontech);"HybriZAP雙雜合載體系統(tǒng)"(Stratagene);參照"DaltonandTreisman，Cell68:597-612(1992)","FieldsandSternglanz，TrendsGenet10:286-92(1994)")。在雙雜合系統(tǒng)中，將用于本發(fā)明的篩選的多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。由預(yù)期表達(dá)與用于本發(fā)明的篩選的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，并使該文庫(kù)在表達(dá)時(shí)與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄活化區(qū)i或(transcriptionalactivationregion)融合。然后將cDNA文庫(kù)導(dǎo)入上述酵母細(xì)胞，并從檢測(cè)為陽性的克隆分離出源自所述文庫(kù)的cDNA(當(dāng)在酵母細(xì)胞中表達(dá)可與用于本發(fā)明的篩選的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)，兩者的結(jié)合能夠激活報(bào)告基因，可以檢出陽性克隆)。通過將上述分離的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌并表達(dá)蛋白質(zhì)，可以制備由該cDNA編碼的蛋白質(zhì)。就報(bào)告基因而言，除HIS3基因外，還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。合物。例如，可以將用于本發(fā)明的篩選的多肽固定于親和層析柱的載體上，并將受試化合物加于該層析柱，所述受試化合物包含能與用于本發(fā)明的篩選的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)。本說明書中的受試化合物可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。在將所述受試化合物上樣后，對(duì)層析柱進(jìn)行洗滌，并可制備出已與用于本發(fā)明的篩選的多肽結(jié)合的化合物。當(dāng)受試化合物是一種蛋白時(shí)，分析獲得的蛋白的氨基酸序列，基于該序列合成寡聚DNA，以該寡聚DNA為探針篩選cDNA文庫(kù)，從而獲得編碼所述蛋白的DNA。在本發(fā)明中，可以將利用表面等離子體共振現(xiàn)象(surfaceplasmonresonancsphenomenon)的生物傳感器(biosensor)用作對(duì)結(jié)合的化合物進(jìn)行檢測(cè)或定量的手段。當(dāng)使用這類生物傳感器時(shí)，而且只使用極少量的多肽且不需標(biāo)記(例如BIAcore,Pharmacia),可將用于本發(fā)明的篩選的多肽和受試化合物之間的相互作用實(shí)時(shí)觀察為表面等離子體共振信號(hào)。因此，可以使用生物傳感器諸如BIAcore來評(píng)價(jià)用于本發(fā)明的篩選的多肽和受試化合物之間的結(jié)合。當(dāng)固定化的用于本發(fā)明的篩選的多肽暴露于合成化合物、天然物質(zhì)庫(kù)或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫(kù)時(shí)，篩選與之結(jié)合的分子的方法，以及基于組合化學(xué)技術(shù)使用高通量的篩選方法(Wrighton等，Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan,Nature384:17-9(1996))，從而分離與用于本發(fā)明的篩選的蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。或者，本發(fā)明—提供使用由C2093、B5860Ns或C6055s編碼的本發(fā)明的多肽或其等同物篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使受試化合物與多肽或其等同物接觸；(b)才全測(cè)步驟(a)的多肽或其等同物的生物活性；和(c)與不存在受試化合物的條件下測(cè)得的生物活性相比較，選擇抑制所述多肽或其等同物的生物活性的化合物。本發(fā)明的C2093、B5860Ns或C6055s蛋白質(zhì)具有促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的活性，因而可以使用該活性為指標(biāo)，篩選抑制該活性的化合物。只要具有C2093、B5860Ns或C6055s蛋白質(zhì)的生物活性，任何多肽均可用于篩選。所述生物活性包括人C2093、B5860Ns或C6055s蛋白質(zhì)的細(xì)胞增殖活性。例如，可以使用人C2093、B5860Ns或C6055s蛋白質(zhì)，也可以使用與這些蛋白質(zhì)在功能上等同的多肽。因細(xì)胞的不同，所述多肽可以內(nèi)源性或外源性表達(dá)。通過這種篩選分離的化合物是本發(fā)明的C2093、B5860Ns或C6055s多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的候選物。術(shù)語"激動(dòng)劑"指通過與本發(fā)明的多肽結(jié)合而活化其功能的分子。同樣地，術(shù)語"拮抗劑"指通過與本發(fā)明的多肽結(jié)合而抑制其功能的分子。而且，通過這種篩選作為"拮抗劑"而分離的化合物是抑制用于本發(fā)明的篩選的多肽與分子(包括DNA和蛋白)在體內(nèi)的相互作用的候選化合物。通過如下方法進(jìn)行檢測(cè)制備表達(dá)用于本發(fā)明的篩選的多肽的細(xì)胞，在存在受試化合物的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞增殖速度，測(cè)定細(xì)胞周期等，以及測(cè)定集落形成活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法。如上詳細(xì)描述，通過控制C2093、B5860Ns和/或C6055s基因的表達(dá)水平，可以控制膀胱癌的發(fā)病和進(jìn)展。因而，通過以C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平為指標(biāo)進(jìn)行篩選，可以鑒定能夠用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物。在本發(fā)明的上下文中，這樣的篩選可包括例如以下步驟(aM吏受試化合物與細(xì)胞接觸，其中所述細(xì)胞表達(dá)C2093、B5860Ns或C6055s基因中的一個(gè)或多個(gè)；和(b)與不存在受試化合物時(shí)檢出的表達(dá)水平相比，選擇降4氐C2093、B5860Ns或C6055s基因中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平的化合物。表達(dá)一個(gè)或多個(gè)C2093、B5860Ns或C6055s基因中的至少一個(gè)的細(xì)胞，包括例如由膀胱癌建立的細(xì)胞系；這樣的細(xì)胞可以用于本發(fā)明的上述篩選(例如HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4和HT1376)。表達(dá)水平可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行評(píng)估。在本篩選方法中，可選擇降低C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平的化合物作為用于治療或預(yù)防膀胱癌的候選物質(zhì)。或者，本發(fā)明的篩選方法可以包括以下步驟a)使受試化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，其中所述載體含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達(dá)的報(bào)告基因，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因?yàn)镃2093、B5860Ns或C6055s;b)測(cè)定該報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性；和c)與不存在受試化合物時(shí)檢出的該報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性相比，選擇降低該報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性的候選化合物。合適的報(bào)告基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。使用標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以制備篩選所需的報(bào)告子構(gòu)建體。當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)時(shí)，可以使用先前的序列信息來制備報(bào)告子構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)仍未鑒定時(shí)，可以基于標(biāo)記基因的核苷酸序列信息從基因組文庫(kù)中分離含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的核苷酸區(qū)段?？捎糜诮Y(jié)合蛋白的支持物(support)的實(shí)例包括不溶性多糖，如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；及合成樹脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；可優(yōu)選使用由上述材料制備的商業(yè)上可得到的珠子和板(例如多孔板，生物傳感器芯片等)。使用珠子時(shí)，可以將其填入柱子。蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，這些方法例如化學(xué)結(jié)合或物理吸附?？蛇x地，蛋白質(zhì)可通過特異性識(shí)別它的抗體而與支持物結(jié)合。此外，還可以利用抗生物素蛋白和生物素來進(jìn)行多肽與支持物的結(jié)合。蛋白質(zhì)之間的結(jié)合在緩沖液中進(jìn)行，緩沖液例如但不限于磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液，只要所述緩沖液不抑制蛋白之間的結(jié)合即可。本發(fā)明中，利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測(cè)或定量已結(jié)合的蛋白的裝置。使用這樣的生物傳感器(例如BIAcore,Pharmacia)時(shí)，僅使用少量的多肽，而且無需標(biāo)記，即可將蛋白質(zhì)之間的相互作用實(shí)時(shí)觀察為表面等離子體共振信號(hào)?？蛇x地，可以對(duì)C2093、B5860N或C6055多肽進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合蛋白質(zhì)的標(biāo)記可用于檢測(cè)或測(cè)定已結(jié)合的蛋白質(zhì)。具體地，對(duì)一種蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)標(biāo)記之后，在受試化合物存在的條件下使標(biāo)記的蛋白與其它蛋白接觸，然后在洗滌之后根據(jù)標(biāo)記檢測(cè)或測(cè)定已結(jié)合的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法中，可以使用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記蛋白質(zhì)，所迷標(biāo)記物質(zhì)如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、3《、'251、13'1)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、卩-半乳糖苷酶、(3-葡糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如，異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明)和生物素/抗生物素蛋白。當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，可通過液體閃爍法(liquidscintillation)進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)定。可選地，通過加入該酶的底物，用吸收光度計(jì)(absorptiometer)檢測(cè)或測(cè)定底物的酶促變化(如產(chǎn)生顏色)，從而可以檢測(cè)或測(cè)定用酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)。此外，將熒光物質(zhì)用作標(biāo)記的情況中，可利用焚光光度計(jì)檢測(cè)或測(cè)定已結(jié)合的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的篩選中使用抗體的情況下，所述抗體優(yōu)選利用上述標(biāo)記物質(zhì)之一進(jìn)行標(biāo)記，并基于標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行4全測(cè)或測(cè)定?；蛘撸部梢詫⒖笴2093、B5860Ns或C6055s多肽的抗體用作第一抗體(primaryantibody),使用以標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體對(duì)其進(jìn)^i全測(cè)。此外，本發(fā)明的篩選中與蛋白結(jié)合的抗體，可使用蛋白G或蛋白A柱進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)定。在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何受試化合物，這些化合物包括但不限于細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物以及天然化合物。本發(fā)明的受試化合物可以使用本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)法中多種方法中的任一種荻得，所述方法包括(l)生物學(xué)文庫(kù)，(2)空間定位平4亍固相或5容液相文庫(kù)(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要重疊合法(deconvolution)的合成文庫(kù)法，(4)"一珠一化合物(onebeadonecompound)，，文庫(kù)法和(5)使用親和層析選擇的合成文庫(kù)法。其中，使用親和層析選擇的生物學(xué)文庫(kù)法僅限于肽文庫(kù)，而其它四種方法適用于肽，非肽寡聚體或化合物小分子文庫(kù)(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145)。合成分子文庫(kù)的方法的舉例見于本
技術(shù)領(lǐng)域：
(DeWitt"a/.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-13;Erb"a/.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-6;Zuckermann"a/.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85;Cho"a/.(1993)Science261:1303-5;CarellWa/.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carelle"/.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallop"a/.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)?；衔镂膸?kù)可存在于溶液中(參見Houghten(1992)Bio/Techniques13:412-21),和珠子上(Lam(1991)Nature354:82-4)，芯片(Fodor(1993)Nature364:555-6)，細(xì)菌(美國(guó)專利5,223,409),孢子(美國(guó)專利5,571,698;°5，403,484和5,223,409),質(zhì)粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865-9)或噬菌體(ScottandSmith(1990)Science249:386-90;Delvin(1990)Science249:404-6;Cwirla等(19卯)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-82;Felici(1991)丄Mol.Biol.222:301-10;美國(guó)專利申"i青2002103360)。通過篩選分離的化合物可作為藥物開發(fā)的候選物，其中所述藥物抑制標(biāo)記基因的表達(dá)或由標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，并可用于治療或預(yù)防膀胱癌。此外，還包括化合物中的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或取代而發(fā)生轉(zhuǎn)由標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。將通過本發(fā)明的方法分離的化合物作為藥物施用于人或其它哺乳動(dòng)物時(shí)，所述其它哺乳動(dòng)物包括，但不限于小鼠、大鼠、豚鼠(guinea-pig)、兔、貓、狗、羊、豬、牛、猴、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)時(shí)，分離的化合物可以直接給藥，或者可以利用已知的藥物制備方法配制成劑型。關(guān)于本發(fā)明的藥物組合物和配制物、以及它們的制造和使用方法，將在下文中詳細(xì)說明。評(píng)估患膀胱癌的受試者的預(yù)后本發(fā)明還提供評(píng)估患有BLC的受試者的預(yù)后情況的方法，所述方法包括將受試細(xì)胞群體中的一種或多種BLC相關(guān)基因的表達(dá)與疾病階段i普中的源自患者的參照細(xì)胞群體中的相同BLC相關(guān)基因的表達(dá)相比較的步驟。通過比較受試細(xì)胞群體與參照細(xì)胞群體中一種或多種BLC相關(guān)基因的基因表達(dá)，或比較源自受試者的受試細(xì)胞群體中基因隨時(shí)間的表達(dá)圖式，可以評(píng)估受試者的預(yù)后情況。例如，與正常對(duì)照相比一種或多種上調(diào)的BLC相關(guān)基因，如表4中所列的那些基因的表達(dá)上升，或與正常對(duì)照相比一種或多種下調(diào)的BLC相關(guān)基因，如表5中所列的那些基因的表達(dá)下降，表示預(yù)后不佳。相反地，一種或多種表4-5中所列的BLC相關(guān)基因的表達(dá)與正常對(duì)照相似，表示受試者預(yù)后比較良好。優(yōu)選地，可以通過比較選自表4和5中所列基因的一種或多種基因的基因表達(dá)模式來評(píng)估受試者的預(yù)后情況。試劑盒本發(fā)明還包括BLC檢測(cè)試劑，例如能夠特異性結(jié)合或鑒定一種或多種BLC核酸的核酸(諸如與BLC核酸的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸序列)或者能夠與由BLC核酸編碼的一種或多種蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。所述檢測(cè)試劑可以以試劑盒的形式包裝在一起。例如，可以將檢測(cè)試劑分別包裝在不同的容器中，例如核酸或抗體(可與固體基質(zhì)結(jié)合，或與使其同基質(zhì)結(jié)合的試劑分開包裝)、對(duì)照試劑(陽性和/或陰性)和/或可檢測(cè)標(biāo)記。試劑盒內(nèi)還可以包括實(shí)施所述測(cè)定的說明(如書面說明書、磁帶、VCR、CD-ROM等)。試劑盒的試驗(yàn)方式可以是本領(lǐng)域已知的Northern雜交或夾心ELISA。例如，可以將BLC檢測(cè)試劑固定于固體基質(zhì)如多孔條(porousstrip)上，以形成至少一個(gè)BLC檢測(cè)位點(diǎn)。多孔條的測(cè)定區(qū)或檢測(cè)區(qū)可以包括多個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都含有核酸。測(cè)試條也可以含有陰性和/或陽性對(duì)照的位點(diǎn)?；蛘?，對(duì)照位點(diǎn)可以設(shè)置于與測(cè)試條不同的條上。任選地，不同的檢測(cè)位點(diǎn)可以含有不同量的固定化核酸，即第一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)量較多，隨后的位點(diǎn)量較少。添加受試樣品后，顯示可測(cè)信號(hào)的位點(diǎn)數(shù)目提供了樣品中存在的BLC的量的定量指標(biāo)(quantitativeindication)。檢測(cè)位點(diǎn)的形狀可以是任何適宜的可檢測(cè)的形狀，一般為跨越測(cè)試條寬度的條狀或點(diǎn)狀?；蛘撸噭┖羞€包含含有一種或多種核酸的核酸基質(zhì)陣列(nucleicacidsubstrate)。陣列上的核酸可特異性地鑒定由表4-5中所列的BLC相關(guān)基因表示的一種或多種核酸序列。通過與陣列測(cè)試條或芯片的結(jié)合水平可以鑒定由表4-5中所列的BLC相關(guān)基因表示的2,3,4,5,6,7,8,9，10，15,20，25,40,50或更多種核酸的表達(dá)?；|(zhì)陣列可以存在于例如固體基質(zhì)上，所述固體基質(zhì)如美國(guó)專利5,744,305(其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考)中描述的"芯片"。陣列和核酸混合物(。luralities):本發(fā)明還包括含有一種或多種核酸的核酸基質(zhì)陣列。陣列上的核酸特異性地對(duì)應(yīng)由表4-5中所列的BLC相關(guān)基因所示的一種或多種核酸序列。通過檢測(cè)與陣列結(jié)合的核酸，可鑒定由表4-5中所列的BLC相關(guān)基因表示的2,3,4，5,6,7，8，9,10,15，20,25,40,50或更多種核酸的表達(dá)水平。本發(fā)明還包括獨(dú)立的(isolated)多種核酸的混合物(即兩種或兩種以上核酸的混合物)。核酸可以存在于液相或固相中，例如固定于如硝酸纖維素膜的固體支持物上。核酸混合物包含由表4-5中所列的BLC相關(guān)基因表示的一種或多種核酸。在多個(gè)實(shí)施方案中，核酸混合物包含由表4-5中所列的BLC相關(guān)基因表示的2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20，25,40,50或更多種核酸。抑制膀胱癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供通過降低一種或多種上調(diào)的表4中所列的BLC相關(guān)基因的表達(dá)(或其基因產(chǎn)物的活性)、或者提高一種或多種下調(diào)的表5中所列的BLC相關(guān)基因的表達(dá)(或其基因產(chǎn)物的活性)來治療或減輕受試者中的BLC癥狀的方法?？梢詫⑦m當(dāng)?shù)闹委熁衔镱A(yù)防性或治療性地施用于患有BLC或處于BLC發(fā)病危險(xiǎn)中(或?qū)LC易感)的受試者。采用標(biāo)準(zhǔn)的臨床方法或者通過檢測(cè)一種或多種表4-5中所列的BLC相關(guān)基因的異常表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的異?