專利名稱：：對維生素c的發(fā)酵生產(chǎn)的制作方法對維生素c的發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā)明涉及多核苷酸和多肽作為生物技術(shù)工具在從微生物生產(chǎn)維生素c中的用途，其中所述多核苷酸和/或被編碼的多肽對在所述微生物中生產(chǎn)所述發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率有著直接或間接的影響。本發(fā)明還涉及經(jīng)過遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維生素c的用途。維生素c是對人類來說非常重要且必不可少的營養(yǎng)因子。維生素c還用于動物飼料，盡管一些畜牧動物可自身體內(nèi)合成維生素c。在過去的70年中，已通過公知的Reichstein方法從D-葡萄糖對維生素C進(jìn)行了工業(yè)生產(chǎn)。該工藝中的所有歩驟都是通過化學(xué)方式進(jìn)行的，只除了其中一個步驟(從D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化)，其通過微生物轉(zhuǎn)化來進(jìn)行。從對維生素C的工業(yè)生產(chǎn)的最初實踐開始，就已使用了多種化學(xué)改良和技術(shù)改良，來提高Reichstein方法的效率。近來對維生素C生產(chǎn)的發(fā)展被概括于Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,5thEdition,Vol.A27(1996),pp.547ff中。維生素C生產(chǎn)的不同中間步驟已在微生物或從中分離出的酶的協(xié)助下進(jìn)行。因此，可通過發(fā)酵工藝，通過屬于例如Ketogulonicigenium附屬或Gluconobacter屬的菌株從L-山梨糖起始來生產(chǎn)2-酮基-L-古洛酸(2-KGA，這是可通過堿性重排反應(yīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化為維生素C的中間產(chǎn)物)，或者通過屬于Gluconobacter屬或?qū)俚闹亟M菌株，從D-葡萄糖起始進(jìn)行另一種發(fā)酵工藝來生產(chǎn)2-酮基-L-古洛酸。目前用于對維生素進(jìn)行化學(xué)生產(chǎn)的方法具有一些人們不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有機(jī)及無機(jī)溶劑。因此，在過去數(shù)十年屮，人們已在研究更加經(jīng)濟(jì)且環(huán)保的用微生物轉(zhuǎn)化來制造維生素C的其它方法。從大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)來發(fā)酵生產(chǎn)維生素C己在多種微生物中被報道過，所述微生物例如藻類和酵母，其屮使用了不同的培養(yǎng)方法。但是，使用這些微生物的缺點在于產(chǎn)生的維生素C的低產(chǎn)率，這是因為已知這些微生物既能生產(chǎn)2-酮基-古洛酸也能生產(chǎn)維生素C，所述微生物更容易合成2-KGA，因此通過微生物生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率受到相對高的2-KGA生產(chǎn)的限制，例如產(chǎn)生了小于0.1的維生素C與2-KGA濃度比。因此，人們需要開發(fā)出具有更好的工業(yè)應(yīng)用性的生產(chǎn)體系，該體系例如可被操作以獲得提高的效價和/或具有減少的發(fā)酵時間。一種特別有用的體系運用了編碼與膜結(jié)合的L-山梨糖酮脫氫酶或與膜結(jié)合的PQQ結(jié)合D-山梨糖醇脫氫酶的基因。此類體系的一個例子使用了來自G/wco朋tectermy^朋N44-l的編碼L-山梨糖酮脫氫酶的基因(下文中稱為SNDHai)，該酶將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸。該基因及其同源體已被描述于WO2005/017159中，該公開文本通過引用并入本文。人們持續(xù)需要進(jìn)一歩更優(yōu)化的發(fā)酵體系，用于對維生素C進(jìn)行微生物生產(chǎn)，以獲得比上文描述的體系更高的產(chǎn)率。令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，在合適的培養(yǎng)條件下，表達(dá)SNDHai的宿主細(xì)胞可用于進(jìn)一步優(yōu)化對維生素C的直接生產(chǎn)。這可通過對特定組的基因進(jìn)行同時操作來達(dá)到，在本文中將對這些基因進(jìn)行進(jìn)一歩描述。此類基因可選自由STS、RCS、SMS或VCS基因構(gòu)成的組。該組基因/蛋白質(zhì)以及對每個組的操作將在本文中被進(jìn)一歩描述和舉例。術(shù)語"直接發(fā)酵"、"直接生產(chǎn)"、"直接轉(zhuǎn)化"等意指微生物能通過一個或多個生物轉(zhuǎn)化歩驟將某底物轉(zhuǎn)化為特定的產(chǎn)物，而無需任何額外的化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。例如，術(shù)語"將D-山梨糖醇直接轉(zhuǎn)化為維生素C"意在描述下述過程，其中，微生物生產(chǎn)維生素C，并且，其中，D-山梨糖醇作為碳源提供，而無需中間產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。能直接發(fā)酵維生素C的單種微生物是優(yōu)選的。本文中使用的由遺傳改變導(dǎo)致的"提高的"或"維生素C的提高的產(chǎn)率"表示較之沒有被遺傳改變的微生物而言提高至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%。此類未被改變的細(xì)胞通常也被稱為野生型細(xì)胞。因此，在第一個方面，本發(fā)明的目的是提供一種對維生素C進(jìn)行直接發(fā)酵生產(chǎn)的方法，所述方法通過在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)其基因組已被遺傳工程改造的宿主細(xì)胞，以及通過從此類細(xì)胞或培養(yǎng)基分離維生素C來實現(xiàn)，所述遺傳工程改造通過包含下述多核苷酸的DNA序列來進(jìn)行a)編碼根據(jù)SEQIDNO:2的L-山梨糖酮脫氫酶或活性片段或其衍牛物的多核苷酸，以及b)編碼選自下述組的蛋白質(zhì)的至少一種多核苷酸，所述組由1)涉及山梨糖/山梨糖醇代謝系統(tǒng)(Sorbitol/SorboseMetabolizationSystem,SMS)的蛋白質(zhì)；2)涉及穿過細(xì)胞膜的糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(SugarIransportSystem,STS)的蛋白質(zhì)；3)涉及呼吸鏈系統(tǒng)(RespiratoryQiainSystem,RCS)的蛋白質(zhì)；以及4)顯示出與甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶/甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶或肌氨酸氧化酶a亞基或同滲容摩(osmolality)傳感器蛋白envZrp426或轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OmpR或PetP或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白質(zhì)構(gòu)成。術(shù)語"遺傳工程改造"或"遺傳改變"表示對活的生物體中遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的科學(xué)改變。這包括生產(chǎn)和使用重組DNA。更特別地，這用于描述來自天然存在的生物而經(jīng)遺傳工程改造或修飾的生物。遺傳工程改造可通過本領(lǐng)域已知的多種方法來進(jìn)行，例如，基因替換，基因擴(kuò)增，基因打斷，使用質(zhì)粒、病毒或其它載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染。經(jīng)遺傳修飾的生物，例如，經(jīng)遺傳修飾的微生物通常還被稱作重組生物，例如重組微生物。SMS蛋白是涉及山梨糖醇/山梨糖代謝系統(tǒng)(Sorbitol/SorboseMetabolizationSystem)的蛋白。多核苷酸和這些多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在本文中被縮寫為SMS。SMS蛋白在對D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代謝中發(fā)揮作用。STS蛋白是涉及穿過細(xì)胞膜的糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(Sugar工ransportSystem)的蛋白。多核苷酸和這些多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在本文中被縮寫為STS。STS蛋白在對糖、糖醇和相關(guān)化合物穿過細(xì)胞膜或周質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用。RCS蛋白是涉及呼吸鏈系統(tǒng)(RespiratoryQiainSystem)的蛋白。多核苷酸和這些多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在本文中被縮寫為RCS。RCS蛋白在生物的公知呼吸鏈(也被稱為電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng))中發(fā)揮作用。根據(jù)(b.4)的蛋白涉及維生素C生產(chǎn)系統(tǒng)(Yitamin^productionSystem)。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和這些多核苷酸編碼的蛋白在木文中被縮寫為VCS。迄今為止，人們沒有認(rèn)識到VCS蛋白參與維生素C的生產(chǎn)，也沒有認(rèn)識到其參與與將碳源轉(zhuǎn)化為維生素C相關(guān)的生物化學(xué)途徑。在一種優(yōu)選的實施方式中，以下述方式對選自STS、RCS、SMS或VCS蛋白構(gòu)成的組的蛋白的活性加以操作，所述方式使得所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)的維生素的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率較之所述蛋白的野生型副本有所提高。術(shù)語"操作"在本文中意欲包括對基因的遺傳修飾或改變，包括修飾其表達(dá)水平，優(yōu)選通過分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行。特別地，該術(shù)語意欲包括對蛋白活性的上調(diào)或下調(diào)，此類調(diào)控可通過上調(diào)或下調(diào)編碼該蛋白的基因來達(dá)成。上文詳細(xì)描述的用于上調(diào)或下調(diào)某蛋白活性的其它方法也可用于本發(fā)明的該實施方式。本發(fā)明的另一目的是提供包含此類多核苷酸的載體，特別是表達(dá)載體的形式。此外，本發(fā)明還有一個目的是提供生產(chǎn)經(jīng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞的方法，例如，用此類DNA序列載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這可例如通過將本文示例的多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)重組或非重組宿主細(xì)胞來實現(xiàn)，所述宿主細(xì)胞可以含有或可以不含相應(yīng)基因的內(nèi)源等同物。此類經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也是本發(fā)明的目的。從從屬權(quán)利要求顯而易見本發(fā)明的有利實施方式。本發(fā)明的這些方面和其它方面、這些實施方式和其它實施方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，應(yīng)從本文教導(dǎo)顯而易見。用作為外源核酸分子受體的任何細(xì)胞可用作為宿主細(xì)胞，例如攜帶可復(fù)制表達(dá)載體或克隆載體的細(xì)胞或者通過公知技術(shù)進(jìn)行了遺傳工程改造或遺傳改變以在其染色體或基因組上含有想要的基因的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核來源或真核來源的，例如細(xì)菌細(xì)胞、動物細(xì)胞(包括人類細(xì)胞)、真菌細(xì)胞(包括酵母細(xì)胞)和植物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是微生物。更優(yōu)選地，所述微生物屬于能體內(nèi)表達(dá)活性形式的L-山梨糖酮脫氫酶的細(xì)菌。在根據(jù)本發(fā)明改變后能以良好數(shù)量直接生產(chǎn)維生素c的己知細(xì)菌包括來自Ketogulonicigenium,Pantoea、Pseudomonas或Escherichia或Corynebacterium屬和乙酸細(xì)菌的菌株?？捎糜诒景l(fā)明以提高對維生素C的直接生產(chǎn)的微生物可被公眾從不同來源獲得，例如，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)，MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany、AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，P.O.Box1549,Manassas,VA20108USA或CultureCollectionDivision,NITEBiologicalResourceCenter,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan(以前是InstitueforFermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku，Osaka532-8686，J叩肌)。保存到IFO的優(yōu)選的細(xì)菌的例子例如是G7wco/w6acfe廠oxyc/a似(以前被稱為G.附e/a"(9ge"w)IF03293、G7wco朋6acteroxy(ia朋(以前被稱為G.melanogenus)IF03292、Gluconobacteroxydans(以前被稱為G.,油'gz'"o愿)IF03244、cluconboatecter(以前被稱為G.industrius)IFO3260、G7wcowc^actercen'm^IF03266、G7wcowofoacteraxy(ia/is"IFO3287和Acetobacteraceitissubsp.orleanusIFO3259，上述這些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Jcetokzcterace"',一w聽IFO13693禾口1977年12月8曰保藏的Jceto6acterc;ce"'^Zw/.IFO13773。菌株爿cetokzc^平ATCC15164也是優(yōu)選細(xì)菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株G7wcooZ^cteroxyugiswia/M"(以前被稱為G.gricBiols)N44-l是優(yōu)選細(xì)菌的另一個例子，其是菌株IFO3293的衍生物，在Sugisawaetal.,Agric，Biol.Chem.54:1201-1209,1990中對其有所描述。乙酸細(xì)菌在本發(fā)明中是優(yōu)選的，以從大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)以高產(chǎn)率直接生產(chǎn)維生素C。來自Gluconobacter，Gluconacetobacter禾nAcetobacter屬的菌株是進(jìn)一步優(yōu)選的，已發(fā)現(xiàn)它們能從L-山梨糖酮直接生產(chǎn)維生素C，而發(fā)現(xiàn)至少G/wcowo^zcteroxj^朋sDSM17078能從D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮直接生產(chǎn)維生素C。已按照《布達(dá)佩斯條約》，于2005年1月26日將G/wco朋6actero;cj^a朋DSM17078(以前稱作G/Mc歸&cter，t/謝N44-1)保藏至DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)，MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany。特別地，本發(fā)明涉及直接生產(chǎn)維生素C的方法，其中將本文公開的多核苷酸的組合或者下文描述的經(jīng)修飾多核苷酸序列的組合引入合適的維生素，在允許以高生產(chǎn)能力、產(chǎn)率和/或效率生產(chǎn)維生素C的條件下培養(yǎng)重組微生物，從培養(yǎng)集中分離出生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物，以及可選地，對其進(jìn)行進(jìn)一歩純化。若干種底物可在上述工藝中用作為碳源。特別適用的碳源是可以容易地從D-葡萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑獲得的那些，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯，或2,5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯。優(yōu)選地，底物選自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，更優(yōu)選地，選自D-葡萄糖、D-山梨糖醇或L-山梨糖，以及最優(yōu)選地，選自D-山梨糖醇或L-山梨糖。在涉及使用微生物進(jìn)行上述工藝時，術(shù)語"底物"和"生產(chǎn)底物"在本文中可互換使用。在涉及上述工藝的方面，使用微生物將底物轉(zhuǎn)化為維生素C表示通過微生物來轉(zhuǎn)化底物，導(dǎo)致產(chǎn)生維生素C，即，可直接將底物轉(zhuǎn)化為維生素C。在允許上文定義的從底物進(jìn)行的此類轉(zhuǎn)化的條件下培養(yǎng)所述微生物。在本文中用于使用微生物進(jìn)行的上述工藝的培養(yǎng)基可以是用于生產(chǎn)維生素C的任何合適的培養(yǎng)基。典型地，該培養(yǎng)基是包含例如鹽和(多種)底物，并具有一定pH的水性培養(yǎng)基。其中底物被轉(zhuǎn)化為維生素C的培養(yǎng)基也被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基。本文中使用的"發(fā)酵"或"生產(chǎn)"或"發(fā)酵工藝"可以是利用技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基、條件和方案，使用生長中的細(xì)胞或使用非生長中的所謂靜止細(xì)胞，這在適合于將合適的底物轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)物(例如維生素C)的條件下，使用技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基、條件和方案對所述靜止細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)之后進(jìn)行。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，應(yīng)當(dāng)理解，上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬性的異名(synonym)或基原異名(basonym)，其如InternationalCodeofNomenclatureofProkaryotes所定義。本文中使用的對微生物的命名是InternationalCommitteeonSystematicsofProkaryotesandtheBacteriologyandAppliedMicrobiologyDivisionoftheInternationalUnionofMicrobiologicalSocieties官方接受的(在優(yōu)先權(quán)申請的提交日期時)，并被其官方出版物InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology(IJSEM)所公開。具體的參考文獻(xiàn)是Urbanceetal.,IJSEM(2001)vol51:1059-1070，以及IJSEM(2001)vol51:1231-1233上的修訂通知，其中描述了對作為A^togw/師'".gem.訓(xùn)vw/gare的G*.ox_y<ifl"5DSM4025的分類學(xué)上的重新歸類。本文中使用的靜止細(xì)胞指下述微生物的細(xì)胞，所述微生物例如是存活但不能活躍生長的，或者是以低的比生長速率[y]生長的，例如，低于0.02h"的生長速率，優(yōu)選地，低于0.01h—1。顯示出上述生長速率的細(xì)胞被稱為"靜止細(xì)胞模式"。如上所述使用微生物來進(jìn)行的本發(fā)明的工藝可以以不同的步驟或階段來進(jìn)行優(yōu)選地，在第一個歩驟(也被稱為歩驟(a)或生長階段)中，于能夠生長的條件下對微生物進(jìn)行培養(yǎng)。通過改變條件來終止該階段，其中，所述條件改變使得微生物的生長速率降低，導(dǎo)致靜止細(xì)胞產(chǎn)生，這也被稱為歩驟(b)，接著是用(b)的靜止細(xì)胞從底物來生產(chǎn)維生素C，這也被稱為生產(chǎn)階段。使用微生物的上述工藝中進(jìn)行的生長階段和生產(chǎn)階段可在同樣的容器中進(jìn)行，即，僅有一種容器，或在兩種或更多的不同容器中進(jìn)行，在兩個階段之間具有可選的分離步驟?？赏ㄟ^任何合適的手段從細(xì)胞中回收得到產(chǎn)生的維生素C。"回收"指，例如，可將維生素C從生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離出來?？蛇x地，可對由此產(chǎn)生的維生素C進(jìn)行進(jìn)一步加工。就關(guān)于進(jìn)行上述工藝的本發(fā)明的目的而言，術(shù)語"生長階段"、"生長步驟"和"生長時期"在本文中可互換使用。這同樣適用于"生產(chǎn)階段"、"生產(chǎn)歩驟"、"生產(chǎn)時期"。進(jìn)行上述工藝的一種途徑可以是下述工藝，其中微生物生長于第一容器(所謂的生長容器)中，它們作為靜止細(xì)胞的來源，細(xì)胞中的至少一部分被轉(zhuǎn)移到第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。生產(chǎn)容器中的條件可以是使得從生長容器中轉(zhuǎn)移出的細(xì)胞變?yōu)樯衔亩x的靜止細(xì)胞的條件。維生素C在第二容器中產(chǎn)生，并從其中被回收。在關(guān)于進(jìn)行上述工藝的方面，生長步驟可在水性培養(yǎng)基中進(jìn)行，艮口，補(bǔ)充有用于在需氧條件下生長的合適營養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)可以以，例如，分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式來進(jìn)行。培養(yǎng)時間可以例如隨所用的細(xì)胞種類、pH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，其可以為例如以分批或補(bǔ)料分批模式進(jìn)行時，大約IO小時至大約IO天之間，優(yōu)選為大約1天至大約10天之間，更優(yōu)選地，大約1至大約5天，這取決于所述微生物。如果細(xì)胞以連續(xù)模式被培養(yǎng)，駐留時間可以例如為大約2至大約100小時，優(yōu)選地，大約2至大約50小時，這取決于所述微生物。如果微生物選自細(xì)菌，培養(yǎng)可進(jìn)行于大約3.0至大約9.0的pH下，優(yōu)選為大約4.0至大約9.0，更優(yōu)選地，大約4.0至大約8.0，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約5.0至大約8.0。如果使用了藻類或酵母，培養(yǎng)可進(jìn)行于低于大約7.0的pH下，優(yōu)選低于大約6.0，更優(yōu)選低于大約5.5，最優(yōu)選地，低于大約5.0。用于使用細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)的合適的溫度范圍可以為，例如，大約13°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約18°C至大約37°C，更優(yōu)選地，大約13°C至大約36。C，最優(yōu)選地，大約18。C至大約33°C。如果使用藻類或酵母，用于進(jìn)行培養(yǎng)的合適的溫度范圍可以例如為，大約15。C至大約40。C，優(yōu)選地，大約20°C至大約45°C，更優(yōu)選地，大約25°C至大約40°C，進(jìn)一歩更優(yōu)選地，大約25°C至大約38°C，最優(yōu)選地，大約30°C至大約38°C。用于進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基通?？梢院邢率鰻I養(yǎng)物作為可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，優(yōu)選地，L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇和甘油；并且含有可消化的氮源，例如，有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。所述培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或面包酵母。多種無機(jī)物質(zhì)也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，生長培養(yǎng)基通常含有無機(jī)鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和碳酸鈣。在關(guān)于進(jìn)行上述工藝的方面，比生長速率例如為至少0.02h—、對于以分批、補(bǔ)料分批或半連續(xù)模式生長的細(xì)胞而言，生長速率取決于，例如，生長培養(yǎng)基的組成、pH、溫度等。通常，生長速率可以例如在大約0.05至大約0.2h-'的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，在大約0.06至大約0.15h"的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，在大約0.07至大約0.13h"的范圍內(nèi)。在使用微生物進(jìn)行的上述方法的另一個方面，可通過在瓊脂平板(作為生長容器)上對各個微生物進(jìn)行培養(yǎng)來提供靜止細(xì)胞，其中使用了基本上相同的條件，例如，如上所述的培養(yǎng)時間、pH、溫度、營養(yǎng)培養(yǎng)基，并添加有瓊脂。如果生長和生產(chǎn)階段進(jìn)行于兩種不同的容器屮，那么來自生長階段的細(xì)胞可被收獲或濃縮，并轉(zhuǎn)移至第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。該容器可以含有補(bǔ)充有任何適用的生產(chǎn)底物(可通過細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為維生素C)的水性培養(yǎng)基?？赏ㄟ^任何合適的操作來收獲或濃縮來自生長容器的細(xì)胞，所述操作例如，離心、膜橫流(membranecrossflow)超濾或微濾、過濾、傾析、絮凝。由此獲得的細(xì)胞還可以以原始培養(yǎng)液的形式從生長容器轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器中，而不用被收獲、濃縮或洗滌，即，以細(xì)胞懸浮液的形式被轉(zhuǎn)移。在一種優(yōu)選的實施方式中，細(xì)胞以細(xì)胞懸浮液的形式從生長容器被轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器，在它們之間沒有任何洗滌或分離歩驟。如果生長和生產(chǎn)階段進(jìn)行于同樣的容器中，細(xì)胞可以生長于適當(dāng)?shù)臈l件下，以達(dá)到理想的細(xì)胞密度，接著用含有生產(chǎn)底物的生產(chǎn)培養(yǎng)基來替換生長培養(yǎng)基。此類替換可以例如是，在從容器中收回或收獲上清液的同時，并以與之相同的速度，將生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)入到容器中。為將靜止細(xì)胞保留于容器中，可以使用用于細(xì)胞回收或駐留的操作，例如，細(xì)胞回收步驟。此類回收步驟，例如包括但不限于如下的方法使用離心機(jī)、過濾器、超濾步驟的膜橫流微濾、膜反應(yīng)器、絮凝或在合適的多孔、非多孔或聚合物基質(zhì)上的細(xì)胞固定。在轉(zhuǎn)移階段之后，對容器應(yīng)用下述工藝條件在此條件下，細(xì)胞以如上文定義的靜止細(xì)胞模式存在，并且，生產(chǎn)底物能有效地轉(zhuǎn)化為維生素C。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，用于生產(chǎn)歩驟中的生產(chǎn)容器中的水性培養(yǎng)基在下文中被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基，其可以僅含有將被轉(zhuǎn)化為維生素C的生產(chǎn)底物，或還可以含有額外的無機(jī)鹽，例如，氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀、磷酸鈣和碳酸鈣。生產(chǎn)培養(yǎng)基還可以含有可消化的氮源，例如有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉米浸出液；以及無機(jī)物質(zhì)，例如，氨、硫酸銨和硝酸鈉，其濃度為使得細(xì)胞被保持為上文定義的靜止細(xì)胞模式的濃度。培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生產(chǎn)歩驟可以，例如，以分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式進(jìn)行。在補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式下，來自生長容器和生產(chǎn)培養(yǎng)基的兩種細(xì)胞都可以以合適的補(bǔ)料速率被連續(xù)或間歇地補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中?；蛘?，僅生產(chǎn)培養(yǎng)基可被連續(xù)或間歇補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中，而來自生長容器的細(xì)胞被一次性轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器。來自生長容器的細(xì)胞可在生產(chǎn)容器中用作為細(xì)胞懸浮液，或者可被用作為例如，在任何固相(例如，多孔或聚合物基質(zhì))上絮凝或固定的細(xì)胞。生長時期被定義為從底物進(jìn)入到生產(chǎn)容器中開始，到收獲含有維生素C的上清液(即所謂的收獲流)之間的時期，該時期可根據(jù)，例如，使用的細(xì)胞的濃度和種類、pH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而變動，其優(yōu)選在大約2至大約100小時之間。pH和溫度可與生長步驟中的pH和溫度不同，但應(yīng)與生長歩驟中的基本上相同。在一種優(yōu)選的實施方式中，生產(chǎn)歩驟可以以連續(xù)模式進(jìn)行，這意味著，含有來自生長容器的細(xì)胞的第一種補(bǔ)料流和含有底物的第二種補(bǔ)料流被連續(xù)或間歇補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中。第一種流可以僅含有從生長培養(yǎng)基中分離/分開的細(xì)胞，或可以含有直接來自生長步驟的細(xì)胞懸浮液，即，懸浮于生長培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而沒有任何中間的細(xì)胞分離、洗滌和/或分離步驟。在本文中定義的第二種補(bǔ)料流可以包括生產(chǎn)步驟的操作所需要的所有其它補(bǔ)料流，例如，以一種或多種不同的流的形式存在的包含底物的生產(chǎn)培養(yǎng)基、用于稀釋的水以及用于控制pH的堿。在關(guān)于進(jìn)行上述工藝的方面，當(dāng)兩種流都連續(xù)補(bǔ)料時，第一種流的補(bǔ)料速率與第二種流的補(bǔ)料速率之比可在大約0.01至大約10之間變動，優(yōu)選地，在大約0.01至大約5之間變動，最優(yōu)選地，在大約0.02至大約2之間變動。該比例取決于第一種和第二種流中各自的細(xì)胞和底物的濃度。進(jìn)行本發(fā)明的使用微生物的上述工藝的另一種途徑可以是在生產(chǎn)容器中使用一定細(xì)胞密度的靜止細(xì)胞的工藝。通過技術(shù)人員已知的方法，f600nm處，細(xì)胞密度作為吸收單位(光學(xué)密度)被測得。在一種優(yōu)選的實施方式中，生產(chǎn)步驟中的細(xì)胞密度為至少大約10，更優(yōu)選地，大約10至大約200之間，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約15至大約200之間，進(jìn)一歩更優(yōu)選地，大約15至大約120之間，最優(yōu)選地，大約20至大約120之間。為在生產(chǎn)階段期間(例如，以連續(xù)或半連續(xù)模式進(jìn)行的)，以想要的細(xì)胞密度將細(xì)胞保持于生產(chǎn)容器中，本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何手段都可以使用，例如，通過離心、過濾、微濾的膜橫流超濾、傾析、絮凝進(jìn)行的細(xì)胞再利用，通過膜設(shè)備進(jìn)行的細(xì)胞駐留，或細(xì)胞固定。此外，在生產(chǎn)歩驟以連續(xù)或半連續(xù)模式進(jìn)行的情況下，從生長容器中連續(xù)或間歇補(bǔ)入細(xì)胞，生產(chǎn)容器中的細(xì)胞密度可被保持于恒定的水平，這例如，通過從生產(chǎn)容器中收獲一定量的細(xì)胞來進(jìn)行，所述的量對應(yīng)于從生長容器中補(bǔ)入的細(xì)胞的在關(guān)于進(jìn)行上述工藝的方面，從生產(chǎn)容器中回收/收獲在所謂的收獲流中含有的產(chǎn)生出的維生素C。收獲流可以包括，例如，來自生產(chǎn)容器的不含細(xì)胞的水溶液或含有細(xì)胞的水溶液，其中含有通過生產(chǎn)容器中的靜止細(xì)胞從生產(chǎn)底物轉(zhuǎn)化得到的維生素C?？赏ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何操作，將仍處于收獲流中的細(xì)胞與維生素C分開，例如，過濾、離心、傾析、膜橫流超濾或微濾、切線流超濾或微濾或死端(deadend)過濾。在該細(xì)胞分離操作之后，收獲流中基本不含細(xì)胞。在另一個方面，本發(fā)明的工藝可組合有將產(chǎn)生的維生素C與收獲流中含有的其它組分分離和/或純化的額外步驟，即，所謂的下游加工步驟。這些步驟可包括技術(shù)人員已知的任何手段，例如，濃縮、結(jié)晶、沉淀、吸附、離子交換、電滲析、兩極膜電滲析和/或反滲透。維生素C可作為游離酸形式或其已知的任何鹽的形式被進(jìn)一歩純化，這是通過下述操作手段來進(jìn)行的，例如，用活性炭進(jìn)行處理、離子交換、吸附和洗脫、濃縮、結(jié)晶、過濾和干燥。特別地，將維生素C與收獲流中其它組分的第一次分離可通過例如下述方法的任何合適的組合或重復(fù)來進(jìn)行，所述方法例如兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析、兩極膜電滲析、反滲透或吸附(其進(jìn)行于，例如，離子交換樹脂上或非離子樹脂上)。如果獲得的維生素C的形式為維生素C的鹽，將該鹽形式轉(zhuǎn)化為游離酸形式可通過例如，兩極膜電滲析、離子交換、模擬移動床色譜技術(shù)等來進(jìn)行。上述步驟的組合也可使用，例如，將電滲析和兩極膜電滲析組合為一個歩驟，以及使用模擬移動床色譜方法的多個離子交換歩驟的組合。上述任何方案單獨或組合就構(gòu)成了用T分離和純化產(chǎn)物(即維生素C)的方便的手段。由此獲得的產(chǎn)物還可被進(jìn)一歩分離(例如，通過濃縮、結(jié)晶、沉淀、對晶體的洗滌和干燥的方式來進(jìn)行)和/或進(jìn)一步純化(用活性炭處理、離子交換和/或重結(jié)晶)。在上述工藝的一種優(yōu)選的實施方式中，通過一系列上述下游加工步驟來從收獲流中純化維生素C，而不必在該加工中的任何時刻將其轉(zhuǎn)移到非水性溶液中，即，所有歩驟都在水性環(huán)境中進(jìn)行。此類優(yōu)選的下游加工方案可以包括，例如，通過兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析對來自生產(chǎn)容器的收獲流進(jìn)行濃縮，通過兩極膜電滲析和/或離子交換將濃縮溶液中以其鹽的形式存在的維生素C轉(zhuǎn)化為其酸的形式，通過例如用活性炭、離子交換或非離子樹脂進(jìn)行處理等方法來進(jìn)行純化，接著進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮歩驟和結(jié)晶。這些晶體可被分離、洗滌和干燥。如果必要的話，晶體還可被重新溶解于水中，用活性炭和/或離子交換樹脂對其進(jìn)行處理，并重結(jié)晶。然后可對上述晶體進(jìn)行分離、洗滌和干燥。根據(jù)本發(fā)明，攜帶有根據(jù)本發(fā)明的SNDHai基因以及至少一種經(jīng)遺傳工程改造的、如本文所示例的選自SMS、STS、RCS和VCS構(gòu)成的組的基因的宿主細(xì)胞(特別是來自Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter屬的重組微生物)能從合適的碳源以比其它己知生物顯著更高的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率直接生產(chǎn)維生素C，例如，在靜止細(xì)胞方法中測量時，20小時的溫育期后，從D-山梨糖醇或L-山梨糖分別為300mg/1或更多的量，或800mg/l或更多的量。在靜止細(xì)胞方法中測量時，20小時的溫育期后，從D-山梨糖醇生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率可以甚至高達(dá)400、600、1000mg/l或者甚至超過1.5、2、4、10、20、50、100g/1。在靜止細(xì)胞方法中測量時，20小時的溫育期后，從L-山梨糖生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率可以甚至高達(dá)1000mg/1，或者甚至超過1.5、2、4、10、20、50、100g/1。SEQIDNO:2所示以及本文描述的SNDHai蛋tl在微生物中的直接維生素C生產(chǎn)中具有重要功能，特別是在細(xì)菌中，例如乙酸細(xì)菌中，例如Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter中，即其功能較之野生型副本有所增強(qiáng)或提高的微生物中。