；钚裕梢澡b定出上述受試者。在本發(fā)明的上下文中，適當(dāng)?shù)闹委焺┌?，例如?xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞增殖的抑制劑。本發(fā)明的治療方法包括如下步驟與獲得BLC細(xì)胞相同的組織類型的正常細(xì)胞相比，提高在BLC細(xì)胞中其表達(dá)降低的一種或多種基因("下調(diào)的"或"低表達(dá)的"基因)的表達(dá)和/或其基因產(chǎn)物的活性。在這些方法中，使用有效量的化合物對(duì)受試者進(jìn)行治療，所述化合物可提高受試者中一種或多種低表達(dá)的(下調(diào)的)基因的量。給藥可以是全身給藥或局部給藥。適宜的治療化合物包括低表達(dá)基因的多肽產(chǎn)物，其生物活性片段，和編碼低表達(dá)基因且具有允許在BLC細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)調(diào)控元件的核酸；例如可提高BLC細(xì)胞內(nèi)源性的此類基因的表達(dá)水平的物質(zhì)(即，其上調(diào)一種或多種低表達(dá)基因的表達(dá)水平)。施用這樣的化合物可以消減受試者膀胱癌細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)異常低表達(dá)基因的影響，并改善受試者的臨床狀態(tài)?？蛇x地，本發(fā)明的治療方法包括如下步驟降低在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)異常升高的一種或多種基因("上調(diào)的"或"過表達(dá)的"基因)的表達(dá)和/或其基因產(chǎn)物的活性?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的幾種方法中的任何一種來抑制表達(dá)。例如，通過給受試者施用能抑制或拮抗一個(gè)或多個(gè)過表達(dá)基因的表達(dá)的核酸可以抑制表達(dá)，所述核酸例如能夠破壞一個(gè)或多個(gè)過表達(dá)基因的表達(dá)的反義寡核芬酸或小干擾RNA。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療方法包括降低C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)或功能的步驟。在這些方法中使用有效量的化合物對(duì)受試者進(jìn)行治療，所述化合物可降低受試者中一種或多種過表達(dá)基因(即C2093、B5860Ns或C6055s基因)的表達(dá)和/或活性。給藥可以是全身給藥或局部給藥。治療化合物包括可降低BLC細(xì)胞內(nèi)源性的此類基因的表達(dá)水平的化合物(即，下調(diào)過表達(dá)基因的表達(dá)的化合物)。施用這樣的治療化合物可以消減受試者細(xì)胞中異常過表達(dá)基因的影響，并預(yù)期改善受試者的臨床狀C2093、B5860Ns或C6055s基因表達(dá)的抑制可以采用本領(lǐng)域已知的幾種方法中的任何一種，這些方法中包括給受試者施用抑制或拮抗基因表達(dá)的核酸?？蓪⑵茐幕虮磉_(dá)的反義寡核苷酸、siRNA或核酶用于抑制基因表達(dá)。如上所述，可以使用對(duì)應(yīng)C2093、B5860Ns或C6055s基因的核苷酸序列的反義寡核苷酸來降低C2093、B5860Ns或C6055s基因的表達(dá)水平。具體地說，本發(fā)明的反義寡核苷酸可以通過與由C2093、B5860Ns或C6055s基因編碼的多肽或與之對(duì)應(yīng)的mRNA中的任何一個(gè)結(jié)合而發(fā)揮作用，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA降解和/或抑制基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終抑制C2093、B5860Ns或C6055s蛋白質(zhì)的功能。通過與合適的基質(zhì)(basematerial)混合，可以將反義寡核苷酸及其衍生物制成外用制劑，如搽劑(liniment)或罨劑(poultice),并用于本發(fā)明的治療或預(yù)防膀胱癌的方法，其中所述合適的基質(zhì)對(duì)衍生物是惰性的(inactive)。抑制一種或多種過表達(dá)基因的基因產(chǎn)物的核酸還包括小干擾RNA(siRNA),所述RNA含有編碼C2093、B5860Ns或C6055s基因的核苷酸序列的有義鏈核酸與反義鏈核酸的組合。將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？梢杂糜诒景l(fā)明所述的治療或預(yù)防，其包括以DNA為RNA轉(zhuǎn)錄的模板的技術(shù)。構(gòu)建siRNA以使單轉(zhuǎn)錄物(singletranscript)具有來自靶基因的互補(bǔ)的反義序列和有義序列，例如為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)。反義多核苦酸、小干擾RNA及核酶如上所述，使用對(duì)應(yīng)于表4中所列的BLC相關(guān)基因的核苷酸序列的反義核酸，可以降低基因的表達(dá)水平。對(duì)于膀胱癌的治療，對(duì)應(yīng)于表4中所列的在膀胱癌中上調(diào)的BLC相關(guān)基因的反義核酸是有用的。具體地說，本合而發(fā)揮作用，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA降解和/或抑制表4中所列的BLC相關(guān)基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此抑制蛋白質(zhì)的功能。本發(fā)明包括與SEQIDNO:3的核苷酸序列內(nèi)的任意位點(diǎn)雜交的反義寡核芬酸。具體地，本發(fā)明提供反義多核苷酸，該多核苷酸可與含有SEQIDNO:3的核苷酸序列988-1842，即B5860NV1序列的特異區(qū)域的核酸雜交。這種反義寡核苷酸優(yōu)選針對(duì)SEQIDNO:3的核苷酸序列的至少約15個(gè)連續(xù)的核苦酸。上述的反義寡核苷酸更優(yōu)選在上述至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸中含有起始密碼子。反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物也可以用作反義寡核苷酸。所述修飾產(chǎn)物的例子包括低級(jí)烷基膦酸酯(loweralkylphosphonate)修飾如甲基膦酸酯型(methyl-phosphonatetype)或乙基膦酸酯型(ethyl-phosphonate-type),石危代磷酸酯(phosphorothioate)修飾以及磷酰胺(phosphoroamidate)修飾。如本說明書中使用的，術(shù)語"反義核酸'，包括與靶序列完全互補(bǔ)的核香酸和具有一個(gè)或多個(gè)核芬酸錯(cuò)配的核苦酸，只要該反義核酸能與靶序列特異性雜交。例如，本發(fā)明的反義核酸包括那些在至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的范圍(span)內(nèi)，具有至少約70%或更高、優(yōu)選至少約80%或更高、更優(yōu)選約至少90%或更高、還更優(yōu)選至少約95。/?；蚋叩耐葱缘亩嗪塑账?。所述同源性可使用本領(lǐng)域已知的算法確定。此外在本發(fā)明中，所述反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物也可以用作反義寡核苷酸。所述修飾產(chǎn)物的例子包括但不限于低級(jí)烷基膦酸酯修飾，如甲基膦酸酯型(methyl-phosphonatetype)或乙基膦酸酯型(ethyl-phosphonate-type)，硫代磷酸酯修飾以及磷酰胺修飾。所述反義多核苷酸可用作分離或檢測(cè)編碼本發(fā)明的多肽的DNA的探針，或者用于擴(kuò)增的引物。本發(fā)明的反義核酸通過如下方法作用于產(chǎn)生由BLC相關(guān)標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞將本發(fā)明的反義核酸與編碼該蛋白質(zhì)的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA降解并抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此抑制蛋白質(zhì)的功能。通過與合適的基質(zhì)混合，可以將本發(fā)明的反義核酸制成外用制劑，如搽劑(liniment)或罨劑(poultice)，其中所述合適的基質(zhì)對(duì)核酸是惰性的。并且根據(jù)需要，通過添加賦形劑、等滲劑(isotonicagents)、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、鎮(zhèn)痛劑等，可以將本發(fā)明的反義核酸配制成例如片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。這些劑型可通過如下的公知方法制備。給患者施用本發(fā)明的反義核酸，可以直接將其施于患處，也可以將其輸入血管以葉吏其到達(dá)患處。使用反義封固介質(zhì)(antisense-mountingmedium)可以提高持久性和膜通透性。所述反義封固介質(zhì)的例子包括但不限于脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑或它們的衍生物。本發(fā)明的反義核酸衍生物的劑量，可以根據(jù)患者的狀況適當(dāng)調(diào)整，并以所需的量^f吏用。例如，可以施用的劑量范圍為0.1至100mg/kg,優(yōu)選O.l至50mg/kg。本發(fā)明的反義核酸抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)，因而可以用于抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性。此外，含有本發(fā)明的反義核酸的表達(dá)抑制劑也可以用于抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性。述基因表達(dá)上調(diào)的原因例如細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在靶細(xì)胞中，siRNA與對(duì)應(yīng)于表4中所列的一個(gè)BLC相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)減少。寡核苷酸的長(zhǎng)度為至少IO個(gè)核苷酸，可以與天然存在的轉(zhuǎn)錄物等長(zhǎng)。優(yōu)選寡核苷酸的長(zhǎng)度為75、50、25個(gè)核苷酸或更短。最優(yōu)選寡核苷酸的長(zhǎng)度為約19-25個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸包括經(jīng)修飾的寡核苷酸。例如，使用硫代寡核苷酸可以賦予寡核芬酸核酸酶抗性。而且，可以使用針對(duì)標(biāo)記基因的siRNA以降低標(biāo)記基因的表達(dá)水平。本說明書中，術(shù)語"siRNA，，指能阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子?？梢圆捎脤iRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，這其中包括以DNA為RNA轉(zhuǎn)錄的模板的技術(shù)。在本發(fā)明的上下文中，siRNA含有針對(duì)上調(diào)標(biāo)記基因，如表4中所列的BLC相關(guān)基因的有義核酸序列和反義核酸序列。構(gòu)建siRNA以使其單轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的互補(bǔ)的反義序列和有義序列，例如為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。如表4中所列的BLC相關(guān)基因的siRNA與靶基因雜交，并由此通過與正常單鏈mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，并藉此干擾蛋白質(zhì)的翻譯和表達(dá)，從而減少或抑制由表4中所列的BLC相關(guān)基因編碼的多肽的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的siRNA分子可以根據(jù)其在嚴(yán)緊條件下與表4中所列的mRNA或cDNA特異性雜交的能力來定義。就本發(fā)明而言，術(shù)語"雜交"或"特異性雜交，，可以互換使用，它們均是指2個(gè)核酸分子在"嚴(yán)緊的雜交條件"下雜交的能力。短語"嚴(yán)緊的雜交條件"在前述內(nèi)容中已經(jīng)說明，并且指如下條件，在該條件下核酸分子，通常在核酸的復(fù)雜混合物中，與其靶序列雜交，但不與其它序列發(fā)生可4全測(cè)程度的雜交(butnotdetectablytoothers叫uences)。嚴(yán)緊條件依賴于序列，并且在不同情況中是不同的。較長(zhǎng)序列在較高溫度下特異性雜交。關(guān)于核酸雜交的全面指南見于Tijssen,rec/zm々wMo/ecw/arS/o/ogy—外Z)n.(i,zfl/7.oww〃/zjVwc/e/ciVo6&s,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一4殳i也，選4奪的嚴(yán)緊條件為比在限定的離子強(qiáng)度、pH下指定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。Tm是有50%的與靶標(biāo)互補(bǔ)的探針在平衡狀態(tài)下與靶序列雜交(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)的溫度(當(dāng)靶序列過量時(shí)，Tm溫度下，有50%的探針在平衡狀態(tài)下被占用)。此外，通過添加去穩(wěn)定劑，如曱酰胺也可以形成嚴(yán)緊條件。對(duì)選擇性或特異性的雜交而言，陽性信號(hào)為至少2倍背景，優(yōu)選為IO倍背景雜交。示例性的嚴(yán)緊雜交條件可為如下在50%曱酰胺、5xSSC、1%SDS中于42。C保溫，或者在5xSSC、1。/。SDS中于65。C保溫，然后用0.2xSSC、0.1%SDS于50°C進(jìn)行洗滌。在本發(fā)明的上下文中，siRNA的長(zhǎng)度優(yōu)選為500、200、100、50或25個(gè)核苷酸或更短。更優(yōu)選地，siRNA的長(zhǎng)度為約19-約25個(gè)核苷酸?！銥榱嗽鰪?qiáng)siRNA的抑制活性，可以將核苷酸"u"添加到靶序列的反義鏈的3，端。待添加的"u，，的數(shù)目為至少約2,通常為約2-約IO,優(yōu)選為約2-約5。添加的"u"在siRNA的反義鏈的3，端形成單鏈。如表4所列的BLC相關(guān)基因的siRNA,可以以能與mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式直接導(dǎo)入細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA分子一般如用于反義分子的上述描述進(jìn)行修飾。而其它的修飾也是可能的，例如膽固醇結(jié)合的siRNA顯示改善的藥理學(xué)性質(zhì)。SongWa/.A^wwM^/.9:347-51(2003):或者，編碼siRNA的DNA也可以攜帶于載體中。例如，通過將BLC相關(guān)性基因靶序列克隆到表達(dá)載體中來制備上述載體，其中所述表達(dá)載體具有可操作連接的以兩條鏈均能表達(dá)(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)的方式位于該靶序列側(cè)翼的調(diào)控序列(Lee，N.S.,"a/.,(2002)NatureBiotechnology20:500-5.)。其為BLC相關(guān)性基因的mRNA的反義鏈的RNA分子由第一啟動(dòng)子(例如所克隆DNA3'的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄，其為BLC相關(guān)性基因的mRNA的有義鏈的RNA分子由第二啟動(dòng)子(例如所克隆DNA5，的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄。所述有義鏈和反義鏈在體內(nèi)雜交，從而產(chǎn)生用于沉默BLC相關(guān)性基因的siRNA構(gòu)建體?；蛘撸梢岳脙蓚€(gè)構(gòu)建體制備siRNA構(gòu)建體的有義鏈和反義鏈?？寺〉腂LC相關(guān)性基因可編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如發(fā)夾的構(gòu)建體，其中單轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的互補(bǔ)反義序列和有義序列。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可在有義序列和反義序列之間放置由任意核苷酸序列組成的環(huán)序列(loopsequence)。因此，本發(fā)明還提供具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA,其中[A]為核糖核苷酸序列，其對(duì)應(yīng)于與表4中所列的mRNA或cDNA特異性雜交的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，[A]為對(duì)應(yīng)于選自表4的基因的序列的核糖核苷酸序列，為由約3-約23個(gè)核芬酸組成的核糖核芬酸序列，和[A，]是由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序列。[A]區(qū)與[A，]區(qū)雜交，然后形成由[B]區(qū)組成的環(huán)(loop)。所述環(huán)序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為3-23個(gè)核苷酸。所述突環(huán)序列，例如可以選自由如下序列組成的組(http:〃www.ambion.com/techlib/tb/tb—506.html)。此外，由23個(gè)核苦酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque，J,M.,"a/.，(2002)Nature418:435-8.)。CCC,CCACC或CCACACC:Jacque,J.-M.,"a/.,(2002)Nature418:435-8.UUCG:Lee,N.S.,"a/.，(2002)NatureBiotechnology20:500-5.Fruscoloni，P.,".，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44.UUCAAGAGA:Dykxhoorn,D.M.,"a/.,(2002)NatureReviewsMolecularCellBiology4:457-67.例如，具有本發(fā)明的環(huán)結(jié)構(gòu)的優(yōu)選siRNA如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自下組CCC,UUCG，CCACC,CCACACC和UUCAAGAGA。優(yōu)選的環(huán)結(jié)構(gòu)是UUCAAGAGA(DNA中為"ttcaagaga")。適當(dāng)?shù)膕iRNA的核苷酸序歹'J可4吏用人人Ambion網(wǎng)站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder,html)可4尋到的siRNAi殳計(jì)計(jì)算機(jī)程序來設(shè)計(jì)。所述計(jì)算機(jī)程序基于如下規(guī)程選擇核苷酸序列用于siRNA合成。選擇siRNA靶位點(diǎn)1.從目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描，尋找AA二核苷酸序列。記錄每個(gè)AA的出現(xiàn)及其3'側(cè)鄰近的19個(gè)核苷酸作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。Tuschl等在(1999)Gew&sDev13(24):3191-7中，不推薦針對(duì)5'和3'非翻譯區(qū)(UTRs)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個(gè)堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)樯鲜鰠^(qū)域可能富含調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾與siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將所述潛在靶位點(diǎn)與人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，不考慮與其它編碼序列顯著同源的任何靶序列。可采用BLAST(可見于NCBI服務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行同源性搜索。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion,可優(yōu)選沿待評(píng)價(jià)的基因的長(zhǎng)度選擇幾個(gè)靶序列。BLC相關(guān)基因序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列可以相同也可以不同，但應(yīng)能夠獨(dú)立地、或者以時(shí)間性或空間性方式調(diào)控這些基因表達(dá)。通過將BLC相關(guān)基因的模板分別克隆到載體上，siRNA得以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，其中所述載體含有例如來自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元或人HIRNA啟動(dòng)子。為了將載體導(dǎo)入細(xì)胞，可以使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑(transfection-enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices),Lipofectamin2000(Invi加gen)，Oligofectamin(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，在體外檢測(cè)C2093、B5860Ns或C6055smRNA的多個(gè)部分的寡核苷酸或者與這些部分互補(bǔ)的寡核苷酸的降低腫瘤細(xì)胞中(例如使用HT1197,UMUC3,J82,HT1376,SW780,RT4或HT1376膀胱癌細(xì)胞系)C2093、B5860Ns或C6055s產(chǎn)生的能力。使用C2093、B5860Ns或C6055s特異性抗體或采用其它檢測(cè)策略檢測(cè)到與不存在候選siRNA組合物的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，與所述候選siRNA組合物接觸的細(xì)胞中C2093、B5860Ns或C6055s轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)物減少。對(duì)于在體外的基于細(xì)胞的試驗(yàn)或無細(xì)胞試-瞼中減少C2093、B5860Ns或C6055s產(chǎn)生的序列，進(jìn)一步試驗(yàn)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。對(duì)于在體外的基于細(xì)胞的試驗(yàn)或無細(xì)胞試驗(yàn)中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的序列，在大鼠或小鼠中進(jìn)行體內(nèi)試-瞼，以確認(rèn)C2093、B5860Ns或C6055s產(chǎn)生的減少和患有惡性新生物的動(dòng)物中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的減少。本發(fā)明還包括含有靶序列的核酸序列的雙鏈分子，所述靶序列例如SEQIDNO:1的核苷酸2543-2561(SEQIDNO:21)，SEQIDNO:3的核苷酸2491-2509,SEQIDNO:5的核苷酸1639-1657(SEQIDNO:25)，SEQIDNO:129的核苦酸1905-1923,SEQIDNO:131的核苷酸1873-1891,SEQIDNO:133的核苷酸1921-1939或者SEQIDNO:135的核苷酸2001-2019(SEQIDNO:144)。在本發(fā)明中，將包含有義《連和反義《連的雙鏈分子導(dǎo)入表達(dá)C2093、B5860Ns或C6055s基因的細(xì)胞時(shí)可以抑制所述基因的表達(dá)，其中所述雙鏈分子由有義鏈和反義鏈相互雜交而形成，其中所述有義鏈包含對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:21、25或144的核糖核芬酸序列，而所述反義鏈包含與所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。在本發(fā)明中，當(dāng)分離的核酸為RNA或其衍生物時(shí)，應(yīng)在核苷酸序列中將堿基"t"替換為"u"。如本說明書中使用的，術(shù)語"互補(bǔ)的，，指核酸分子的核苦酸單位之間形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對(duì)，而術(shù)語"結(jié)合"指兩種核酸或化合物、或者相關(guān)核酸或化合物、或者其組合之間的物理或化學(xué)相互作用?；パa(bǔ)的核酸序列在適宜條件下雜交，以形成幾乎不含或不含錯(cuò)配的穩(wěn)定雙鏈體。此外，本發(fā)明的分離的核苷酸的有義鏈和反義鏈可以通過雜交形成雙鏈核香酸或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的雙鏈體的每10個(gè)配對(duì)中出現(xiàn)的錯(cuò)配不超過1個(gè)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈體的鏈完全互補(bǔ)，即這樣的雙鏈不含^"配。核酸分子少于6319個(gè)核苷酸(對(duì)于SEQIDNO:1),5318個(gè)核普酸(對(duì)于SEQIDNO:3)，3851個(gè)核苷酸(對(duì)于SEQIDNO:129)，3819個(gè)核苦酸(對(duì)于SEQIDNO:131),3851個(gè)核苷酸(對(duì)于SEQIDNO:133)或3819個(gè)核苷酸(對(duì)于SEQIDNO:135)。例如，核酸分子的長(zhǎng)度為500、200、75個(gè)核苷酸或更短。本發(fā)明還包括包含一個(gè)或多個(gè)本說明書中描述的核酸的載體，以及包含該載體的細(xì)胞。對(duì)于針對(duì)C2093、B5860Ns或C6055s的siRNA或者編碼這些siRNA的DNA而言，本發(fā)明的分離的核酸是有用的。將這些核酸用于siRNA或編碼該siRNA的DNA時(shí)，有義鏈優(yōu)選為長(zhǎng)于約19個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)于約21個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明的多肽的表達(dá)，因而可以用于抑制本發(fā)明的多肽的生物學(xué)活性。并且，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表達(dá)抑制劑可以用于抑制本發(fā)明的多肽的生物學(xué)活性。因此，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療膀胱癌。此外，為了增強(qiáng)siRNA的抑制活性，可將核芬酸"u"添加到靶序列的反義鏈的3，端。要添加的"u"的數(shù)目為至少約2個(gè)，通常為約2-約10個(gè)，優(yōu)選為約2-約5個(gè)。添加的"u"在siRNA的反義鏈的3'端形成單鏈。并且，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表達(dá)抑制劑可用于抑制本發(fā)明的多肽的生物活性。因此，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細(xì)胞增殖性疾病，如膀胱癌。此夕卜,本發(fā)明提供抑制本發(fā)明的C2093、B5860Ns或C6055s多肽的表達(dá)的核酶。通常，核酶分為大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯鍵的酶。與大核酶反應(yīng)后，反應(yīng)位點(diǎn)由5，-磷酸基團(tuán)和3'-羥基基團(tuán)組成。大核酶進(jìn)一步分為(l)催化鳥苷在5，-剪接位點(diǎn)的酯基轉(zhuǎn)移作用的I組內(nèi)含子RNA;(2)催化經(jīng)由套索樣(lariat-Iike)結(jié)構(gòu)經(jīng)過兩步反應(yīng)自我剪接的II組內(nèi)含子RNA;和(3)通過水解在5'位點(diǎn)切割tRNA前體的核糖核酸酶P的RNA組件。另一方面，小核酶與大核酶相比更小(約40bp),并且小核酶切割RNA產(chǎn)生5，-羥基和2，-3，環(huán)狀磷酸酯。錘頭型(Hammerheadtype)核酶(Koizumi"a/.,(1988)FEBSLett228:228-30)和發(fā)夾型核酶(Buzayan，(1986)Nature323:349-53;KikuchiandSasaki,(1991)NucleicAcidsRes19:6751-5)都包括在小核酶中。設(shè)計(jì)和構(gòu)建核酶的方法是本領(lǐng)域中已知的(參見Koizumi""/.,(1988)FEBSLett228:228-30;Koizumi"a/.,(1989)NucleicAcidsRes17:7059-71;KikuchiandSasaki,(1991NucleicAcidsRes19:6751-5)。因而，抑制本發(fā)明的多肽的表達(dá)的核酶也可以根據(jù)其序列信息(SEQIDNO:l,3,5，129,131,133或135)和這些常規(guī)方法來構(gòu)建。針對(duì)C2093、B5860Ns或C6055s轉(zhuǎn)錄物的核酶，可抑制C2093、B5860Ns或C6055s蛋白的過表達(dá)，并可抑制這些蛋白的生物活性。因此，這些核酶可以用于膀胱癌的治療或預(yù)防?？贵w或者，通過施用與基因產(chǎn)物結(jié)合或以其它方式抑制基因產(chǎn)物功能的化合物，來抑制在BLC中過表達(dá)的基因的一種或多種基因產(chǎn)物的功能。例如，所述化合物是與一種或多種過表達(dá)的基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明涉及抗體特別是針對(duì)由上調(diào)的標(biāo)記基因所編碼的蛋白的抗體、或所述抗體的片段的用途。如本說明書中使用的，術(shù)語"抗體"指一種具有特異性結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，其僅與用于合成該抗體的抗原(即上調(diào)標(biāo)記的基因產(chǎn)物)或與其緊密相關(guān)的抗原相互作用(即結(jié)合)。本發(fā)明提供與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體。具體地說，本發(fā)明提供與抗原決定簇結(jié)合的抗體，所述抗原決定簇包含SEQIDNO:4的氨基酸序列304-588,其為B5860NV1的特異序列。可以以任意形式，如單克隆或多克隆抗體使用本發(fā)明的抗體，并包括用本發(fā)明的多肽免疫動(dòng)物如兔獲得的抗血清、所有種類的多克隆抗體和單克隆抗體，人抗體和通過基因重組制備的人源化抗體。作為抗原使用以獲得抗體的本發(fā)明的多肽，可源自任何動(dòng)物物種，但優(yōu)選源自哺乳動(dòng)物，如人、小鼠或大鼠等，更優(yōu)選源自人。人源多肽可以由本發(fā)明公開的核苷酸或氨基酸序列獲取。根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白質(zhì)，也可以是蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可以包含例如選自B5860NV1的特異序列(來自SEQIDNO:4的304_588的位置)的部分氨基酸序列。在本說明書中，抗體定義為與本發(fā)明的多肽的全長(zhǎng)和/或片段反應(yīng)的蛋白質(zhì)。可將編碼本發(fā)明的多肽或其片段的基因插入已知的表達(dá)載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化如本說明書所述的宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^任意標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外回收所需多肽或其片段，然后可將其用作抗原。此外，表達(dá)多肽的全細(xì)胞或其裂解物，或者化學(xué)合成的多肽均可用作抗原?？梢杂每乖庖呷我獠溉閯?dòng)物，但優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。通常使用嚙齒目(Rodentia)，兔形目(Lagomorpha)或靈長(zhǎng)類(Primates)動(dòng)物。嚙齒目動(dòng)物包括例如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠(hamster)。兔形目動(dòng)物包括例如家兔。靈長(zhǎng)類動(dòng)物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(oldworldmonkey))如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴(rhesusmonkey)、狒狒(sacredbaboon)和黑猩程(chimpanzee)。用抗原免疫動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體地，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，將抗原懸液與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑如福氏(Freund's)完全佐劑混合，制成乳液，然后施用于哺乳動(dòng)物。其后優(yōu)選每4至21天施用數(shù)次與適量福氏不完全佐劑混合的抗原。也可使用合適的載體進(jìn)行免疫。如上述進(jìn)行免疫后，用標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)血清中所需的抗體量的增加。可以按如下方法制備針對(duì)本發(fā)明的多肽的多克隆抗體從經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物(該哺乳動(dòng)物經(jīng);險(xiǎn)測(cè)其血清中所需的抗體增加)收集血液，并通過任意常規(guī)的方法從所述血液中分離血清。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，并且可以從所述血清中分離含有該多克隆抗體的級(jí)分。使用例如與本發(fā)明的多肽偶聯(lián)的親和柱，并進(jìn)一步用蛋白A或蛋白G柱純化該級(jí)分可從僅識(shí)別本發(fā)明的多肽的級(jí)分中制備免疫球蛋白G或M。為了制備單克隆抗體，從用抗原免疫的哺乳動(dòng)物收集免疫細(xì)胞，在如上所述檢查血清中所需抗體水平升高，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的例如哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選具備獲得的特性以便用藥物選擇融合細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞。才艮4居已^口的方法，》口Milstein等(GalfreandMilstein,MethodsEnzymol73:3-46(1981))的方法可將上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基(含次黃噤呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)，可以選出由細(xì)胞融合所得的雜交瘤。通常，細(xì)胞培養(yǎng)是在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行數(shù)天至數(shù)周，這段時(shí)間足以使除了所需的雜交瘤細(xì)胞之外的所有其它細(xì)胞(非融合的細(xì)胞)死亡。然后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋(standardlimitingdilution)篩選并克隆生產(chǎn)所需抗體的雜交瘤纟田月包。多肽、表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物免疫人淋巴細(xì)胞，如EB病毒感染的淋巴細(xì)胞。然后，使免疫后的淋巴細(xì)胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細(xì)胞，如U266融合，以獲得產(chǎn)生所需的可與所述多肽結(jié)合的人抗體的雜交瘤細(xì)胞(特開昭63-17688)。然后將獲得的雜交瘤細(xì)胞移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。獲得的單克隆抗體可以通過例如石克酸4妄沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)了本發(fā)明的多肽的親和柱進(jìn)行純化。本發(fā)明的抗體不僅可以用于純化和檢測(cè)本發(fā)明的多肽，還可以作為本發(fā)明的多肽的激動(dòng)劑和拮抗劑的候選物。此外，該抗體可以用于與本發(fā)明的多肽相關(guān)的疾病的抗體治療。當(dāng)將獲得的抗體施用于人體時(shí)(抗體治療)，優(yōu)選使用人抗體或人源化抗體以降低免疫原性。例如，可以用選自多肽、表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物的抗原免疫具有人抗體基因文庫(kù)(repertory)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然后，從該動(dòng)物收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合以獲得雜交瘤，從該雜交瘤可制備針對(duì)所述多肽的人抗體(參見WO92-03918，W094-02602,WO94-25585,W096-33735和WO96-34096)?；蛘?，可以通過癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞，如經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞無限增殖化(immortalize),并用于制備單克隆抗體。如此獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程技術(shù)重組制備(參見例如BorrebaeckandLarrick，(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies,publishedintheUnitedKingdombyMacMillanPublishersLTD)。例如，可以/人免疫細(xì)月包，如產(chǎn)生抗體的雜交瘤或經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞來克隆編碼抗體的DNA,將該DNA插入合適的載體并轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，從而制備重組抗體。本發(fā)明還4是供如上所述制備的重組抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要其可以結(jié)合一種或多種本發(fā)明的多肽。例如，所述抗體片段可以是Fab、F(ab，)2、Fv或?qū)碜訦鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv)(Hustona/.,(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83)。更具體地，可以用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體以產(chǎn)生抗體片段?；蛘?，還可以構(gòu)建編碼該抗體片段的基因，將其插入合適的表達(dá)載體，并在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見例如Co"a/"(1994)JImmunol152:2968-76;BetterandHorwitz,(1989)MethodsEnzymol178:476-96;PluckthunandSkerra,(1989)MethodsEnzymol178:497-515;Lamoyi,(1986)MethodsEnzymol121:652-63;Rousseaux&a/"(1986)MethodsEnzymol121:663-9;BirdandWalker,(1991)TrendsBiotechnol9:132-7》抗體可以通過與各種分子如聚乙二醇(PEG)接合進(jìn)行修飾。本發(fā)明提供這樣的修飾抗體?？赏ㄟ^將抗體進(jìn)行化學(xué)修飾來獲得修飾抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的?？蛇x地，可獲得本發(fā)明的抗體作為在源自非人抗體的可變區(qū)及源自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體，或者作為含有源自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、源自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體。所述抗體可利用已知技術(shù)制備。人源化可通過用嚙齒類的CDRs或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列的方式進(jìn)4亍(見例如Verhoeyen(1988)5Wee239:1534-1536)。因而，這樣的人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上小于完整人可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)域已被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。除人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的完整人抗體也是可以利用的。這樣的抗體可利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備。例如，體外方法包括使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(kù)(例如，Hoogenboom&Winter,(1992)J.Mol.Biol.227:381-8)。類似地，可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如內(nèi)源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，來制備人抗體。該方法描述于例如美國(guó)專利Nos.6,150,584;5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625，126;5,633,425;5,661,016?？梢詫⑷缟汐@得的抗體純化至均質(zhì)。例如，可根據(jù)用于普通蛋白質(zhì)的分離和純化方法進(jìn)行抗體的分離和純化。例如，通過適當(dāng)選擇和組合使用柱層析如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電H焦，可以分離4元體(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane,(1988)ColdSpringHarborLaboratory),4旦并不局卩艮于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和4i例示性的可使用的蛋白A柱包括例如HyperPOROS和SepharoseF.F.(Pharmacia)。除親和層析外，例示性的層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshaketal.,(1996)ColdSpringHarborLaboratoryPress)?？梢酝ㄟ^液相層析，如HPLC和FPLC進(jìn)行層析過程。例如，可以采用吸光度測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、放射免疫測(cè)定(RIA)和/或免疫熒光檢測(cè)來測(cè)定本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在平板上，將本發(fā)明的多肽施加到平板上，再施加含有所需抗體的樣品(如產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液或純化的抗體)。然后施加用酶(如i威性磷酸酶)標(biāo)記的識(shí)別第一抗體的第二抗體，并保溫平板。接下來在洗滌后，在平板中加入酶底物如磷酸對(duì)硝基苯酯，測(cè)定吸光度以評(píng)價(jià)樣品的抗原結(jié)合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可以用作抗原來評(píng)價(jià)抗體的結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore(Pharmacia)評(píng)價(jià)本發(fā)明抗體的活性。上述方法允許通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明的多肽的樣品，并;f全測(cè)或測(cè)定由抗體和多肽形成的免疫復(fù)合物，來^^測(cè)或測(cè)定本發(fā)明的多肽。因?yàn)楸景l(fā)明所述的檢測(cè)或測(cè)定多肽的方法可特異性地檢測(cè)或測(cè)定多肽，所以該方法可應(yīng)用于使用多肽的各種實(shí)驗(yàn)。定向于癌細(xì)胞中發(fā)生的特異性分子變化的癌癥療法已經(jīng)通過下述抗癌藥的臨床開發(fā)和管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)被認(rèn)定為有效用于治療晚期乳腺癌的曲妥單抗(trastuzumab)(Herceptin),用于治療慢性骨髓性白血病的曱磺酸伊馬替尼(imatinibmethylate)(Gleevec),用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B細(xì)胞淋巴瘤和外膜細(xì)胞(mantlecell)淋巴瘤的美羅華(rituximab)(抗CD20mAb)(CiardielloFandTortoraG.(2001)ClinCancerRes.;7(10):2958-70.Review.;SlamonDJ,a/.，(2001)NEnglJMed.;344(11):783-92.;RehwaldU,"a/.,(2003)Blood.;101(2):420-4.;FangG,"a/.,(2000).Blood,96,2246-53.)。