這意味著當(dāng)具有SNDHai活性的蛋白在特別合適的宿主生物中表達(dá)或優(yōu)選過量表達(dá)時，對維生素C的直接生產(chǎn)就被增強(qiáng)和/或增加和/或提高。當(dāng)至少一種編碼選自SMS、STS、RCS或VCS系統(tǒng)構(gòu)成的組的蛋白的多核苷酸被同時改變時，在此類宿主生物中對維生素C的生產(chǎn)被進(jìn)一歩提高.SNDHai蛋白可由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或與其基本相同的多核苷酸編碼，SEQIDNO:l是從G.oxydansDSM17078分離的。在本文上下文中，應(yīng)當(dāng)注意，關(guān)于SNDHai編碼序列時提到"與……基本相同的多核苷酸"的表達(dá)指選自下述組的多核苷酸序列或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由a)多核苷酸，其包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列b)多核苷酸，其包含可使用來自微生物的DNA作為模板，使用根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過核酸擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的核苷酸序列；c)多核苷酸，其包含編碼含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，或包含編碼由(a)或(b)中任何多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物或片段中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SNDHai多肽的活性；d)多核苷酸，其編碼SNDHai多肽，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸雜交，或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸雜交；e)多核苷酸，其編碼SNDHai多肽，并且，其與編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同構(gòu)成。根據(jù)SEQIDNO:2的多核苷酸是按照實施例38所述的方法，從多種不同微生物中分離的，按照實施例39和40所述，在活性試驗中證實了針對其指出的功能。SNDHai活性在木文中被定義為能將L-山梨糖酮直接轉(zhuǎn)化為抗壞血酸的酶活性。可使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，例如根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的核苷酸引物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過核酸擴(kuò)增獲得上文定義的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析對其加以表征。本發(fā)明還包括編碼保留有從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的部分多肽序列的多核苷酸，例如，SEQIDNO:12、14、16、18、20、22禾B27所示的多肽。多肽優(yōu)選包含選自本申請公開的多肽的氨基酸序列的至少25個連續(xù)的氨基酸的部分氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如下事實多肽的某些小片段是生物活性所必要的。但是，存在其它一些區(qū)域，其中可插入、缺失氨基酸或用其它氨基酸進(jìn)行取代，優(yōu)選地，與被替換的氨基酸相似的其它氨基酸取代。本文中使用的"活性片段或衍生物"表示保留有與SEQIDNO:2所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信號傳遞活性或抗體反應(yīng)活性。術(shù)語"相同的生物功能"或"功能等同物"在本文中使用時表示蛋白質(zhì)與SEQIDNO:2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信號傳遞活性或者抗體反應(yīng)活性。D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝包括一方面，將這些化合物吸收進(jìn)胞質(zhì)溶膠，以及進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為可用于吸收途徑的代謝物，所述吸收途徑例如Embden-Meyerhof-Parnas途徑、磷酸戊糖途徑、Entner-Doudoroff途徑以及三羧酸循環(huán)，它們都涉及對于活的細(xì)胞的生長和維持來說必要的全部關(guān)鍵的能量形成和合成代謝反應(yīng)。另一方面，D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝還包括通過所謂的不完全氧化過程將這些化合物轉(zhuǎn)化為經(jīng)進(jìn)一步氧化的產(chǎn)物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和維生素C。SMS蛋白在本文中被定義為涉及山梨糖醇/山梨糖代謝系統(tǒng)的蛋白。優(yōu)選地，SMS蛋白選自與膜結(jié)合的PQQ依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖酮脫氫酶、與膜結(jié)合的FAD依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、胞質(zhì)NAD依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、NAD(P)依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶(也被稱為NADPH依賴性的山梨糖還原酶)、NAD依賴性的木糖醇脫氫酶、NAD依賴性的醇脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、NAD(P)H依賴性的L-山梨糖還原酶、胞質(zhì)NADP依賴性的山梨糖酮脫氫酶、胞質(zhì)NAD(P)H依賴性的L-山梨糖酮還原酶、與膜結(jié)合的醛脫氫酶、胞質(zhì)醛脫氫酶、3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶構(gòu)成的組。進(jìn)一步更優(yōu)選的SMS蛋白選自氧化還原酶家族，更優(yōu)選地，NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(NC-IUBMB)推薦的氧化還原酶[ECl]。特別優(yōu)選的是在供體的CH-OH基團(tuán)上發(fā)揮作用的氧化還原酶[ECl.l]，特別是以NAD+或NADP+作為受體的氧化還原酶[ECl.1.l]以及具有其它受體的氧化還原酶[EC1.1.99]，或者在供體的醛或氧代基團(tuán)上發(fā)揮作用的氧化還原酶[EC1.2]，特別是以NAD+或NADP+作為受體的氧化還原酶[EC1.2.1]。進(jìn)一歩更優(yōu)選地，它們選自屬于[ECl.1.l.l]、[EC1.1.1.15]或[EC1.2.1.-]的酶組的脫氫酶。可通過技術(shù)人員公知的方法來測定SMS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如在存在其底物、電子受體或供體(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯酚)引哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP、NADPH，可通過光度、色度或熒光方法對其消耗進(jìn)行直接或間接測量)以及其它可能與活性的發(fā)展相關(guān)的無機(jī)組分的情況下，溫育含有SMS蛋白的膜級分(membranefraction)。因此，例如，可在下述試驗中測量與膜結(jié)合的D-山梨糖醇脫氫酶的活性，所述試驗中，在存在pH6的磷酸鹽緩沖液、D-山梨糖醇和人工電子受體DCIP和PMS的情況下，溫育含有該酶的膜級分?？稍?00nm處測量DCIP的消耗速率，其與膜級分中存在的D-山梨糖醇脫氫酶活性直接成正比。因此，例如，通過增加對D-山梨糖醇代謝途徑的不完全氧化中涉及的SMS蛋白的活性，我們可以獲得從D-山梨糖醇到產(chǎn)物(例如維生素C)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的增加。在另一例子中，通過降低將D-山梨糖醇吸收進(jìn)中央代謝所涉及的SMS蛋白的活性，我們也可以獲得從D-山梨糖醇到產(chǎn)物(例如維生素C)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的增加。STS蛋白通常是與膜結(jié)合的，或者與與膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)相關(guān)，并且作為單個蛋白發(fā)揮作用，或者作為蛋白復(fù)合體(例如透性酶或活性轉(zhuǎn)運蛋白)中的亞基發(fā)揮作用。已知STS蛋白作用于選擇性促進(jìn)、協(xié)助或使得化合物(例如糖、糖醇、糖酮或糖醛)能夠穿過細(xì)胞膜或周質(zhì)膜轉(zhuǎn)運。STS蛋白可基于其機(jī)制被分為三類。第一組轉(zhuǎn)運蛋白使用來自質(zhì)子推動的力量，以將分子轉(zhuǎn)運經(jīng)過濃度梯度。這些同向轉(zhuǎn)運和反向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)偶聯(lián)有兩種不同分子穿過膜的運動(通過具有兩個針對兩個不同分子的不同結(jié)合位點的透性酶來實現(xiàn))；在同向轉(zhuǎn)運中，兩個分子以同樣的方向轉(zhuǎn)運，而在反向轉(zhuǎn)運中，一個分子被運入，而另一個被運出。第二組轉(zhuǎn)運蛋白，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)，的能量來自磷酸烯醇丙酮酸的高能磷酸基團(tuán)經(jīng)由多種蛋白組分向底物的轉(zhuǎn)移，在運入時底物被磷酸化為其磷酸酯形式。第三組轉(zhuǎn)運蛋白將ATP的水解和底物轉(zhuǎn)運偶聯(lián)起來。這些系統(tǒng)被稱為ATP結(jié)合盒(ABC)型轉(zhuǎn)運蛋白。ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)由底物特異性結(jié)合蛋白(其位于革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)，或者是與革蘭氏陽性相關(guān)的膜)、完整膜結(jié)構(gòu)與和胞質(zhì)面對的ATP水解結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。關(guān)于膜轉(zhuǎn)運蛋白的更為詳細(xì)的描述可在Bamberg,E.etal.(1993)"Chargetransportofionpumpsonlipidbilayermembranes",Q.Rev.Biophys.26:1-25;Findlay，J.B.C.(1991)"Structureandfunctionofmembranetransportsystems",CumOpin.Struct,biol.1:804-810;Higgins，C.F.(1992)"ABCtransportersfrommicroorganismtoman"Ann.Rev.CellBiol.8:67-113;Gennis:R.B.(1989)"Pores,channelsandtrasnporters"in:Biomembranes,MolecularStructureandFunction,Springer,Heidelberg,p.270-322;Nikaido,H.&SaierH.(1992)"Transportproteinsinbacteria:commonthemesintheirdesign"Science258:936-942中找到。在一種實施方式中，本發(fā)明的STS蛋白選自轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]，更優(yōu)選地，用醇基團(tuán)作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7.1]以及用含氮基團(tuán)作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7.3]，最優(yōu)選地，蛋白質(zhì)-np-磷酸組氨酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7丄69]和磷酸烯醇丙酮酸-蛋白質(zhì)磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7.3.9]或者選自水解酶[EC3]，優(yōu)選地，作用-丁-酸酐的水解酶[EC3.6]。此外，本發(fā)明的STS蛋白可選自糖轉(zhuǎn)運蛋白和Z或糖醇轉(zhuǎn)運蛋白，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)運蛋白和周質(zhì)結(jié)合/轉(zhuǎn)移蛋白，更優(yōu)選地，周質(zhì)山梨糖醇結(jié)合蛋白、周質(zhì)溶質(zhì)結(jié)合蛋白、周質(zhì)D-阿洛糖結(jié)合蛋白，海藻糖/麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運蛋白(包括例如膜組分的亞基)，甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運蛋白(包括例如MtlKATP酶或膜(MtlG或MtlF)組分的亞基)以及涉及PTS的蛋白，包括Ptsl酶I、Hpr蛋白、酶IIAMan、P-環(huán)ATP酶蛋白家族或Hpr激酶?？赏ㄟ^技術(shù)人員公知的方法來測定STS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如將含有STS蛋白的膜級分與經(jīng)放射性標(biāo)記的、可被STS蛋白主動轉(zhuǎn)運的糖或糖醇溫育。包括進(jìn)細(xì)胞物質(zhì)的放射性與轉(zhuǎn)運蛋白的活性直接成正比。因此，例如，可在下述試驗中測量與膜結(jié)合的D-山梨糖醇脫氫酶的活性，所述試驗中，在存在pH6的磷酸鹽緩沖液以及經(jīng)放射標(biāo)記的碳源(例如葡萄糖)的情況下，溫育含有特定轉(zhuǎn)運蛋白的完整細(xì)胞。可通過技術(shù)人員已知的方法來測量放射性碳源(例如葡萄糖)被細(xì)胞吸收的速率，其與膜級分中存在的STS蛋白活性直接成正比。因此，例如，通過以使其活性降低的方式修飾涉及D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮的STS基因/蛋白，可以減少這些分子被吸收的數(shù)量或者它們被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的速率。在這種情況下，依賴于這些化合物在膜水平上的轉(zhuǎn)化的一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C)的產(chǎn)量和/生產(chǎn)效率可能被提高。在該例子中，應(yīng)當(dāng)以使得對應(yīng)的STS蛋白具有降低或無效(即，變?yōu)闆]有功能的)的活性的方式來修飾各STS基因/蛋白。己知RCS蛋白在下述機(jī)制中很重要，通過該機(jī)制，細(xì)胞中通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電子被進(jìn)一步轉(zhuǎn)移，這通常通過涉及輔助因子和氧化酶以及最終電子受體的一系列氧化還原反應(yīng)來進(jìn)行。活的生物體用于生產(chǎn)必要活動所需的能量的主要機(jī)制是呼吸。在高等生物中，碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪酸在胞質(zhì)中通過糖酵解異化途徑以及氧化過程被代謝為乙酰-CoA。乙酰-CoA再通過被稱為檸檬酸循環(huán)的一系列反應(yīng)(發(fā)生于線粒體中)被進(jìn)一步代謝。從這些反應(yīng)獲得的能量用于產(chǎn)生以例如FADH2和NADH的形式貯存的還原能量。然后這些化合物用于所謂的電子轉(zhuǎn)移鏈，電子轉(zhuǎn)移鏈?zhǔn)且幌盗醒趸€原鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中涉及位于線粒體內(nèi)膜中的不同組分。最終電子受體是氧，其再與從反應(yīng)鏈獲得的質(zhì)子反應(yīng)，形成水。從該過程獲得的質(zhì)子濃度梯度是ATP合成的驅(qū)動力。在細(xì)菌中，該基礎(chǔ)呼吸過程遵循同樣的生理原理，但可能以不同方式進(jìn)行，并且涉及不同組分、中間產(chǎn)物、酶復(fù)合體以及終產(chǎn)物。細(xì)菌呼吸過程的效率變化可以很大，這取決于每個物種所表達(dá)的功能性生物組分，這進(jìn)而取決于可獲得的遺傳機(jī)制以及取決于給定的生長條件。舉例而言，乙酸細(xì)菌(其是專性需氧的革蘭氏陰性微生物，屬于Jceto6fl"er、G/McooZacter禾口G7i/cowac"o6acte廠屬)在能量廣生過禾呈的方面呈現(xiàn)出特殊的性質(zhì)。這些細(xì)菌因其能不完全氧化不同的底物(例如醇、糖、糖醇以及醛)而為人們所公知。這些過程為人們所已知并通常被稱為氧化發(fā)酵，它們已被長時間應(yīng)用于食品和化學(xué)工業(yè)屮，尤其是對醋和L-山梨糖的生產(chǎn)中。已知使用屬于Gluconobacter屬的菌株從不完全氧化獲得的有用產(chǎn)物是對從D-山梨糖醇和L-山梨糖起始而言，2-酮基-L-古洛酸(2-KGA);對從D-葡萄糖起始而言，5-酮基-D-古洛酸(這是用于對D-酒石酸進(jìn)行生物合成的前體)。對乙酸細(xì)菌來說，不完全氧化是產(chǎn)生能量的主要機(jī)制。它們通過位于周質(zhì)空間中、周質(zhì)膜上以及胞質(zhì)中的不同的脫氫酶完成這些反應(yīng)。不同的脫氫酶使用不同的輔助因子，最常見的是用于膜結(jié)合酶或周質(zhì)酶的PQQ和FAD，以及用于胞質(zhì)酶的NAD/NADP。G7wcowc^flcte;VG7MCOwflceto6(3cter和AcetoZacter菌牛朱的電子車專禾多f連已知分別包括輔酶Q10(CoQ10)和CoQ9作為用于所有過程的通用電子轉(zhuǎn)移化合物，在一些情況下，所述電子轉(zhuǎn)移鏈包括某些種類的細(xì)胞色素c元件(element)。據(jù)報道，Gluconobacter菌株不含細(xì)胞色素c氧化酶，但其具有其它類型的末端氧化酶，例如bo類型的。在一種優(yōu)選的實施方式中，涉及電子轉(zhuǎn)移的RCS蛋白或蛋白亞基選自呼吸鏈蛋白，更優(yōu)選地，它們選自作為載體蛋白發(fā)揮作用或在輔助因子和/或輔基(prostheticgroup)的生物合成中發(fā)揮作ffl的蛋白，特別是涉及輔助因子和/或它們的前體(例如FAD、NAD、NADP、PQQ、泛醌(包括CoQlO)、細(xì)胞色素a、b、c、d以及亞鐵血紅素的生物合成中發(fā)揮作用的蛋白。最優(yōu)選地，它們選自PQQ生物合成蛋白(例如PQQ生物合成蛋白A、B、C、D、E)或亞鐵血紅素輸出蛋白(例如CcmA或CcmB)。在另一優(yōu)選的實施方式中，涉及電子轉(zhuǎn)移的RCS蛋G或蛋白亞基選自NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(NC-IUBMB)推薦的氧化還原酶[ECl]，更優(yōu)選地在作為供體的聯(lián)苯酚以及相關(guān)物質(zhì)上發(fā)揮作用的氧化還原酶[EC1.10]，特別是用氧作為受體的氧化還原酶[EC1.10.3]或具有其它受體的氧化還原酶[EC1.1.99]，特別是醇脫氫酶(受體)[EC1.1.99.8]。最優(yōu)選地，它們選自屬于氧化酶家族的蛋白，特別是對氰化物不敏感的型末端氧化酶亞基I和II，對氰化物敏感的60型末端氧化酶亞基I、II、III和IV，細(xì)胞色素c氧化酶亞基，特別是與膜結(jié)合的醇脫氫酶g3-ADH細(xì)胞色素c亞基?？赏ㄟ^技術(shù)人員公知的方法來測定RCS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如在存在輔酶Q2(CoQ2)——一種人工電子受體的情況下，溫育含有RCS蛋白的無細(xì)胞提取物或膜級分(membranefraction)，以及通過例如Clark型氧電極(RankBrothers,Cambridge,UnitedKingdom)等方來測量氧的消耗。因此，例如，可以在下述試驗中測量泛醌氧化酶bd(—種氰化物抗性末端氧化酶)的活性，該試驗中，在存在50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)、0.02%去銜劑Tween20以及100氰化物(以使其它氰化物敏感性氧化酶失活)時，溫育含有該酶的無細(xì)胞提取物或膜級分。然后可通過加入30mM被還原的人工電子受體——CoQ^d來來起始酶反應(yīng)，接著測量275nm處吸光度的增加?？稍贑lark型電極協(xié)助下測量耗氧速率，其與膜級分或無細(xì)胞提取物中存在的泛醌氧化酶bd活性直接成正比。因此，例如，通過以使其具有增強(qiáng)的活性的形式修飾涉及對末端氧化酶的生物合成的RCS多核苷酸/蛋白，可增加對依賴于一系列脫氫反應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C或2-KGA)的總生產(chǎn)效率。在另一例子屮，通過修飾對輔助因子(例如CoQ10或細(xì)胞色素c)的生物合成中涉及的RCS多核苷酸/蛋白，使得這些輔助因子可以以更高的水平被合成，可以增加細(xì)菌中依賴作為呼吸鏈重要元件的這些化合物的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的總體能力，以及對于依賴氧化還原反應(yīng)的發(fā)酵化合物(例如維生素C或2-KGA)的生產(chǎn)和生長產(chǎn)生正面影響。在另一例子中，以使其活性被增強(qiáng)的方式對涉及對氰化物不敏感的旁路氧化酶(非能量形成形式)的生物合成的RCS多核苷酸Z蛋白加以修飾，可能對于細(xì)胞對發(fā)酵產(chǎn)物的總體生產(chǎn)能力產(chǎn)生正面影響，甚至是細(xì)胞處于非生長的狀況或者處于低的總體代謝活性的狀況下時。當(dāng)在也表達(dá)SNDHai的微生物中，按照下文所述表達(dá)或修飾選自本文公開的STS、RCS、SMS或VCS構(gòu)成的組的蛋白時，通過直接發(fā)酵對維生素C的生產(chǎn)可被大大提高。這在本文中也被稱為同時表達(dá)。如果同時表達(dá)是遺傳操作事件的結(jié)果，那么這也被稱為同時操作。這可例如在表達(dá)SNDHai的微生物，例如重組SNDHai的微生物中實現(xiàn)，后一種微生物也被稱為重組微生物。本文示例性給出了8個新穎的VCS基因，它們可對在表達(dá)具有SNDHai活性的蛋白的微生物中維生素C的產(chǎn)量提高有作用。這些經(jīng)過遺傳工程改造的基因中的每一個可單獨使用，或者與選自同樣的組或由STS、RCS和SMS構(gòu)成的其它組中的至少一種額外的基因組合使用。術(shù)語"基因"在本文中用來表示編碼如上文定義的蛋白的多核苷酸。這8個不同基因編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:37、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73禾QSEQIDNO:41的氨基酸序列的VCS多肽。對應(yīng)的核苷酸序列分別示于SEQIDNO:36、SEQIDNO:52、SEQIDNO:56、SEQIDNO:60、SEQIDNO:64、SEQIDNO:68、SEQIDNO:72和SEQIDNO:40，這是從G.ojc_yc/aMDSM17078中分離的。本發(fā)明還包括與這些序列之一基本相同的多核苷酸。在本文上下文中，應(yīng)當(dāng)注意，與VCS編碼序列一起使用的"與……基本相同的多核苷酸"指選自下述組的多核苷酸序列或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由a)多核苷酸，其分別包含根據(jù)SEQIDNO:36、SEQIDNO:52、SEQIDNO:56、SEQIDNO:60、SEQIDNO:64、SEQIDNO:68、SEQIDNO:72和SEQIDNO:40的核苷酸序列b)多核苷酸，其包含可使用來自微生物的DNA作為模板，分別使用根據(jù)SEQIDNO:38禾卩SEQIDNO:39或SEQIDNO:54禾口SEQIDNO:55或SEQIDNO:58和SEQIDNO:59或SEQIDNO:62禾nSEQIDNO:63或SEQIDNO:66禾卩SEQIDNO:67或SEQIDNO:70禾口SEQIDNO:71或SEQIDNO:74和SEQIDNO:75或SEQIDNO:42和SEQIDNO:43的引物組，通過核酸擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的核苷酸序列；c)多核苷酸，其包含編碼下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分別包含根據(jù)SEQIDNO:37、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73禾nSEQIDNO:41的氨基酸序列，或所述多肽由(a)或(b)中任何多核苷酸編碼，其中，在所述衍生物或片段中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有vcs蛋白質(zhì)的活性；d)多核苷酸，其編碼VCS蛋白質(zhì)，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:37、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73和SEQIDNO:41的氨基酸序列的多肽的多核苷酸雜交，或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸雜交；e)多核苷酸，其編碼VCS蛋白質(zhì)，并且，其與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:37、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73禾口SEQIDNO:41的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同構(gòu)成。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為"杏詢序列"，以便用來自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對數(shù)據(jù)庫PROSW-SwissProt(完全發(fā)布版本加上增加的更新)進(jìn)行搜索?；騐CS01(SEQIDNO:36)被標(biāo)注為編碼展示出與甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶/甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的相似性的蛋白(SEQIDNO:37)?；騐CS02(SEQIDNO:52)被標(biāo)注為編碼展示出與肌氨酸氧化酶a亞基的相似性的蛋白(SEQIDNO:53)?；騐CS03(SEQIDNO:56)被標(biāo)注為編碼展示出與肌氨酸氧化酶"亞基的相似性的蛋白(SEQIDNO:57)?；騐CS04(SEQIDNO:60)被標(biāo)注為編碼展示出與同滲容摩傳感器蛋白envzrp426的相似性的蛋白(SEQIDNO:61)?；騐CS05(SEQIDNO:64)被標(biāo)注為編碼展示出與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OmpR的相似性的蛋白(SEQIDNO:65)。基因VCS06(SEQIDNO:68)被標(biāo)注為編碼展示出與PetP的相似性的蛋白(SEQIDNO:69)?；騐CS07(SEQIDNO:72)被標(biāo)注為編碼展示出與肽去甲酰酶的相似性的蛋白(SEQIDNO:73)?；騐CS08(SEQIDNO:40)被標(biāo)注為編碼展示出與天冬酰胺合酶的相似性的蛋白(SEQIDNO:41)?？墒褂胏DNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，例如分別根據(jù)SEQIDNO:38和SEQIDNO:39或SEQIDNO:54和SEQIDNO:55或SEQIDNO:58和SEQIDNO:59或SEQIDNO:62和SEQIDNO:63或SEQIDNO:66和SEQIDNO:67或SEQIDNO:70和SEQIDNO:71或SEQIDNO:74和SEQIDNO:75或SEQIDNO:42和SEQIDNO:43的核苷酸引物對，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過核酸擴(kuò)增從任何合適的生物獲得根據(jù)本發(fā)明的編碼VCS蛋白的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析對其加以表征。與VCS蛋白/基因相關(guān)的不同的SEQIDNO被概括如下蛋白/基因多核苷酸序列的SEOIDNO氨基酸序列的SEOIDNO引物的SEQIDNOVCS01363738/39VCS02525354/55VCS03565758/59VCS04606162/63VCS05646566/67VCS06686970/71VCS07727374/75VCS08404142/43本文還示例性給出了12個新穎的STS基因，它們可對在表達(dá)SNDHai的微生物中維生素C的產(chǎn)量提高有作用。這些經(jīng)過遺傳工程改造的基因中的每一個可單獨使用，或者與選自同樣的組或由VCS、RCS和SMS構(gòu)成的其它組中的至少一種額外的基因組合使用。這12個不同基因編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:33、SEQIDNO:121的氨基酸序列的STS多肽。對應(yīng)的核苷酸序列分別示于SEQIDNO:80、SEQIDNO:84、SEQIDNO:88、SEQIDNO:92、SEQIDNO:96、SEQIDNO:100、SEQIDNO:104、SEQIDNO:108、SEQIDNO:112、SEQIDNO:116、SEQIDNO:32、SEQIDNO:120，這些是從G.oxj^朋sDSM17078中分離的。本發(fā)明還包括與這些序列之一基本同源的多核苷酸。在本文上下文中，應(yīng)當(dāng)注意，與STS編碼序列一起使用的"與……基木相同的多核苷酸"指選自下述組的多核苷酸序列或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由a)多核苷酸，其分別包含根據(jù)SEQIDNO:80、SEQIDNO:84、SEQIDNO:88、SEQIDNO:92、SEQIDNO:96、SEQIDNO:100、SEQIDNO:104、SEQIDNO:108、SEQIDNO:112、SEQIDNO:116、SEQIDNO:32、SEQIDNO:120的核苷酸序列b)多核苷酸，其包含可使用來自微生物的DNA作為模板，分別使川根據(jù)SEQIDNO:82和SEQIDNO:83或SEQIDNO:86和SEQIDNO:87或SEQIDNO:90和SEQIDNO:91或SEQIDNO:94和SEQIDNO:95或SEQIDNO:98和SEQIDNO:99或SEQIDNO:102和SEQIDNO:103或SEQIDNO:106禾QSEQIDNO:107或SEQIDNO:IIO和SEQIDNO:111或SEQIDNO:114和SEQIDNO:115或SEQIDNO:118和SEQIDNO:119或SEQIDNO:34禾口SEQIDNO:35或SEQIDNO:122和SEQIDNO:123的引物組，通過核酸擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的核苷酸序列；c)多核苷酸，其包含編碼下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分別包含根據(jù)SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:33、SEQIDNO:121的氨基酸序列，或所述多肽由(a)或(b)中任何多核苷酸編碼，其中，在所述衍生物或片段中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有STS蛋白質(zhì)的活性；d)多核苷酸，其編碼STS蛋白質(zhì)，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:33、SEQIDNO:121的氨基酸序列的多肽的多核苷酸雜交，或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸雜交；e)多核苷酸，其編碼STS蛋白質(zhì)，并且，其與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:33、SEQIDNO:121的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同構(gòu)成。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為"査詢序列"，以便用來自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對數(shù)據(jù)庫PROSW-SwissProt(完全發(fā)布版本加上增加的更新)進(jìn)行搜索?；騍TS01(SEQIDNO:80)被標(biāo)注為編碼展示出與KMw'e〃a戸ewmom'"e的DalTD-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)運蛋白的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:81)?；騍TS06(SEQIDNO:84)被標(biāo)注為編碼展示出與Thermococcuslitoralis的海藻糖/麥芽糖ABC型轉(zhuǎn)運蛋白的MalG膜組分的相似性的蛋白(SEQIDNO:85)。基因STS07(SEQIDNO:88)被標(biāo)注為編碼展示出與Agrobacteriumtumefaciens的海藻糖/麥芽糖ABC型轉(zhuǎn)運蛋白的MalG膜組分的相似性的蛋白(SEQIDNO:89)?；騍TS15(SEQIDNO:92)被標(biāo)注為編碼展示出與的Pseudomonasflurescens甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運蛋白的MtlKATP酶組分的相似性的蛋白(SEQIDNO:93)?；騍TS16(SEQIDNO:96)被標(biāo)注為編碼展示出與Pseudomonasfluorescens的甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運蛋白的MtlG膜組分的相似性的蛋白(SEQIDNO:97)?；騍TS17(SEQIDNO:100)被標(biāo)注為編碼展示出與尸^Womo"tw^ww^cms的甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運蛋白的MtlF膜組分的相似性的蛋白(SEQIDNO:101)?；騍TS18(SEQIDNO:104)被標(biāo)注為編碼展示出與周質(zhì)山梨糖醇結(jié)合蛋白的相似性的蛋白(SEQIDNO:105)?；騍TS21(SEQIDNO:108)被標(biāo)注為編碼展示出與Sg"7/m的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的Ptsl酶I的相似性的蛋白(SEQIDNO:109)?；騍TS22(SEQIDNO:112)被標(biāo)注為編碼展示出與Sac/〃mw^/fo的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的Hpr蛋白的相似性的蛋白(SEQIDNO:113)?；騍TS23(SEQIDNO:116)被標(biāo)注為編碼展示出與Srwce〃flme/z'tow^的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的酶IIAMan的相似性的蛋白(SEQIDNO:117)?；騍TS24(SEQIDNO:32)被標(biāo)注為編碼展示出與未鑒定的、可能涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的、P-環(huán)ATP酶蛋白家族的相似性的蛋白(SEQIDNO:33)?；騍TS25(SEQIDNO:120)被標(biāo)注為編碼展示出與磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的Hpr激酶的相似性的蛋白(SEQIDNO:121)?？墒褂胏DNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，例如分別根據(jù)SEQIDNO:82和SEQIDNO:83或SEQIDNO:86和SEQIDNO:87或SEQIDNO:90和SEQIDNO:91或SEQIDNO:94禾卩SEQIDNO:95或SEQIDNO:98禾卩SEQIDNO:99或SEQIDNO:102禾卩SEQIDNO:103或SEQIDNO:106禾QSEQIDNO:107或SEQIDNO:IIO和SEQIDNO:111或SEQIDNO:114和SEQIDNO:115或SEQIDNO:118禾口SEQIDNO:119或SEQIDNO:34和SEQIDNO:35或SEQIDNO:122和SEQIDNO:123的核苷酸引物對，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過核酸擴(kuò)增從任何合適的生物獲得根據(jù)本發(fā)明的編碼STS蛋白的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析對其加以表征。與STS蛋白/基因相關(guān)的不同的SEQIDNO被概括如下<table><row><column>蛋白/基因</column><column>多核苷酸序列的SEOIDNO</column><column>氨基酸序列的SEOIDNO</column><column>引物的SEOIDNO</column></row><row><column>STS01</column><column>80</column><column>81</column><column>82/83</column></row><row><column>STS06</column><column>84</column><column>85</column><column>86/87</column></row><row><column>STS07</column><column>88</column><column>89</column><column>90/91</column></row><row><column>STS15</column><column>92</column><column>93</column><column>94/95</column></row><row><column>STS16</column><column>96</column><column>97</column><column>98/99</column></row><row><column>STS17</column><column>100</column><column>101</column><column>102/103</column></row><row><column>STS18</column><column>104</column><column>105</column><column>106/107</column></row><row><column>STS21</column><column>108</column><column>109</column><column>110/111</column></row><row><column>STS22</column><column>112</column><column>113</column><column>114/115</column></row><row><column>STS23</column><column>116</column><column>117</column><column>118/119</column></row><row><column>STS24</column><column>32</column><column>33</column><column>34/35</column></row><row><column>STS25</column><column>120</column><column>121</column><column>122/123</column></row><table>木文還示例性給出了7個新穎的SMS基因，它們可對在表達(dá)SNDHai的微生物中維生素C的產(chǎn)量提高有作用。這些經(jīng)過遺傳工程改造的基因中的每一個可單獨使用，或者與選自同樣的組或由STS、VCS和RCS構(gòu)成的其它組中的至少一種額外的基因組合使用。這7個不同基因編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:45、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145的氨基酸序列的SMS多肽。對應(yīng)的核苷酸序列分別示于SEQIDNO:124、SEQIDNO:128、SEQIDNO:132、SEQIDNO:44、SEQIDNO:136、SEQIDNO:140、SEQIDNO:144，這些是從G.oxydansDSM17078中分離的。本發(fā)明還包括與這些序列之一基本同源的多核苷酸。在本文上下文中，應(yīng)當(dāng)注意，與SMS編碼序列一起使用的"與……基本相同的多核苷酸"指選自下述組的多核苷酸序列或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由a)多核苷酸，其分別包含根據(jù)SEQIDNO:124、SEQIDNO:34128、SEQIDNO:132、SEQIDNO:44、SEQIDNO:136、SEQIDNO:140、SEQIDNO:144的核苷酸序列b)多核苷酸，其包含可使用來自微生物的DNA作為模板，分別使用根據(jù)SEQIDNO:126和SEQIDNO:127或SEQIDNO:130和SEQIDNO:131或SEQIDNO:134禾卩SEQIDNO:135或SEQIDNO:46和SEQIDNO:47或SEQIDNO:138和SEQIDNO:139或SEQIDNO:142和SEQIDNO:143或SEQIDNO:146和SEQIDNO:147的引物組，通過核酸擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的核苷酸序列；c)多核苷酸，其包含編碼下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分別包含根據(jù)SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:45、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145的氨基酸序列，或所述多肽由(a)或(b)中任何多核苷酸編碼，其中，在所述衍生物或片段中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SMS蛋白質(zhì)的活性；d)多核苷酸，其編碼SMS蛋白質(zhì)，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:45、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145的氨基酸序列的多肽的多核苷酸雜交，或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸雜交；e)多核苷酸，其編碼SMS蛋白質(zhì)，并且，其與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:45、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同構(gòu)成。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為"查詢序列"，以便用來自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對數(shù)據(jù)庫PROSW-SwissProt(完全發(fā)布版本加上增加的更新)進(jìn)行搜索?；騍MS02(SEQIDNO:124)被標(biāo)注為編碼展示出與Bacillussubtilis的NAD(P)依賴性D-山梨糖醇脫氫酶的相似性的蛋白(SEQIDNO:125)?；騍MS03(SEQIDNO:128)被標(biāo)注為編碼5鎖'〃m的NAD(P)依賴性山梨糖醇脫氫酶的蛋白(SEQIDNO:129)。基因SMS04(SEQIDNO:132)被標(biāo)注為編碼NAD(P)H依賴性L-山梨糖還原酶(SEQIDNO:133)?；騍MS05(SEQIDNO:44)被標(biāo)注為編碼NAD(P)依賴性山梨糖酮脫氫酶(SEQIDNO:45)?；騍MS12(SEQIDNO:136)被標(biāo)注為編碼與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶(SDH)(SEQIDNO:137)?；騍MS13(SEQIDNO:140)被標(biāo)注為編碼與膜結(jié)合的PQQ-依賴性D-山梨糖醇脫氫酶的亞基A(SEQIDNO:141)?；騍MS14(SEQIDNO:144)被標(biāo)注為編碼與膜結(jié)合的PQQ-依賴性D-山梨糖醇脫氫酶的亞基B(SEQIDNO:145)?？墒褂胏DNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，例如分別根據(jù)SEQIDNO:126和SEQIDNO:127或SEQIDNO:130和SEQIDNO:131或SEQIDNO:134和SEQIDNO:135或SEQIDNO:46和SEQIDNO:47或SEQIDNO:138和SEQIDNO:139或SEQIDNO:142和SEQIDNO:143或SEQIDNO:146和SEQIDNO:147的核苷酸引物對，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過核酸擴(kuò)增從任何合適的生物獲得根據(jù)本發(fā)明的編碼SMS蛋白的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析對其加以表征。與SMS蛋白/基因相關(guān)的不同的SEQIDNO被概括如下蛋白/基因多核苷酸序列氨基酸序列引物_的SEOIDNO的SEOIDNO的SEQIDNOSMS02124125126/127SMS03128129130/131SMS04132133134/135SMS05444546/47SMS12136137138/139SMS13140141142/143SMS14144145146/147本文還示例性給出了15個新穎的RCS基因，它們可對在表達(dá)SNDHai的微生物中維生素C的產(chǎn)量提高有作用。這些經(jīng)過遺傳工程改造的基因中的每一個可單獨使用，或者與選自同樣的組或由VCS、RCS和SMS構(gòu)成的其它組中的至少一種額外的基因組合使用。這15個不同基因編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:49的氨基酸序列的RCS多肽。對應(yīng)的核苷酸序列分別示于SEQIDNO:148、SEQIDNO:152、SEQIDNO:156、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:168、SEQIDNO:172、SEQIDNO:176、SEQIDNO:180、SEQIDNO:184、SEQIDNO:188、SEQIDNO:192、SEQIDNO:196、SEQIDNO:200、SEQIDNO:48，這是從G.oxyAmsDSM17078中分離的。本發(fā)明還包括與這些序列之一基本同源的多核苷酸。在本文上下文中，應(yīng)當(dāng)注意，與RCS編碼序列一起使用的"與……基本相同的多核苷酸"指選自下述組的多核苷酸序列或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由a)多核苷酸，其分別包含根據(jù)SEQIDNO:148、SEQIDNO:152、SEQIDNO:156、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:168、SEQIDNO:172、SEQIDNO:176、SEQIDNO:180、SEQIDNO:184、SEQIDNO:188、SEQIDNO:192、SEQIDNO:196、SEQIDNO:200、SEQIDNO:48的核苷酸序列b)多核苷酸，其包含可使用來自微生物的DNA作為模板，分別使用根據(jù)SEQIDNO:150和SEQIDNO:151或SEQIDNO:154和SEQIDNO:155或SEQIDNO:158和SEQIDNO:159或SEQIDNO:162和SEQIDNO:163或SEQIDNO:166禾QSEQIDNO:167或SEQIDNO:170和SEQIDNO:171或SEQIDNO:174和SEQIDNO:175或SEQIDNO:178禾口SEQIDNO:179或SEQIDNO:182禾口SEQIDNO:183或SEQIDNO:186和SEQIDNO:187或SEQIDNO:190和SEQIDNO:191或SEQIDNO:194和SEQIDNO:195或SEQIDNO:198和SEQIDNO:199或SEQIDNO:202和SEQIDNO:203或SEQIDNO:50和SEQIDNO:51的引物組，通過核酸擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的核苷酸序列；c)多核苷酸，其包含編碼下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分別包含根據(jù)SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:49的氨基酸序列，或所述多肽由(a)或(b)中任何多核苷酸編碼，其中，在所述衍生物或片段中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有RCS蛋白質(zhì)的活性；d)多核苷酸，其編碼RCS蛋白質(zhì)，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:49的氨基酸序列的多肽的多核苷酸雜交，或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸雜交；e)多核苷酸，其編碼RCS蛋白質(zhì)，并且，其與編碼分別包含根據(jù)SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:49的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同構(gòu)成。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為"査詢序列"，以便用來自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對數(shù)據(jù)庫PROSW-SwissProt(完全發(fā)布版本加上增加的更新)進(jìn)行搜索?；騌CS01(SEQIDNO:148)被標(biāo)注為編碼展示出與CydA對氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亞基I的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:149)。基因RCS02(SEQIDNO:152)被標(biāo)注為編碼展示出與CydA對氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亞基I的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:153)。基因RCS03(SEQIDNO:156)被標(biāo)注為編碼展示出與CydB氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亞基II的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:157)?；騌CS04(SEQIDNO:160)被標(biāo)注為編碼展示出與bo型泛醌氧化酶亞基II的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:161)?；騌CS05(SEQIDNO:164)被標(biāo)注為編碼展示出與bo型泛醌氧化酶亞基I的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:165)?；騌CS06(SEQIDNO:168)被標(biāo)注為編碼展示出與bo型泛醌氧化酶亞基III的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:169)。基因RCS07(SEQIDNO:172)被標(biāo)注為編碼展示出與bo型泛醌氧化酶亞基IV的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:173)?；騌CS08(SEQIDNO:176)被標(biāo)注為編碼展示出與g3-ADH與膜結(jié)合的醇脫氫酶細(xì)胞色素c亞基的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:177)?；騌CS21(SEQIDNO:180)被標(biāo)注為編碼輔酶PQQ生物合成蛋白A(SEQIDNO:181)?；騌CS22(SEQIDNO:184)被標(biāo)注為編碼輔酶PQQ生物合成蛋白B(SEQIDNO:185)?；騌CS23(SEQIDNO:188)被標(biāo)注為編碼輔酶PQQ生物合成蛋白C(SEQIDNO:189)?；騌CS24(SEQIDNO:192)被標(biāo)注為編碼輔酶PQQ生物合成蛋白D(SEQIDNO:193)?；騌CS25(SEQIDNO:196)被標(biāo)注為編碼輔酶PQQ生物合成蛋白E(SEQIDNO:197)?；騌CS27(SEQIDNO:200)被標(biāo)注為編碼展示出與涉及細(xì)胞色素c生物合成的SraJ,/n'zoZH'wmy'，om'cwm的亞鐵血紅素輸出蛋白CycW的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:201)?；騌CS28(SEQIDNO:48)被標(biāo)注為編碼展示出與涉及細(xì)胞色素c生物合成的亞鐵血紅素輸出蛋白CcmA的強(qiáng)烈相似性的蛋白(SEQIDNO:49)。可使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，例如分別根據(jù)SEQIDNO:150和SEQIDNO:151或SEQIDNO:154和SEQIDNO:155或SEQIDNO:158和SEQIDNO:159或SEQIDNO:162禾口SEQIDNO:163或SEQIDNO:166禾口SEQIDNO:167或SEQIDNO:170和SEQIDNO:171或SEQIDNO:174和SEQIDNO:175或SEQIDNO:178禾口SEQIDNO:179或SEQIDNO:182和SEQIDNO:183或SEQIDNO:186和SEQIDNO:187或SEQIDNO:190禾卩SEQIDNO:191或SEQIDNO:194禾卩SEQIDNO:195或SEQIDNO:198和SEQIDNO:199或SEQIDNO:202和SEQIDNO:203或SEQIDNO:50禾BSEQIDNO:51的核苷酸引物對，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過核酸擴(kuò)增從任何合適的生物獲得根據(jù)本發(fā)明的編碼RCS蛋白的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析對其加以表征。與RCS蛋白/基因相關(guān)的不同的SEQIDNO被概括如下蛋白/基因多核苷酸序列氨基酸序列引物_的SEOIDNO的SEOIDNO的SEOIDNORCS01148149150/151RCS02152153154/155RCS03156157158/159RCS04160161162/163RCS05164165166/167RCS06168169170/171RCS07172173174/175RCS08176177178/179RCS21180181182/183RCS22184185186Z187RCS23188189190/191RCS24192193194/195RCS25196197198/199RCS27200201202/203RCS28484950/51在進(jìn)一步闡述同時表達(dá)之前，將基于SNDHai更為詳細(xì)地描述對單個基因/多核苷酸的構(gòu)建和表達(dá)以及在上文示例的宿主細(xì)胞的基因組中進(jìn)行的改變。除非另有指明，該描述還可應(yīng)用于構(gòu)建和表達(dá)本文公開的STS、RCS、SMS禾口VCS基因。在對雙鏈DNA的克隆中，可以使用一系列宿主/克隆載體的組合。用于在五.co//中表達(dá)本發(fā)明的基因(即，SNDHai基因)的優(yōu)選載體可以選自通常用于E.cc^'的任何載體，例如能表達(dá)加上His標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)的pQE載體(QIAGENAGSwitzerland)、pBR322或其衍生物(包括，例如pUC18禾卩pBluescriptII(StratageneCloningSystems,Calif"USA))、pACYC177禾npACYC184及其衍生物和來自廣宿主范圍質(zhì)粒的載體，例如RK2禾BRSF1010。用于在細(xì)菌(包括Go"o6acte廠、G/wcw2"ceto/^cfer、//ceto&cfer禾t]尸^^fo附面oy)中表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列的優(yōu)選載體選自可在G7wcww6a"er、Jceto6acter禾口P化Mtfomowcw以及4尤選的克隆生物(例如co//)中復(fù)制的任何載體。優(yōu)選的載體是廣宿主范圍載體，例如，粘粒載體(例如pVK100)及其衍生物和RSF1010。為使克隆的基因穩(wěn)定且有效地表達(dá)，還為了對攜帶有克隆基因的宿主細(xì)胞進(jìn)行高效地培養(yǎng)，應(yīng)對載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性進(jìn)行仔細(xì)考慮。含有例如可轉(zhuǎn)座元件(例如Tn5)的核酸分子也可用作為載體，以將想要的基因引入到優(yōu)選宿主中，尤其是染色體上。含有從優(yōu)選宿主中分離出的任何DNA和本發(fā)明的SNDHai基因的核酸分子還可用于將該基因引入優(yōu)選的宿主細(xì)胞，尤其是染色體上。可通過使用本領(lǐng)域公知的任何傳統(tǒng)方法，例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合交配或電穿孔，在考慮宿主細(xì)胞和核酸分子性質(zhì)的情況下，將此類核酸分子轉(zhuǎn)移至優(yōu)選的宿主中?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法，將L-山梨糖酮脫氫酶基因/核苷酸序列連接到合適的載體上以產(chǎn)生表達(dá)載體，所述載體含有在上述宿主細(xì)胞中可操作的調(diào)控區(qū)域，例如，啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以經(jīng)分離的形式提供，優(yōu)選地，被純化至均質(zhì)。術(shù)語"經(jīng)分離的"表示物質(zhì)被移出其原來的環(huán)境(例如，如果其天然存在的話，就是天然環(huán)境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經(jīng)分離的，但與天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開的同樣的多核苷酸或多肽就是經(jīng)分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經(jīng)分離的，因為此類載體或組合物并非其天然環(huán)境的一部分。本文中使用的經(jīng)分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA，它們與從中獲得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰的兩條編碼序列(5'末端一條，3'末端一條)并非緊密相鄰。因此，在一種實施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰的5'非編碼(例如，啟動子)序列的一些或全部。術(shù)語"經(jīng)分離的多核苷酸"因此包括，例如，加入到載體中、加入到自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或者作為獨立-r其它序列的單獨分子(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時)或化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)通過化學(xué)方式合成時)的額外多肽。此外，"經(jīng)分離的核酸片段"是這樣的核酸片段其天然并不作為片段存在，并且將不會在天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。本文中使用的術(shù)語"多核苷酸"、"基因"和"重組基因"指可與染色體DNA分離開的、包括編碼蛋白質(zhì)(例如，G.oxj;^朋DSM17078SNDHai蛋白)的開放讀碼框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的區(qū)域，所述區(qū)域可包括，例如，對于由其獲得的多肽的適當(dāng)表達(dá)和穩(wěn)定來說重要的啟動子區(qū)域、調(diào)控子區(qū)域和終止子區(qū)域。基因可包括編碼序列、非編碼序列(例如，位于基因編碼區(qū)域3'末端和5'末端的非翻譯序列)和調(diào)控序列。此外，基因指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子。技術(shù)人員還將理解，導(dǎo)致SNDHai蛋白氨基酸序列的變化的DNA序列多態(tài)性可存在于種群(population)中，例如，G/wco朋kcter種群中。SNDHai基因中的此類遺傳多態(tài)性可由于天然變異存在于種群的個體間，或者存在于不同種群的細(xì)胞中。典型地，此類天然變異可導(dǎo)致SNDHai基因核苷酸序列中1-5%的變化度。作為天然變異結(jié)果的、并且不會改變SNDHai蛋白的功能活性的SNDHai中的任何以及全部此類核苷酸變異和由此得到的氨基酸多態(tài)性也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中使用的術(shù)語"多核苷酸"或"核酸分子"意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)禾PRNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?？墒褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)來合成核酸。此類寡核苷酸可用于例如，制備具有改變的堿基配對能力或增加的對核酸酶的抗性的核酸。本文中提供的序列信息不應(yīng)被狹義理解為需耍包括進(jìn)被錯誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可以很容易地用于從能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C的重組或非重組微生物(特別是G/mco"o6Cox.w/a"s，優(yōu)選地，G/wcwzo&cteroxjy/omDSM17078)中分離出完整基因，隨后可容易地對該基因進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，由此鑒定出測序錯誤。除非特別指明，本文中通過對DNA分子進(jìn)行測序來確定的所有核苷酸序列都是用自動DNA測序儀(測定的，并且，本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過對按照上文所述測定的DNA序列進(jìn)行翻譯來推測的。因此，如本領(lǐng)域所已知的，對由該自動方法所測定的任何DNA序列而言，本文所測定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯誤。典型地，通過自動方法測出的核苷酸序列與被測序的DNA分子的實際核苷酸序列至少大約90%同源，更典型地，至少大約95%至至少大約99.9%相同。通過其它方法，包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的人工DNA測序方法，可對實際序列進(jìn)行更為精確的測定。也如本領(lǐng)域所己知的，測得的核苷酸序列中較之實際序列的單個插入或缺失將會導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的讀碼框位移，使得從此類插入或缺失的點開始，測得的核苷酸序列編碼的預(yù)計氨基酸序列完全不同于被測序的DNA分子實際編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒定出此類被錯誤鑒定的堿基，并且知道如何改正此類錯誤。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以僅包含本發(fā)明提供的核酸序列(例如，SEQIDNO:1示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作為探針或引物的片段(例如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4)或編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的一部分的片段。從對SNDHai基因的克隆測定的核苷酸序列允許產(chǎn)生被設(shè)計來鑒定和/或克隆SNDHai家族其它成員以及來自其它物種的SNDHai同源體的探針和引物。典型地，該探針/引物包含基本純化的寡核苷酸，其典型地包含與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大約12或15個、優(yōu)選大約18或20個、更優(yōu)選大約22或25個、進(jìn)一歩更優(yōu)選大約30、35、40、45、50、55、60、65或75個或更多個連續(xù)核苷酸雜交(優(yōu)選地，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的核苷酸序列區(qū)域。還可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用基于本文含有的序列信息設(shè)計的合成寡核苷酸引物，分離出包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，來擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析加以表征。多核苷酸的片段還可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。此類多核苷酸可作為探針或引物用于PCR反應(yīng)。不管其編碼功能或非功能多肽，核酸都可用作為雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有SNDHai活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括(1)從cDNA文庫(例如來自除G/Mco"o6actero矽&朋外的其它生物)分離編碼本發(fā)明蛋白的基因或其等位變體，以及(2)用于探測特定細(xì)胞中所述蛋白的mRNA的表達(dá)的Northern印跡分析，或(3)用于增強(qiáng)禾Q/或提高同源SNDHai基因在所述其它生物中的功能或活性?；诒疚奶峁┑暮塑账嵝蛄械奶结樋捎糜跈z測編碼同樣或同源蛋白(例如，其它生物中的)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列?？苫谄渑c本文公開的G.xo;;^wwSNDHai核酸的同源性，使用G.ox_yc/a"sDNA或其一部分作為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，分離出對應(yīng)于本發(fā)明的G.:wj^"朋SNDHaiDNA的天然變體或非G.oxj^/"m同源體的核酸分子，它們也包括在本發(fā)明內(nèi)。在優(yōu)選的實施方式中，探針還包含與其附著的標(biāo)記基團(tuán)，例如，標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔助因子。例如，可使用基于本文教導(dǎo)的核苷酸序列設(shè)計的兩套簡并寡核苷酸引物庫，進(jìn)行PCR來分離同源基因序列或基本相同的基因序列。用于反應(yīng)的模板可以是通過對從已知能表達(dá)或懷疑能表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆及測序，以確保擴(kuò)增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過多種已知方法，用PCR片段分離全長cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫?；蛘撸?jīng)標(biāo)記的片段可用丁f帝選基因組文庫。PCR技術(shù)還可用于從其它生物分離全長cDNA。例如，可按照標(biāo)準(zhǔn)方案，從合適的細(xì)胞或組織來源分離RNA。可在RNA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中使用與擴(kuò)增片段的5'最末端具有特異性的寡核苷酸引物，以引導(dǎo)第一鏈合成。然后可使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，對得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如，用鳥嘌呤)，可用RNaseH消化雜交體，然后可(例如，用poly-C引物)引導(dǎo)第二鏈合成。由此，可容易地分離擴(kuò)增的片段上游的cDNA序列。關(guān)于有用的克隆策略的綜述，參見，例如上文所述的Sambrooketal.禾口上文所述的Ausubeletal.。本文示例的基因(例如根據(jù)SEQIDNO:1的SNDHai基因)的同源體、基本相同的序列、功能等同物和直向同源體可從多種不同的微生物獲得。用于分離特定基因和/或其片段的流程在本文中有所示例。根據(jù)這些流禾呈，已從G7wco"oZ)acteraxyi/am1IFO3292、G7wc冊o6flcteroxj^/fl"sIFO3287、Jcetoteter取ATCC15164禾口G7wc,kzcterIFO3244成功地分離出SNDHai基因。因此，編碼SNDHai家族其它成員、具有與根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，編碼來自其它物種的SNDHai蛋白、具有與SEQIDNO:l示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(優(yōu)選地，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下)與本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:1所示的多核苷酸)雜交。有利地，此類多核苷酸可從能將給定的碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C的微生物(特另ll是G7wcowo/^cteroxj^a朋，優(yōu)選地，G7wcowo6acterox少c/fl似DSM17078)中獲得。本文中用到的術(shù)語"雜交"被用來描述雜交和洗漆，在所述雜交和洗滌條件下，典型地，互相之間同源性為至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優(yōu)選為至少約80%、進(jìn)一步優(yōu)選為至少約85%到90%、最優(yōu)選為至少95%的核苷酸序列保持相互雜交的狀態(tài)。在一種實施方式中，本發(fā)明的核酸與SEQIDNO:1所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。此類嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個優(yōu)選的非限制的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45℃下雜交，隨后在lxSSC、0.P/oSDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗滌優(yōu)選在55℃下，更優(yōu)選在60℃下，進(jìn)一步優(yōu)選在65。C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100ygZml的鮭魚精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)中，或包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二烷基磺酸鈉、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針(例如通過用RocheDiagnosticsGmbH,68298Mannheim,Germany的DIG標(biāo)記系統(tǒng)來制備的)在42℃溫育2小時至4天，接著在2xSSC和0.1%SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68°C，于0.5xSSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。優(yōu)選地，與本發(fā)明的核苷酸序列雜交(優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸對應(yīng)于天然存在的核酸分子。本文中使用的"天然存在的"核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。在一種實施方式中，核酸編碼天然的G.oxj^/a"sSNDHai蛋白。技術(shù)人員知道何種條件適合用于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件及高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。本領(lǐng)域中易于獲得關(guān)于此類條件的其它指導(dǎo)，例如，在Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾口Ausubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當(dāng)然，僅與poly(A)序歹U(例如mRNA的3，末端poly(A)區(qū))或僅與T(或U)殘基的互補(bǔ)性延伸區(qū)段(stretch)雜交的多核苷酸將不會被包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分特異性雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因為此類多核苷酸將與任何含有poly(A)延仲區(qū)段的核酸分子或其互補(bǔ)序列(例如，實際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。采用典型手段，可以對從其它生物，例如能將給定碳源(例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮)直接轉(zhuǎn)化為維生素C的微生物(特別是其它G/wcoo&cter物種)構(gòu)建的基因組DNA文庫或cDNA文庫進(jìn)行篩選。例如，可以通過Northern印跡分析來對G/wco朋6acte/'的菌株進(jìn)行篩選。在探測到與本發(fā)明多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄本之后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由分離自合適菌株的RNA來構(gòu)建DNA文庫。或者，可以使用能與本發(fā)明多核苷酸雜交的探針來對全基因組DNA文庫進(jìn)行篩選?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以及本文提供的序列信息，來分離本發(fā)明的核酸序列，例如SEQIDNO:1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如，Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989所述)，使用SEQIDNO:1所示的核酸分子的全部或一部分作為雜交探針，分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。此外，可通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如，使用自動DNA合成儀)來制備對應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列的寡核苷酸或可與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸。術(shù)語"同源性"或"相同性百分比"在木文中可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優(yōu)比較的目的(例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條氨基酸序列或核苷酸序列達(dá)到最佳的比對)，對序列進(jìn)行比對。然后對相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列上相應(yīng)位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，%相同性=相同位置的數(shù)量/位置(即重疊位置)總數(shù)x100)。優(yōu)選地，這兩條序列長度相同。技術(shù)人員會知道有若干計算機(jī)程序可被用于確定兩條序列間的同源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法來完成對序列的比對和對兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優(yōu)選的實施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來確定兩條氨基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG軟件包(可從http://www.accelrys.com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員會意識到上述的所有不同參數(shù)將導(dǎo)致有細(xì)微區(qū)別的結(jié)果，但是使用不同算法時兩條序列的總體％相同性不會有顯著改變。