這些藥物臨床上是有效的，并且比傳統(tǒng)抗癌劑具有更好的耐受性，因?yàn)樗鼈儍H僅靶向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此，這些藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質(zhì)量，而且證明了分子靶向癌癥療法理念的合理性。另外，當(dāng)靶向藥物與標(biāo)準(zhǔn)化療組合使用時(shí)，可以增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化療的效力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1,47-56.;KlejmanA，"a/.,(2002).Oncogene,21,5868-76.)。因此，未來的癌癥治療將很可能涉及將常頭見藥物與針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和侵入力(invasiveness)的耙物特異性試劑組合。這些調(diào)節(jié)方法可以離體(exv/vo)、體外(例如通過在藥劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞)或體內(nèi)(例如通過給受試者施用藥劑)進(jìn)行。所述方法包括作為抵制蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的組合、或者核酸分子或核酸分子的組合?？梢杂棉卓?即降低或抑制)一種或多種過表達(dá)基因的活性的治療劑來治療疾病和病癥，所述疾病和病癥的特征在于基因和基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或生物活性(相對(duì)于未患有疾病或病癥的受試者)分別有所增加?？梢灾委熜曰蝾A(yù)防性地施用拮抗活性的治療劑。因此，可以用于本發(fā)明上下文中的治療劑包括例如(i)過表達(dá)或低表達(dá)的一種或多種基因的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗過表達(dá)基因或基因產(chǎn)物的抗體；(iii)編碼過表達(dá)或低表達(dá)的一種或多種基因的核酸；(iv)反義核酸或"功能障礙(dysfunctional)"的核酸(即，由于在一個(gè)或多個(gè)過表達(dá)基因的核酸內(nèi)的異源插入所致)；(v)小干擾RNA(siRNA);或(vi)調(diào)節(jié)劑(即，改變過表達(dá)或低表達(dá)多肽與其結(jié)合配對(duì)物(bindingpartner)之間的相互作用的抑制劑、激動(dòng)劑和拮抗劑)。將功能障礙的反義分子用于通過同源重組來"敲除"多肽的內(nèi)源性功能(參見例如Capecchi,(1989)Science244:1288-92)。以生物活性下降(相對(duì)于未患有疾病或病癥的受試者)為特征的疾病和病癥，可以使用提高活性(即，對(duì)其活性的激動(dòng)劑)的治療劑進(jìn)行治療?？梢砸灾委熁蝾A(yù)防的方式施用上調(diào)活性的治療劑?？梢岳玫闹委焺┌ǖ幌抻诙嚯?或其類似物、衍生物、片段或同源物)或提高生物利用度(bioavailability)的;敫動(dòng)劑。通過獲取患者組織樣品(例如從活檢組織)，并在體外檢測(cè)其RNA或肽水平、表達(dá)的肽(或表達(dá)有所改變的基因的mRNA)的結(jié)構(gòu)和/或活性，來定量肽和/或RNA,從而可以容易地檢測(cè)出水平的上升或下降。本領(lǐng)域公知的方法包括f旦不限于免疫測(cè)定法(例如在Westem印跡分析、免疫沉淀后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細(xì)胞化學(xué)等)和/或檢測(cè)mRNA表達(dá)的雜交試驗(yàn)(例如Northern試驗(yàn)、點(diǎn)印跡、原位雜交等)。預(yù)防性給藥在出現(xiàn)疾病的明顯臨床癥狀之前進(jìn)行，以阻止疾病或病癥的出現(xiàn)或者延遲其進(jìn)程。本發(fā)明的療法可以包括使細(xì)胞與調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，所述調(diào)節(jié)劑可調(diào)節(jié)一種或多種差異表達(dá)基因的基因產(chǎn)物的活性。蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)劑的例子包括但不限于核酸、蛋白質(zhì)、這些蛋白質(zhì)的天然存在的同源配體(naturally-occurringcognateligands)、肽、肽沖莫擬物及其它小分子。例如，合適的試劑可以刺激一種或多種差異性低表達(dá)基因的一種或多種蛋白質(zhì)的活性。針對(duì)膀胱癌的預(yù)防接種(vaccinate)本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受試者中膀胱癌的方法，該方法包括如下步驟對(duì)所述受試者施用疫苗，其中所述疫苗包含由選自表4中所列的BLC相關(guān)基因(即上調(diào)基因)的核酸編碼的多肽，該多肽的免疫活性片段或者編碼該多肽或其片段的多核香酸。施用所述多肽在受試者中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。為了誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，應(yīng)給有需要的受試者施用由選自表4中所列的BLC相關(guān)基因的核酸編碼的多肽，該多肽的免疫活性片段或者編碼該多肽或其片段的多核苷酸。多肽或其免疫活性片段可以用作針對(duì)BLC的疫苗。在一些情況下，蛋白質(zhì)或其片段可以以結(jié)合于T細(xì)胞受體(TCR)或由抗原呈遞細(xì)胞(APQ,如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)或B細(xì)胞呈遞的形式進(jìn)行施用。由于DC具有強(qiáng)抗原呈遞能力，所以在APC中使用DC是最優(yōu)選的。在本發(fā)明中，針對(duì)BLC的疫苗是指具有如下能力的物質(zhì)將其接種于動(dòng)物后誘導(dǎo)抗胂瘤免疫。根據(jù)本發(fā)明，由表4中所列的BLC相關(guān)基因編碼的多肽或其片段被認(rèn)為是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，其可誘應(yīng)。因此，本發(fā)明還包括使用多肽誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。一般而言，抗腫瘤免疫包括諸如以下的免疫應(yīng)答-誘導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，-誘導(dǎo)識(shí)別腫瘤的抗體，和-誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，當(dāng)某蛋白質(zhì)接種動(dòng)物后誘導(dǎo)任一種所述免疫反應(yīng)時(shí)，確定該蛋白質(zhì)具有抗腫瘤免疫誘導(dǎo)效果。由蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫可以通過在體內(nèi)或體外觀察宿主中的免疫系統(tǒng)針對(duì)該蛋白質(zhì)的應(yīng)答而進(jìn)行檢測(cè)。例如，檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)的方法是公知的。具體地，進(jìn)胞。以抗原特異性方式應(yīng)答于APC所呈遞抗原的T細(xì)胞由于該抗原的刺激而分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；CTL)，然后增殖(這稱為T細(xì)胞活化)。因此，一些肽的CTL誘導(dǎo)可以通過將該肽經(jīng)由APC呈遞于T細(xì)胞和檢測(cè)CTL的誘導(dǎo)來進(jìn)行評(píng)估。此外，APC具有激活CD4+T細(xì)胞，CD8+T纟田月包，巨噬細(xì)胞，嗜酸粒細(xì)胞(eosinophil)和NK細(xì)胞的功效。由于CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，可使用這些細(xì)胞的激活效應(yīng)作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用。使用樹突細(xì)胞(DC)作為APC評(píng)價(jià)CTL誘導(dǎo)作用的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在APC中，DC是具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在該方法中，首先使受試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細(xì)胞接觸。在與DC接觸后，如果檢測(cè)出具有針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的T細(xì)胞，則表示該受試多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。CTL的抗腫瘤活性可以例如采用"Cr標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的溶解(lysis)作為指標(biāo)來進(jìn)行檢測(cè)?；蛘?，采用3&胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞損傷程度的方法也是眾所周知的。除DC外，外周血單核細(xì)胞(PBMC)也可用作APC。已才艮道通過在存在GM-CSF和IL-4的情況下培養(yǎng)PBMC來增強(qiáng)CTL的誘導(dǎo)。相似地，已顯示通過在存在鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)和IL-7的條件下培養(yǎng)PBMC來誘導(dǎo)CTL。可以認(rèn)為通過這些方法確定為具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽，是具有DC激活效應(yīng)和隨后的CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，請(qǐng)導(dǎo)針對(duì)肺瘤細(xì)胞的CTL的多肽可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得誘導(dǎo)針對(duì)肺瘤的CTL的能力的APC也可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過APC呈遞多肽抗原而獲得細(xì)胞毒性的CTL也可用作抗胂瘤的疫苗。利用由APC和CTL產(chǎn)生的抗肺瘤免疫的這些腫瘤治療方法稱為細(xì)胞免疫療法。一般來說，當(dāng)使用多肽用于細(xì)胞免疫療法時(shí)，已知通過組合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并使其與DC接觸來增加CTL誘導(dǎo)的效率。因此，當(dāng)用蛋白質(zhì)片段刺激DC時(shí)，使用多種類型的片段的混合物是有利的。可選地，多肽對(duì)抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可以通過觀察針對(duì)肺瘤的抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)來進(jìn)行確認(rèn)。例如，當(dāng)用多肽免疫的試驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該多肽的抗體并且這些抗體抑制胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，所述多肽可視為具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。施用本發(fā)明的疫苗可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，而該抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)能夠治療和預(yù)防BLC?？拱┲委熁?qū)Π┌Y發(fā)病的預(yù)防可以包括任何下述步驟諸如癌性細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，癌癥的退化(involution)以及癌發(fā)生的抑制。癌癥的治療或預(yù)防還包括患有癌癥的個(gè)體死亡率和發(fā)病率降低、血液中腫瘤標(biāo)記物水平減少、癌癥伴發(fā)的可檢測(cè)癥狀的緩解等。所述治療性和預(yù)防性效果優(yōu)選是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。例如，在觀察中顯著性水平為5%或更低，在所述觀察中將疫苗針對(duì)細(xì)胞增殖性疾病的治療性或預(yù)防性效果與未施用疫苗的對(duì)照進(jìn)行比較。例如，可將Student'st-檢驗(yàn)，Mann-WhitneyU-檢驗(yàn)或ANOVA用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。上述具有免疫活性的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體可與佐劑組合。佐劑是指當(dāng)與具有免疫活性的蛋白質(zhì)共同(或相繼)施用時(shí)能增強(qiáng)針對(duì)該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。例示性的佐劑包括但不限于霍亂毒素(choleratoxin)、沙門氏菌毒素(salmonellatoxin)、明風(fēng)(alum)等。此外，本發(fā)明的疫苗可適宜地與藥物可接受的載體組合。這樣的載體的例子包括但不限于無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液、培養(yǎng)液等。此外，疫苗可根據(jù)需要包含穩(wěn)定劑，懸浮劑，防腐劑，表面活性劑等。疫苗可全身或局部地進(jìn)行施用。疫苗施用可以通過單次給藥進(jìn)行，或者通過多次給藥來強(qiáng)化(boost)。當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時(shí)，可以例如通過離體方法治療或預(yù)防肺瘤。更具體地，可以收集接受治療或預(yù)防的受試者的PBMC，使細(xì)胞與多肽在離體條件下接觸，誘導(dǎo)APC或CTL，然后將該細(xì)胞施用于受試者。也可通過將編碼多肽的載體在離體條件下導(dǎo)入PBMC中來誘導(dǎo)APC。體外誘導(dǎo)的APC或CTL可以在施用前進(jìn)行克隆。通過克隆和培養(yǎng)具有高靶細(xì)胞破壞活性的細(xì)胞，可以更有效地實(shí)施細(xì)胞免疫治療。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可以用于針對(duì)提供細(xì)胞的受試者進(jìn)行細(xì)胞免疫治療，還可以用于針對(duì)來自其它個(gè)體的相似類型的腫瘤進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。此外，本發(fā)明提供治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病諸如癌癥的藥物組合物，其包含藥物有效量的本發(fā)明的多肽。該藥物組合物可以用于提高抗腫瘤免疫。C2093、B5860Ns或C6055s的正常表達(dá)限定在睪丸內(nèi)。因而，對(duì)這些基因的抑制不會(huì)給其它器官造成不良影響。因此，C2093、B5860Ns或C6055s多肽優(yōu)選用于治療細(xì)胞增殖性疾病，特別是膀胱癌。而且，由于在癌細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)的肽片段顯示誘導(dǎo)抗癌免疫應(yīng)答，因此也可以將C2093、B5860Ns或C6055s的肽片l殳用于治療或預(yù)防細(xì)月包增殖性疾病如膀胱癌的藥物組合物中。本發(fā)明中，以足夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的劑量施用多肽或其片^殳，劑量范圍為0.1mg-10mg，優(yōu)選0.3mg-5mg,更優(yōu)選0.8mg-1.5mg。反復(fù)進(jìn)行施用。為誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，例如可以每2周分4次施用1mg肽或其片段。此外，編碼C2093、B5860Ns或C6055s的多核苷酸或者它們的片段可以用于產(chǎn)生抗腫瘤免疫。可以將這樣的多核苷酸并入表達(dá)載體以在待治療的受試者中表達(dá)C2093、B5860Ns或C6055s或者它們的片段。因此，本發(fā)明包含誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中給患有細(xì)胞增殖性疾病如膀胱癌或處于發(fā)生此類疾病的危險(xiǎn)中的受試者施用編碼C2093、B5860Ns或C6055s的多核苷酸或者它們的片段。用于抑制BLC或惡性BLC的藥物組合物本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，其含有通過本發(fā)明的篩選方法選擇的任意化合物。當(dāng)為治療細(xì)胞增殖性疾病(例如膀胱癌)而將通過本發(fā)明的篩選方法分離的化合物作為藥物施用于人或其它哺乳動(dòng)物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、犬、羊、豬、牛、猴子、狒狒、黑猩猩時(shí)，分離的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的藥物制備方法配制成劑型。例如，根據(jù)需要，藥物可以作為糖衣片劑、膠囊劑、酏劑和微膠嚢口服施用；或者用水或任何其它藥物可接受的液體配制成無菌溶液或懸浮液，以注射劑的形式非口服施用。例如，可以將化合物以一般接受的藥物配制方式(dmgimplementation)所需的單位劑型、與藥理學(xué)可接受的載體或介質(zhì)混合在一起，所述載體或介質(zhì)具體為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑(excipient)、々某介物(vehicle)、防腐劑、粘合劑等。這些制劑中有效成分的量給出(make)可獲得的指定范圍內(nèi)的合適劑量。能夠混合到片劑和膠嚢中的添加劑的例子包括但不限于，粘合劑如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠(tragacanthgum)和阿拉伯膠；賦形劑例如結(jié)晶纖維素；溶脹劑例如玉米淀粉、明膠和海藻酸(alginicacid);潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂；增甜劑例如蔗糖、乳糖或糖精；和調(diào)味劑例如薄荷(pepperaiint)、Gcm//zen'a油和櫻桃。當(dāng)單位劑型為膠嚢劑時(shí)，上述成分中還可以包括液體載體，例如油。注射用無菌組合物可以使用媒介物例如注射用蒸餾水，按照標(biāo)準(zhǔn)的藥物配制方式進(jìn)行配制。生理鹽水、葡萄糖以及包含佐劑，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉的其它等滲液體，可用作注射用水溶液。這些可以與合適的增溶劑組合使用，所述增溶劑例如醇，特別是乙醇、多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，例如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油是油質(zhì)液體的實(shí)例，所述油質(zhì)液體可以與苯甲酸千酯或苯曱醇組合使用作為增溶劑，還可與緩沖液，如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液；鎮(zhèn)痛劑，如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，如苯曱醇、酚；以及抗氧化劑配制在一起。制備的注射劑可以裝入到合適的安瓿(ampoule)中?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法給患者施用本發(fā)明的藥物組合物(pharmaceuticalcompound),例如通過動(dòng)月永內(nèi)、,爭(zhēng)月永內(nèi)或經(jīng)皮注射，以及鼻內(nèi)、肌內(nèi)或口服給藥施用于患者。施用劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡以及施用方法而變化；不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠按常規(guī)選擇它們。如果所述化合物由DNA編碼，可將該DNA插入到基因治療載體中，并施用該載體以進(jìn)行治療。施用的劑量和方法因患者的體重、年齡和癥狀而異，但是選擇和優(yōu)化這些參數(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。本發(fā)明中，適宜的藥物制劑包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括口腔或舌下)、陰道或非消化道(包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))施用的制劑，以及適于通過吸入或吹入(insufflation)施用的制劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。制劑可以任選包裝在獨(dú)立的劑量單位(dosageunit)中。適于口服施用的藥物制劑包括膠嚢劑、扁嚢劑(cachet)或片劑，它們各含有一定量的活性成分。適合的制劑還包括粉末、顆粒，溶液，懸浮液或乳液。活性成分可以任選以大丸劑(bolus)、藥糖劑(electuary)或糊劑(paste)的形式施用。用于口服給藥的片劑和膠嚢劑可含有常規(guī)賦形劑諸如結(jié)合劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑或濕潤(rùn)劑。片劑可通過壓縮或模制來制備，其中任選含有一種或多種配方成分。壓縮片劑可通過如下方法制備將活性成分以自由流動(dòng)的形式(如粉末或顆粒)任選地與結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑和/或分散劑混合，并在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中進(jìn)行壓縮。模制片劑可通過如下方法制備在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中對(duì)利用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉末化合物的混合物進(jìn)行模制。所述片劑可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包覆(coated)?？诜后w制備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、糖漿或酏劑的形式，或者也可以作為干燥產(chǎn)物提供，在使用前用水或其它適宜媒介物制成。所述液體制備物可含有常規(guī)添加劑諸如懸浮劑，乳化劑，非水性媒介物(可包括食用油)和/或防腐劑。片劑可任選地配制以提供其中活性成分的緩釋或控釋。片劑的包裝中可以包含每月服用的一片藥物。適于非消化道施用的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其中任選地含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑(bacteriostat)和使得制劑與目標(biāo)受體的血液等張的(isotonic)溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其中含有懸浮劑和/或增稠劑。所述制劑可以以單位劑量或多次劑量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶；還可以在冷凍-千燥(凍干的)條件下保存，這樣僅需要恰在使用前添加無菌液體載體例如鹽水、注射用水?？蛇x地，可提供所述制劑用于連續(xù)輸注(continuousinfusion)。即配即用的注射溶液和懸浮液可由前述的無菌粉末、顆粒及片劑的類型制備。適于直腸給藥的制劑包括栓劑(suppository)及標(biāo)準(zhǔn)載體如可可脂或聚乙二醇。適于口內(nèi)局部給藥，例如口腔或舌下給藥的制劑包括4走劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調(diào)味基質(zhì)，如蔗糖和阿拉伯膠(acacia)或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質(zhì)，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含活性成分。鼻內(nèi)給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物可以用作液體噴霧劑、可分散粉末，或以滴劑(drop)的形式。滴劑可用水性或非水性基質(zhì)配制，該基質(zhì)中也含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。吸入給藥時(shí)，可以由吹入器、霧化器、氣溶膠包裝(pressurizedpack)或其它輸送氣溶膠噴霧的便利裝置方便地輸送化合物。氣溶膠包裝可含有適宜的噴射劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供輸送計(jì)量量(meteredamount)的閥門來確定劑量單位?？蛇x地，通過吸入或吹入給藥時(shí)，化合物可以是干粉組合物的形式，例如該化合物與適宜粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以以單位劑型提供，這些劑型例如膠囊、藥筒(cartridge)、凝膠(gelatin)或發(fā)泡包(blisterpack),借助吸入器或吹入器，可由上述劑型施用所述粉末。其它的制劑包含可釋放治療劑的可植入裝置及粘性貼片(adhesivepatches)。需要時(shí)，可以采用適于緩釋活性成分的上述制劑。藥物組合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑，免疫抑制劑和/或防腐劑。應(yīng)當(dāng)理解除上述具體提及的成分外，本發(fā)明的制劑可含有本