在又一種實施方式中，使用GCG軟件包(可從http://www.accelrys.com獲得)的GAP程序來確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩陣，缺口權(quán)重為40、50、60、70或80，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一種實施方式中，使用E.Meyers禾PW.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法來確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可從http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi獲得)中，其中使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長度懲罰(penalty)為12，缺口懲罰為4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步地被用作"查詢序列"來進(jìn)行針對公眾數(shù)據(jù)庫的搜索，例如，去鑒定相關(guān)序列或家族中其它成員?？梢允褂肁ltschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)來進(jìn)行此類搜索?？梢杂肂LASTN程序，以分?jǐn)?shù)=100，字長(wordlength)=12來進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTX程序，以分?jǐn)?shù)=50，字長=3來進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。本著比較的目的，為獲得有缺口的比對，可以利用Altschuletal.，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。當(dāng)利用BLAST禾卩GappedBLAST程序時，可以使用各個程序(例如BLASTX和BLASTN)的爾央省參婁女。見http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov。在另一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含是本發(fā)明的核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1所示的序列)的互補(bǔ)序列的核酸分子。與本文公開的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是這樣的序列其與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列足夠互補(bǔ)，從而其可與所述核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體(duplex)。在另一種優(yōu)選的實施方式中，SEQIDNO:1所示的本發(fā)明的核酸或其互補(bǔ)序列含有至少一處突變，所述突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物具有經(jīng)修飾的功能/活性。所述至少一處突變可通過本領(lǐng)域已知的方法或本文所述的方法引入。在關(guān)于SNDHai的方面，所述至少一處突變導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的SNDHai蛋白其功能較之野生型副本而言有所增強(qiáng)或提高。SNDHai蛋白的活性也由此增加。用于引入此類突變的方法是本領(lǐng)域公知的。具有增加的SNDHai活性的細(xì)胞是優(yōu)選的，因為此類細(xì)胞將能生產(chǎn)更多的維生素C，特別是當(dāng)選自SMS、RCS、STS或VCS基因構(gòu)成的組的任何其它基因按照本文所述被遺傳工程改造后。另一方面涉及載體，所述載體含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的術(shù)語"載體"指能運送連接到其上的另一個核酸分子的核酸分子。一種載體類型是"質(zhì)粒"，"質(zhì)粒"指環(huán)狀的雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片斷可以連接到所述的環(huán)上。另一種載體的類型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因組中。某些載體能在其被引入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點的細(xì)菌載體)。其它載體在被引入宿主細(xì)胞之后就被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，因此它們與宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)可操作地連接到其上的基因的表達(dá)。此類載體在本文中被稱為"表達(dá)載體"。一般而言，在重組DNA技術(shù)中用到的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本文中術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用到的載體形式。然而，本發(fā)明也包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們能提供等同的功能。木發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸存在的形式適合于該核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這意味著該重組表達(dá)載體包括一段或多段調(diào)控序列，所述調(diào)控序列是基于將用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來選擇的，其被可操作地連接到將要表達(dá)的核酸序列上。在重組表達(dá)載體中，"可操作地連接"被用來表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調(diào)控序列上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中表達(dá)，或者當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時，在該宿主細(xì)胞中的表達(dá))的方式進(jìn)行。術(shù)語"調(diào)控序列"將包括啟動子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中對此類調(diào)控序列進(jìn)行了描述。調(diào)控序列包括在很多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的調(diào)控序列，也包括僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到，對表達(dá)載體的設(shè)計可能取決于以下因素例如對將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望獲得的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，其包括但不限于本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，SNDHai蛋白、SNDHai蛋白的突變體形式、融合蛋白等。本文示例的多肽的功能等同物也是本發(fā)明的一部分，其定義基于本發(fā)明的氨基酸序列，通過對此類序列的一個或多個氨基酸殘基進(jìn)行添加、插入、缺失和/或取代來獲得，其中，通過本領(lǐng)域已知的試驗或本文特別描述的試驗測量時，此類衍生物優(yōu)選仍具有L-山梨糖酮脫氫酶活性。可通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)肽合成或者通過重組技術(shù)，基于本文公開的DNA序列，用本領(lǐng)域已知的方法，來制造此類功能衍生物。蛋白質(zhì)和肽中通常不影響此類分子活性的氨基酸交換是已知的。為了在合適的微生物中表達(dá)SNDHd蛋白，可對本發(fā)明的重組表達(dá)載體加以設(shè)計。例如，根據(jù)本發(fā)明的蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，例如，在屬于Gluconobacter、Gluconaceiobacter或Acetobacter屬的菌株屮表達(dá)。在木發(fā)明中有用的表達(dá)載體包括源自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體的載體和源自上述物質(zhì)的組合的載體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。DNA插入應(yīng)當(dāng)被可操作地連接到合適的啟動子上，啟動子可以是組成型啟動子或可誘導(dǎo)的啟動子。技術(shù)人員知道如何選擇合適的啟動子。表達(dá)構(gòu)建體可以含有用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點，還可在轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有核糖體結(jié)合位點，以用于翻譯。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可優(yōu)選包括處于起點的起始密碼子，以及恰當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诖g的多肽末尾的終止密碼子。可通過傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入合適的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)橋聯(lián)(transconjugation)"和"轉(zhuǎn)染"意指本領(lǐng)域內(nèi)已知的、用于將外源核酸(例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于對宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的合適方法可在Sambrook,etal.(上文所述的)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)及其它實驗手冊中找到。為對已將外源DNA整合進(jìn)它們基因組的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和選擇，通常，將編碼選擇標(biāo)記(例如，對抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對藥物(例如卡納霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素和鏈霉素)抗性的那些。編碼選擇標(biāo)記的核酸優(yōu)選在與編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細(xì)胞，或者其可在單獨的載體上引入，該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制。可通過藥物選擇鑒定出經(jīng)過引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，己合并有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞會死亡)。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的多肽，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或可通過在合適的宿主中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列)獲得的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的多肽可僅含對SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸的保守取代，或?qū)Ψ顷P(guān)鍵氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非關(guān)鍵氨基酸是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中可被改變、且不會對生物功能造成實質(zhì)性影響的殘基。例如，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間保守的氨基酸殘基被預(yù)計為對改變特別不敏感。此外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和其它SNDHai蛋白之間保守的氨基酸也對改變不太敏感。術(shù)語"保守取代"用于表示下述取代，其中，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，其包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶beta支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。如上所述，本發(fā)明的多核苷酸可用于對合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，使其在發(fā)酵中更好且更有效，例如，在對維生素C的直接發(fā)酵工藝中更好且更有效。因此，本發(fā)明還涉及對編碼SNDHai多肽或其活性片段或其衍生物的基因以及編碼具有SMS、STS、RCS或VCS活性的多肽或其活性片段或其衍生物的基因的同時使用，用于制備重組宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞從而將顯示出提高的直接生產(chǎn)維生素C的能力。微生物基因組中的改變可例如通過單交叉重組或多交叉重組用經(jīng)改變的DNA序列替換野生型DNA序列來進(jìn)行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉(zhuǎn)化子，該改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補(bǔ)足微生物可能的營養(yǎng)缺陷型的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。還可通過下述方法獲得微生物基因組中導(dǎo)致功能更強(qiáng)的多肽的改變使用例如化學(xué)誘變劑、輻射或轉(zhuǎn)座子對微生物基因組進(jìn)行隨機(jī)誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物的更好的或更有效的牛產(chǎn)菌株的突變體。用于篩選和選擇的標(biāo)準(zhǔn)方法是技術(shù)人員己知的。在一種特定實施方式中，人們需要敲除或遏制本發(fā)明SNDHai基因的阻遏子，即，其中，當(dāng)引入合適的宿主細(xì)胞時，其阻遏子基因的表達(dá)被人工遏制，以提高對發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供攜帶此類被遏制基因的微生物的方法是本領(lǐng)域公知的。本文中使用的"對基因表達(dá)的遏制"包括完全和部分遏制，以及在特定條件下的遏制，還包括對兩個等位基因中任何一個的表達(dá)的遏制。用于SNDHai蛋白的上述誘變策略可導(dǎo)致想要的化合物(特別是維生素C)的產(chǎn)率增加。這些策略的列出并不意味著限制；對這些誘變策略的變化對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的?？赏ㄟ^這些機(jī)制，用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生出微生物，例如表達(dá)經(jīng)突變SNDHai核酸和蛋白分子的Gluconobacter或細(xì)菌的相關(guān)菌株，使得對想要的化合物(例如維生素C)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或產(chǎn)量被提高。本文所述的核酸分子、多肽、載體、引物和重組微生物可用于下述方法中的一種或多種鑒定Gluconobacteroxydans以及相關(guān)的生物；繪制與Gluconobacteroxydans相關(guān)的生物的基因組圖譜；對感興趣的Gluconobacteroxydans序列進(jìn)行鑒定和定位；進(jìn)化研究；測定功能所需的SNDHai蛋白區(qū)域；調(diào)節(jié)SNDHai蛋白活性或功能；調(diào)節(jié)SNDHai途徑的活性；以及調(diào)節(jié)對想要的化合物(例如，維生素C)的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。SNDHai肽的活性可通過本領(lǐng)域已知的方法以及本文將進(jìn)一步示例的方法來測定。為更進(jìn)一步地展示本發(fā)明的細(xì)節(jié)，本文提供了多個實施例，其中，非常詳細(xì)地示例性描述了對選自STS、RCS、SMS或VCS基因構(gòu)成的組的基因的操作。選擇編碼選自STS、RCS、SMS或VCS蛋白構(gòu)成的組的蛋白的其它基因并按照本文提供的教導(dǎo)對它們加以操作，以獲得產(chǎn)生產(chǎn)率提高的維生素C的微生物對于技術(shù)人員來說將是顯而易見的。為提供上述方法的更多指導(dǎo)，提供了下表，其中，更為詳細(xì)地描述了如何操作選自STS、RCS、SMS或VCS基因構(gòu)成的組的基因。本文中，表達(dá)"上"和"下"指蛋白分別優(yōu)選過量表達(dá)和欠表達(dá)，例如可通過分別對相應(yīng)基因的上調(diào)和F調(diào)來實現(xiàn)。通過除了遺傳操作之外的任何其它方法增強(qiáng)或降低了相應(yīng)蛋白的活性，也可獲得等同的結(jié)果。<table><row><column>名稱；多肽/基因的SEQIDNO:</column><column>與……的相似性</column><column>上</column><column>下</column></row><row><column>SMS02;124Z125</column><column>NAD(P)依賴性D-山梨糖醇脫氫酶</column><column>-</column><column>X</column></row><row><column>SMS03;128/129</column><column>NAD(P)依賴性D-山梨糖醇脫氫酶</column><column>-</column><column>X</column></row><row><column>SMS04;132/133</column><column>NAD(P)H依賴性L-山梨糖還原酶</column><column>-</column><column>X</column></row><row><column>SMS05;44/45</column><column>NAD(P)依賴性L-山梨糖酮脫氫酶</column><column>-</column><column>X</column></row><row><column>SMS12;136/137</column><column>與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶</column><column>X</column><column>-</column></row><row><column>SMS13;140/141</column><column>與膜結(jié)合的PQQ依賴性D-山梨糖醇脫氫酶亞基A</column><column>X</column><column>-</column></row><row><column>SMS14;144/145</column><column>與膜結(jié)合的PQQ依賴性D-山梨糖醇脫氫酶亞基B</column><column>X</column><column>-</column></row><row><column>STS01;80/8l</column><column>D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)運蛋白</column><column>X</column><column>-</column></row><table><table><row><column>名稱；多肽/基因的SEQIDNO:</column><column>與……的相似性</column><column>上</column><column>下</column></row><row><column></column><column>STS06;84/85</column><column>海藻糖/麥芽糖ABC型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的膜蛋白組分</column><column></column><column>X</column></row><row><column></column><column>STS07;88/89</column><column>海藻糖/麥芽糖ABC型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的膜蛋白組分</column><column></column><column>X</column></row><row><column></column><column>STS15;92/93</column><column>甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的ATP酶組分</column><column>X</column><column></column></row><row><column></column><column>STS16;96/97</column><column>甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的膜蛋白組分</column><column>X</column><column></column></row><row><column></column><column>STS17;100/101</column><column>甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的膜蛋白組分</column><column>X</column><column></column></row><row><column></column><column>STS18;104/105</column><column>甘露糖醇/山梨糖醇ABC型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的周質(zhì)山梨糖醇結(jié)合蛋G</column><column>X</column><column></column></row><row><column></column><column>STS21;108/109</column><column>磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的PtsI酶I</column><column></column><column>X</column></row><row><column></column><column>STS22;122/123</column><column>磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的HPr蛋白</column><column></column><column>X</column></row><row><column></column><column>STS23;116/117</column><column>磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的酶IIAMan</column><column></column><column>X</column></row><row><column></column><column>STS24;32/33</column><column>涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的P-環(huán)ATP酶蛋白家族</column><column></column><column>X</column></row><row><column></column><column>STS25;120/121</column><column>涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的HPR激酶</column><column></column><column>X</column></row><row><column></column><column>RCS01;148/149RCS02;152/153RCS03;156/157</column><column>對氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亞基I和II</column><column>X</column><column></column></row><row><column></column><column>RCS04;160/161RCS05;164/165</column><column>bo型泛醌氧化酶亞基I、II、m和IV</column><column>X</column><column></column></row><table><table><row><column>名稱多肽/基因的SEQIDNO:</column><column>與……的相似性</column><column>上</column><column>下</column></row><row><column>RCS06;168/169RCS07;172/173</column><column></column><column></column></row><row><column>RCS08;176/177</column><column>G3-ADH與膜結(jié)合的醇脫氫酶細(xì)胞色素c亞基</column><column>X</column><column></column></row><row><column>RCS21;180/181RCS22;184/185RCS23;188/189RCS24;192/193RCS25;196/197</column><column>涉及PQQ生物合成的蛋白</column><column>X</column><column></column></row><row><column>RCS27;200/201RCS28;48/49</column><column>涉及細(xì)胞色素c生物合成的亞鐵血紅素輸出蛋白</column><column></column><column>X</column></row><row><column>VCS01;36/37</column><column>甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶/甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶</column><column></column><column>X</column></row><row><column>VCS02;52Z53VCS03;56/57</column><column>肌氨酸氧化酶a亞基</column><column></column><column>X</column></row><row><column>VCS04;60/61</column><column>同滲容摩傳感器蛋白envZrp426</column><column></column><column>X</column></row><row><column>VCS05;64/65</column><column>轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OmpR</column><column></column><column>X</column></row><row><column>VCS06;68/69</column><column>PetP</column><column></column><column>X</column></row><row><column>VCS07;72/73</column><column>肽去甲酰酶</column><column></column><column>X</column></row><row><column>VCS08;40/41</column><column>天冬酰胺合酶(谷氨酰胺-水解)</column><column></column><column>X</column></row><table>技術(shù)人員將知道如何增強(qiáng)和/或提高蛋白(例如SNDHai或醇脫氫酶)的活性。這些可以例如通過對宿主生物進(jìn)行遺傳修飾來完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產(chǎn)生更多或更穩(wěn)定的的拷貝的方式來進(jìn)行。這還可以通過增加蛋白的比活性來完成。在下述說明書中，詳細(xì)描述了達(dá)到此目的方案，即，通過增加(上調(diào))特定蛋白，例如SNDHai的活性，增加從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量。在進(jìn)行必要修正后，這些方案可應(yīng)用于功能較之野生型副本將被增強(qiáng)或提高的RCS、SMS和STS蛋白。為使生物產(chǎn)生更多拷貝的SNDHai基因(即，過量表達(dá)該基因)和/或蛋白，所進(jìn)行的修飾包括使用強(qiáng)啟動子，或者對SNDHai基因(的部分)或其調(diào)控元件加以突變(例如，插入、缺失或點突變)。這還可包括將多個拷貝的基因插入到合適的微生物中。SNDHai蛋A比活性的增加也可通過木領(lǐng)域已知的方法來完成。此類方法可包括對SNDHai基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點突變)。本文中使用的突變可以是導(dǎo)致功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的多肽(例如，功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的SNDHai基因產(chǎn)物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其提高了SNDHai的合成，或者導(dǎo)致SNDHai蛋白以改變的氨基酸序列表達(dá)，該改變使得該蛋白的功能較之具有未被改變的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增強(qiáng)。干擾可在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平或翻譯后水平上發(fā)生。本領(lǐng)域中還已知可以通過將SNDHai蛋白與特定增強(qiáng)子相接觸或與能與SNDHai蛋白發(fā)生特異性相互作用的其它物質(zhì)相接觸，來增強(qiáng)給定蛋白質(zhì)活性的方法。為鑒定出此類特定增強(qiáng)子，可表達(dá)SNDHai蛋白，并對存在懷疑能增強(qiáng)SNDHai蛋白活性的化合物時的活性加以測試。還可通過對編碼SNDHai的信使RNA進(jìn)行穩(wěn)定化來增加SNDHai蛋白的活性。此類方法也是本領(lǐng)域已知的，見，例如Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.禾口Ausubeletal.(eds.)，1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。本文中使用的術(shù)語一一活性的"增加"包括增加生產(chǎn)生物中一種或多種多肽的活性，所述多肽是本文所述的相應(yīng)的多核苷酸編碼的。本領(lǐng)域中可獲得用于增加給定蛋白(在本文的情況下是SNDHai蛋白)活性的多種方法。通常，可增加蛋白質(zhì)的比活性或者可以增加蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)。術(shù)語"增加活性"或者類似表述還包括下述情形其屮，SNDHai蛋白活性被引入以前不含該活性的細(xì)胞，這例如通過將編碼SNDHai的基因引入以前不含該基因等同物的細(xì)胞或以前不能表達(dá)相應(yīng)蛋白的活性形式的細(xì)胞來實現(xiàn)。為協(xié)助這種增加，對應(yīng)于本文所述多核苷酸的基因的拷貝數(shù)可被增加。或者，可使用強(qiáng)啟動子來指導(dǎo)多核苷酸的表達(dá)。在另一種實施方式中，基因的啟動子、調(diào)控區(qū)域和/或核糖體結(jié)合位點可被改變，以增加表達(dá)。還可以通過增加信使RNA的相對半壽期來增強(qiáng)或強(qiáng)加表達(dá)。在另一種實施方式中，還可以通過在多肽氨基酸序列屮利用能增加活性的一處或多處突變來增加多肽自身的活性。例如，改變多肽與其相應(yīng)底物的相對Km可導(dǎo)致活性提高。類似地，可增加肽的相對半壽期。在基因表達(dá)增強(qiáng)或者比活性增加的情況下，可通過改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或用于培養(yǎng)的方法來達(dá)成這種提高。本文中使用的"增強(qiáng)的表達(dá)"或"提高的活性"表示較之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增強(qiáng)和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或濃度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%的增加。還可通過將蛋白與其活性的特異性或一般性增強(qiáng)劑相接觸來增加SNDHai蛋白的活性。在本文公開的其它一些情況下，SMS、STS、RCS或VCS多肽的活性將被降低或消失，使得從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率額外增加。在進(jìn)行必要修正后，關(guān)于減少(下調(diào))SMS05蛋白活性的下述流程可應(yīng)用于RCS、SMS、STS和VCS蛋白，特別是本文示例的、其功能較之野生型副本將有所減少的那些。為協(xié)助這種減少，對應(yīng)于本文所述多核苷酸的基因的拷貝數(shù)可被減少，例如，通過基因的欠表達(dá)或者對基因的打斷來實現(xiàn)。如果基因的轉(zhuǎn)錄水平較之野生型基因降低，所述基因就被說成是"欠表達(dá)"。這可以通過例如Northern印跡雜交分析來測量，Northern印跡雜交分析對作為基因表達(dá)指示的mRNA的量進(jìn)行定量。在本文中，如果產(chǎn)生的mRNA的量較之野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量減少了至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%或100%，那么該基因就是欠表達(dá)的?；蛘撸墒褂萌鯁幼觼碇笇?dǎo)多核苷酸的表達(dá)。在另一種實施方式中，基因的啟動子、調(diào)控區(qū)域和/或核糖體結(jié)合位點可被改變，以獲得對表達(dá)的負(fù)調(diào)。還可以通過減少信使RNA的相對半壽期來降低表達(dá)。在另一種實施方式中，還可以通過在編碼多肽的基因序列中利用一處或多處突變來減少多肽自身的活性，這導(dǎo)致多肽氨基酸序列中的至少一處突變，從而減少了活性。例如，改變多肽與其相應(yīng)底物的親和性可導(dǎo)致活性降低。類似地，可減少肽的相對半壽期。在基因表達(dá)降低或者活性降低的情況下，可通過改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或用于培養(yǎng)的方法來達(dá)成這種降低。本文中使用的"降低的表達(dá)"或"降低的活性"表示較之野生型蛋白、多核苷酸或基因時言，至少5%、10%、25%、50%、75%或100%的減少。還可通過將蛋白與其活性的特異性或一般性抑制劑相接觸來降低給定蛋白的活性。術(shù)語"降低的活性"、"減少的或消失的活性"在本文中可互換使用。為提高某重組宿主細(xì)胞對維生素C的產(chǎn)生，可在該生物中抑制SMS05基因的表達(dá)，這例如通過靶向弓SMS05核苷酸序列的調(diào)控區(qū)域(例如，SMS05啟動子和Z或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核苷酸序列，以形成三螺旋結(jié)構(gòu)，阻止靶細(xì)胞中SMS05基因的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)。一般而言，見Helene,C.(1991)AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene，C.etal.(1992)Ann.N.YAcadSci.660:27-36和Maher,LJ.(1992)Bioassays14(12):807-15。還可通過對SMS05基因加以修飾來抑制或阻止基因表達(dá)，例如，通過向SMS05基因中引入一處或多處突變來實現(xiàn)，其中所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生較之野生型蛋白而言功能顯著降低的SMS05蛋白。本文中使用的突變可以是導(dǎo)致功能更弱或更不穩(wěn)定的多肽(例如，功能更弱或更不穩(wěn)定的SMS05基因產(chǎn)物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其干擾了SMS05的合成，或者導(dǎo)致SMS05蛋白以改變的氨基酸序列表達(dá)，該改變使得該蛋白的功能較之具有未被改變的氨基酸序列的野生型副本而言被完全或部分破壞。干擾可在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平或翻譯后水平上發(fā)生。微生物基因組中的改變可例如通過單交叉重組或多交叉重組用經(jīng)改變的DNA序列替換野生型DNA序列來進(jìn)行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉(zhuǎn)化子，該改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補(bǔ)足微生物可能的營養(yǎng)缺陷型的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。此類改變的例子包括基因打斷，即對基因加以擾亂，使得通常由該基因生產(chǎn)的產(chǎn)物不以功能性形式產(chǎn)生。這可通過完全缺失、選擇性標(biāo)記的缺失和插入、選擇性標(biāo)記的插入、讀碼框位移突變、同框(in-frame)缺失或者導(dǎo)致成熟前終止的點突變導(dǎo)致。在這些情況中的一些中，基因的整條mRNA不存在，在另一些中，產(chǎn)生的mRNA的量有所變化。在所有情況下，所述基因編碼的多肽都不以功能性形式產(chǎn)生，其或者不存在或者以經(jīng)突變形式存在，例如，具有木文定義的降低的活性的蛋白。還可通過下述方法獲得微生物基因組中導(dǎo)致功能更弱或沒有功能的多肽的改變使用例如化學(xué)誘變劑、輻射或轉(zhuǎn)座子對微生物基因組進(jìn)行隨機(jī)誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物的更好的或更有效的生產(chǎn)菌株的突變體。用于篩選和選擇的標(biāo)準(zhǔn)方法是技術(shù)人員已知的。