技術(shù)領(lǐng)域：
對(duì)于所述制劑類型常規(guī)的其它試劑，例如適于口服給藥的制劑可以含有調(diào)味劑。舉例來說，當(dāng)向標(biāo)準(zhǔn)成年人(體重60kg)口服給藥時(shí)，雖然根據(jù)其癥狀存在一些差異，但與本發(fā)明的多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量為約0.1mg-約100mg每天，優(yōu)選為約1.0mg-約50mg每天，更優(yōu)選為約1.0mg-約20mg每天。當(dāng)以注射劑形式向標(biāo)準(zhǔn)成年人(體重60kg)非胃腸道給藥時(shí)，雖然根據(jù)患者、靶器官、癥狀和給藥方法存在一些差異，但靜脈內(nèi)注射約0.01mg-約30mg每天，優(yōu)選約O.lmg-約20mg每天，更優(yōu)選約O.lmg-約10mg每天的劑量是合適的。而且，在其它動(dòng)物的情況下，可以按換算為60kg體重的量施用。優(yōu)選的單位劑量制劑如下所述含有有效劑量或其適當(dāng)部分的活性成分。對(duì)于前述的各種情況，可以以約0.1-約250mg/kg每天的劑量范圍口服或通過注射施用所述組合物，例如多肽和有機(jī)化合物。成人的劑量范圍通常為約5mg-約17.5g/天，優(yōu)選為約5mg-約10g/天，更優(yōu)選為約100mg-約3g/天。片劑或其它以分散單元提供的單位劑型可適宜地含有以這樣的劑量或者作為多個(gè)這樣的劑量有效的量，例如含有約5mg-約500mg,更通常為約100mg-約500mg。所用劑量依賴于多種因素，包括受試者的年齡和性別，治療的確切疾患及其嚴(yán)重程度。此外，給藥途徑也依賴于病癥及其嚴(yán)重程度而變化。然而無論怎樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員都能在考慮上述因素的基礎(chǔ)上常規(guī)地計(jì)算出合適的最佳劑量。此外，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防膀胱癌的藥物組合物，其含有抑制C2093、B5860Ns或C6055s基因表達(dá)的有效成分。這樣的有效成分包括針對(duì)C2093、B5860Ns或C6055s基因的反義多苷酸、siRNA或核酶，或者所述反義多核苦酸、siRNA或核酶的衍生物，如表達(dá)載體。siRNA的核芬酸序列可以按與前述相同的方式進(jìn)行^1計(jì)。而且，也可以按與前述相同的方式選擇C2093、B5860Ns或C6055smRNA的各個(gè)部分的寡核苷酸和與之互補(bǔ)的寡核苷酸。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制表達(dá)的C2093、B5860Ns或C6055ssiRNA寡核苦酸的例子包括分別包含SEQIDNO:21、25和144的輩巴序列。SEQIDNO:25的靶序列是2種B5860N轉(zhuǎn)錄物即B5860NV1和B5860NV2之間所共有的，因此，包含SEQIDNO:25作為有義鏈的siRNA可以抑制B5860NV1和B5860NV2轉(zhuǎn)錄物兩者的表達(dá)。SEQIDNO:144的把序列是4種C6055轉(zhuǎn)錄物即MGC34032、Genbank登錄號(hào)No,AK128063、C6055V1和C6055V2之間所共有的，因此，包含SEQIDNO:144作為有義鏈的siRNA可以抑制全部的MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AKl28063、C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。在本發(fā)明中，當(dāng)核酸序列為RNA或其衍生物時(shí)，應(yīng)將核苷酸序列中的堿基"t"替換為"u"?？梢砸阅芘cmRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式將siRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞?；蛘撸梢砸耘c使用針對(duì)C2093、B5860N或C6055的siRNA相同的方式，將編碼siRNA的DNA包含在載體中。此外，為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可在有義序列和反義序列之間放置由任意核苷酸序列組成的環(huán)序列。因此，本發(fā)明還提供具有通式5，-[A]畫[B]扁[A，]-3，的siRNA。如上所述，在該式中，其中為核糖核苦酸序列，其對(duì)應(yīng)于與C2093、B5860N或C6055的mRNA或cDNA特異性雜交的序列，為由約3-約23個(gè)核苷酸組成的核糖核苦酸序列，且[A，]是由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序列。在本發(fā)明的siRNA中，為了提高siRNA的抑制活性，可以將核苷酸"u"添加到[A，]的3，端。添加的"u"的數(shù)目至少為約2個(gè)，通常為約2-約10個(gè)，優(yōu)選為約2-約5個(gè)。而且，由23個(gè)核苷酸組成的環(huán)序列也可以提供活性siRNA(Jacque，丄-M.,"a/.,(2002)Nature418:435-438.)。例如，本發(fā)明的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的優(yōu)選siRNA如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自下組CCC，UUCG,CCACC,CCACACC和UUCAAGAGA。優(yōu)選的環(huán)序列是UUCAAGAGA(DNA中為"ttcaagaga")。適于在本發(fā)明的上下文中使用的例示性發(fā)夾siRNA包括序列)5，-gugaagaagugcgaccgaa-[B]-uucggucgcacuucuucac-3，(SEQIDNO:24),靶序列)5，-ccaaaguuccguagucuaa-[B]-uuagacuacggaacuuugg-3'(SEQIDNO:28)和靶序列)5'-gttgcagttacagatgaag陽[B]-cttcatctgtaactgcaac-3'(SEQIDNO:147)。通過與合適的基質(zhì)混合，可以將這些活性成分制成外用制劑，如搽劑或罨劑，其中所述合適的基質(zhì)對(duì)衍生物(derivative)是惰性的。并且根據(jù)需要，通過添加賦形劑、等滲劑(isotonicagents)、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、鎮(zhèn)痛劑等，可以將這些活性成分配制成例如片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和冷凍干燥劑。這些劑型可以按常規(guī)方法制備。通過直接將活性成分施于患處(ailingsite),或通過將其輸入血管以使其到達(dá)患處而將活性成分給予患者。也可使用封固劑(mountingmedium)來提高持久性和膜通透性。封固劑的例子包括脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑或它們的衍生物。本發(fā)明的這種組合物的劑量可以根據(jù)患者的身體狀況(condition)適當(dāng)調(diào)整，并按所需的量使用。例如，可以施用的劑量范圍為0.1-100mg/kg，優(yōu)選0.1-50mg/kg。本發(fā)明的另外的實(shí)施方式為用于治療和預(yù)防膀胱癌的組合物，該組合物含有抗由C2093、B5860Ns或C6055s基因編碼的多肽的抗體或可與該多肽結(jié)合的抗體的片段。當(dāng)向標(biāo)準(zhǔn)成年人(體重60kg)口服給藥時(shí)，雖然根據(jù)癥狀存在一些差別，但用于治療或預(yù)防膀胱癌的抗體或其片段的劑量為約0.1mg-約100mg每天，優(yōu)選為約1.0mg-約50mg每天，更優(yōu)選為約1.0mg-約20mg每天。當(dāng)以注射劑形式向標(biāo)準(zhǔn)成年人(體重60kg)非消化道給藥時(shí)，雖然根據(jù)患者的狀況、疾病癥狀和給藥方法而存在一些差別，但靜脈內(nèi)注射約O.Olmg-約30mg每天，優(yōu)選約O.lmg-約20mg每天；更優(yōu)選約O.lmg-約10mg每天的劑量是合適的。同樣地，在其它動(dòng)物的情況下，可以按換算為60kg體重的量施用。以下的實(shí)施例中將描述本發(fā)明的各個(gè)方面，但其并非意欲限制權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。以下的實(shí)施例，將對(duì)BLC細(xì)胞中差異表達(dá)的基因的鑒定與表征進(jìn)行說明。除非另外限定，本說明書中使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員一般理解的含義相同。盡管與本說明書中的所述類似或等同的方法和材料均可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但以下描述了合適的方法和材料。本說明書中引用的任何專利、專利申請(qǐng)和出版物均并入作為參考。實(shí)施例材料與方法患者、細(xì)胞系、組織樣品和新輔助化療人膀胱癌細(xì)胞系HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780和RT4獲自ATCC。所有的細(xì)胞均在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，即對(duì)于HT1197、UMUC3、J82和HT1376使用含O.lmM必需氨基酸(Roche)、lmM丙酮酸鈉(Roche)、0.01mg/ml胰島素(Sigma)的EMEM(Sigma,St.Louis,MO);對(duì)于HBLIOO和COS7<吏用Dulbecco改進(jìn)的Eaglei杏養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA);對(duì)于RT-4使用McCoy's5a(Sigma);對(duì)于SW780使用L-15。每種培養(yǎng)基都添加有10。/。胎牛血清(Cansera)和1。/?？股?抗真菌溶液(antimycoticsolution)(Sigma)。于37°C,在不含C02的濕潤(rùn)空氣的氣氛中維持SW780細(xì)胞。于37。C,在含5%0)2的濕潤(rùn)空氣的氣氛中維持其它細(xì)胞系。在每位患者4是供書目的知情同意(informedconsent)后，獲取由外科手術(shù)切除的膀胱癌的組織樣品，并獲fof目應(yīng)的臨床信息。選4奪已通過組織學(xué)確定為膀胱移行細(xì)胞癌的總共33個(gè)癌樣本(女性9人、男性24人；除一人(BC01025)年齡不詳外，年齡范圍在53-T7歲，年齡中值為66.5歲)(表l)用于本研究。根據(jù)UICCTNM分類判斷臨床病期(clinicalstage)。我們只加入希望接受4艮治性膀胱切除術(shù)的無結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移的T2aN0M0-T3bN0M0的患者，且這些患者之前未接受過放射性治療。要求參與者沒有腎功能、肝功能和血液機(jī)能的重度異常，且其ECOG病期(performancestatus，PS)判定為^2。(表l)受試患者<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>在進(jìn)行新輔助化學(xué)療法前的活體檢驗(yàn)時(shí)，由各患者取3-5片癌組織。立即將這些樣品埋入TissueTekOCT介質(zhì)(Sakura,Tokyo，Japan),冷凍并于-80。C保存。使用恒冷切片機(jī)(cryostat)(Sakura,Tokyo,Japan)將冷凍組織切成8pm切片，然后用蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)進(jìn)行染色以便組織學(xué)檢查。使用具有脈沖紫夕卜窄束聚焦激光(pulsedultravioletnarrowbeam-focuslaser)的EZ-cutsystem按生產(chǎn)商的規(guī)程選擇性地富集用于本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)的膀胱癌細(xì)胞。所有患者均經(jīng)胸部X射線、腹部和骨盆的計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)和核》茲共振成像一全查，并確認(rèn)未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。RNA提取和基于T7的RNA擴(kuò)增如前所述(KitaharaO，"a/.,(2001)CancerRes;61:3544-9)從顯微切割的(microdissect)癌細(xì)胞的各群體提取總RNA。為了確保RNA的品質(zhì)，將由各病例的殘留組織提取的總RNA在變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過存在核糖體RNA條帶來確認(rèn)品質(zhì)?？俁NA提取和基于T7的RNA擴(kuò)增，除使用RNeasyMicroKits(QIAGEN,Valencia,CA,USA)之外，還可以按之前的描述(OkabeH,"a/.,(2001)CancerRes;61:2129-37)進(jìn)行。經(jīng)兩輪RNA擴(kuò)增后，對(duì)于各樣品得到30-100pg的擴(kuò)增RNA(aRNA)。作為對(duì)照，以相同方式擴(kuò)增正常人膀胱poly(A)+RNA(BDBioscience,PaloAlto，CA)。如本發(fā)明人較早前已經(jīng)通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)(KitaharaO,a/.，(2001)CancerRes;61:3544-9)確認(rèn)的，無論使用總RNA還是使用aRNA作為模板，由該方法擴(kuò)增的RNA正確地反映最初的RNA來源中的比例，其中來自微陣列的數(shù)據(jù)與由RT-PCR獲得的結(jié)果一致。cDNA微陣列為了獲得點(diǎn)樣于載玻片上的cDNA,按之前所述對(duì)各基因進(jìn)行RT-PCR(KitaharaO,"a/.,(2001)CancerRes;61:3544-9)。使用高密度MicroarraySpotterLucidea(GEHealthcare,AmershamBiosciences)將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣在VII型載玻片(GEHealthcare,AmershamBiosciences,BuckinghamshireUK)上；在一個(gè)載玻片上重復(fù)(induplicate)點(diǎn)樣9216個(gè)基因。制備3組不同的栽玻片(共有27648個(gè)基因點(diǎn))，每組載玻片上還點(diǎn)樣相同的52個(gè)持家基因和2個(gè)陰性對(duì)照基因。按之前描述的方式由aRNA制備cDNA探針(OkabeH,"a/.,(2001)CancerRes;61:2129-37)。為進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，分別在存在Cy5-dCTP和Cy3陽dCTP(GEHealthcare,AmershamBiosciences)的條件下對(duì)9.0jag來自各癌癥組織和來自對(duì)照的擴(kuò)增RNA(aRNA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按之前的描述進(jìn)行雜交、洗滌和信號(hào)檢測(cè)(OkabeH,"a/.，(2001)CancerRes;61:2129-37)。信號(hào)的定量檢測(cè)從27648個(gè)點(diǎn)定量Cy3和Cy5的信號(hào)強(qiáng)度，并利用ArrayVision軟件(ImagingResearch,Inc.,St.Catharines,Ontario,Canada)通過替換背景來分析信號(hào)。隨后，調(diào)整各靶標(biāo)點(diǎn)(targetspot)的Cy5(腫瘤)和Cy3(對(duì)照)的熒光強(qiáng)度以使52個(gè)持家基因的平均Cy5/Cy3比為1。因?yàn)橛傻托盘?hào)強(qiáng)度獲得的數(shù)據(jù)的可信度低，因此如前所述(OnoK,"a/.,(2000)CancerRes;60:5007-11)在各載玻片上確定截止值(cutoffvalue),如果Cy3和Cy5兩種染料產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度低于截止值，則在進(jìn)一步的分析中排除該基因(Saito-HisaminatoA,"a/.,(2002)DNARes;9:35-45)。對(duì)于其它基因，對(duì)使用各樣品的原始數(shù)據(jù)將Cy5/Cy3計(jì)算為相對(duì)表達(dá)比的前述方法進(jìn)行了修正，因?yàn)槿绻鸆y3或Cy5信號(hào)強(qiáng)度低于截止值時(shí)，會(huì)提供Cy5/Cy3比極高或極低的讀數(shù)(reading)，從而導(dǎo)致選出假性預(yù)測(cè)基因。為了減少這樣的偏移，當(dāng)Cy3或Cy5信號(hào)強(qiáng)度低于截止值時(shí)，將各樣品的Cy3和Cy5信號(hào)強(qiáng)度加上各截止值的一半計(jì)算Cy5/Cy3比。鑒定膀胱癌中上調(diào)或下調(diào)的基因按以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)膀胱癌中通常上調(diào)或下調(diào)的基因進(jìn)行鑒定和分析。首先選出滿足下述條件的基因能夠計(jì)算超過50%的病例的相對(duì)表達(dá)比，并且在超過50%的病例中其表達(dá)是上調(diào)或下調(diào)的。此外，如果能夠計(jì)算35-50%的病例的相對(duì)表達(dá)比時(shí)，還要評(píng)價(jià)了該基因在80%的病例中上調(diào)或下調(diào)。各基因的相對(duì)表達(dá)比(Cy5/Cy3強(qiáng)度比)被歸于如下4個(gè)類群之一(l)上調(diào)(表達(dá)比大于5.0);(2)下調(diào)(表達(dá)比小于0.2);(3)表達(dá)無變化(表達(dá)比為0.2-5.0);(4)未表達(dá)(或微量表達(dá)，但小于檢測(cè)的截止水平)。這些類群用于檢測(cè)出一組基因，這些基因的表達(dá)比變化在各樣品間是一致的，并且對(duì)某亞群是特異性的。為了檢測(cè)出在膀胱癌細(xì)胞中一般上調(diào)或下調(diào)的候選基因，對(duì)27648個(gè)基因的全體表達(dá)圖式進(jìn)行篩選，以選出表達(dá)比大于5.0或小于0.2的基因。在看起來在腫瘤細(xì)胞中上調(diào)的全部394個(gè)基因中，注意集中在內(nèi)部識(shí)別號(hào)(in-houseidentificationmunber)為C2093、B5860N和C6055的基因上，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)比在超過50%的提供資料的膀胱癌病例中超過5.0,且正常人組織表達(dá)模式顯示其在正常器官包括心、肺、肝和腎中是低表達(dá)的。半定量RT-PCR選捧44個(gè)上調(diào)基因，通過實(shí)施半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)考察它們的表達(dá)水平。使用隨機(jī)引物(Roche)和SuperscriptII(Invitrogen)將來自各樣品的3|igaRNA等分試樣逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。對(duì)各cDNA混合物進(jìn)行稀釋，然后使用與為靶標(biāo)DNA或04尸Di7特異性反應(yīng)所制備的相同的引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖la的RT-PCR中使用的引物序列列于表2。圖lb和lc的RT-PCR中使用的PCR引物序列如下用于C20935'-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3'(SEQIDN0.9)和5'-TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3'(SEQIDNO.10);用于B5860NV1和V2的共同序列5'-GCTACAAGTAAAGAGGGGATGG-3'(SEQIDNO.ll)和5'-GGACAGAAAGGTAAGTCAGTGGG-3'(SEQIDNO.12)。以GAPDH的表達(dá)為內(nèi)部對(duì)照。最優(yōu)化PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，以確保產(chǎn)物強(qiáng)度在擴(kuò)增的線性范圍內(nèi)(表2)。表2圖la的RT-PCR中使用的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>B5860N、F1653、B9838和C6055的[a32P]-dCTP標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交(表3)。用于C6055的微陣列探針5'-CCCCAGTTGAGAGTTTGCTC-3'(SEQIDNO:137)和5'-CTGTCATGTGCTCATGTGAGTTT-3'(SEQIDNO:53);用于C6055的4個(gè)轉(zhuǎn)錄物的共有區(qū)域5'-TGACATCGGGATTCAGACTAA-3'(SEQIDNO:138)和5'-AAAGATGCTGGTCCTTGTGC-3'(SEQIDNO:139)。按生產(chǎn)商的說明書，使用TRIzol試劑(Invitrogen)從全部的膀胱癌細(xì)胞系和冰凍外科樣品才是取總RNA。在用DNaseI(NipponGene,Osaka,Japan)處理后，使用Micro-FastTrack(Invitrogen)按生產(chǎn)商的說明書分離mRNA。在1%變性瓊脂糖凝膠上分離各l嗎的各種mRNA的等分試樣和從正常成人的心、肺、肝、腎、腦、胰、睪丸和膀胱分離的polyA(+)RNA(Clontech，PaloAlto,CA),并轉(zhuǎn)移在尼龍膜上。按供應(yīng)商的推薦進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和洗滌。使用增感屏(intensifyingscreen)在-80。C將印跡放射自顯影14天。表3用于通過RT-PCR制備Northern探針的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>5,RACE和3，RACE通過使用SMART(TM)RACEcDNAAmplificationKit(Clontech)進(jìn)行cDNA末端5'快速擴(kuò)增(5'RACE)和cDNA末端3'快速擴(kuò)增(3，RACE),來確定B5860N和C6055的5'末端和3，末端序列。由膀胱癌細(xì)胞系，SW780細(xì)胞合成cDNA模板用于擴(kuò)增，并使用試劑盒中提供的API引物和如下引物進(jìn)行PCR:用于5'RACE的B5860N特異性反向引物(5'-CATTTTCTGATCCCCACCTCCCTTTG-3'(SEQIDN0.14)),用于5'RACE的C6055特異性反向引物(C6055一GSP1;5'-GATCCAAATGCTAGGGATCCTGTGTG-3'(SEQIDNO:140)和C6055一NGSP1;5'-CCTGTGTGATATCGTATGGCTCGTCCA-3'(SEQIDNO:141));和用于3'RACE的B5860N特異性正向引物(5'-AGAGGGGATGGGGAAGGTGTTGC-3'(SEQIDNO.15))。表達(dá)載體的構(gòu)建使用KOD-PlusDNA聚合酶(Toyobo,Osaka,Japan)通過PCR擴(kuò)增C2093、B5860Ns和C6055scDNA的完整編碼序列，PCR使用的引物如下TCAAGAGG-3'(SEQIDNO.16)(下劃線表示NotI位點(diǎn))和C2093-反向，5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3'(SEQIDN0.17)(下劃線表示NotI位點(diǎn))，B5860NVl-正向，5'-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAGAGTCAGGGTGTGC-3，(SEQIDNO.18)(下劃線表示NotI位點(diǎn))和B5860NVl-反向，5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3'(SEQIDNO.19)(下劃線表示XhoI位點(diǎn))，B5860NV2-正向，5'-GGAATTCATGGAGAGTCAGGGTGTG-3'(SEQIDNO.20)(下劃線表示EcoRI位點(diǎn))和B5860NV2-反向，5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3'(SEQIDNO.19)(下劃線表示XhoI位點(diǎn))，C6055-正向，5'-AGAATTCATGATCTTCCTACTGTGTATTATTGGC-3'(SEQIDNO:142)(下劃線表示EcoRJ位點(diǎn))和C6055-反向，5'-TATCTCGAGCTGCTTCCTAGTTTGTGGATTTTC-3';(SEQIDNO:143)(下劃線表示XhoI位點(diǎn))。將PCR產(chǎn)物分別插入pCAGGSnHA表達(dá)載體的EcoRI和XhoI,和NotI位點(diǎn)。通過DNA測(cè)序確定這些構(gòu)建體。Western印跡分析使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)按生產(chǎn)商的說明書分別用l嗎的pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA或pCAGGS-C6055-HA瞬時(shí)(transiently)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(用于pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NVl-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA轉(zhuǎn)化細(xì)胞)或7.5%SDS-聚丙歸酰胺凝膠(用于pCAGGS-C6055-HA轉(zhuǎn)化細(xì)胞)上對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后與作為第一抗體以1:1000稀釋的小鼠抗HA抗體(Roche)—起溫育。在與作為第二抗體的羊抗小鼠IgG-HRP(AmershamBiosciences)溫育之后，用ECL試劑盒(AmershamBiosciences)將信號(hào)可視化。進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞中外源性C2093、B5860N和C6055蛋白為考察外源性C2093、B5860NV1和B5860NV2或C6055的亞細(xì)胞定位，對(duì)全部的3個(gè)構(gòu)建體以每孔lxl()S個(gè)細(xì)胞接種COS7細(xì)胞。24小時(shí)后，使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)按生產(chǎn)商的說明書分別用l嗎的pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA或pCAGGS-C6055-HA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞。然后，使用含4%多聚曱醛(paraformaldehyde)的PBS固定細(xì)胞15分鐘，用含0.1%TritonX-100的PBS于4°C處理2.5分鐘以賦予細(xì)胞通透性。接下來，用3。/。BSA的PBS溶液于4。C覆蓋(cover)細(xì)胞12小時(shí)，以封閉非特異性雜交。接著，將各個(gè)轉(zhuǎn)染了構(gòu)建體的COS7細(xì)胞與l:1000稀釋的小鼠抗HA抗體(Roche)溫育。用PBS清洗后，兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞均用以1:3000稀釋的Alexa488-結(jié)合的抗小鼠第二抗體(MolecularProbe)進(jìn)行染色。用4',6-二脒基-2-笨吲哚二鹽酸(DAPI)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染(counter-stain)。在TCSSP2AOBS顯微鏡(Leica,Tokyo,Japan)下獲取熒光影像。同步化及流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析使用FuGENE6(Roche)按供應(yīng)商的規(guī)程用8嗎的pCAGGS-C2093-HA、或pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(lx106)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，進(jìn)一步用阿非迪霉素(lng/ml)處理16小時(shí)以使細(xì)胞抑制(arrest)在G1期。用新鮮培養(yǎng)基清洗3次以使細(xì)胞周期釋放(release),在指定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。將細(xì)胞與諾考達(dá)唑(250ng/ml)溫育16小時(shí)以使其抑制在有絲分裂期(mitoticphase),然后收獲細(xì)胞。將同步化粘附和分離的細(xì)胞的400ml等分試樣于4°C與70%乙醇組合并用其固定，以用于FACS分析。用PBS(-)清洗2次后，然后將細(xì)胞與lml含lmgRNaseI的PBS于37。C溫育30分鐘。然后在1ml含50mg碘化丙錠(PI)的PBS中對(duì)細(xì)月包進(jìn)行染色。在流式細(xì)胞儀(FACScalibur;BectonDickinson,SanDiego,CA)中從至少10000個(gè)中細(xì)胞確定細(xì)胞周期階段的每個(gè)部分的百分比。使用psiU6X3.0構(gòu)建C2093、B5860N和C6055特異性siRNA表達(dá)載體按照之前的報(bào)導(dǎo)(WO2004/076623)使用psiU6BXsiRNA表達(dá)載體建立基于載體的RNAi系統(tǒng)。通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiU6BX載體的Bbsl位點(diǎn)，來制備針對(duì)C2093(psiU6BX-C2093)、B5860N(psiU6BX-B5860N)、C6055(psiU6BX-C6055)的siRNA表達(dá)載體以及對(duì)照質(zhì)粒，psiU6BX-EGFP、-SCR。雙鏈寡核苷酸的核苷酸序列顯示如下C2093si弁3用于耙序列GTGAAGAAGTGCGACCGAA(SEQIDNO:21)有義(SEQIDNO:22):5'-TTCTTCAC-3'反義(SEQIDNO:23)5、TTCTTCAC-3'B5860Ns說3用于耙序列CCAAAGTTCCGTAGTCTAA(SEQIDNO:25)有義(SEQIDNO:26)5'-AACTTTGG-3'反義(SEQIDNO:27)5'—AACTTTGG-3'C6055si-有義(SEQIDNO:145):144)ACTGCAAC-3'反義(SEQIDNO:146)ACTGCAAC-3'siRNA對(duì)照(SilNO:29)有義(SEQIDNO:30):(SEQIDGCTGC丁TC-3'反義(SEQIDNO:31):GCTGCTTC-3'siRNA對(duì)照(SiSCR)用于靶序列GCGCGCTTTGTAGGATTCG(SEQIDNO:33)有義(SEQIDNO:34):AAGCGCGC-3'反義(SEQIDNO:35):AAGCGCGC-3'這些siRNA表達(dá)載體表達(dá)具有由如下核苷酸序列組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA:C2093si#3;GTGAAGAAGTGCGACCGAATTCAAGAGATTCGGTCGCACTTCTTCAC(SEQIDNO:24),B5860Nsi#3:CCAAAGTTCCGTAGTCTAATTCAAGAGATTAGACTACGGAACTTTGG(SEQIDNO:28),TAACTGCAAC(SEQIDNO:147)GTGCTGCTTC(SEQIDNO:32)，和CAAAGCGCGC(SEQIDNO:36)。C2093、B5860N和C6055的基因沉默效應(yīng)將人膀胱癌細(xì)胞系涂布于0-cm亞(1《106細(xì)胞/亞)，所述人膀胱癌細(xì)胞系對(duì)C2093和B5860N而言是UMUC3和J82,對(duì)C6055而言是SW780。然后，對(duì)于C2093和B5860N使用FuGENE6(Roche)和Lipofectamine2000(Invitrogen)試劑、對(duì)于C6055使用Nucleofector(Ai職a)試劑，分別用psiU6BX-EGFP和psiU6BX-SCR作為陰性對(duì)照、psiU6BX-C2093、psiU6BX-B5860N或psiU6BX-C6055按照供應(yīng)商的推薦進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在用各構(gòu)建體轉(zhuǎn)染6天后，由細(xì)胞提取總RNA,然后使用前述的C2093、B5860N和C6055共同區(qū)域特異性引物通過半定量RT-PCR確認(rèn)siRNA的敲低效應(yīng)(knockdowneffect)。作為內(nèi)部對(duì)照的GAPDH和ACTB的引物如下GAPDH5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(SEQIDN0.7)和5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3'(SEQIDN0.8)。ACTB5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3，(SEQIDNO:148)5，-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3'(SEQIDNO:149)進(jìn)一步，分別在含0.6、1.0和0.3mg/ml新霉素的選擇培養(yǎng)基上將使用UMUC3、J82和SW780細(xì)胞系表達(dá)siRNA的轉(zhuǎn)染子培養(yǎng)21、28和24天。用4%多聚曱醛固定后，用姬姆薩液(Giemsasolution)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行染色以評(píng)價(jià)集落形成。進(jìn)行MTT試驗(yàn)以定量分析細(xì)胞生存力。分別在含有新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天和28天后，以0.5mg^ml的濃度加入MTT溶液(3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)(Sigma)。37°C保溫2.5小時(shí)或1.5小時(shí)后，加入酸-SDS(0.01NHCl/10o/oSDS);劇烈混合懸浮液，然后于37。C保溫過夜以溶解黑藍(lán)色的晶體。用MicroplateReader550(BioRad)測(cè)定570nm下的吸光度。觀察因C2093-siRNA產(chǎn)生的多核細(xì)胞使用FuGENE6(Roche)以si-C2093和作為陰性對(duì)照的si-EGFP轉(zhuǎn)染UMUC3細(xì)胞之后，將它們進(jìn)行培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)染7天后通過顯微鏡觀察它們的細(xì)胞形態(tài)。為進(jìn)一步確認(rèn)C2093蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程使用抗C2093抗體進(jìn)4亍Western印跡?？笴2093抗體和抗B5860N抗體使用pET21載體分別制備表達(dá)在其COOH末端含有His標(biāo)簽的C2093(1612-1780a.a.)(SEQIDNO:150)和B5860NV2(337-527a.a)或B5860NV1(621-811a.a.)(SEQIDNO:151)的部分片段。在大腸桿菌BL21密碼子強(qiáng)化(codon-plus)菌抹(Stratagene,LaJolla,CA)中表達(dá)重組蛋白質(zhì)，按供應(yīng)商的規(guī)程使用Ni-NTA樹脂和TALON進(jìn)行純化。將這些蛋白質(zhì)接種于兔。按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在親和柱上純化免疫血清。親和純化的抗C2093抗體和抗B5860N抗體用于Western印跡、免疫沉淀和免疫染色。免疫細(xì)胞化學(xué)染色以檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞中內(nèi)源性C2093和B5860N蛋白為考察內(nèi)源性C2093或B5860N的亞細(xì)胞定位，分別以lxl()S個(gè)細(xì)胞每孔接種內(nèi)源性表達(dá)C2093或B5860N的UMUC3細(xì)胞。24小時(shí)后，使用含4%多聚曱醛的PBS固定細(xì)胞15分鐘，并用含0.1%TritonX-100的PBS于4°C處理2分鐘以賦予細(xì)胞通透性。接下來，用3%BSA的PBS溶液于4。C覆蓋細(xì)胞12小時(shí)，以封閉非特異性雜交。接著，將UMUC3細(xì)胞與1:100稀釋的親和純化的抗C2093抗體或抗B5860N抗體溫育。用4',6'-二脒基-2'-苯基p引哚二鹽酸(DAPI)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。用PBS清洗后，將UMUC3細(xì)胞用1:3000稀釋的Alexa488-結(jié)合的抗兔第二抗體(MolecularProbe)進(jìn)行染色。在共聚焦顯微鏡(Leica,Tokyo，Japan)下獲取熒光影像。免疫組織化學(xué)染色以4企測(cè)正常組織或膀胱癌組織中內(nèi)源性C2093和B5860N蛋白進(jìn)行使用ENVISION+Kit/HRP(DakoCytomation,Glostmp，Denmark)對(duì)石蠟包埋的正常成人組織(BioChain,Hayward,CA)和外科膀胱癌樣本的載玻片進(jìn)行染色，染色前需分別經(jīng)過如下處理對(duì)切片進(jìn)行脫石蠟處理，使用抗C2093抗體在高pH抗原回收液(DAKO)中用微波爐于80。C加熱5分鐘；或者，對(duì)切片進(jìn)行脫石蠟處理，使用抗B5860N抗體在高pH抗原回收液(DAKO)中于108°C自分泌(autocrave)15分鐘。封閉內(nèi)源性的過氧化物酶和蛋白質(zhì)之后，將這些切片與1:20稀釋的親和純化的抗C2093抗體或抗B5860N抗體溫育。使用過氧化物酶標(biāo)記的抗兔免疫王求蛋白(Envisionkit,DakoCytomation,Carpinteria，CA)進(jìn)行免疫染色。最后，用3,3V-二氨基聯(lián)苯(Dako)對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行顯色，并用蘇木精(hematoxylin)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染。結(jié)果為獲得膀胱癌的正確表達(dá)模式，使用LMM僅收集膀胱癌細(xì)胞。如通過顯微鏡觀察所測(cè)定的，估計(jì)通過該操作選出的癌細(xì)胞的比例幾乎是100%(數(shù)據(jù)未顯示)。鑒定出394個(gè)表達(dá)比超過5.0的上調(diào)基因(表4)。這些基因中，包括288個(gè)在膀胱癌細(xì)胞中過表達(dá)且功能性表征的基因，而另外的106個(gè)(包括51個(gè)EST)是目前未知的。這些上調(diào)元件中包括與信號(hào)傳導(dǎo)途徑、癌基因、細(xì)胞周期及細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架相關(guān)的重要基因。在另一方面，鑒定出1272個(gè)表達(dá)比低于0.2的下調(diào)基因(表5)。這些下調(diào)基因中，包括1026個(gè)在膀胱癌細(xì)胞中下調(diào)且功能性表征的基因，而另夕卜246個(gè)(包括119個(gè)EST)是未知的。為確認(rèn)在膀胱癌中這些上調(diào)的基因的表達(dá)圖式，使用膀胱癌細(xì)胞系及包含正常膀胱和正常轉(zhuǎn)移細(xì)胞的正常人組織進(jìn)行了半定量RT-PCR分析。比較在所有提供信息的病例的大部分中過表達(dá)的44個(gè)上調(diào)基因的表達(dá)水平的比例，其結(jié)果在大多數(shù)試驗(yàn)病例中是與微陣列分析的結(jié)果高度相似的(圖1)。特別是B5860N、B0811、C2093、F6022、F4976、D5491、F0411、D7746、A0576N、F1653、C2210、C7757和D7443在正常重要器官(vitalorgan)中均未見表達(dá)。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了旨在鑒定膀胱癌細(xì)胞中一般性上調(diào)基因的本發(fā)明人的策略的可靠性。為了進(jìn)一步考察這些上調(diào)基因即A0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838和C6055的表達(dá)圖式，分別以使用如表3所示的各引物組通過RT-PCR制備的A0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838和C6055的各[a"P]-dCTP標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物為各探針，對(duì)膀胱癌細(xì)胞系進(jìn)行Northern印跡分析(圖2)。與在正常膀胱中的表達(dá)相比，它們?nèi)吭诎螂装┘?xì)胞系中顯示更高的表達(dá)。特別是A0576N、C2093、B5860N、B9838和C6055在膀胱癌細(xì)胞系中特異性過表達(dá)，而在含正常膀胱的正常人組織中不表達(dá)。這顯示這些特異性過表達(dá)的基因可以成為分子靶向療法的優(yōu)秀候選物。表4膀胱癌中上調(diào)的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>(SEQIDNO.3,編碼SEQIDN0.4))和C6055(表示MGC34032假設(shè)蛋白(Genebank登錄號(hào)NM—152697SEQIDNO:133,編碼SEQIDNO:134))的基因。C2093、B5860N和C6055基因的表達(dá)分別在可獲得表達(dá)數(shù)據(jù)的膀胱癌病例的25例中的24例、20例中的17例,和32例中的21例中是上升的。為確定這些上調(diào)基因的表達(dá)，進(jìn)行半定量RT-PCR分析，以比較膀胱癌樣品與含正常膀胱癌細(xì)胞的正常組織間的表達(dá)水平。首先，發(fā)現(xiàn)與正常膀胱細(xì)胞和包括肺、心、肝和腎的正常人組織相比，C2093在21例臨床膀胱癌樣品的17例中顯示表達(dá)上升(圖la和b)。而且，該基因在全部6個(gè)膀胱癌細(xì)胞系中同樣是過表達(dá)的(圖lb)。接著，發(fā)現(xiàn)與正常人組織、特別是正常膀胱mRNA相比，B5860N在21例臨床膀胱癌樣品的20例中顯示表達(dá)上升(圖la和c),而且在試驗(yàn)的全部6個(gè)膀胱癌細(xì)胞系中均是過表達(dá)的(圖lc)。為進(jìn)一步考察這些基因的表達(dá)圖式，以C2093、B5860N和C6055的cDNA片段為探針，用多種人類組織和膀胱癌細(xì)胞系進(jìn)行Northern印跡分析(參見材料與方法)。C2093在睪丸以外的正常人組織中不表達(dá)或不能檢出(圖2e;上)，而其在所有膀胱癌細(xì)胞系中均令人驚訝地過表達(dá)(圖2e;下)。同樣地，B5860N也僅在睪丸表達(dá)(圖2f;上)，而與其它正常組織，特別是正常人膀胱相比，其在所有的膀胱癌細(xì)胞系中均顯著過表達(dá)(圖2f;下)。C6055同樣在正常人組織中不表達(dá)或不能檢出(圖2g;上)，而其在6個(gè)膀胱癌細(xì)胞系中的3個(gè)中過表達(dá)(圖2g;下)。因此，關(guān)注集中在膀胱癌特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物上。C2093、B5860N和C6055的基因組結(jié)構(gòu)(genomicstructure)由于數(shù)據(jù)庫(kù)中的C2093最初并非是全長(zhǎng)的，為獲得C2093、B5860N和C6055的全長(zhǎng)cDNA序列，使用膀胱癌細(xì)胞系SW780作為模板，以EST步移(ESTwalking)及5'RACE和3'RACE實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)行RT-PCR(參見材料與方法)。C2093由31個(gè)外顯子組成，表示M期磷蛋白1(MPHOSPH1),位于染色體10q23.31上。C2093的全長(zhǎng)mRNA序列含6319個(gè)核苷酸，編碼1780個(gè)氨基酸。