在一種特定實施方式中，需要敲除本發(fā)明的SMS05基因，即，其中，當(dāng)引入合適的宿主細(xì)胞時，其基因表達(dá)被人工遏制，以提高對發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供攜帶此類被遏制基因的微生物的方法是本領(lǐng)域公知的。可通過缺失掉基因或其調(diào)控區(qū)域的至少一部分，來誘導(dǎo)對內(nèi)源SMS05基因的遏制。本文中使用的"對基因表達(dá)的遏制"包括完全遏制和部分遏制，以及在特定條件下的遏制，還包括對兩個等位基因中任何一個的表達(dá)的遏制。為制造其中SMS05基因的表達(dá)被人工遏制的敲除微生物，首先可克隆SMS05基因，然后可使用該基因來構(gòu)建用于同源重組的載體，以在靶標(biāo)微生物中失活內(nèi)源SMS05基因。用于同源重組的載體含有設(shè)計來使靶標(biāo)微生物中內(nèi)源SMS05基因失活的核酸序列。此核酸序列可以是例如，含有至少部分缺失突變的SMS05基因或其調(diào)控區(qū)域(例如，將被失活的基因側(cè)翼存在的區(qū)域(順式情況下)或單獨存在的(反式情況下))的核酸序列，或者其可以是含有其它基因的SMS05基因或其調(diào)控區(qū)域。優(yōu)選地，選擇還可用作為標(biāo)記發(fā)揮作用的基因作為將被插入進(jìn)SMS05基因或其調(diào)控區(qū)域的基因。將使用的插入基因包括，例如，前文定義的藥物抗性基因。對于基因可插入到SMS05基因中的位置沒有特別限制，只要在該位置的插入能導(dǎo)致對耙標(biāo)中內(nèi)源SMS05基因表達(dá)的遏制即可。為避免插入的極性作用，可通過使用例如sacB系統(tǒng)，或通過長側(cè)翼同源性PCR來引入同框沉默缺失。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。用于SMS05蛋白的上述誘變策略可導(dǎo)致想要的化合物(特別是維生素C)的產(chǎn)率增加。這些策略的列出并不意味著限制；對這些誘變策略的變化對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的?？赏ㄟ^這些機(jī)制，用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生出微生物，例如表達(dá)經(jīng)突變SMS05核酸和蛋白分子的G/wco"o&ctero:cj^a^或細(xì)菌的相關(guān)菌株，使得對想要的化合物(例如維生素C)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或產(chǎn)量被提高。在本文公開的其它一些情況下，SMS、STS或RCS多肽的活性將被增加，使得從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率額外增加。在進(jìn)行必要修正后，關(guān)于增加(上調(diào))STS01蛋白活性的下述流程可應(yīng)用于RCS、SMS或STS蛋白，特別是本文示例的、其功能較之野生型副木將有所增加的那些。本發(fā)明還涉及下述微生物，其中，給定多肽(例如STS01多肽)的活性增強(qiáng)和/或提高，使得從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率增加，優(yōu)選地，在過量表達(dá)SNDHai或其活性片段或其衍生物的微生物中。這可例如通過將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)入重組或非重組微生物來完成，所述微生物可以含有STS01基因的內(nèi)源等同物，或者可以不含。技術(shù)人員將知道如何增強(qiáng)和/或提高給定蛋白(例如STS01蛋白)的活性。這些可以例如通過增加蛋白的比活性，或者通過對宿主生物進(jìn)行遺傳修飾來完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產(chǎn)生更多或更穩(wěn)定的蛋白(例如，STS01蛋白)的拷貝的方式來進(jìn)行。在下述說明書中，詳細(xì)描述了達(dá)到此目的方案，即，通過增加STSOl蛋白的活性，增加從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量。在進(jìn)行必要修正后，這些方案可應(yīng)用于其它STS、RCS或SMS蛋白。為使生物產(chǎn)生更多拷貝的STS01基因(即，過量表達(dá)該基因)和/或蛋白，所進(jìn)行的修飾包括使用強(qiáng)啟動子，或者對STS01基因(的部分)或其調(diào)控元件加以突變(例如，插入、缺失或點突變)。這還可包括將多個拷貝的基因插入到合適的微生物中。STS01蛋白比活性的增加也可通過本領(lǐng)域已知的方法來完成。此類方法可包括對STS01基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點突變)。如果基因的轉(zhuǎn)錄水平較之野生型基因有所增強(qiáng)，那么認(rèn)為該基因被"過量表達(dá)"。這可通過例如對mRNA的量加以定量的Northern印跡分析來測量，mRNA的量被用作為對基因表達(dá)的指示。在本文中，如果產(chǎn)生的mRNA的量較之野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%,那么基因就是過量表達(dá)的。本領(lǐng)域中還己知可以通過將STS01蛋白與特定增強(qiáng)子相接觸或與能與STS01蛋白發(fā)生特異性相互作用的其它物質(zhì)相接觸，來增強(qiáng)給定蛋白質(zhì)活性。為鑒定出此類特定增強(qiáng)子，可表達(dá)STS01蛋白，并對存在懷疑能增強(qiáng)STS01蛋白活性的化合物時的活性加以測試。還可通過對編碼STS01的信使RNA進(jìn)行穩(wěn)定化來增加STS01蛋白的活性。此類方法也是本領(lǐng)域已知的，見，例如Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.和Ausubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。更詳細(xì)地，當(dāng)以下述方式轉(zhuǎn)化過量表達(dá)SNDHai的重組微生物時，獲得了特別好的結(jié)果，所述方式使得編碼展示出與未鑒定的、可能涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的、P-環(huán)ATP酶蛋白家族的相似性的蛋白(SEQIDNO:33)的內(nèi)源基因STS24(SEQIDNO:32)按照實施例15-18所述被敲除。此外，當(dāng)以下述方式轉(zhuǎn)化過量表達(dá)SNDHai的重組微生物時，獲得了特別好的結(jié)果，所述方式使得內(nèi)源基因VCS01(SEQIDNO:36)按照實施例19-24所述被敲除，該基因編碼展示出與甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶Z甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的相似性的蛋白(SEQIDNO:37)。此外，當(dāng)以下述方式轉(zhuǎn)化過量表達(dá)SNDHai的重組微生物時，獲得了特別好的結(jié)果，所述方式使得內(nèi)源基因VCS08(SEQIDNO:40)按照實施例25-28所述被敲除，該基因編碼展示出與天冬酰胺合酶(谷氨酰胺水解)的相似性的蛋白(SEQIDNO:41)。此外，當(dāng)以下述方式轉(zhuǎn)化過量表達(dá)SNDHai的重組微生物時，獲得了特別好的結(jié)果，所述方式使得編碼NAD(P)依賴性山梨糖酮脫氫酶(SEQIDNO:45)的內(nèi)源基因SMS05(SEQIDNO:44)按照實施例29-33所述被敲除。此外，當(dāng)以下述方式轉(zhuǎn)化過量表達(dá)SNDHai的重組微生物時，獲得了特別好的結(jié)果，所述方式使得編碼D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)運蛋白(SEQIDNO:81)的內(nèi)源基因STSOl(SEQIDNO:80)按照實施例34和35所述被敲除。此外，當(dāng)以下述方式轉(zhuǎn)化過量表達(dá)SNDHai的重組微生物時，獲得了特別好的結(jié)果，所述方式使得編碼PQQ生物合成涉及的蛋白(pqqA)(SEQIDNO:181)的內(nèi)源基因(SEQIDNO:180)RCS21按照實施例36和37所述被敲除。將通過下述實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所述實施例不應(yīng)被理解為起限制作用。本文提到的所有參考文獻(xiàn)、專利申請、專利和公開的專利申請的內(nèi)容都通過引用并入本文。實施例實施例1制備染色體DNA以及通過PCR擴(kuò)增DNA片段在由25g/1甘露糖醇、5g/1酵母提取物(Difco)和3g/1細(xì)菌蛋白胨(Bactopeptone)(Difco)構(gòu)成的甘露糖醇培養(yǎng)基型(MB)液體培養(yǎng)基中，于30℃對G/wco朋k7cteroxyt/fl朋DSM17078的細(xì)胞進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述白勺方、法，從培養(yǎng)的細(xì)胞制備GluconobacteroxydansDSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物一一Pf(SEQIDNO:3)禾PPr(SEQIDNO:4)，通過PCR來制備DNA片段。按照廠商說明書，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)和10ng染色體DNA以μl的總體積來進(jìn)行反應(yīng)，獲得了含有SNDHaiDNA序列(SEQIDNO:1)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗證了其正確序列。實施例2用在甘露糖醇培養(yǎng)基型瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的靜Lh細(xì)胞從L-山梨糖酮來生產(chǎn)維生素CIFO菌株3293、3292、3244、3260、3266、3287、3259、13693和13773以及^4ceto6actersp.ATCC15164禾口G7wccwobacferox_y<ia/wDSM17078，菌株IFO3293的衍生物，被用于從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C。在含有5g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/1葡萄糖、5g/1甘露糖醇、1g/1MgS04'7H20、5ml/1乙醇和15g/1瓊脂的No.350培養(yǎng)基上，于27。C，對菌株IFO13693和IFO13773進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(DifcoLaboratories,Detroit,Mich"USA)、3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)和18g/l瓊脂(Difco)的甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)瓊脂培養(yǎng)基上，于27。C，對所有其它^cetokzcter菌株和所有G/wcwzokzcter菌株進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于靜止細(xì)胞反應(yīng)，所述反應(yīng)進(jìn)行于30℃，230rpm振蕩下，5ml試管中，進(jìn)行20小時。反應(yīng)混合物(0.5ml)含有l(wèi)。/。的L-山梨糖酮、0.3。/。NaCl、1%CaC03和終濃度為600納米下(OD600)10個吸光率單位的細(xì)胞。在培養(yǎng)階段的最后，用具有與Aminex-HPX陽78H(300x7.8mm)柱(Biorad,Reinach,Switzerland)相連的Lichrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck,Darmstadt,Germany)白勺Agilent1100HPLC系統(tǒng)(AgilentTechnologies,Wilmington,USA)，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混合物進(jìn)行分析。流動相為0.004M硫酸，流速為0.6ml/分鐘。用UV探測器(波長254nm)組合折射系數(shù)探測器，記錄下兩個信號。此外，用氨基柱(YMC-PackPolyamine-II，YMC，Inc.,Kyoto,Japan)在254nm處的UV探測來進(jìn)行對維生素C的鑒定。流動相為50mMNH4H2P04和乙腈(40:60)。AgilentSeries1100HPLC-質(zhì)譜(MS)系統(tǒng)被用于鑒定維生素C。用電噴霧界面在陽離子模式下來操作MS。用LUNA-C8(2)柱(100x4.6mm)(Phenomenex，Torrance,USA)來進(jìn)行分離。流動相為0.1%蟻酸禾口甲醇(96:4)的混合物。維生素C在駐留時間為3.1分鐘時被洗脫出來。通過駐留時間和該化合物的分子量來確認(rèn)維生素C的身份。為排除D-異抗壞血酸的存在，用氨基柱(YMC-PackPolyamine-II，YMC，Inc.,Kyoto,Japan)在254nm處的UV探測通過駐留時間對維生素C進(jìn)行額外的鑒定。流動相為50mMNH4H2PO4和乙腈(40:60)。如表1所示，G/wco"o&cter和Jceto&cter菌株能從L-山梨糖酮產(chǎn)生維生素C。表1.從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C<table><row><column>菌株</column><column>維生素C(mg/L)</column></row><row><column>G.oxydansIFO3293</column><column>1740</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078</column><column>570</column></row><row><column>G*.oxydansIFO3292</column><column>410</column></row><row><column>G.oxydansIFO3244</column><column>1280</column></row><row><column>G.frateuriiIFO3260</column><column>50</column></row><row><column>G.cerinusIFO3266</column><column>140</column></row><row><column>G.oxydansIFO3287</column><column>60</column></row><row><column>A.acetisubsp.OrleanusIFO3259</column><column>30</column></row><row><column>A.acetisubspXylinumIFO13693</column><column>40</column></row><row><column>A.acetisubsp.XylinumIFO13693</column><column>120</column></row><row><column>Acetobactersp.ATCC15164</column><column>310</column></row><row><column>空白對照</column><column>未探測到</column></row><table>空白對照:反應(yīng)在沒有細(xì)胞的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。實施例3在試管和瓶中發(fā)酵從L-山梨糖和D-山梨糖醇來生產(chǎn)維生素C將G.oxydansDSM17078的細(xì)胞用于接種4mlNo.3BD液體培養(yǎng)基，并在220rpm振蕩下，于30。C在試管(18mm直徑)中對其進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在培養(yǎng)時期的末尾，收集到20mg/l的維生素C。在200rpm振蕩下，30。C時，在500ml帶擋板搖瓶中的50mlNo.5培養(yǎng)基中，對菌株DSM17078的細(xì)胞(重復(fù)三份)進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20和15g/1的CaC03。72小時的培養(yǎng)后，在三個瓶中通過HPLC檢測到的維生素C的量為400、500和680mg/l。實施例4在補(bǔ)料分批發(fā)酵中從D-山梨糖醇來生產(chǎn)維生素C在180rpm振蕩下，30。C時，在2升帶擋板搖瓶中的200mlNo.5培養(yǎng)基中，對G.oxydansDSM17078的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、15g/1酵母提取物(FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/1MgS047H20和15g/1的CaC03。48小時后，用150ml該培養(yǎng)物去接種10升的生物反應(yīng)器(B.BraunED10,Melsungen，Germany)，所述反應(yīng)器中已預(yù)先裝有5.3升的培養(yǎng)基(含有20g/lD-山梨糖醇、0.5g/1甘油、15g/1酵母提取物(FlukaBiochemika,Buchs，Switzerland)禾n2.5g/1MgS047H20)，并裝備有溫度、pH和溶解氧傳感器和控制線圈。溫度被控制為30。C，通過加入28X氨溶液將pH控制為6.0，氣流為4.5升/分鐘，通過攪拌速度(最小300rpm)級聯(lián)將溶解氧控制為30%。6小時的反應(yīng)時間后，以25g/h的速率，在44小時的時期內(nèi)，補(bǔ)加入500g/l的山梨糖醇溶液。96小時的反應(yīng)時間后，上清液中僅留有l(wèi)%的底物，并己產(chǎn)生了950mg/l的維生素C。實施例5在細(xì)胞膜部分中從L-山梨糖酮或L-山梨糖來生產(chǎn)維生素C在500ml帶擋板瓶中100mlNo.3BD液體培養(yǎng)基中，220rpm的振蕩下，于30。C對G.oxydansDSM17078的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在500rpm對得到的培養(yǎng)物進(jìn)行離心，以去除CaC03。然后在5,000rpm對來自該步驟的上清液進(jìn)行離心，以使細(xì)胞沉淀。將收集的細(xì)胞懸浮于3ml的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，通過在900psi.兩次經(jīng)過FrenchPressureCell(SIM-AMINCOSpetronicInstruments,USA)來使細(xì)胞破碎。先在5,000rpm下對得到的均勻混合物進(jìn)行離心，以去除細(xì)胞殘骸。然后，將上清液稀釋為最終的蛋白質(zhì)濃度為3mg蛋白質(zhì)/ml。將該經(jīng)過稀釋的樣品稱為不含細(xì)胞的提取物(CFE)。在100,000xg對CFE進(jìn)行60分鐘的離心。棄去上清液，收集沉淀，作為膜部分。在220rpm振蕩下，于30°C，在50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，用膜部分(100來進(jìn)行15小時的反應(yīng)(200/xl)。待測底物為L-山梨糖酮(1%終濃度)和L-山梨糖(2%終濃度)。用于反應(yīng)的最終蛋白質(zhì)濃度為1.5mg/ml。在培養(yǎng)時期的末尾，從1%L-山梨糖酮和2%L-山梨糖分別產(chǎn)生了680mg/1和10mg/1的維生素C。實施例6用生長于3BD瓊脂培養(yǎng)基上的靜止細(xì)胞，從D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮來生產(chǎn)維生素C在含有70g/1L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1CaC03禾口18gZl瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C對G.oxj^fl^DSM17078的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。如實施例2所述，用2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或1%L-山梨糖酮于30。C來進(jìn)行24小時靜止細(xì)胞反應(yīng)(10ml試管中，1ml反應(yīng)混合物)。菌株DSM17078分別從D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮生產(chǎn)出了280、400和1780mg/1的維生素C。如實施例2所述，在含有2。/。D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或2。/。L-山梨糖酮的反應(yīng)混合物中，用No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上生長的DSM17078細(xì)胞來進(jìn)行其它反應(yīng)(10ml試管中，0.5ml反應(yīng)混合物)，進(jìn)行2天。菌株DSM17078分別從D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮生產(chǎn)出了1.8、2.0和5.1g/l的維生素C。按照上文所述，用2%L-山梨糖酮，用G.IFO3293的細(xì)胞來進(jìn)行反應(yīng)。菌株IF03293在2天內(nèi)生產(chǎn)出了5.7g/l的維生素C。實施例7用生長于液體培養(yǎng)基中的靜止細(xì)胞來從D-山梨糖醇生產(chǎn)維生素CG.ox_yAwwDSM17078的細(xì)胞被培養(yǎng)于200mlNo.5培養(yǎng)基上，所述67培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、15g/1酵母提取物(FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/1MgS047H20禾Q15g/1CaC03，培養(yǎng)在2升帶擋板搖瓶中，于30°C下在180rpm的振蕩下進(jìn)行。24小時后，在3220g下對培養(yǎng)物進(jìn)行離心(Eppendorf581OR,Hamburg,Germany)，并將細(xì)胞重新懸浮于0.9%NaCl溶液中，再在3220g下離心，細(xì)胞沉淀被用于接種一只含有50ml完全生長培養(yǎng)基(100g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、15g/1酵母提取物、2.5g/1MgS047H20、15g/1CaC03)的帶擋板500ml搖瓶以及另一只含有50ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(100g/1D-山梨糖醇、3g/lNaCl、10g/lCaCO3)的帶擋板500ml搖瓶。在兩只瓶中，作為600nm處測量的光密度(OD6。Q)的初始細(xì)胞密度均為10。在180rpm振蕩下，于30。C對兩只瓶進(jìn)行培養(yǎng)。48小時后，生長培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基中的細(xì)胞懸浮液分別已經(jīng)積累了1.06禾卩1.18g/1的維生素C。培養(yǎng)期間在完全培養(yǎng)基中沒有觀察到額外的生長。實施例8對能從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的細(xì)菌進(jìn)行Southern印跡分析從G/wco"Wacteroxj^a^IFO3293、IFO3292、IFO3244、IFO3287，G7wcowo6flcteryatewn',IFO3260禾卩IFO3265，G7wcowo6actercen'"w5IF03266禾口IFO3269，Jceto6acteracWwfep.or/ea聰sIFO3259，v4ceto6acterace"5wfo/.xy"w畫IFO13693禾口IF013773,^4ceto6acter平ATCC15164和fcc/ze/c/n'aa"K-12的細(xì)胞來制備染色體DNA。在含有5g/1細(xì)菌蛋白胨(Difco)、5g/1酵母提取物(Difco)、5g/L葡萄糖、5g/l甘露醇、1g/1MgS047H20、5ml/L乙醇和15g/l瓊脂的No.350培養(yǎng)基上，于27。C對菌株IFO13693和IFO13773進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在含有25g/1甘露醇、5g/1酵母提取物(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.,USA)、3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)和18g/l瓊脂(Difco)的甘露醇培養(yǎng)基(MB)瓊脂培養(yǎng)基上，于27。C對所有其它的^ceto6flcte/'菌株和所有G/wco"W"cter菌株進(jìn)行3天的培養(yǎng)。Eco/z'K-12被培養(yǎng)于LuriaBroth瓊脂培養(yǎng)基上。染色體DNA制備物被用于在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行Southern印跡雜交。用C/al(當(dāng)分析N-結(jié)構(gòu)域區(qū)域時)或五coRI(當(dāng)分析C-結(jié)構(gòu)域區(qū)域時)對染色體DNA制備物進(jìn)行消化，通過瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖)分離出1μg的DNA片段。用0.25N的HC1對凝膠進(jìn)行15分鐘的處理，然后用0.5NNaOH進(jìn)行30分鐘的處理，然后將其按照廠商說明書印到VacuumBlotterModel785(BIO-RADLaboratoriesAG,Switzerland)的尼龍膜上。使用表2中所述的引物組，用PCR-DIG標(biāo)記試劑盒(RocheDiagnostics)來制備探針。PCR產(chǎn)物PI對應(yīng)于SNDHai的被稱為N-結(jié)構(gòu)域的區(qū)域(可能的跨膜區(qū)域)，而PCR產(chǎn)物P2則對應(yīng)于SNDHai的被稱為C-結(jié)構(gòu)域的區(qū)域(可能的主要脫氫酶區(qū)域)。表2.用于PCR以產(chǎn)生用于Southern雜交的經(jīng)過標(biāo)記的探針的引物<table><row><column>引物組</column><column>引物的SEQIDNOs.</column><column>PCR產(chǎn)物</column><column>PCR產(chǎn)物的預(yù)計大小(bp)</column></row><row><column>SNDHIF和SNDH420R</column><column>5和6</column><column>Pl</column><column>420</column></row><row><column>SNDH501F和SNDH2364R</column><column>7和8</column><column>P2</column><column>1864</column></row><row><column>SNDH501F和SNDH1530R</column><column>7和9</column><column>P3</column><column>1030</column></row><row><column>SNDH1391F和SNDH2364R</column><column>10和8</column><column>P4</column><column>974</column></row><table>表2顯示了Southern印跡雜交實驗的結(jié)果。在用Pl(N-結(jié)構(gòu)域)探針進(jìn)行的雜交中，觀察到了關(guān)于G.oxydansIFO3293、IFO3293、IFO3244、IFO3287和A印.ATCC15164的清楚的陽性條帶。在用P2(C-結(jié)構(gòu)域)探針進(jìn)行的雜交中，觀察到了關(guān)于菌株IFO3293、IFO3292、IFO3244、IFO3287和A平ATCC15164的清楚的陽性條帶，而對菌株IFO3260、IFO3265、IFO3266、IFO3269和IFO13773只觀察到了模糊的條帶。對照菌株E.coliK-12對于這兩種結(jié)構(gòu)域都沒有顯示出可被探測到的信號表3.對用針對SNDHai的N-和C-結(jié)構(gòu)域的探針(探針Pl和P2)進(jìn)行Southern印跡雜交在不同菌株中獲得的雜交信號的探測<table><row><column>菌株</column><column>Pl</column><column>P2</column></row><row><column>G.oxydansIFO3293</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3292</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3244</column><column>十</column><column>+</column></row><table><table><row><column>G.frateuriiIFO3260</column><column>nd</column><column>tr</column></row><row><column>G.frateuriiIFO3265</column><column>nd</column><column>tr</column></row><row><column>G.cerinusIFO3266</column><column>nd</column><column>tr</column></row><row><column>G.oxydansIFO3269</column><column>nd</column><column>tr</column></row><row><column>G.oxydansIFO3287</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>A.acetisubsp.orleanusIFO3259</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>A.acetisubsp.xylinumIFO13693</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>A.acetisubsp.xylinumIFO13773</column><column>nd</column><column>tr</column></row><row><column>AcetobacterATCC15164</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>E.coilK-12</column><column>nd</column><column>nd</column></row><table>tr，痕量；nd，未探測到。探針PI和P2是表2中列出的引物組合成的(作為DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物)。實施例9對GluconobacteroxydansDSM17078SNDHai基因的直向同源體的PCR擴(kuò)增和測序染色體DNA制備物(按照實施例8中所示來制備)被用作為PCR的模板，其中使用表2中所示的四對引物組。每份反應(yīng)(總體積，50^1)中使用5至100ng的染色體DNA。除非另有指明，使用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics)。PCR條件如下所示在94°C溫育2分鐘；30個如下循環(huán)(i)94°C變性歩驟，15秒，(ii)60。C退火歩驟，30秒，(iii)72。C合成步驟，45至120秒(對引物組P1、P2、P3和P4而言，用于合成步驟的時間分別為45秒、120秒、90秒和卯秒);在72。C延伸7分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分離出PCR反應(yīng)的樣品，用溴化乙啶染色后，用透照器(tmnsilluminator)來觀察條帶。PCR反應(yīng)的結(jié)果被概括于表4中。表4.對用表2的引物組在不同菌株中獲得的PCR產(chǎn)物P1、P2、P3和P4的探測(通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察產(chǎn)物)<table><row><column>菌株</column><column>PI</column><column>P2</column><column>P3</column><column>P4</column></row><row><column>G.oxydansIFO3293</column><column>+</column><column>+*</column><column>nt</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3292</column><column>+</column><column>nd</column><column>nd</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3244</column><column>+</column><column></column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.frateruiiIFO3260</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>G.cerinusIFO3266</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>G.oxydansIFO3287</column><column>+</column><column>+</column><column>nd</column><column>+</column></row><row><column>A.acetisubsp.xylinumIFO</column><column>3259</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>Aacetisubsp.xylinumIFO</column><column>13693</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>Aacetisubsp.xylinumIFO</column><column>13773</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>Acetobactersp.ATCC</column><column>15164+</column><column>+</column><column>+</column><column>nd</column><column>nd</column></row><row><column>E.coliK-12</column><column>nd</column><column>nd</column><column>nt</column><column>nd</column></row><table>一，探測到；nd，未探測到；nt，未檢測。*用與用于ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)相同的反應(yīng)循環(huán)，用GC-richPCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics)來進(jìn)行該PCR。當(dāng)在瓊脂糖凝膠上觀察到清楚的PCR條帶時，PCR產(chǎn)物被直接用于使用標(biāo)準(zhǔn)方法的核苷酸測序。將針對不同pcr產(chǎn)物獲得的核苷酸序列及其所編碼的肽的相應(yīng)的氨基酸序列，與來自G.似jYto朋DSM17078的SNDHai基因和蛋白質(zhì)的全長序列進(jìn)行比較。G/wcowWflcte/-oxv^2MIFO3292SNDHai直向同源體用來自G.ox_y&"5IFO3292的染色體DNA作為模板，用引物SNDH1391F(SEQIDNO:10)和SNDH2364R(SEQIDNO:8)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了pcr產(chǎn)物(大約1kb)，將其用于用sndh1391f(seqidNO:10)進(jìn)行的測序。測得的771bp的核苷酸序列(SEQIDNO:11)顯示出了與來自G.ox.yJa似DSM17078的SNDHai的序列(SEQIDNO:1)的1431-2201位核苷酸的98.7%(761/771)的同源性。推斷出的256個氨基酸的氨基酸序列(SEQIDNO:12)顯示出與來自G.oxydansDSM17078的SNDH的氨基酸序列(SEQIDNO:2)的478-733位具有100%的相同性。GfacowokitcteroxydansIFO3287SNDHai直向同源體用來自G.oxy&MIFO3287的染色體DNA作為模板，用引物SNDHIF(SEQIDNO:5)禾BSNDH420R(SEQIDNO:6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了PCR產(chǎn)物(大約0.4kb)，將其用于用SNDH420R(SEQIDNO:6)進(jìn)行的測序。測得的350bp的核苷酸序列(SEQIDNO:13)顯示出了與SEQIDNO:1的31-380位核苷酸的97.4%(341/350)的同源性。推斷出的116個殘基的氨基酸序列(SEQIDNO:14)顯示出了與SEQIDNO:2的11-126位氨基酸的100%的相同性。用引物SNDH501F(SEQIDNO:7)禾BSNDH2364R(SEQIDNO:8)擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物(大約1.9kb)被用于用SNDH501F(SEQIDNO:7)進(jìn)行的測序。測得的808bp的核苷酸序列(SEQIDNO:15)顯示出了與SEQIDNO:1的578-1385位核苷酸的98.0%(745/808)的同源性。推斷出的268個殘基的氨基酸序列(SEQIDNO:16)顯示出了與SEQIDNO:2的194-461位氨基酸的100%的相同性。用引物SNDH1391F(SEQIDNO:10)禾卩SNDH2364R(SEQIDNO:8)擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物(大約1kb)被用于用SNDH1391F(SEQIDNO:10)進(jìn)行的測序。測得的800bp的核苷酸序列(SEQIDNO:17)顯示出了與SEQIDNO:1的1469-2268位核苷酸的98.8%(790/800)的同源性。推斷出的266個殘基的氨基酸序列(SEQIDNO:18)顯示出了與SEQIDNO:2的491-756位氨基酸的100%的相同性。Acetobactersp.ATCC15164SNDHai直向同源體用來自A.SP.ATCC15164的染色體DNA作為模板，用引物SNDHIF(SEQIDNO:5)禾nSNDH420R(SEQIDNO:6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了PCR產(chǎn)物(大約0.4kb)，將其用于用SNDH420R(SEQIDNO:6)進(jìn)行的測序。測得的360bp的核苷酸序列(SEQIDNO:19)顯示出了與SEQIDNO:1的31-390位核苷酸的97.8%(352/360)的同源性。