該轉(zhuǎn)錄物的ORF起始于各外顯子1內(nèi)。B5860N表示含DEP結(jié)構(gòu)域1(DEPDC1),位于染色體的lp31.2上。該基因還具有兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄變體，它們分別由12個(gè)外顯子和11個(gè)外顯子組成，分別對(duì)應(yīng)于B5860NVI(SEQIDN0.3,編碼SEQIDNO,4)和B5860NV2(SEQIDN0.5，編碼SEQIDNO.6)(圖3b)。VI的外顯子8中存在可替換的變異(alternativevariations),其余的外顯子是兩個(gè)突變體共有的。V2變體沒有VI的外顯子8，其在最后的外顯子內(nèi)產(chǎn)生相同的終止密碼子。B5860NV1和B5860NV2變體的全長(zhǎng)cDNA序列分別由5318個(gè)核香酸和4466個(gè)核苦酸組成。這些變體的ORF起始于各外顯子1內(nèi)。最終，VI和V2轉(zhuǎn)錄物分別編碼811個(gè)和527個(gè)氨基酸。為進(jìn)一步確認(rèn)膀胱癌細(xì)胞系和正常人組織，包括膀胱、心、肺、肝、腎、腦、胰中各變體的表達(dá)圖式，進(jìn)行了Northern印跡分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種變體均在膀胱癌細(xì)胞中高度過表達(dá)，而在睪丸以外的正常人組織中不表達(dá)或不能檢出(圖2f,下)。特別是V2轉(zhuǎn)錄物僅在睪丸中表達(dá)。因而，進(jìn)一步進(jìn)行了B5860N的兩個(gè)變體的功能分析。根據(jù)NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)，C6055由24個(gè)外顯子組成，稱作MGC34032,位于染色體lp31.3上。因?yàn)镃6055并不包含在^:據(jù)庫(kù)中MGC34032的最后外顯子(外顯子24)內(nèi)，本發(fā)明人使用膀胱癌細(xì)胞系SW780為模板，以EST步移及5'RACE和3'RACE實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)行RT-PCR，以獲得C6055的全長(zhǎng)cDNA序列(參見材料與方法)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新轉(zhuǎn)錄物一C6055V1(SEQIDNO:129,編碼SEQIDNO:130)和C6055V2(SEQIDNO:131，編碼SEQIDNO:132)。最終，該基因具有4個(gè)不同的剪接變體，它們分別由24個(gè)、25個(gè)、22個(gè)和22個(gè)外顯子組成，分別對(duì)應(yīng)于MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AKl28063、C6055V1和C6055V2(圖3c)。MGC34032的外顯子1、2、3、4和24存在可替換的變異，其余的外顯子是4個(gè)變體共有的。C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物中沒有MGC34032的外顯子1、2和3,其在最后的外顯子內(nèi)產(chǎn)生相同的終止密碼子。特別是C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物的ORF起始于各外顯子4，這顯示C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物具有相同的ORF。MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)cDNA序列分別由2302、3947、3851和3819個(gè)核普酸組成。最終，MGC34032、Genbank登錄號(hào)No.AK128063、C6055V1和C6055V2轉(zhuǎn)錄物分別編碼719、587、675和675個(gè)氨基酸。為了進(jìn)一步確定在膀胱癌細(xì)胞系中及正常人體組織，包括膀胱、心、肺、肝、腎、腦、睪丸及胰中各變體的表達(dá)圖式，本發(fā)明人使用cDNA片段C6055用于微陣列作為探針，進(jìn)行Northern印跡分析。結(jié)果，約3.9kb的轉(zhuǎn)錄物在一些膀胱癌細(xì)胞(HT-1376、SW780和RT4)中高度過表達(dá)，而在正常人體組織中不表達(dá)或不能檢出(圖2g，上)。而且，7.5kb的轉(zhuǎn)錄物僅在HT1376細(xì)胞中特異性表達(dá)，但還未鑒定該轉(zhuǎn)錄物的全mRNA序列。此外，當(dāng)我們使用這些轉(zhuǎn)錄物中的共有區(qū)作為探針進(jìn)行Northern印跡分析時(shí)，僅在正常睪丸中檢測(cè)出對(duì)應(yīng)于MGC3卯32的2.3kb轉(zhuǎn)錄物(圖2g,中和下)。因而，本發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了C6055V1基因產(chǎn)物的功能分析。C2093、B5860N和C6055的亞細(xì)胞定位為進(jìn)一步考察C2093、B5860N和C6055的性質(zhì)，考察了這些基因產(chǎn)物在COS7細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。首先，將表達(dá)C2093蛋白的質(zhì)粒(pCAGGS-C2093-HA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞時(shí)，通過Western印跡分析按預(yù)想的大小觀察到210KDa-C2093蛋白(圖4a)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示外源性C2093主要定位在COS7細(xì)胞中的核器官，并觀察到在一些細(xì)胞中其在染色體周圍積累(圖4b)。因而，用阿非迪霉素使細(xì)胞同步化(synchronize),考察了細(xì)胞周期進(jìn)行過程中C2093蛋白的定位。明顯地，該蛋白在G1/G0和S期定位于細(xì)胞核，特別是在G2/M期積累在染色體周圍。接著，將表達(dá)B5860NV1或V2蛋白的質(zhì)粒(pCAGGS-B5860NV1-HA或pCAGGS-B5860NV2-HA)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7纟田月包時(shí)，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)通過Western印跡分析按預(yù)想的大小觀察到外源性B5860NV1和V2蛋白(圖4d;VI:左，V2:右)。而且，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示BS860NV1定位于細(xì)胞質(zhì)(圖4e，上)，但也觀察到在一些細(xì)胞中其存在于核器官(圖4e,下)；而B5860NV2主要定位在細(xì)胞質(zhì)(圖4f，上)，并且也觀察到在一些細(xì)胞中其存在于細(xì)胞質(zhì)膜(cytoplasmicmembrane)下(圖4f，下)。因而，用阿非迪霉素使細(xì)胞同步化，并考察細(xì)胞周期進(jìn)行過程中B5860NV1和V2蛋白的定位。B5860NV1蛋白在G1/G0和S期定位于細(xì)胞核，而在G2/M期定位于細(xì)胞質(zhì)膜下(圖4g);而B5860NV2蛋白在G2/M期定位于細(xì)胞質(zhì)膜下(圖4h)。此外，將表達(dá)B5860NV1和V2蛋白的兩種質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞時(shí)，觀察到B5860NV1蛋白定位于核及細(xì)胞質(zhì)器官，而B5860NV2定位于核并在G2/M期轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)膜下(圖4i)。為進(jìn)一步確定內(nèi)源性C2093的亞細(xì)胞定位，使用經(jīng)親和純化的抗C2093抗體通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析，考察了其在細(xì)胞周期進(jìn)行過程中的定位。內(nèi)源性C2093蛋白在間期(interphase)定位于細(xì)胞核中，在前期(prophase)、中期(metaphase)和早后期(earlyanaphase)定位于細(xì)胞質(zhì)，特別是在晚后期(lateanaphase)其位于中間體(midbody)，而在末期(telophase)其位于收縮環(huán)(contractilering)附近(圖4j)。因此，C2093可能在胞質(zhì)分裂(cytokinesis)中起重要作用。接下來，像C2093—樣，在細(xì)胞周期進(jìn)行過程中考察膀胱癌細(xì)胞中的內(nèi)源性B5860N,使用經(jīng)親和純化的B5860N多克隆抗體進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)分析。內(nèi)源性B5860N蛋白在間期主要定位于細(xì)胞核，而在M期則定位于細(xì)胞質(zhì)(圖4k)。SMART和SOSUI計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)表明，預(yù)測(cè)的C6055蛋白包含第8、第9或第IO跨膜區(qū)。為了驗(yàn)證這個(gè)預(yù)測(cè)，我們考察了該基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染36小時(shí)和60小時(shí)后的COS7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。首先，將表達(dá)C6055蛋白的質(zhì)粒(pCAGGS-C6055-HA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞時(shí)，使用抗HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western印跡分析。結(jié)果顯示出與C6055蛋白的預(yù)想大小相當(dāng)?shù)?7Kda條帶以及另外的75Kda條帶(圖41)。為了驗(yàn)證75Kda條帶是否表示通過磷酸化或糖基化修飾的C6055的形式，我們?cè)谶M(jìn)行免疫印跡之前，用人-磷酸酶、O-糖苷酶或N-糖苷酶(N-glycosydase)及O-糖香酶處理細(xì)胞提取物。經(jīng)磷酸酶和O-糖苷酶處理后，75Kda條帶不消失，而經(jīng)O-糖苷酶處理后75Kda條帶消失，這顯示C6055蛋白僅在活細(xì)胞中進(jìn)行O-糖基化(圖4m)。為考察C6055蛋白的亞細(xì)胞定位，我們?cè)谵D(zhuǎn)染了C6055的COS7細(xì)胞中進(jìn)行了熒光免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，在36小時(shí)時(shí)觀察到C6055定位于細(xì)胞質(zhì)，而在60小時(shí)時(shí)外源性C6055主要定位于COS7細(xì)胞中的細(xì)胞膜(圖4n)。設(shè)計(jì)以降低C2093、B5860N和C6055的表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)的生長(zhǎng)抑制效果為評(píng)價(jià)C2093、B5860N和C6055的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，通過基于哺乳動(dòng)物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)在顯示C2093、B5860N和C6055過表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞系J82、UMUC3和SW780中敲低了內(nèi)源性C2093、B5860N和C6055的表達(dá)(參見材料與方法)。通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)考察了C2093、B5860N和C6055的表達(dá)水平。如圖5-7所示，與對(duì)照siRNA構(gòu)建體(psiU6BX-EGFP和SCR)相比，C2093、B5860N和C6055特異性siRNA顯著抑制各基因的表達(dá)(圖5a,5d,6a，7a)。為確認(rèn)C2093、B5860N和C6055特異性siRNA引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，分別進(jìn)行了集落形成試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)。導(dǎo)入C2093-si3構(gòu)建體抑制J82和UMUC3細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖5b，c,e,f)，B5860N-si3構(gòu)建體抑制J82細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖6b,c)，而C6055-si-08構(gòu)建體抑制SW780細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖7b,c),這與上述表達(dá)下降的結(jié)果相一致。每個(gè)結(jié)果是通過3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)-險(xiǎn)證的。這些發(fā)現(xiàn)顯示，C2093、B5860N和C6055在膀胱癌的細(xì)胞增殖中具有重要功能。尤其是為了進(jìn)一步闡明C2093在胞質(zhì)分裂中的作用，我們將C2093-siRNA轉(zhuǎn)染到膀胱癌細(xì)胞系UMUC3細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后7天通過顯微術(shù)觀察細(xì)胞形態(tài)。我們確定C2093-siRNA敲低了C2093蛋白的表達(dá)(圖8b)，并在轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中觀察到多核細(xì)胞(圖8a,c)，這顯示si-C2093敲低細(xì)胞使胞質(zhì)分裂變?nèi)?failedincytokinesis)。臨床樣品中C2093和B5860N蛋白的表達(dá)在外科手術(shù)切除的侵入性膀胱癌組織和正常膀胱組織切片及各種正常組織(腎、心、肺和肝)中分別進(jìn)行C2093或B5860N的免疫組織化學(xué)分析。僅在膀胱癌組織中觀察到針對(duì)兩種蛋白的強(qiáng)染色(圖9a,b)，而在正常膀胱組織中未檢出C2093的染色(圖9a)。討論在本報(bào)導(dǎo)中，通過使用全基因組cDNA微陣列獲得的膀胱癌的正確表達(dá)模式，分離了與正常人體組織相比在膀胱癌細(xì)胞中顯著過表達(dá)的新基因C2093、B5860N和C6055。通過免疫化學(xué)染色，觀察到B5860N蛋白作為中間絲(intermediatefilament)定位于細(xì)胞質(zhì)，這顯示B5860N可在細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的相互作用中扮演關(guān)4定角色。此外，證實(shí)了用siRNA處理膀胱癌細(xì)胞有效抑制全部3個(gè)靶基因C2093、B5860N和C6055的表達(dá)，并且明顯抑制膀胱癌細(xì)胞/肺瘤生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)顯示C2093、B5860N和C6055在胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖中可能起到重要作用，并可為用于抗癌藥開發(fā)的有希望的靶標(biāo)。工業(yè)實(shí)用性本說明書所述的膀胱癌的基因表達(dá)分析是通過激光捕獲切割(laser-capturedissection)和全基因組cDNA孩i陣列的組合而獲得的，其鑒定了特異性基因作為預(yù)防和治療癌癥的靶標(biāo)。基于這些差異表達(dá)的基因亞組(subset)的表達(dá)，本發(fā)明提供用于鑒定和檢測(cè)膀胱癌的分子診斷標(biāo)記。的分子靶標(biāo)。本發(fā)明中報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)增加了對(duì)膀胱癌的全面理解，促進(jìn)新型診斷策略的開發(fā)，提供用于鑒定治療藥和預(yù)防劑的分子靶標(biāo)的線索。這樣的信息有助于對(duì)膀胱腫瘤發(fā)生的更深的理解，為開發(fā)用于診斷、治療和最終預(yù)防膀胱癌的新戰(zhàn)略提供了指示。與非癌性膀胱組織相比，人基因C2093、B5860Ns和C6055s的表達(dá)在膀胱癌中顯著提高。因此，這些基因作為膀胱癌的診斷標(biāo)記是有用的，由它們編碼的蛋白質(zhì)可用于膀胱癌的診斷試驗(yàn)。本發(fā)明人還顯示C2093、B5860Ns或C6055s蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而對(duì)應(yīng)于C2093、B5860Ns和C6055s基因的小干擾RNA則抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)顯示，C2093、B5860Ns和C6055s蛋白可促進(jìn)致癌活性。因此，這些癌蛋白中的每個(gè)均是用于開發(fā)抗癌藥物的有用的靶標(biāo)。例如，阻斷C2093、B5860Ns和C6055s表達(dá)或者抑制其活性的物質(zhì)作為抗癌劑,特別是用于治療膀胱癌的抗癌劑，具有治療上的功效。這樣的物質(zhì)的例子包括針對(duì)C2093、B5860Ns和C6055s基因的反義寡核苷酸、小干擾RNA和核酶，以及識(shí)別C2093、B5860Ns和C6055s的抗體。本說明書提及的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物皆全文并入本說明書作為參考。但可理解的是上述說明書實(shí)際上是例示性和解釋性的，意;fe夂闡明本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案。通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明并不意欲受到上述說明的限定，而由如下權(quán)利要求及其等同物限定。權(quán)利要求1.一種診斷受試者中的膀胱癌或發(fā)生膀胱癌的素因的方法，該方法包括測(cè)定源自患者的生物樣品中膀胱癌相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中所述基因在所述樣品中的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平相比上升或下降表示該受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述膀胱癌相關(guān)基因選自基因BLCNos.l-394，且與正常對(duì)照水平相比，所述樣品中的表達(dá)水平上升表示所述受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。3.權(quán)利要求2的方法，其中與所述正常對(duì)照水平相比，所述樣品中的表達(dá)水平高至少io%。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述膀胱癌相關(guān)基因選自基因BLCNos.395-1666,且其中與正常對(duì)照水平相比，所述樣品中的表達(dá)水平下降表示所述受試者患有膀胱癌或處于發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)中。5.權(quán)利要求4的方法，其中與所述正常對(duì)照水平相比，所述樣品中的表達(dá)水平低至少10%。6.權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)定多個(gè)膀胱癌相關(guān)基因的表達(dá)水平。7.權(quán)利要求l的方法，其采用選自下組的方法測(cè)定基因的表達(dá)水平(a)4企測(cè)膀胱癌相關(guān)基因的mRNA，(b)檢測(cè)由膀胱癌相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)，和(c)檢測(cè)由膀胱癌相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)的生物活性。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述檢測(cè)在DNA陣列上進(jìn)行。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述源自患者的生物樣品包括上皮細(xì)胞。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述源自患者的生物樣品包括膀胱癌細(xì)胞。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述源自患者的生物樣品包括來自膀胱癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞。12.膀胱癌參照表達(dá)才莫式，其包括選自基因BLCNos.l-1666的2個(gè)或2個(gè)以上膀胱癌相關(guān)基因的基因表達(dá)圖式。13.膀胱癌參照表達(dá)模式，其包括選自基因BLCNos.1-394的2個(gè)或2個(gè)以上膀胱癌相關(guān)基因的基因表達(dá)圖式。14.膀胱癌參照表達(dá)模式，其包括選自基因BLCNos.395-1666的2個(gè)或2個(gè)以上膀胱癌相關(guān)基因的基因表達(dá)圖式。15.—種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)使受試化合物與多肽接觸，其中所述多肽由選自基因BLCNos.1-1666的多核苷酸編碼；b)4全測(cè)多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇與多肽結(jié)合的受試化合物。16.—種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)使受試化合物與表達(dá)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的細(xì)胞接觸，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因選自基因BLCNos.1-1666;和b)選擇候選化合物，所述候選化合物與在不存在受試化合物時(shí)檢出的多肽的表達(dá)水平相比，降低選自基因BLCNos.1-394的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)水平，或者提高選自基因BLCNos.395-1666的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)水平。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞包括膀胱癌細(xì)胞。18.—種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)使受試化合物與多肽接觸，其中所述多肽由選自基因BLCNos.1-1666的多核苦酸編碼；b)檢測(cè)步驟a)的多肽的生物活性；和c)選擇受試化合物，所述受試化合物與在不存在受試化合物時(shí)檢出的由選自基因BLCNos.1-394的多核苷酸編碼的多肽的生物活性相比，抑制所述多肽的生物活性，或者與在不存在受試化合物時(shí)檢出的由選自基因BLCNos.395-1666的多核苷酸編碼的多肽的生物活性相比，增強(qiáng)所述多肽的生物活性。19.