推斷出的120個殘基的氨基酸序列(SEQIDNO:20)顯示出了與SEQIDNO:2的11-130位氨基酸的100%的相同性。用引物SNDH501F(SEQIDNO:7)禾卩SNDH2364R(SEQIDNO:8)擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物(大約1.9kb)被用于用SNDH501F(SEQIDNO:7)進(jìn)行的測序。測得的760bp的核苷酸序列(SEQIDNO:21)顯示出了與SEQIDNO:1的563-1322位核苷酸的98.0%(745/760)的同源性。推斷出的252個殘基的氮基酸序列(SEQIDNO:22)顯示出了與SEQIDNO:2的189-440位氨基酸的100%的相同性。GluconobacteroxydansIFO3244SNDHai直向同源H本通過使用用G.oxydansIFO3244的染色體作為模板和下述引物組獲得的PCR產(chǎn)物，來測定G.oxydansIFO3244的SNDHai直向同源體基因的完全核苷酸序列，所述引物組為SNDHIF(SEQIDNO:5)禾BSNDH420R(SEQIDNO:6);SNDH501F(SEQIDNO:7)禾口SNDH1530R(SEQIDNO:9);SNDH1391F(SEQIDNO:10)禾卩SNDH2364R(SEQIDNO:8);SNDH382(SEQIDNO:23)禾QSNDH1530R(SEQIDNO:9);SNDHIF(SEQIDNO:5)禾口SNDH689R(SEQIDNO:24)。用Sg/II和SgwHI消化過并被連接的染色體DNA被用于使用下述引物組的另外兩種PCR:SNDH420R(SEQIDNO:6)禾QSNDH501F(SEQIDNO:7)和SNDH1530R(SEQIDNO:9)和IS-50.3(SEQIDNO:25)。完整的核苷酸序列(SEQIDNO:26)顯示出與來自G.oxydansDSM17078的SNDHai的核苷酸序列(SEQIDNO:1)具有98.4%的同源性。推斷出的氨基酸序列(SEQIDNO:27)顯示出了與SEQIDNO:2的氨基酸序列的100%的相同性。實施例10通過增加SNDHai基因劑量增加從L-山梨糖酮到維生素C的生產(chǎn)73用菌株DSM17078的染色體DNA作為模版，用引物組Nl(SEQIDNO:28)和N2(SEQIDNO:29)來進(jìn)行PCR，擴(kuò)增具有上游和下游側(cè)翼序列的SNDHai基因。按照廠商說明書，用GC-richPCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics)來進(jìn)行PCR。將擴(kuò)增得到的DNA片段插入到載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中。然后用hindIII和XhoI去消化得到的質(zhì)粒。將包括有SNDHai基因的HindIII-Xhol片段連接到預(yù)先用州HindIII和Xhol處理過的載體pVK100(可從AmericanTypeCultureCollection獲得，目錄號ATCC37156)上。連接混合物被用于轉(zhuǎn)化E.coliTG1。想要的質(zhì)粒被命名為pVK-P-SNDHai-T，將其從E.coliTG1中分離出來，并通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的電轉(zhuǎn)化(ElectrocellmanipulatorECM600,BTXInc.,SanDiego,CA，USA)將其引入到G.oxydans似菌株DSM17078中。在200rpm的振蕩下，于30°C，在500ml帶擋板搖瓶中的50mlNo.5培養(yǎng)基中，對G.o"t/a/w菌株DSM17078和攜帶有質(zhì)粒pVK-P-SNDHai-T的G.o義j^/"浴菌株DSM17078的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5gZl甘油、15g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS(V7H20和15g/1CaC03。48小時的培養(yǎng)之后，通過HPLC對兩只瓶中的上清液進(jìn)行測量，其中維生素C的含量分別為U0mg/l和200mg/1。實施例11通過具有增加的SNDHai基因劑量的重組微生物靜止細(xì)胞，從L-山梨糖酮或D-山梨糖醇來生產(chǎn)維生素C通過用菌株DSM17078的染色體DNA作為模板，用引物組N1(SEQIDNO:28)禾BN2(SEQIDNO:29)進(jìn)行PCR，來擴(kuò)增具有上游和下游側(cè)翼序列的G.oxWfl"sDSM17078(SEQIDNO:1)的SNDHai基因。按照廠商說明書，用GC-richPCR系統(tǒng)(RocheDiagnosticsGmbH)來進(jìn)行PCR。擴(kuò)增出的片段被插入到載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)中。然后用Mw/III和Mol來消化得到的質(zhì)粒。包括有SNDHai基因的HindIII-Xhol片段被連接到之前用HindIII和Xhol處理過的載體pVKlOO(可從AmericanTypeCultureCollection獲得，目錄號為ATCC37156)上。連接混合物被用于轉(zhuǎn)化ETGI。想要的質(zhì)粒被命名為pVK-P-SNDHai-T，將其從E.coli中分離出來，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(ElectrocellmanipulatorECM600，BTXInc.,SanDiego，CA，USA)將其引入到G.oxydans菌株DSM17078中。三種獨立的轉(zhuǎn)化子，被命名為DSM17078(pVK-P-SNDHai-T)克隆1號、2號和3號，它們與親本菌株G.oxydansDSM17078—起，每種都被培養(yǎng)于3BD瓊脂和MB瓊脂培養(yǎng)基上。從平板上刮下細(xì)胞，將其用于靜止細(xì)胞反應(yīng)(1%L-山梨糖酮作為底物)，如實施例9所述。在No.3BD瓊脂上培養(yǎng)之后，在靜止細(xì)胞測試中，菌株DSM17078產(chǎn)生出了2.5g/l的維生素C，而菌株DSM17078(pVK-P-SNDHai-T)克隆1號、2號和3號則分別產(chǎn)生出了4.2、4.1和4.2g/l的維生素C。在MB瓊脂上培養(yǎng)之后，在靜止細(xì)胞測試中，菌株DSM17078產(chǎn)生出了0.12g/1的維生素C，而菌株DSM17078(pVK-P-SNDHai-T)克隆1號、2號和3號則分別產(chǎn)生出了1.8、2.5和0.94g/1的維生素C。用G.oxydansDSM17078和克隆2號(見上)的細(xì)胞來進(jìn)行另一項反應(yīng)，所述細(xì)胞在220rpm振蕩下于30。C，分別在雙份500ml帶擋板搖瓶中的50mlNo.5培養(yǎng)基(100g/1D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物、2.5g/1MgS047H20、15g/1CaC03)中培養(yǎng)了3天。對每種菌株而言，在500rpm對一瓶中得到的培養(yǎng)物進(jìn)行離心，以去除CaC03。然后再在5，000rpm下對來自該歩的上清液進(jìn)行離心，以沉淀細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞重新懸浮于10ml0.9%的NaCl溶液中，再在5,000rpm下進(jìn)行離心以沉淀細(xì)胞。再將收集到的細(xì)胞重新懸浮于水中，并用于接種lml生產(chǎn)培養(yǎng)基(20g/1D-山梨糖醇、3g/1NaCl、10g/1CaC03)，所述培養(yǎng)基處于10ml反應(yīng)試管中，最終的靜止細(xì)胞密度相當(dāng)于600nm處的5OD單位。在30°C和220rpm下，20小時反應(yīng)時間后，對菌株DSM17078和過量表達(dá)SNDHai的DSM17078而言，從生產(chǎn)瓶中收獲的上清液中分別含有360和760mg/1的維生素C。相反，72小時后，從剩下的生長培養(yǎng)基中收獲的上清液分別含有0和440mg/1的維生素C。實施例12在五.CO//的靜止細(xì)胞中從L-山梨糖酮來生產(chǎn)維生素C沒有終止密碼子的SNDHai基因被命名為SNDHai-l，其對應(yīng)于SEQIDNO:1的1-2364位核苷酸，用引物對SNDHai-Nde(SEQIDNO:30)和SNDHaiHis-X(SEQIDNO:31)，通過PCR(RocheHighFidelity試劑盒)從菌株DSM17078的染色體DNA對其進(jìn)行了擴(kuò)增。擴(kuò)增出的DNA被克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)，以獲得pCR2.1-TOPO-SNDHai-l，其SNDHai序列通過核苷酸測序被驗證為是正確的。然后用AWel和oI切出來SNDHai-l基因，將其連接到pET-21b(十)(Novagen，Madison,WI，USA)的MM和^oI位點之間，以產(chǎn)生出pET21b-SNDHaiHis;6xHis被加到SNDHai的C-末端。pET21b-SNDHaiHis被引入到co//BL21(DE3)中。從在添加有50μg/ml羧芐青霉素的LB中培養(yǎng)的E.coliBL21(DE3)/pET21b-SNDHaiHis的過夜培養(yǎng)物中取5ml，接種到200ml同樣的培養(yǎng)基中。在230rpm下于37°C對細(xì)胞進(jìn)行2小時的培養(yǎng)，然后用1mMIPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)在230rpm下于25°C培養(yǎng)3小時。對得到的培養(yǎng)物進(jìn)行離心，然后用鹽水洗兩次，將細(xì)胞沉淀懸浮于2ml水中。細(xì)胞被用于靜止細(xì)胞反應(yīng)，其中使用的反應(yīng)混合物(5ml試管中，500μ1)含有OD600=10的細(xì)胞，1%的單水合山梨糖酮、5μMPQQ、5mMMgCl2、0.3%NaCl禾卩1%CaC03，反應(yīng)在30°C下進(jìn)行15小時。在溫育15小時后，生產(chǎn)出了0.14g/l的維生素C。當(dāng)用1μMPQQ來進(jìn)行靜止細(xì)胞反應(yīng)時(其它條件都與上文所述相同)，在溫育3小時后生產(chǎn)出了0.05g/l的維生素C。實施例13通過具有增加的SNDHai基因劑暈的重組微生物的靜止細(xì)胞從D-山梨糖醇來生產(chǎn)維生素C在180rpm的振蕩下，于30°C，在500ml帶擋板搖瓶中的50mlNo.5培養(yǎng)基中，對過量表達(dá)SNDHai的G.oxydansDSM17078細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、15g/1酵母提取物(FlukaBioChemika，Buchs，Switzerland)、2.5g/1MgS047H20和15g/1CaC03，培養(yǎng)48小時。得到的細(xì)胞懸浮液被用于接種2L的生物反應(yīng)器，所述反應(yīng)器被稱為生長容器(Biostat-MD，B.BraunMelsungen，Melsungen，Germany)，其中含有1.25升的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由100g/1D-山梨糖醇、15g/1酵母提取物(FlukaBioChemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/1MgS047H20、0.3g/1KH2P04禾n0.12g/1CaS04組成。細(xì)胞被培養(yǎng)于30°C，1升/分鐘通氣速率下，用25%的Na2C03溶液將pH控制為5.7，通過改變攪拌速率將溶解氧控制為10%的飽和度。24小時后，作為600nm處吸光率單位測得的細(xì)胞密度為20。在該時間點，將含有100g/1D-山梨糖醇、15g/l酵母提取物(FlukaBioChemika,Buchs，Switzerland)、2.5g/1MgS047H20、0.3g/1KH2P04n0.12g/1CaS04的補(bǔ)料溶液以125ml/小時的補(bǔ)料速率補(bǔ)入到生長容器中，以125ml/小時的收獲速率連續(xù)收獲培養(yǎng)物。通過該方法，生長容器屮的體積被保持恒定為1.25升。按照上文所述對其它工藝參數(shù)進(jìn)行連續(xù)控制。該培養(yǎng)物以125ml/小時的速率被連續(xù)補(bǔ)入到第二反應(yīng)器中，該反應(yīng)器被稱為生產(chǎn)容器，其中裝有5升生產(chǎn)培養(yǎng)基，其中含有100g/1D-山梨糖醇、0.3g/1NaCl和0.12g/1CaS04，溫度被保持為30°C，通過20%的NaOH溶液將pH控制為7.0。通氣速率被保持恒定為10升/分鐘，通過變化攪拌器速率將溶解氧控制為20%。具有相同組成的生產(chǎn)培養(yǎng)基還被連續(xù)補(bǔ)入到生產(chǎn)容器中，補(bǔ)料速率為375ml/小時。通過以500ml/小時的速率持續(xù)收獲上清液，使容器體積保持恒定，得到來自具有500kDa孔徑的橫流超濾模塊(UFP-500-E-9A，AmershamBiosciences)的過濾流，用Masterflex泵，以50升/小時，通過其從生產(chǎn)容器中收獲細(xì)胞懸浮液。滲余物被泵回到容器中。一旦生產(chǎn)容器中的細(xì)胞密度達(dá)到600nm下的吸光率為100，就開始以25ml/小時的速率從流回到生產(chǎn)容器中的經(jīng)過濃縮的細(xì)胞流中收獲細(xì)胞，以保持生產(chǎn)容器中的細(xì)胞密度恒定。不含細(xì)胞的上清液的收獲流含有4g/1的維生素C，其以500ml/小時的速率被持續(xù)補(bǔ)入到具有雙夾套(doublejacket)的收集容器中，這在30°C下進(jìn)行(EcolineRel12,Lauda，Lauda陽Koenigshofen，Germany)。該容器持續(xù)將上清液以180升/小時的速率補(bǔ)入到兩區(qū)室電滲析單元(含有10對具有陽離子交換膜CMX-S和陰離子交換膜ASM的堆疊，膜的總面積為0.2m2，來自EurodiaIndustries,Wissous，F(xiàn)rance)的稀釋區(qū)室中，持續(xù)的流被泵出容器以保持其體積恒定為2升。另一具有雙夾套(最初含有去離子水，30°C)容器被持續(xù)補(bǔ)入新鮮的去離子水，速率為62.5ml/小時，其以200升/小時地速率向電滲析單元的濃縮區(qū)室中持續(xù)泵入水性溶液，持續(xù)的收獲流被從容器中泵出。用蠕動泵(7518-00,Masterflex，USA)將補(bǔ)料溶液泵到電滲析夾套中，在旋轉(zhuǎn)式泵(MD-20，IWAK，Tokyo,Japan)的協(xié)助下，使溶液通過每個電滲析區(qū)室流通。在整個過程中，對電滲析堆疊應(yīng)用14V(電源FuMATechTS001/5，St.Ingbert，Germany)。收獲流中維生素C的濃度為16g/l。實施例14通過下游加工歩驟對用靜止細(xì)胞反應(yīng)生產(chǎn)的維生素C進(jìn)行純化將實施例14中含有16g/1維生素C的收獲流補(bǔ)入到螯合樹脂(AmberliteIRC748,RohmandHaas,Philadelphia,PA,USA)中，以從流中除去二價陽離子。然后在經(jīng)過冷卻的容器(補(bǔ)料容器)中對其進(jìn)行收集，當(dāng)收集到10升是，通過兩極膜電滲析單元(含有7對NeoseptaBP1/CMB膜，膜的總面積為0.14m2，來自EurodiaIndustries,Wissous，F(xiàn)rance)以分批模式對它們進(jìn)行加工。以200升/小時將該溶液泵過電滲析單元的補(bǔ)料區(qū)室，并回收到補(bǔ)料容器中。最初含有5升的2g/1NaOH溶液的另一經(jīng)過冷卻的容器(濃縮容器)被以100升/小時泵過兩極膜電滲析單元的濃縮區(qū)室。通過應(yīng)用25V的最大電壓，以及20A的最大電流，將來自補(bǔ)料區(qū)室的鈉離子轉(zhuǎn)移到濃縮區(qū)室中，因此在補(bǔ)料流中存在的維生素C的鈉鹽形式被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的游離酸形式。達(dá)到90%的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率后，該過程被終止。在濃縮容器中，6升含有7.5g/1NaOH的溶液被收集于稀釋容器中，9升含有大約16g/l游離酸形式維生素C和1.6g/l鈉鹽形式的維生素C的溶液被通過陽離子交換樹脂(AmberliteFPC21H,RohmandHass,Philadelphia,PA,USA)進(jìn)行進(jìn)一步的加工，以將從鈉鹽到游離酸形式的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率提高到大約99%。或者，通過陽離子交換樹脂，對來自電滲析步驟的IO升含有16g/1鈉鹽形式的維生素C的溶液進(jìn)行直接地處理，將其以99%的產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為游離酸形式。然后通過下述一系列步驟，對通過上述任何方法獲得的、以游離酸形式存在的維生素C的流進(jìn)行加工，所述步驟為陰離子交換、活性炭處理、濃縮、結(jié)晶、晶體過濾和干燥。獲得的晶體的終純度為98%，用組合下游加工步驟獲得的產(chǎn)率為80%。實施例15制備染色體DNA以及通過PCR擴(kuò)增STS24DNA片段在由25g/1甘露糖醇、5g/1酵母提取物(Difco)和3g/1細(xì)菌蛋白胨(D論o)構(gòu)成的甘露糖醇培養(yǎng)基型(MB)液體培養(yǎng)基屮，于30°C對G/wco"oZ)Gctero"c/a氾DSM17078的細(xì)胞進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述的方法，從培養(yǎng)的細(xì)胞制備G/wc朋o^cteroxj^a似DSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物一一Pf(SEQIDNO:34)和Pr(SEQIDNO:35)，通過PCR來制備DNA片段。按照廠商說明書，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)和10ng染色體DNA以100的總體積來進(jìn)行反應(yīng)，獲得了含有STS24DNA序列(SEQIDNO:32)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗證了其正確序列。實施例16在G.oxw/fl^DSM17078中打斷STS24基因?qū)嵤├?5中獲得的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)E.coli載體pCR2.1-TOPO，并用于轉(zhuǎn)化E.coliTG1，以獲得攜帶有pCR2.1-STS24的Apr轉(zhuǎn)化子。然后，用連接酶將從pUC-4K(AmershamBioscience,編號X06404)分離的Kmr盒插入目標(biāo)基因的限制性位點之一，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTGI，以獲得攜帶有pCR2.1-STS24::Km的AprKmr轉(zhuǎn)化子。用選自載體部分的多克隆位點的兩種限制性酶消化從轉(zhuǎn)化子制備的pCR2.1-STS24::Km質(zhì)粒，以分離出含有STS24::Km的DNA片段。通過電轉(zhuǎn)化，用得到的DNA片段轉(zhuǎn)化G.oxydansDSM17078，得到基因打斷子--G.oc>y/""5DSM17078-STS24::Km。實施例17使用在含有7%L-山梨糖的3BD瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的靜止細(xì)胞從D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C在含有70g/1L-山梨糖、0.5g/1甘油、7.5g/1酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03和18g/l瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27。C對G.xydansDSM17078、G.xydansDSM17078-STS24::Km的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30°C，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在溫育期結(jié)束時，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行分析。用2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或1%L-山梨糖酮來進(jìn)行第一系列的靜止細(xì)胞反應(yīng)(1.5ml反應(yīng)管中0.2ml反應(yīng)混合物)，所有反應(yīng)混合物都還含有0.3%NaCl、1%CaC03以及終濃度為600納米處10個吸光度單位(OD,)的細(xì)胞。20小時溫育后，G.xydansDSM17078從D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮分別生產(chǎn)出了145、212和1130mg/1的維生素C。相比之下，G.o;cj^浴DSM17078-STS24::Km分別生產(chǎn)出了1070、1470和3230mg/1的維生素C。在額外一項實驗中，用反應(yīng)混合物(含有0.3%NaC.l、l%CaC03)中的2%L-山梨糖酮與終濃度為OD6QQ=5的細(xì)胞一起溫育15小時。對上清液的分析顯示0;9YfoMDSM17078積累了1.4g/1的維生素C，G.xydansDSM17078-STS24::Km積累了6.6g/1的維生素C。還用反應(yīng)混合物(還含有0.3%NaCl、l%CaC03)中的2%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖以及終濃度為OD6QQ=5的細(xì)胞進(jìn)行了其它一些實驗(5ml反應(yīng)管中1ml反應(yīng)混合物)。20小時的溫育時間之后，G.raoxydasDSM17078從D-山梨糖醇和L-山梨糖分別生產(chǎn)出了0.44和0.36g/1的維生素C;G.xydansDSM17078-STS24::Km分別生產(chǎn)出了1.32禾口1.33g/1的維生素C。當(dāng)在10ml反應(yīng)管中，用1.5ml反應(yīng)混合物(具有上文所述的組成)中的5%D-山梨糖醇與終濃度為OD6Q()=5的細(xì)胞溫育20小時的情況下，G.o矽&似DSM17078生產(chǎn)出了0.18g/1的維生素C，GoxydansDSM17078-STS24::Km生產(chǎn)出了1.42g/1的維生素C。45小時的溫育后，同樣的反應(yīng)混合物中維生素C的濃度分別為0.72g/1和2.94g/l。實施例18同時誘變編碼SNDHai和STS24的基因?qū)е聫腄-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮對維生素C的生產(chǎn)被提高通過電轉(zhuǎn)化將pVK-P-SNDHai-T質(zhì)粒引入G.oxydansDSM17078和G.oxydansDSM17078-STS24::Km。在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03和18g/l瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27℃對G.oxydansDSM17078、G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T、G.oxydansDSM17078-STS24::Km和GoxydansDSM17078-STS24::Km/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸鎦水中，用于在30℃，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在溫育期結(jié)束時，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行分析。在含有70g/1L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03和18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27℃對G.oxydansDSM17078、G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T、oxydansDSM17078-STS24::Km和G.oxydansDSM17078-STS24::Km/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30℃，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。用細(xì)胞懸浮液制備一系列反應(yīng)體系(5ml反應(yīng)管中0.5ml反應(yīng)混合物)，其中用反應(yīng)混合物(還含有0.3﹪NaCl、1%CaC03)中的2%L-山梨糖與終濃度為OD600=5的細(xì)胞一起溫育。20小時的溫育時間之后，在上清液中測量到下述濃度的維生素C:<table><row><column>菌株</column><column>維生素C(mg/1)</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078</column><column>360</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T</column><column>760</column></row><table><table><row><column>G.oxydansDSM17078-STS24::Km</column><column>1330</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078-STS24::Km/pVK-P-SNDHai-T</column><column>2080</column></row><table>在使用從含7%D-山梨糖的no.3BD瓊脂平板上培養(yǎng)的細(xì)胞獲得的細(xì)胞上清液的另外一系列反應(yīng)中，用含有5%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖酮、0.3%NaCl和1%CaC03的反應(yīng)混合物與終濃度為OD6Q()=5的細(xì)胞進(jìn)行溫育(15ml反應(yīng)管中l(wèi)ml反應(yīng)混合物)。20小時的溫育時間之后，在上清液中測量到下述濃度的維生素C:<table><row><column>菌株</column><column>維生素C(mgZl)</column><column></column><column>從D-山梨糖醇</column><column>從L-山梨糖酮</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078</column><column>180</column><column>2050</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T</column><column>750</column><column>2890</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078-STS24::Km</column><column>1640</column><column>5210</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078-STS24::Km/pVK-P-SNDHai-T</column><column>2400</column><column>6770</column></row><table>實施例19制備染色體DNA以及通過PCR擴(kuò)增VCS01DNA片段在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)禾Q3g/1細(xì)菌蛋白胨(Difco)構(gòu)成的甘露糖醇培養(yǎng)基型(MB)液體培養(yǎng)基中，于30°C對G/GluconbacteroxydansDSM17078的細(xì)胞進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述的方法，從培養(yǎng)的細(xì)胞制備GluconbacteroxydansDSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物一一Pf(SEQIDNO:38)禾QPr(SEQIDNO:39)，通過PCR來制備DNA片段。按照廠商說明書，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)和10ng染色體DNA以100的總體積來進(jìn)行反應(yīng)，獲得了含有VCS01DNA序列(SEQIDNO:36)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗證了其正確序列。實施例20在G.oxydansDSM17078中打斷VCS01基因?qū)嵤├?9中獲得的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)五.co/Z載體pCR2.1-TOPO，并用于轉(zhuǎn)化E.coliTG1，以獲得攜帶有pCR2.1-VCS01的A^轉(zhuǎn)化子。然后，用連接酶將從pUC-4K(AmershamBioscience,編號X06404)分離的Kmr盒插入目標(biāo)基因的限制性位點之一，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTGl，以獲得攜帶有pCR2.1-VCSOl::Km的AprKmr轉(zhuǎn)化子。用選自載體部分的多克隆位點的兩種限制性酶消化從轉(zhuǎn)化子制備的pCR2.1-VCSOl::Km，以分離出含有VCSOl::Km的DNA片段。通過電轉(zhuǎn)化，用得到的DNA片段轉(zhuǎn)化G.oxydansDSM17078，得到基因打斷子——G.oxydansDSM17078-VCSOl::Km。實施例21使用在含有7%L-山梨糖的3BD瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的靜止細(xì)胞從D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C在含有70g/1L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/IMgS047H20、10g/1的CaC03和18g/1瓊脂(Difco)的No,3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27℃對G.oxydansDSM17078、G.oxydansDSM17078-VCSOl::Km的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30℃，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在溫育期結(jié)束時，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行分析。用2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或1%L-山梨糖酮來進(jìn)行第一系列的靜止細(xì)胞反應(yīng)(1.5ml反應(yīng)管中0.2ml反應(yīng)混合物)，所有反應(yīng)混合物都還含有0.3%NaCl、1%CaC03以及終濃度為600納米處10個吸光度單位(OD,)的細(xì)胞。20小時溫育后，G.oxydansDSM17078從D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮分別生產(chǎn)出了145、212和1130mg/1的維生素C。相比之下，oxydansDSM17078-VCSOl::Km分別生產(chǎn)出了1490、2220和2830mg/1的維生素C。在另一項反應(yīng)(5ml反應(yīng)管中的0.5ml反應(yīng)混合物)中，將靜止細(xì)胞懸浮于含有2%山梨糖酮、0.3%NaCl和1%CaC03的培養(yǎng)基中，達(dá)到OD600=5的終濃度。20小時的溫育后，G.oxydansDSM17078積累了1.1g/1的維生素C,G.oxydansDSM17078-VCSOl::Km積累了4.4g/1的維生素C。實施例22在液體培養(yǎng)物中從D-山梨糖醇生產(chǎn)維生素C在180rpm振蕩下，30。C時，在2升帶擋板搖瓶中的50mlNo.5培養(yǎng)基中，對G.oxj^a似DSM17078和G.oxj^fl^DSM17078-VCSOl::Km的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、15g/1酵母提取物(FlukaBiochemika，Buchs,Switzerland)、2.5g/1MgS047H20禾卩15g/1的CaC03。48小時后，測量兩份培養(yǎng)物的光密度OD6QQ，用獲得的值計算對每種菌株而言加入到含有50mlNo.5培養(yǎng)基的兩只另外的搖瓶(兩份重復(fù)實驗)中的接種體的體積，以獲得經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的對應(yīng)于OD6。。=0.12的第二次培養(yǎng)物中的接種體密度。在180rpm振蕩下，30°C時對搖瓶進(jìn)行溫育。96小時后，使用實施例2所述的HPLC方法，進(jìn)行取樣分析。雖然在來自G.DSM17078的兩份上清液中沒有探測到維生素C，但在來自G.oxW愿DSM17078-VCSOl::Km的兩份上清液中積累了大約220和320mg/l的維生素C(平均值為270mg/1)。實施例23同時誘變編碼SNDHai和VCS01的基因?qū)е聫腄-山梨糖醇對維生素C的生產(chǎn)被提高通過電轉(zhuǎn)化將pVK-P-SNDHai-T質(zhì)粒引入G.ow由mDSM17078和G.oxyAwsDSM17078-VCSOl::Km。在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03和18g/l瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27。C對G.oxj^a朋DSM17078、G.axj^/a朋DSM17078/pVK-P-SNDHai-T和G.ox少c/a似DSM17078-VCS01::Km/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30°C，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。用2。/。D-山梨糖醇，在還含有0.3。/。NaCl和1%CaC03與終濃度為OD600=5的細(xì)胞的反應(yīng)混合物中進(jìn)行一系列反應(yīng)84(5ml反應(yīng)管中0.5ml反應(yīng)混合物)。20小時的溫育時間之后，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行分析。在上清液中測量到下述濃度的維生素C:<table><row><column>菌株</column><column>維生素C(mg/1)</column></row><row><column></column><column>G.oxydansDSM17078</column><column>240</column></row><row><column></column><column>G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T</column><column>640</column></row><row><column></column><column>G.oxydansDSM17078-VCS01::Km/pVK-P-SNDHai-T</column><column>1100</column></row><table>實施例24同時誘變編碼SNDHai和VCS01的基因?qū)е略谝后w培養(yǎng)物中從D-山梨糖醇對維生素C的生產(chǎn)被提高在180rpm振蕩下，30℃時，在2升帶擋板搖瓶屮的50mlNo.5培養(yǎng)基中，對G.oxydansDSM17078、G.oxydansDSM17078-VCS01::Km和G.oxydnasDSM17078-VCSOl::Km/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、15g/1酵母提取物(FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland)、2.5g/1MgS047H20和15g/1的CaC03。48小時后，測量兩份培養(yǎng)物的光密度OD600。，用獲得的值計算對每種菌株而言加入到含有50mlNo.5培養(yǎng)基的兩只另外的搖瓶(兩份重復(fù)實驗)中的接種體的體積，以獲得經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的對應(yīng)于OD600=0.12的第二次培養(yǎng)物中的接種體密度。在180rpm振蕩下，30℃時對搖瓶進(jìn)行溫育。72小時和96小時后，按照上文所述的HPLC方法，進(jìn)行取樣分析。在上清液中測量到了下述濃度的維生素C:<table><row><column>菌株</column><column>維生素C(mg/1)</column></row><row><column></column><column></column><column>72小時</column><column>96小時</column></row><row><column></column><column>G.oxydansDSM17078</column><column>30</column><column>0</column></row><row><column></column><column>G.oxydansDSM17078-VCSOl::Km</column><column>60</column><column>80</column></row><row><column></column><column>G.oxydansDSM17078-VCS01::Km/pVK-P-SNDHai-T</column><column>180</column><column>260</column></row><table>實施例25制備染色體DNA以及通過PCR擴(kuò)增VCS08DNA片段在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)和3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)構(gòu)成的甘露糖醇培養(yǎng)基型(MB)液體培養(yǎng)基中，于30。C對GluconobacteroxydansDSM17078的細(xì)胞進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述的方法，從培養(yǎng)的細(xì)胞制備GluconobacteroxydansDSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物——Pf(SEQIDNO:42)和Pr(SEQIDNO:43)，通過PCR來制備DNA片段。按照廠商說明書，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)和10ng染色體DNA以100pi的總體積來進(jìn)行反應(yīng)，獲得了含有VCS08DNA序列(SEQIDNO:40)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗證了其正確序列。