一種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)使候選化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，其中所述載體含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的控制下表達(dá)的報(bào)告基因，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因選自基因BLCNos.l-1666;b)測(cè)定所述報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性；和c)選擇候選化合物，與在不存在受試化合物時(shí)檢出的所述報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性相比，當(dāng)所述標(biāo)記基因?yàn)檫x自基因BLCNos.l-394的上調(diào)標(biāo)記基因時(shí)，所述候選化合物降低所述報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性，或者當(dāng)所述標(biāo)記基因?yàn)檫x自基因BLCNos.395-1666的下調(diào)標(biāo)記基因時(shí)，所述候選化合物增強(qiáng)所述報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性。20.含有檢測(cè)試劑的試劑盒，其中檢測(cè)試劑與(a)選自基因BLCNos.l-1666的2個(gè)或2個(gè)以上核酸序列，或者(b)由其編碼的多肽結(jié)合。21.—種陣列，其含有與選自基因BLCNos.1-1666的1個(gè)或多個(gè)核酸序列結(jié)合的2個(gè)或2個(gè)以上核酸。22.—種治療或預(yù)防受試者中膀胱癌的方法，其包括對(duì)所述受試者施用反義組合物，所述反義組合物包含與選自基因BLCNos.l-394的編碼序列互補(bǔ)的核苷酸序列。23.—種治療或預(yù)防受試者中膀胱癌的方法，其包括對(duì)所述受試者施用siRNA組合物，其中所述siRNA組合物降低選自基因BLCNos.l-394的核酸序列的表達(dá)。24.—種治療或預(yù)防受試者中膀胱癌的方法，其包括如下步驟對(duì)所述受試者施用藥物有效量的抗體或其免疫學(xué)活性片段，其中所述抗體或其免疫學(xué)活性片段與由選自基因BLCNos.1-394的任一基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合。25.—種治療或預(yù)防受試者中膀胱癌的方法，其包括對(duì)所述受試者施用疫苗，其中所述疫苗包含選自下組的至少一種(1)由選自基因BLCNos.1-394的核酸編碼的多肽；(2)所述多肽的免疫學(xué)活性片段；或(3)編碼所述多肽的多核苷酸。26.—種誘導(dǎo)抗肺瘤免疫的方法，所述方法包括如下步驟使抗原呈遞細(xì)胞與多肽、編碼該多肽的多核苷酸或者含有該多核苷酸的載體接觸，其中多肽由選自基因BLCNos.1-394的基因，或者其免疫原性多肽編碼片段編碼。27.權(quán)利要求26的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括對(duì)受試者施用抗原呈遞細(xì)胞的步驟。28.—種治療或預(yù)防受試者中膀胱癌的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的方法獲得的化合物的步驟。29.—種治療或預(yù)防受試者中膀胱癌的方法，其包括對(duì)所述受試者施用藥物有效量的物質(zhì)，其含有(a)選自基因BLCNos.395-1666的多核苷酸，或者(b)由該核苦酸編碼的多肽。30.—種治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針對(duì)選自基因BLCNos.1-394的多核苷酸的反義多核苷酸或siRNA。31.—種治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的與由選自基因BLCNos.1-394的基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或其片段。32.—種治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，所述組合物含有作為有效成分的藥物有效量的通過權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的方法選擇的化合物，和藥物可接受的載體。33.選自下組的基本上純的多肽(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽；(b)多肽，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或者與SEQIDNO:4具有至少約80%同源性的序列；(c)包含經(jīng)修飾的SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽，其中該序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸通過缺失、添加、插入和/或被其它氨基酸取代而被修飾，且突變數(shù)目通常不超過全部氨基酸的35%;而且其中所述多肽具有與由SEQIDNO:4的任一氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性；和(d)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)4各條件與由SEQIDNO:3的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQIDNO:4的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。34.分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求33的多肽。35.—種載體，其含有權(quán)利要求34的多核苷酸。36.—種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求34的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體。37.生產(chǎn)權(quán)利要求33的多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有編碼權(quán)利要求33的多肽的多核苷酸或者包含該多核苷酸的載體；(b)使宿主細(xì)胞表達(dá)多肽；和(c)收集表達(dá)的多肽。38.與權(quán)利要求33的多肽結(jié)合的抗體，其中所述抗體與包含SEQIDNO:4的氨基酸序列304-588的抗原決定簇結(jié)合。39.與SEQIDNO:3的多核香酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)的、含至少15個(gè)核苷酸的多核苷酸，其中所述多核苷酸與含有SEQIDNO:3的位置988-1842的核苷酸序列雜交。40.針對(duì)包含SEQIDNO:3的核香酸序列的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA，其中所述反義多核苷酸或小干擾RNA的靶序列包含選自SEQIDNO:3的位置988-1842的核香酸序列。41.診斷膀胱癌的方法，所述方法包括以下步驟(a)檢測(cè)生物樣品中基因的表達(dá)水平，所述基因編碼選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(b)將表達(dá)水平的提高與膀胱癌相關(guān)聯(lián)。42.權(quán)利要求41的方法，其中通過選自下組的任一方法檢測(cè)表達(dá)水平(a)檢測(cè)mRNA,其編碼選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)檢測(cè)蛋白質(zhì)，其包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)檢測(cè)蛋白質(zhì)的生物活性，所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。43.—種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使受試化合物與選自下組的多肽接觸(1)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(2)多肽，其包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，或包含與所述序列具有至少約80%同源性的序列；和(3)由多核苦酸編碼的多肽，所述多核香酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)檢測(cè)所述多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性；和(c)選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。44.一種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使受試化合物與選自下組的多肽接觸(1)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(2)多肽，其包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、(3)由多核香酸編碼的多肽，所述多核苦酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核香酸序列組成的多核苦酸雜交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135,其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)檢測(cè)步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)選擇化合物，所述化合物與不存在受試化合物時(shí)檢出的生物活性相比，抑制該多肽的生物活性。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述生物活性是細(xì)胞增殖活性。46.—種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使受試化合物與細(xì)胞接觸，其中所述細(xì)胞表達(dá)一個(gè)或多個(gè)多核苷酸，所述一個(gè)或多個(gè)多核苷酸包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135;和(b)選擇化合物，所述化合物與不存在受試化合物時(shí)檢出的表達(dá)水平相比，降低一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的表達(dá)水平，所述一個(gè)或多個(gè)多核苷酸包含選自下組的核苦酸序列SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述細(xì)胞為膀胱癌細(xì)胞。48.—種篩選用于治療或預(yù)防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使受試化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，其中所述載體含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的控制下表達(dá)的報(bào)告基因，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因包含SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135中的任一個(gè)核苷酸序列；(b)測(cè)定所述報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性；和(c)選擇化合物，所述化合物與不存在受試化合物時(shí)檢出的所述報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性相比，降低所述報(bào)告基因的表達(dá)水平或活性。49.一種治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針對(duì)多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA作為有效成分，和藥物可接受的載體，其中所述多核苦酸編碼選自下組的多肽(a)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,其中fM戈、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，且該多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)由多核芬酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。50.權(quán)利要求49的組合物，其中所述小干擾RNA包含SEQIDNO:21、25或144的核苦酸序列作為靶序列。51.權(quán)利要求50的組合物，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，^巾[A]為對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:21、25或144的核苷酸序列的核糖核苷酸序列，[B]為由3-23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸序列，和[A，]為由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序歹'J。52.權(quán)利要求49的組合物，所述組合物包含轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。53.—種治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的抗選自下組的多肽的抗體(a)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，且該多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苦酸序列組成的多核苦酸雜交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136作為有效成分，和藥物可接受的載體。54.—種治療或預(yù)防膀胱癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的通過權(quán)利要求43-48中任一項(xiàng)的方法選擇的化合物作為有效成分，和藥物可接受的載體。55.—種治療或預(yù)防膀胱癌的方法，所述方法包括施用藥物有效量的反義多核苦酸或小干擾RNA的步驟，所述反義多核苷酸或小干擾RNA針對(duì)編碼選自下組的多肽的多核苷酸(1)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(2)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中^F又代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，且該多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(3)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。56.權(quán)利要求55的方法，其中所述siRNA包含SEQIDNO:21、25或144的核普酸序列作為靶序列。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]為對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:21、25或144的核普酸序列的核糖核苦酸序列，[B]為由3-23個(gè)核苷酸組成的核糖核苦酸序列，和[A，]為由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苦酸序列。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述組合物包含轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。59.—種治療或預(yù)防膀胱癌的方法，所述方法包括施用藥物有效量的抗體的步驟，所述抗體針對(duì)選自下組的多肽(a)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，且該多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)由多核苦酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苷酸序列組成的多核香酸雜交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。60.—種治療或預(yù)防膀胱癌的方法，所述方法包括施用藥物有效量的通過權(quán)利要求43-48中任一項(xiàng)的方法選擇的化合物的步驟。61.—種治療或預(yù)防膀胱癌的方法，所述方法包括施用藥物有效量的選自(a)-(c)的多肽或編碼該多肽的多核苷酸的步驟(a)包含選自下組的氨基酸序列的多肽或其片段SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，且該多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(c)由多核苦酸編碼的多肽或其片段，所述多核芬酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苦酸序列組成的多核苷酸雜交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDN0:2、4、6、130、132、134和136。62.—種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括如下步驟使選自(a)-(c)的多肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸，或者將編碼該多肽的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞(a)包含選自下組的氨基酸序列的多肽或其片段SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，且該多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(c)由多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苷酸序列組成的多核普酸雜交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。63.權(quán)利要求62的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將抗原呈遞細(xì)胞施用于受試者的步驟。64.—種治療或預(yù)防膀胱癌的藥物組合物，所述組合物含有藥物有效量的選自(a)-(c)的多肽或編碼該多肽的多核苷酸(a)包含選自下組的氨基酸序列的多肽或其片段SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，且該多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(c)由多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由選自下組的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135,其中所述多肽具有與由選自下組的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136作為有效成分，和藥物可接受的載體。65.權(quán)利要求64的藥物組合物，其中所述多核苷酸是并入表達(dá)載體的。66.診斷膀胱癌的診斷試劑，其中所述試劑含有寡核苷酸或抗體，所述寡核苷酸與編碼多肽的多核苷酸雜交，所述多肽包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,所述抗體與所述多肽結(jié)合。67.包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中所述有義鏈含有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:21、25或144的核糖核苷酸序列，且其中反義鏈含有與所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苦酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈相互雜交形成所述雙鏈分子；而且其中將所述雙鏈分子導(dǎo)入表達(dá)至少任意一個(gè)由選自SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135的核苷酸序列組成的基因的細(xì)胞時(shí)，所述雙鏈分子可抑制所述基因的表達(dá)。68.權(quán)利要求67的雙鏈分子，其中所述有義鏈含有來源于選自SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135的任一核苦酸序列的約19-約25個(gè)連續(xù)的核苷酸。69.權(quán)利要求67的雙鏈分子，其中所述有義鏈由對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:21、25或144的核糖核苷酸序列組成。70.權(quán)利要求67的雙鏈分子，其中單一核糖核苷酸轉(zhuǎn)錄物包含有義鏈和反義鏈，所述雙鏈分子進(jìn)一步包含連接所述有義鏈和所述反義鏈的單鏈核糖核香酸序列。71.—種載體，其編碼權(quán)利要求67的雙鏈分子。72.權(quán)利要求71的載體，其中所述載體編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物，其中所述轉(zhuǎn)錄物包含有義鏈和反義鏈。73.權(quán)利要求71的載體，其中所述轉(zhuǎn)錄物進(jìn)一步包含連接所述有義鏈和所述反義《連的單鏈核糖核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明公開了旨在檢測(cè)和診斷膀胱癌(BLC)的方法。在一類實(shí)施方案中，本診斷方法包括測(cè)定識(shí)別BLC細(xì)胞與正常細(xì)胞的BLC相關(guān)基因的表達(dá)水平的步驟。本發(fā)明還進(jìn)一步利用一些BLC相關(guān)基因提供預(yù)測(cè)和預(yù)防膀胱癌轉(zhuǎn)移的方法，所述BLC相關(guān)基因在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌細(xì)胞中具有獨(dú)特的表達(dá)圖式。最后，本發(fā)明提供用于膀胱癌治療的治療藥物的篩選方法、膀胱癌的治療方法及為對(duì)象接種膀胱癌疫苗的方法。特別是，本發(fā)明提供在膀胱癌中表達(dá)顯著提高的新的人類基因C2093、B5860N和C6055。這些基因及由這些基因編碼的多肽有許多應(yīng)用，例如用于膀胱癌的診斷、用作開發(fā)針對(duì)疾病的藥物的靶標(biāo)分子及用于抑制膀胱癌的細(xì)胞增殖。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101175862SQ200680011580公開日2008年5月7日申請(qǐng)日期2006年2月9日優(yōu)先權(quán)日2005年2月10日發(fā)明者中村佑輔,中鶴修一,片桐豐雅申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司;國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)