實施例26在G.oxydansDSM17078中打斷VCS08基因?qū)嵤├?5中獲得的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)E.coli載體pCR2.1-TOPO，并用于轉(zhuǎn)化E.coliTGl，以獲得攜帶有pCR2.1-VCS08的Apr轉(zhuǎn)化子。然后，用連接酶將從pUC-4K(AmershamBioscience,編號X06404)分離的Kmr盒插入目標(biāo)基因的限制性位點之一，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTGI，以獲得攜帶有pCR2.1-VCS08::Km的AprKmr轉(zhuǎn)化子。用選自載體部分的多克隆位點的兩種限制性酶消化從轉(zhuǎn)化子制備的pCR2.1-VCS08::Km，以分離出含有VCS08::Km的DNA片段。通過電轉(zhuǎn)化，用得到的DNA片段轉(zhuǎn)化G.oxydansDSM17078，得到基因打斷子——G.oxydansDSM17078-VCS08::Km。實施例27使用在3BD瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的靜止細(xì)胞從D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C在含有70g/1L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaCO3和18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27。C對G.oxydansDSM17078、G.oxydansDSM17078-VCS08::Km的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30°C，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在溫育期結(jié)束時，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行分析。在第一項實驗中，用反應(yīng)混合物(含有0.3。/。NaCl、1%CaC03)中的2%L-山梨糖酮與終濃度為OD6(X)=5的細(xì)胞一起溫育15小時。對上清液的分析顯示G.atj;Az朋DSM17078積累了1.4g/1的維生素C，G.DSM17078-VCS08::Km積累了4.6g/l的維生素C。還用反應(yīng)混合物(還含有0.3%NaCl、l%CaC03)中的2。/。D-山梨糖醇或2%L-山梨糖以及終濃度為0D6。。=5的細(xì)胞進(jìn)行了其它一些實驗(5ml反應(yīng)管中1.0ml反應(yīng)混合物)。20小時的溫育時間之后，G.my^/wDSM17078從D-山梨糖醇和L-山梨糖分別生產(chǎn)出了0.44和0.36g/1的維生素C;(xj^應(yīng)DSM17078-VCS08::Km分別生產(chǎn)出了1.39和1.05g/1的維生素C。當(dāng)在10ml反應(yīng)管中，用1.5ml反應(yīng)混合物(具有上文所述的組成)中的5%D-山梨糖醇與終濃度為0D6。Q=5的細(xì)胞溫育20小時的情況下，G.a矽c/a朋DSM17078生產(chǎn)出了0.18g/1的維生素C，G.axyt/a/wDSM17078-VCS08::Km生產(chǎn)出了1.42g/1的維生素C。45小時的溫育后，同樣的反應(yīng)混合物中維生素C的濃度分別為0.65g/1和1.74g/l。實施例28同時誘變編碼SNDHai禾PVCS08的基因?qū)е聫腄-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮對維生素C的生產(chǎn)被提高通過電轉(zhuǎn)化將pVK-P-SNDHai-T質(zhì)粒引入G.oxy^mDSM17078和G.axjYto,wDSM17078-VCS08::Km。在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03和18g/l瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C對G.ox^fl"sDSM17078、G.ox.yJaraDSM17078/pVK-P-SNDHai-T、G.o:cj^a,wDSM17078-VCS08::Km和G.oxydans似DSM17078-VCS08::Km/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30°C，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在反應(yīng)混合物(還含有0.3%NaCl、1%CaC03)中的2%L-山梨糖中進(jìn)行一系列反應(yīng)(5ml反應(yīng)管中0.5ml反應(yīng)混合物)，其中與終濃度為OD6Q()=5的細(xì)胞一起溫育。20小時的溫育期末尾，按照實施例2所述的方法，通過高效液相色譜對反應(yīng)混合物進(jìn)行分析。在上清液中測量到了下述濃度的維生素C:菌株維生素C(mg/1)G.oxydansDSM17078360G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T760G.oxydansDSM17078-VCS08::Km1050G.oxycfawDSM17078-VCS08::Km/pVK-P-SNDHai-T2440在另外一系列反應(yīng)(15ml反應(yīng)管中l(wèi)ml反應(yīng)混合物)屮，用含有5%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖酮的反應(yīng)混合物(還含有0.3%NaCl和1%CaC03)與終濃度為OD6。Q=5的細(xì)胞進(jìn)行溫育。20小時的溫育時間之后，在上清液中測量到下述濃度的維生素C:<table>complextableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>實施例29制備染色體DNA以及通過PCR擴(kuò)增SMS05DNA片段在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)禾B3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)構(gòu)成的甘露糖醇培養(yǎng)基型(MB)液體培養(yǎng)基中，于30°C對GluconobacteroxydansDSM17078的細(xì)胞進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述的方法，從培養(yǎng)的細(xì)胞制備GluconobacteroxydansDSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物一一Pf(SEQIDNO:46)禾BPr(SEQIDNO:47)，通過PCR來制備DNA片段。按照廠商說明書，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)和10ng染色體DNA以100μl的總體積來進(jìn)行反應(yīng)，獲得了含有SMS05DNA序列(SEQIDNO:44)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗證了其正確序列。實施例30在G.oxydansDSM17078中打斷SMS05基因?qū)嵤├?9中獲得的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)E.coli載體pCR2.1-TOPO，并用于轉(zhuǎn)化E.coliTGl，以獲得攜帶有pCR2.1-SMS05的Apr轉(zhuǎn)化子。然后對pCR2.1-SMS05進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)(i)用引物組Psms5No(SEqIDNO:78)和Psms5Ni(SEQIDNO:79)進(jìn)行PCR1，得到片段SMS5No-Ni，以及(ii)用引物組Psms5Ni(SEQIDNO:76)和Psms5Co(SEQIDNO:77)進(jìn)行PCR2。使用引物組Psms5No和Psms5Co，用得到的兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行第三次PCR反應(yīng)——PCR3，產(chǎn)生SMS5dNo-Co。然后，用PstI和怖HindIII消化片段，與經(jīng)Pstl和HindIII消化過的pK19mobsacB(A.Piihleretal.Gene145,69-73，1994)連接，用于轉(zhuǎn)化E.coliTG，以獲得攜帶有pK19mobsacB-dSMS05的Kmr菌落。通過電轉(zhuǎn)化，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化G.oxydansDSM17078。在MB+Km50μg/ml(MK)平板上用l個Kmr菌落劃線，然后再MK和MB+庶糖10%(MSuc)平板上檢査Km抗性和蔗糖敏感性，分別驗證Kmr和蔗糖s。然后，再在MB瓊脂平板上培養(yǎng)一個Kmr和蔗糖s菌落，刮下得到的培養(yǎng)細(xì)胞，適當(dāng)稀釋，涂布到MB瓊脂上。在MB、MK和MSuc瓊脂平板上，用得到的100個菌落進(jìn)行劃線，以分離KmS蔗糖r菌落。得到的菌株之一被命名為G.oxydansDSM17078-dSMS05。實施例31使用在含有7％L-山梨糖的3BD瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的靜止細(xì)胞從D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C在含有70g/1L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC。3和18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27℃對G.oxydansDSM17078、G.oxydansDSM17078-dSMS05的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30℃，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在溫育期結(jié)束時，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行分析。用2%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖來進(jìn)行一系列靜止細(xì)胞反應(yīng)(5ml反應(yīng)管中0.5ml反應(yīng)混合物)，所有反應(yīng)混合物都還含有0.3%NaCl、1%CaC03以及終濃度為600納米處5個吸光度單位(OD6Q。)的細(xì)胞。20小時溫育后，G.ax_WmwDSM17078從2%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖分別生產(chǎn)出了270mg/1或670mg/1的維生素C。相比之下，菌株G.o;cj^fl似DSM17078-dSMS05分別生產(chǎn)出了1540mg/1和1990mg/1的維生素C。實施例32同時誘變編碼SNDHai和SMS05的基因?qū)е聫腖-山梨糖酮對維生素C的生產(chǎn)被提高通過電轉(zhuǎn)化將pVK-P-SNDHai-T質(zhì)粒引入G.ox,v&似DSM17078-dSMS05。在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、7.5g/1酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03禾B18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27℃對G.oxydansDSM17078-dSMS05和G.oxydansDSM17078-dSMS05/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30℃，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在反應(yīng)混合物(還含有0.3%NaCl和1%CaC03)中的2%L-山梨糖酮進(jìn)行一系列反應(yīng)(5ml反應(yīng)管中0.5ml反應(yīng)混合物)，其中與終濃度為006。0=5的細(xì)胞一起溫育。5小時、20小時和30小時的溫育時間之后，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來進(jìn)行取樣分析。在上清液中測量到下述濃度的維生素C:<table>complextableseeoriginaltableonpage90</column></row><table><table><row><column>G.oxydansDSM17078230</column><column>1100</column><column>1300</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078-dSMS05580</column><column>1800</column><column>3100</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078-dSMS05/pVK-P-SNDHai-T2800</column><column>6100</column><column>6800</column></row><table>實施例33同時誘變編碼SNDHai和SMS05的基因?qū)е略谝后w培養(yǎng)物中從D-山梨糖醇對維生素C的生產(chǎn)被提高在180rpm振蕩下，30。C時，在2升帶擋板搖瓶中的50mlNo.5培養(yǎng)基中，對G.oxydansDSM17078、G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T、G.DSM17078-dSMS05禾GG.oxydansDSM17078-dSMS05/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/1D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(FlukaBiochemika,Buchs，Switzerland)、2.5g/1MgS047H20和15g/1的CaC03。48小時后，測量兩份培養(yǎng)物的光密度OD6()()，用獲得的值計算對每種菌株而言加入到含有50mlNo.5培養(yǎng)基的兩只另外的搖瓶(兩份重復(fù)實驗)中的接種體的體積，以獲得經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的對應(yīng)于OD,=0.12的第二次培養(yǎng)物中的接種體密度。在180rpm振蕩下，30°C時對搖瓶進(jìn)行溫育。48小時和96小時后，按照上文所述的HPLC方法，進(jìn)行取樣分析。在上清液中測量到了下述濃度的維生素C:<table><row><column>菌株</column><column>維生素C(mg/1)</column></row><row><column>---</column><column>48小時</column><column>96小時</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078</column><column>60</column><column>0</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078/pVK-P-SNDHai-T</column><column>120</column><column>0</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078-SMS05::Km</column><column>260</column><column>350</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078-SMS05::Km/pVK-P-SNDHai-T</column><column>320</column><column>630</column></row><table>實施例34使用整合系統(tǒng)在G.oxydansDSM17078中過量表達(dá)STS01為過量表達(dá)STS01基因，可用強(qiáng)組成型的經(jīng)修飾Psndh啟動子(SEQIDNO:204)替換STS01的基因。為達(dá)到此目的，通過長側(cè)翼同源性(LFH)-PCR來構(gòu)建由STS01基因的500bp的上游區(qū)域、卡納霉素抗性盒、與經(jīng)修飾的核糖體結(jié)合位點融合的P^h啟動子以及STS01基因的最開始500bp構(gòu)成的DNA片段。為構(gòu)建該DNA片段，首先使用GC-richPCR試劑盒(RocheMolecularBiochemicals)通過PCR擴(kuò)增出各個單獨的部分。使用引物對STS01US+1(SEQIDNO:205)禾卩KmSTS01US-1(SEQIDNO:206)(在5'末端含有互補(bǔ)性的卡納霉素抗性盒重疊序列)，擴(kuò)增出STS01DNA上游區(qū)域。使用引物對KmPsndh+l(SEQIDNO:207)(在5'末端含有互補(bǔ)性的卡納霉素抗性盒重疊序列)和STSOlPsndh-1(SEQIDNO:208)(在5'末端含有互補(bǔ)性的STS01DNA重疊序列)，擴(kuò)增出Psndh啟動子片段。使用引物對PsndhSTS01+1(SEQIDNO:209)(在5'末端含有互補(bǔ)性的Psndh啟動子重疊序列)和STS01-1(SEQIDNO:210)，擴(kuò)增出STS01基因的最開始500個bp。在這些情況下，都用G.my&wDSM17078基因組DNA作為模板。使用質(zhì)粒pUC4K(AmershamBioscience，編號X06404)作為模板，用引物對Km十l(SEQIDNO:211)和Km-1(SEQIDNO:212)，擴(kuò)增出卡納霉素抗性盒。PCR條件由35個循環(huán)的94°C變性30秒、50°C退火30秒和72。C延伸1分鐘組成。對各條PCR片段進(jìn)行凝膠純化、混合，用引物對STS01US+1/STS01-1再次擴(kuò)增，擴(kuò)增出全長產(chǎn)物，由此將Psndh啟動子插入到STS01基因的上游。用于第二輪反應(yīng)的PCR反應(yīng)條件是這樣的94。C2分鐘，然后10個循環(huán)的[94。C30秒，63。C30秒，68。C6分鐘]，接著是20個循環(huán)的[94。C30秒，63。C30秒，68°C6分鐘以及每個循環(huán)額外的20秒]以及在68。C最后延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)G.DSM17078細(xì)胞，在含有終濃度為50ug/ml的卡納霉素的甘露糖醇培養(yǎng)基型瓊脂培養(yǎng)基上對轉(zhuǎn)化子加以選擇。可觀察到若干個可能的轉(zhuǎn)化子，再使用引物對STS01US+1/STS01-1通過PCR對其中一些進(jìn)行分析，以驗證DNA序列已通過雙交叉插入基因組。顯示出正確PCR產(chǎn)物大小的菌株的PCR產(chǎn)物被用于測序。具有正確序列的菌株被命名為G.oxydansDSM17078-STS01upl以及G.oxydansDSM17078-STS01up2。實施例35同時誘變編碼SNDHai和STS01的基因?qū)е聫腄-山梨糖醇對維生素C的生產(chǎn)被提高通過電轉(zhuǎn)化將pVK-P-SNDHai-T質(zhì)粒引入G.ox_yc/a"sDSM17078和G.oxj^a似DSM17078-STS01upl。在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03禾口18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C對G.oxj^msDSM17078/pVK-P-SNDHai-T禾PG.oxj^mwDSM17078-STS01upl/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30°C，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在反應(yīng)混合物(還含有0.3。/。NaCl和1%CaC03)中的2%L-山梨糖醇進(jìn)行一系列反應(yīng)(5ml反應(yīng)管中0.5ml反應(yīng)混合物)，其中與終濃度為OD6QQ=5的細(xì)胞一起溫育。24小時的溫育時間之后，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來進(jìn)行取樣分用G.xydansDSM17078-STS01upl/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞溫育的反應(yīng)混合物上清液含有的維生素C比用G.oxj^a似DSM17078/pVK-P-SNDHai-T溫育的反應(yīng)混合物上清液要多至少20%。實施例36使用整合系統(tǒng)在G.oxydansDSM17078中過量表達(dá)RCS21為過量表達(dá)RCS21基因，可用強(qiáng)組成型的經(jīng)修飾Ps涵啟動子(SEQIDNO:204)替換RCS21的基因。為達(dá)到此目的，通過長側(cè)翼同源性(LFH)-PCR來構(gòu)建由RCS21基因的500bp的上游區(qū)域、卡納霉素抗性盒、與經(jīng)修飾的核糖體結(jié)合位點融合的Psndh啟動子以及RCS21基因的最開始500bp構(gòu)成的DNA片段。為構(gòu)建該DNA片段，首先使用GC-richPCR試劑盒(RocheMolecularBiochemicals)通過PCR擴(kuò)增出各個單獨的部分。使用引物對RCS21US+1(SEQIDNO:213)禾卩KmRCS21US-1(SEQIDNO:214)(在5，末端含有互補(bǔ)性的卡納霉素抗性盒重疊序列)，擴(kuò)增出RCS21DNA上游區(qū)域。使用引物對KmPsndh+l(SEQIDNO:207)(在5'末端含有互補(bǔ)性的卡納霉素抗性盒重疊序列)和RCS21Psndh-l(SEQIDNO:217)(在5'末端含有互補(bǔ)性的RCS21DNA重疊序列)，擴(kuò)增出P』h啟動子片段。使用引物對PsndhRCS21+1(SEQIDNO:215)(在5'末端含有互補(bǔ)性的Psndh啟動子重疊序列)和RCS21-1(SEQIDNO:216)，擴(kuò)增出RCS21基因的最開始500個bp。在這些情況下，都用orj^朋DSM17078基因組DNA作為模板。使用質(zhì)粒pUC4K(AmershamBioscience，編號X06404)作為模板，用引物對Km+1(SEQIDNO:211)禾QKm-1(SEQIDNO:212)，擴(kuò)增出卡納霉素抗性盒。PCR條件由35個循環(huán)的94°C變性30秒、50°C退火30秒和72。C延伸1分鐘組成。對各條PCR片段進(jìn)行凝膠純化、混合，用引物對RCS21US+1/RCS21-1再次擴(kuò)增，擴(kuò)增出全長產(chǎn)物，由此將Psndh啟動子插入到RCS21基因的上游。用于第二輪反應(yīng)的PCR反應(yīng)條件是這樣的94。C2分鐘，然后10個循環(huán)的[94。C30秒，63。C30秒，68。C6分鐘]，接著是20個循環(huán)的[94。C30秒，63。C30秒，68°C6分鐘以及每個循環(huán)額外的20秒;i以及在68。C最后延伸IO分鐘。將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)G.orj^"raDSM17078細(xì)胞，在含有終濃度為50將/ml的卡納霉素的甘露糖醇培養(yǎng)基型瓊脂培養(yǎng)基上對轉(zhuǎn)化子加以選擇?？捎^察到若干個可能的轉(zhuǎn)化子，再使用引物對RCS21US+1/RCS21-1通過PCR對其中一些進(jìn)行分析，以驗證DNA序列己通過雙交叉插入基因組。顯示出正確PCR產(chǎn)物大小的菌株的PCR產(chǎn)物被用于測序。具有正確序列的菌株被命名為G.ox3^/a似DSM17078-RCS21upl以及G.axj^朋sDSM17078-RCS21up2。實施例37同時誘變編碼SNDHai和RCS21的基因?qū)е聫腄-山梨糖醇對維生素C的生產(chǎn)被提高通過電轉(zhuǎn)化將pVK-P-SNDHai-T質(zhì)粒引入G.ox)W"似DSM17078和G.—DSM17078-RCS21upl。在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/1的CaC03禾口18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C對orj^zwDSM17078/pVK-P-SNDHai-T禾。G.ox;;c/a似DSM17078-RCS21upl/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30°C，220rpm振蕩下進(jìn)行的靜止細(xì)胞反應(yīng)。在反應(yīng)混合物(還含有0.3y。NaCl和1%CaC03)中的2%L-山梨糖醇進(jìn)行一系列反應(yīng)(5ml反應(yīng)管中0.5ml反應(yīng)混合物)，其中與終濃度為OD,=5的細(xì)胞一起溫育。24小時的溫育時間之后，按照實施例2所述，通過高效液相色譜(HPLC)來進(jìn)行取樣分用G.oxdans似DSM17078-RCS21upl/pVK-P-SNDHai-T的細(xì)胞溫育的反應(yīng)混合物上清液含有的維生素C比用G.o"t/a朋DSM17078/pVK-P-SNDHai-T溫育的反應(yīng)混合物上清液要多至少20%。實施例38純化SNDHai將通過補(bǔ)料分批發(fā)酵(關(guān)于培養(yǎng)，見實施例3)能生產(chǎn)SNDHm的微生物懸浮于25ml磷酸緩沖液(20mM，pH7.0)中，所述緩沖液中含有2mM的MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)禾n2—3片不含EDTA的蛋"酶抑制劑藥片(RocheDiagnosticsGmbH)。用FrenchPressureCell對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行三次處理。隨后，加入25ml磷酸緩沖液(20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl2、lMNaCl)，對懸浮液進(jìn)行超離心(30000rpm，60分鐘，4°C)。用磷酸緩沖液(20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl2、500mMNaCl)對含有膜部分的沉淀進(jìn)行洗滌，然后將其懸浮于適當(dāng)量的磷酸緩沖液(20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl2)中。然后加入N-辛基葡糖苷(Fluka)，至終濃度為2%(w/v)，在冰上輕微攪拌下將懸浮液培養(yǎng)90分鐘。離心(20000rpm，60分鐘，4°C)后，收集澄清的、略帶紅色的上清液，加入終濃度為15%(w/v)的聚乙二醇6000(Fluka)。在4。C輕微振蕩下培養(yǎng)60分鐘后，接著進(jìn)行離心(10000rpm，30分鐘，4°C)，將沉淀溶解于Tris-HCl緩沖液(20mM，pH7.6，含有2mM的MgCl2和0.5X(w/v)月桂基磺基甜菜堿(Fluka))中。在4。C輕微振蕩下過夜后，對溶液進(jìn)行離心(20000rpm，30分鐘，4°C)。收集上清液，按照下述方法對其進(jìn)行進(jìn)一歩純化。下述純化步驟進(jìn)行于4。C，其在AKTAExplorer10S-系統(tǒng)(AmershamBiosciences)上進(jìn)行，其中使用軟件UNICORN3.1。用于離子交換色譜的典型流速在1-2ml/分鐘的范圍內(nèi)。在280mn處對蛋白質(zhì)洗脫進(jìn)行監(jiān)測，用標(biāo)準(zhǔn)的光度檢測，在純化的所有階段(見下文)對SNDHai活性部分進(jìn)行測定，或?qū)兓糠诌M(jìn)行產(chǎn)物檢測。用20mMTris-HCl緩沖液(pH7.6，含有2mM的MgCl2和0.5%(w/v)月桂基磺基甜菜堿)，在SephadexG25-凝膠過濾柱(空體積2.5ml)上，對澄清的上清液IV進(jìn)行脫鹽，所述上清液以2.5ml為一份。收集SNDHai陽性部分，將其中一份(大約10ml)置于強(qiáng)陰離子交換柱(例如，Mono-QHR,AmershamBiosciences,柱體積:8ml)上，所述柱在使用之前己用緩沖液Al(10mMTris、10mMBisTris、10mMMES、2mMMgCl2、0.5%月桂基磺基甜菜堿，pH7.6)平衡過。用100%的緩沖液Al來洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)，四份柱體積之后，應(yīng)用在6份柱體積內(nèi)至100%緩沖液Bl(Tris，10mM;BisTris，10mM;MES，10mM;MgCl2，2mM和月桂基磺基甜菜堿，0.5%，pH4.7)的線性pH梯度，接著是8份柱體積的100%緩沖液Bl。在大約6.5的pH值(其非常接近于從氨基酸序列計算出的6.52的pl值)洗脫出了SNDH"。收集活性部分，用等量的HEPES-緩沖液(50mM，pH8.0，其中含有2mMMgCl2和0.5%月桂基磺基甜菜堿，終體積為15-20ml)進(jìn)行稀釋，將其用于另一強(qiáng)陰離子交換柱(例如，Mono-QHR，AmershamBiosciences,柱體積1ml)，其已經(jīng)過了緩沖液A2(15mMHEPES，2mMMgCl2，0.5%月桂基磺基甜菜堿，pH7.6)的平衡。用100%的緩沖液A2來洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)，四份柱體積之后，應(yīng)用在20份柱體積內(nèi)至40X緩沖液B2(HEPES，15mM;MgCl2，2mM;LiCl，1M和月桂基磺基甜菜堿，0.5%，pH7.6)的線性鹽梯度，接著是至100%緩沖液B2的梯度。SNDHai在大約150mMLiCl處洗脫出。活性部分在SDS凝膠電泳上顯示為大約85kDa的單條帶。實施例39用于SNDHai的光度檢測用于對SNDHai活性進(jìn)行光度測量的反應(yīng)混合物由0.196mM氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、0.137mM吩嗪硫酸甲酯(PMS)、20.4mML-山梨糖酮和處于終體積為1.0ml的0.1M的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的酶溶液構(gòu)成。所述反應(yīng)從加入酶開始，在具有l(wèi)-cm光路的小管中，于570nm處，對作為NBT還原速率的酶活性進(jìn)行測量(T=25°C)。酶活性的一個單位被定義為每分鐘催化1/zMNBT還原的酶的量。pH7.5處NBT的的消光系數(shù)被取為lOOmM—'cm—'。兩種參照小管被用于活性測定其中一種含有除了L-山梨糖酮之外的上述成分，另一種含有除了酶溶液之外的所有成分。實施例40用于SNDHai的產(chǎn)物檢測用下述組合物(0.5ml的總體積)的檢測，針對從L-山梨糖酮對L-抗壞血酸的生產(chǎn)，直接對含有純的SNDHai的部分(見上)進(jìn)行分析，所述組合物包括0.14mg/ml的純化并脫鹽的SNDHai、50mM磷酸緩沖液(pH6.5)、8mg/ml牛血清清蛋白(BSA)、lOOmML-山梨糖酮、1mMPMS、5mMCaCl2、50PQQ-K2。檢測于25°C，充分振蕩下(臺上振蕩器上，900rpm)，沒有光的情況下，在合適的反應(yīng)試管中進(jìn)行。用具有與Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad,Reinach，Switzerland)相連的LiChrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck,Darmstadt,Germany)的Agilent1100HPLC系纟充(AgilentTechnologies,Wilmington,USA)，通過高效液相色譜(HPLC)對樣品進(jìn)行分析。流動相為0.004M硫酸，流速為0.6ml/分鐘。用UV探測器(波長254nm)組合折射率探測器來記錄兩種信號。此外，用氨基柱(YMC-PackPolyamine-II，YMC，Inc.,Kyoto,Japan)和254nm處的UV探測來進(jìn)行對L-抗壞血酸的鑒定。流動相為50mMNH4H2PO4和乙腈(40:60)。實施例41SMS、STS、RCS和VCS基因和等同物在其它生物中的存在可通過簡單的DNA雜交實驗來測定其它生物(而非本文前面公開的那些)中SMS、STS、RCS和VCS禾口/或展示出與這些序列的相似性/相同性的等同物的存在?；蚪MDNA提取自例如屬于Gluconobacter、Acetobacter,Pseudomonas,Paracoccus,Rhodopseudomonas,PantoeaEscherichia、5accAaramj;ces1、Aspergillus或鼠類的生物，特別是表B和C中提到的生物。在含有5g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/1葡萄糖、5g/1甘露糖醇、1g/1MgS04'7H20、5ml/1乙醇和15g/1瓊脂的No.350培養(yǎng)基上，于27°C，對菌株Jceto6acter"ce"swZw/.義少//"謂IFO13693和IFO13773進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在含有25g/1甘露糖醇、5g/1酵母提取物(Difco)、3g/1細(xì)菌蛋白胨(Difco)禾P18g/1瓊脂(Difco)的甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)型瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C，對所有其它^ceto^cfer、G7wcowflceto6fl"er菌*朱禾口所有G/wcowoZ^cter菌牛朱進(jìn)行3天白勺培養(yǎng)。在LuriaBroth瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)Eco//K-12。在廠商推薦的培養(yǎng)基上或者按照本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)其它菌株。按照例如Sambrooketal,1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述，從合適的生物(例如表B和C中提到的)提取基因組DNA。用限制性酶(例如EcoRI或HIND/III)消化基因組DNA制備物，通過瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖)分離出1的DNA片段。用0.25NHC1對凝膠進(jìn)行15分鐘的處理，接著再用0.5NNaOH處理30分鐘，然后按照廠商說明書，用VacuumBlotterModel785(BIO-RADLaboratoriesAG,Switzerland)將凝膠印到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用得到的印跡與含有SMS、STS、RCS或VCSDNA探針的溶液接觸或雜交，探針是用PCR-DIG標(biāo)記試劑盒(RocheDiagnostics)以及針對每種基因的特定引物組(如表A所公開的)來制備的。此印跡雜交結(jié)果分別示于表B和表C中。表A:引物對的SEQIDNOVCS0138/39STS18106/107RCS02154/155VCS0254/55STS21110/111RCS03158/159VCS0358/59STS22114/115RCS04162/163VCS0462/63STS23118/119RCS05166/167VCS0566/67STS2434/34RCS06170/171VCS0670/71STS25122/123RCS07174/175VCS0774/75SMS02126/127RCS08178/179VCS0842/43SMS03130/131RCS21182/183STS0182/83SMS04134/135RCS22186/187STS0686/87SMS0546/47RCS23190/191STS07卯/91SMS12138/139RCS24194/195STS1594/95SMS13142/143RCS25198/199STS1698/99SMS14146/147RCS27202Z203STS17102/103SMS01150/151RCS2850/51雜交可在嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。此類條件的一個優(yōu)選的非限制性的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨后在1xSSC、0.1%SDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗滌優(yōu)選在55。C下，更優(yōu)選在60。C下，進(jìn)一歩優(yōu)選在65。C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如在含或不含100yg/ml的鮭魚精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，或包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二烷基磺酸鈉、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，于42。C溫育2小時至4天，接著在2xSSC和0.1%SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68。C，于0.5xSSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。為檢測出與探針DNA具有較低相同性的DNA片段，最后的洗滌歩驟可在較低溫度(例如50-65。C)進(jìn)行較短的洗滌時間(例如1-15分鐘)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的PCR方法，對表B或C所示各生物中陽性信號對應(yīng)的基因加以克隆，這使用此生物的基因組DNA與合適的引物組(例如，對STS01而言，SEQIDNO:82和SEQIDNO:83)在下述條件下進(jìn)行每個反應(yīng)使用5至100ng基因組DNA(總體積50/xl)。可用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics)，采用下述反應(yīng)條件94°C2分鐘；30個循環(huán)的(i)94°C15秒的變性步驟，(ii)60°C30秒的退火歩驟，(iii)72°C0.5至5分鐘(取決于目標(biāo)DNA長度，1分鐘/1kb)的合成歩驟；72°C延伸7分鐘?；蛘?，可以用簡并引物來進(jìn)行PCR，對簡并引物的設(shè)計可基于本文公開的相應(yīng)SMS、STS、RCS或VCS蛋白的氨基酸序列(例如，對STS01而言是SEQIDNO:81)或基于作為共有序列的氨基酸序列(通過對由序列搜索程序(例如BLASTP，或當(dāng)核苷酸序列被用作"查詢序列"時，BLASTX)獲得的若干氨基酸序列進(jìn)行比對選出的)，以找到與特定蛋白序列相似的蛋白。對使用簡并引物進(jìn)行的PCR而言，第二個退火步驟的溫度(見上文)可被降低至55°C，或者甚至50-45°C。此實驗的結(jié)果分別如表B和C的第2和3欄所示。通過瓊脂糖凝膠電泳來分離PCR反應(yīng)的樣品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照器(transilluminator)來觀察條帶，從凝膠對條帶進(jìn)行分離，驗證正確的序列。上文提到的共有序列可以是屬于若干蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域/家族數(shù)據(jù)庫的某些類的氨基酸序列，所述數(shù)據(jù)庫例如PROSITE(蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫)、COGs(直向同源體組的簇)、CDD(保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫)、pfam(多重序列比對和隱Markov模型的大集合，覆蓋很多常見的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和家族)。一旦可從含有此類數(shù)據(jù)庫的結(jié)構(gòu)域或家族的蛋白中選出與本發(fā)明的蛋白具有相同/相近功能的某些蛋白，即可使用蛋白序列或其核苷酸序列(當(dāng)可從公眾數(shù)據(jù)庫獲得時)通過PCR來擴(kuò)增編碼該蛋白的對應(yīng)DNA。在其它生物中打斷基因和等同物，用于生產(chǎn)維生素C為在合適的微生物(能從給定碳源直接生產(chǎn)維生素C)中提高維生素c的生產(chǎn)，可按照實施例25-28和29-33，破壞選定的基因(例如STS06)和等同物(例如，按照上文段落所述獲得的PCR產(chǎn)物)，以產(chǎn)生攜帶等同物基因::Km的敲除突變體。用于產(chǎn)生此類敲除突變體的合適的宿主細(xì)胞可選自，例如，表B列出的G/wconWflcter菌株，特別是G.oxj^fo朋IF03293、G.oxy&"5IF03292、G.oxjy/wwIFOATCC621H、G.oxj^fo"sIFO12528、G*.oxj^msIFO3291、G.oxj^/a/isIFO3255、G.ox少i/a朋IFO3244、G.cm.服sIF03266、G./rate鵬7IFO3260、G.axj^msIFO3287、ylceto6flc欣flcWsw65/.or/e朋wsIFO3259、y4cetofoaCerace"'s1/fo7.x_y//"wwIFO13693、Jceto6acteracedswZw/.j9;/^2m附IFO13773禾口JcetoZ^cterATCC15164?？梢园凑障挛乃鰜懋a(chǎn)生敲除突變體將按照上文所述獲得的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)Eco//載體pCR2.1-TOPO，并用于轉(zhuǎn)化co//TG1，以獲得攜帶pCR2.1-基因X的Apr轉(zhuǎn)化子。然后，用連接酶將從pUC-4K(AmershamBioscience,編號X06404)分離的Kmr盒插入目標(biāo)基因的限制性位點之一，用得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Eco//TG1，以獲得攜帶pCR2.1-基因X::Km的AprKmr轉(zhuǎn)化子。用選自載體部分的多克隆位點的兩種限制性酶消化從轉(zhuǎn)化子制備的pCR2.1-基因X::Km質(zhì)粒，以分離出含有基因X::Km的DNA片段。通過電穿孔用得到的DNA片段轉(zhuǎn)化攜帶有所述等同物基因的宿主菌株，以獲得基因打斷子(disruptant)。可產(chǎn)生進(jìn)一步的修飾，包括對所述菌株中的SNDHai以及涉及將D-山梨糖醇、L-山梨糖和/或L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為維生素C的基因進(jìn)行的修飾，以根據(jù)本發(fā)明提高此類菌株的維生素C產(chǎn)量。在用1%L-山梨糖酮作為底物的靜止細(xì)胞反應(yīng)中，突變體菌株生產(chǎn)的維生素C可比野生型菌株多至少20%。使用可被上調(diào)的基因的等同物來生產(chǎn)維生素C可根據(jù)實施例34-37或者根據(jù)用RCS21示例的下述流程，將按上文所述獲得的PCR產(chǎn)物用于SNDHai過量表達(dá)系統(tǒng)。這一流程也適用于RCS、SMS和STS基因的突變體。為在合適的微生物(能從給定碳源直接生產(chǎn)維生素C)中提高維生素C的生產(chǎn)，可在本文描述的過量表達(dá)系統(tǒng)中使用RCS21基因和等同物(例如，前述段落中獲得的PCR產(chǎn)物，其在本文中被稱為基因X)，或者可將上述RCS21基因和等同物克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，并用于轉(zhuǎn)化五.co//TG1，以獲得攜帶pCR2.1-TOPO-基因X的Apr轉(zhuǎn)化子，即攜帶PCR產(chǎn)物的Apr轉(zhuǎn)化子。用引物組——PfNdeI[SEQIDNO:182，但在5'末端具有CCCAT]禾QPrHindIII[SEQIDNO:183，但在5'末端具有CCAAGCTT]通過PCR來擴(kuò)增該插入物。用MM和消化得到的PCR產(chǎn)物，將片段與用ATzoI和MM消化過的PcrtE-SD(Shine-Dalgamo)片段(WO02/099095)一起插入進(jìn)pVKlOO(ATCC37156)的lol禾B//f"JI11位點之間。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.TGI，以獲得攜帶有質(zhì)粒pVK-PcrtE-SD-基因X的Tc'—轉(zhuǎn)化子，然后再通過電轉(zhuǎn)化用其轉(zhuǎn)化合適的宿主(例如G.oxy&MDSM17078)，獲得，例如，TcrG.oxy&raDSM17078/pVK-PcrtE-SD-基因X?？砂凑毡疚那拔乃?，用SNDHai額外轉(zhuǎn)化使fO重組細(xì)胞(例如G.ax;Wfl^菌株DSM17078)和相應(yīng)的野生型菌株對維生素C的生產(chǎn)?？僧a(chǎn)生進(jìn)一步的修飾，包括對所述菌株中的SNDHai以及涉及將D-山梨糖醇、L-山梨糖和/或L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為維生素C的基因進(jìn)行的修飾，以根據(jù)本發(fā)明提高此類菌株的維生素C產(chǎn)量。在用1%L-山梨糖酮作為底物的靜止細(xì)胞反應(yīng)中，重組細(xì)胞生產(chǎn)的維生素C可比野生型菌株多至少200/0。對下表B和C而言信號1:在使用不同菌株的基因組DNA在印跡雜交試驗中對DNA的探測。信號2:使用引物對在PCR反應(yīng)中對不同菌株DNA的探測。信號3:使用簡并引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)中對不同菌株DNA的探測。表B:其它生物中STS06基因的等同物<table><row><column>菌株</column><column>信號1</column><column>信號2</column><column>信號3</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3293</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3292</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansATCC621H</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO12528</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansG624</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansT-100</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3291</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3255</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansATCC9937</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3244</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.cerinusIFO3266</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.frateuriiIFO3260</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3287</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>Acetobacteracerisubsp.orleanusIFO3259</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>Acetobacteracerisubsp.xylinumIFO13693</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>Acetobacteracerisubsp.xylinumIFO13773</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>Acetobactersp.ATCC15164</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.thailandicusNBRC100600</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobacterliquefaciensATCC14835</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobacterpolyoxogenesNBI1028</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobacterdiazotrophicusATCC49037</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobactereuropaeusDSM6160</column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>Acetobacteraceti1023</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>AcetobacterpasteurianusNCI1193</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>PseudomonasputidaATCC21812</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>PseudomonasputidaPAOl</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>PseudomonasaeruginosaDSM50106</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>PseudomonassyringaeB728a</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>ParacoccusdenitrificansstrainPdl222</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>RhodopseudomonaspalustrisCGA009</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>E.coli</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Saccharomycescerevisiae</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Aspergillusniger</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>小鼠</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><table>表B續(xù)其它生物中STS07基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>表B續(xù)其它生物中STS21基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>表B續(xù)其它生物中STS22基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>表B續(xù)其它生物中STS23基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>表B續(xù)其它生物中STS24基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>表B續(xù)其它生物中STS25基因的等同物<table>xomplextalbeseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>表B續(xù)其它生物中VCS02基因的等同物菌株信號1信號2信號3G.o;o/an5DSM17078+G.o;qyftoEFO3293+++G.owrfa;wIFO3292++G.oxycb/wATCC621H-一-G.o^dflw^IFO12528—-一G.ojo;da/wG624-+--+G.o;o^wwIFO3291--+G.owdfl/wIFO3255一—+G.oWa/wATCC9937-+G.o;o^wwIFO3244一+G.ce"'腿IFO3266-+G.teu"z'IFO3260+G.o"dcr/wIFO3287-+爿cefo6acterac幼'rafcp.""w/加IFO13773-+Xce/。6a"er取ATCC15164一+G.細(xì)7。;^zcwsNBRC100600--+co/z'----一--小鼠--表B續(xù)其它生物中VCS03基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>表B續(xù)其它生物中RCS27基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>表B續(xù)其它生物中RCS28基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>表B續(xù)其它生物中SMS03基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>表B續(xù)其它生物中SMS04基因的等同物菌株信號1信號2信號3G.o:o^wDSM17078+++Go;o^z朋IFO3293++G.o:o;rf咖IFO3292++G.o;tyrffl朋ATCC621H++(,at^/flwIFO12528+G.0:9;dan5G624+++C.a^/a加T-100+++Ga^/咖IFO3291+++G,OA^fe/wIFO3255++Gao^卿ATCC9937+++G.0巧cfan5IFO3244+++(IFO3266+++G,勤7IFO3260+++G.o;^i。"sIFO3287++爿c油Z7a故,wZ^y;.or/從"ttyIFO3259+++i4c加&a"ersw&s77.;^//"w/wIFO13693+++Jc他6a"eracW"/f"w/wIFO13773+++y4c咖&a"er取ATCC15164++G.細(xì)7一'cuyNBRC100600+++G7wco恥e敏6fz"e/"/z々we^a娜ATCC14835++G7wc加。e柳6flc^po/;yojco併"^yNBI1028+一+G7wco"M柳6oc/e,Aa-o的;AZcw^ATCC49037+-+G/Meorzacdo&acto-ewropaeujDSM6160+-+^c加Zw欲raceri1023+-+爿ce/o&a"e,/as"Mr/"/^NCI1193+-+Z嚴(yán)owowaymoMfjATCC31821—-+---------小鼠---表b續(xù)其它生物中sms05基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表C:其它生物中RCS01基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS02基因的等同物<table><row><column>菌株</column><column>信號1</column><column>信號2</column><column>信號3</column></row><row><column></column><column><formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>+</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column></column><column><<formula>seeoriginaldocumentpage119</formula></column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS03基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS04基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS06基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS07基因的等同物菌株信號1信號2信號3G,DSM17078++++++Gowrfa/wIFO3293+++++Ga^/咖IFO3292++++++G，ag^/娜ATCC621H++++++G.o"rf咖IFO12528++++++G.G624++++++C.a^rfa/wT-100++++++G,owcfa/MrIFO3291++++++G.o^fa/wIFO3255++++++&a^cfa/wATCC9937+++++Go"rffl"sIFO3244++++++G，即,卿IFO3266+++++G,IFO3260+++++G.oq^。twIFO3287+++++^c徹6a故rsw&s/.or/e朋m5IFO3259+一+Jc加Zwc妙sw6印，；^///iwmIFO13693+一+Jc加6acter<sw&sp，；q^'"mtwIFO13773+-+ATCC15164+-+G.細(xì)7fl"A面NBRC100600+++++G7"co加c加6a^r/z々we/ic/e/wATCC14835++++G7"cowac^o6ac^/ofyaxo取weyNBI1028+++G7wcowac咖^c/erdWo/rqp/ncw^ATCC49037+++G7wco"ac柳6aCerew/"opaeuyDSM6160+++y4c咖Zw"er1023+-+Zc咖6flc欣NCI1193+-+尸Miw/o/wo/za^pwftV/aATCC21812-一P^wcfomowasaerujx'wo犯PAOl---ft^rfomo"a5/Zwomsee打sDSM50106-一-i^《M(io加o"aj""'wgaeB728a-一^z加Zwc欣vfrte/fl"d"AvOP一一+^42他6ac敏c/zroococcumMCD1—-Paracoccw5ctemYr^ca"sstrainPdl222-一及A^w/o/wei^/o/worta^;wz/MJ/risCGA009---P?？ac/trea1056R-----一-----小鼠---表C續(xù)其它生物中RCS08基因的等同物<table>complextableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS21基因的等同物菌株信號1信號2信號3G0J0^yDSM17078++++++GIFO3293+++++Ga^rfa/wIFO3292+++++Goj9^咖ATCC621H+++++Gojt^fatyIFO12528++++++(7.o;qyca"sG624++++++G.ojo^/a/wT-100++++++C,卿da,wIFO3291+++++(7,ao/cf咖IFO3255+++++a呵fifcr/wATCC9937++++++(o;o^an5EFO3244++++++G.""'wwIFO3266++++C,細(xì)圖YIFO3260+++++G.cocyc/aw5IFO3287+++++灰加6acter犯&yp.IFO3259++-+JceZo6a"er孤&sp,ji^力訓(xùn)IFO13693++-+Xcefo&acfer;qy/i/zw加IFO13773++-+Jc加6flc&r取ATCC15164++-+(7./fltwrf/cuyNBRC100600+++++G/wconac咖6flCerh々we/ZzciCTJATCC14835++++G7wco加c咖6flc/er/70/";co欲wesNBI1028++++G7wcwzac柳6ac^ATCC49037+++G7wcoace^flCerewropaewsDSM6160+++Jce/o6ac,e/*ace"1023++一+i4c加6flc&rpas^ewrz'awwjNCI1193++-+P化M(iomowaypwri(iaATCC21812+一+/^ewrfcwo加saen^/:a^PAOl+-+i^eu^/o/wowas/7z/omycewDSM50106+—+尸sewrfomowasr^ynVz砂eB728a+-十尸amcoccw5d抓Y/"訴amsstrainPdl222+-+iZAo^fo/jewdo加o"ospfl/ws/risCGA009-尸G/jfoeacz7mz1056R-一-co/iK-12----一---小鼠-—一表C續(xù)其它生物中RCS22基因的等同物<table>complextableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS23基因的等同物<table>complextableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS24基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>表C續(xù)其它生物中RCS25基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>表C續(xù)其它生物中STS01基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表C續(xù)其它生物中STS15基因的等同物<table>complextableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>表C續(xù)其它生物中STS18基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>表C續(xù)其它生物中SMS12基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table>表c續(xù)其它生物中sms13基因的等同物<table><row><column>菌株</column><column>信號1</column><column>信號2</column><column>信號3</column></row><row><column>G.oxydansDSM17078</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansifo3293</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansifo3292</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G,oxydansATCC621H</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO12528</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansG624</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansT-l00</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansIFO3291</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.oxydansifo3255</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G,oxydansATCC9937</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G，oxydansIFO3244</column><column>++++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.cerinusIFO3266</column><column>+++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G.frateuriiIFO3260</column><column>+++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>G,oxydansIFO3287</column><column>+++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>Acetobacteracetisubsp.orleanusIEFO3259</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Acetobacteracetisubsp.xylinumIFO13693</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Acetobacteracetisubsp.xylinumIFO13773</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Acetobactersp.ATCC15164</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>G.thailandicusNBRC100600</column><column>+++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobacterliquefaciensATCC14835</column><column>++</column><column>+</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobacterpolyoxogenesNBI1028</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobacterdiazotrophicusATCC49037</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>GluconacetobactereuropaeusDSM6160</column><column>-</column><column>-</column><column>+</column></row><row><column>Acetobacteraceri1023</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>AcetobacterpasteurianusNCI1193</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>PseudomonasputidaATCC21812</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>PseudomonasaeruginosaPAO1</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>PseudomonasfluorescensDSM50106</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>PseudomonassyringaeB728a</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>AzotobactervinelandiiAvOP</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>AzotobacterchroococcumMCD1</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>ParacoccusdenitrificansstrainPdl222</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>RhodopseudomnaspalustrisCGA009</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Pantoeacitrea1056R</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>E.coli</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Saccharonycescerevisiae</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>Aspergillusniger</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><row><column>小鼠</column><column>-</column><column>-</column><column>-</column></row><table>表C續(xù)其它生物中SMS14基因的等同物<table>Complextableseetheoriginaldocumentpagex</column></row><table>權(quán)利要求1.對維生素C進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的方法，其中，在允許從能夠從D-葡萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑獲得的碳源直接生產(chǎn)維生素C的合適培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并且，其中，所述宿主細(xì)胞的基因組被包含下述多核苷酸的DNA序列進(jìn)行了遺傳工程改造a)編碼根據(jù)SEQIDNO2的L-山梨糖酮脫氫酶或其活性片段或其衍生物的多核苷酸，以及b)編碼選自下述組的蛋白質(zhì)的至少一種多核苷酸，所述組由1)涉及山梨糖/山梨糖醇代謝系統(tǒng)(SMS)的蛋白質(zhì)；2)涉及穿過細(xì)胞膜的糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(STS)的蛋白質(zhì)；3)涉及呼吸鏈系統(tǒng)(RCS)的蛋白質(zhì)；以及4)顯示出與甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶/甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶或肌氨酸氧化酶α亞基或同滲容摩傳感器蛋白envZrp426或轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OmpR或PetP或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白質(zhì)構(gòu)成；以及可選地，從此類細(xì)胞或所述培養(yǎng)基分離維生素C。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，根據(jù)la)的多核苷酸的表達(dá)指與SEQIDNO:1基本相同的多核苷酸序列和/或選自下述組的多核苷酸序列或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由a)多核苷酸，其包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列b)多核苷酸，其包含可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，使用根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過核酸擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得的核苷酸序列；c)多核苷酸，其包含編碼含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，或包含編碼由(a)或(b)中任何多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物或片段中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有其副本多肽的活性；d)多核苷酸，其編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽，其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸雜交，或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸雜交；e)多核苷酸，其編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽，并且，其與編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或與(a)至(c)中任一條定義的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同構(gòu)成。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞含有編碼STS蛋白的多核苷酸，所述STS蛋白選自糖轉(zhuǎn)運蛋白和/或糖醇轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)成的組。4.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的方法，其中，所述宿t細(xì)胞含有編碼RCS蛋白的多核苷酸，所述RCS蛋白選自在輔助因子和輔基的牛物合成中發(fā)揮作用的蛋白以及作為載體蛋白發(fā)揮作用的蛋白構(gòu)成的組；特別是涉及輔助因子和/或它們的前體，例如FAD，NAD，NADP，PQQ，CoQlO，細(xì)胞色素a、6、c、rf以及亞鐵血紅素的生物合成或成熟的蛋白。5.如權(quán)利耍求1至4中任意一項所述的方法，其屮，所述宿主細(xì)胞含有編碼RCS蛋白的多核苷酸，所述RCS蛋白選自在作為供體的聯(lián)苯酚以及相關(guān)物質(zhì)上發(fā)揮作用的氧化還原酶[EC1.10]和具有其它受體的氧化還原酶[ECl丄99]構(gòu)成的組，特別是醇脫氫酶(受體)[EC1丄99.8]。6.如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞含有編碼SMS蛋白的多核苷酸，所述SMS蛋白選自氧化還原酶[ECl]構(gòu)成的組，特別是在供體的CH-OH基團(tuán)上發(fā)揮作用的氧化還原酶[ECl.l]。7.如權(quán)利要求1至6中任意一項所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞含有至少一種選自下述多核苷酸的多核苷酸-由SEQIDNO:80、SEQIDNO:92、SEQIDNO:96、SEQIDNO:100、SEQIDNO:104及其功能等同物或同源物構(gòu)成的STS組；-由SEQIDNO:136、SEQIDNO:140、SEQIDNO:144及其功能等同物或同源物構(gòu)成的SMS組；-由SEQIDNO:148、SEQIDNO:152、SEQIDNO:156、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:168、SEQIDNO:172、SEQIDNO:176、SEQIDNO:180、SEQIDNO:184、SEQIDNO:188、SEQIDNO:192、SEQIDNO:196及其功能等同物或同源物構(gòu)成的RCS組。8.如權(quán)利要求1至7中任意一項所述的方法，其中，所述多核苷酸被至少一種選自下述多核苷酸的多核苷酸進(jìn)行了遺傳功能改造-由SEQIDNO:36、SEQIDNO:52、SEQIDNO:56、SEQIDNO:60、SEQIDNO:64、SEQIDNO:68、SEQIDNO:72和SEQIDNO:40及其功能等同物或同源物構(gòu)成的VCS組；-由SEQIDNO:84、SEQIDNO:88、SEQIDNO:108、SEQIDNO:112、SEQIDNO:116、SEQIDNO:32、SEQIDNO:120及其功能等同物或同源物構(gòu)成的STS組；-由SEQIDNO:124、SEQIDNO:128、SEQIDNO:132、SEQIDNO:44及其功能等同物或同源物構(gòu)成的SMS組；-由SEQIDNO:48、SEQIDNO:200及其功能等同物或同源物構(gòu)成的RCS組；其中，所述多核苷酸欠表達(dá)或被打斷。9.如權(quán)利要求1至8中任意一項所述的方法，其中，在允許從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)維生素C的條件下，在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。10.如權(quán)利要求1至8中任意一項所述的方法，其中，所述經(jīng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，其選自Pseudomonas、Pantoea、Escherichia、Corynebacterium、Ketogulonicigenium以及乙酸細(xì)菌，例如Gluconobacter、Acetobacter或Gluconacetobacter,優(yōu)選地，Acetobactersp.、Acetobacteraceti、Gluconobacterfrateurii、Gluconobactercerinus、Gluconobacterthailandicus、Gluconobacteroxydans構(gòu)成的組，優(yōu)選地，Gluconobacteroxydans，更優(yōu)選地，GluconobacteroxydansDSM17078。11.一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)具有根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列且具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽或其功能等同物，所述宿主細(xì)胞被至少一種多核苷酸進(jìn)行了遺傳工程改造，所述多核苷酸編碼選自下述組的蛋白質(zhì)1)涉及山梨糖/山梨糖醇代謝系統(tǒng)(SMS)的蛋白質(zhì)；2)涉及穿過細(xì)胞膜的糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(STS)的蛋白質(zhì)；3)涉及呼吸鏈系統(tǒng)(RCS)的蛋白質(zhì)；以及4)顯示出與甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶/甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶或肌氨酸氧化酶a亞基或同滲容摩傳感器蛋白envZrp426或轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OmpR或PetP或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白質(zhì)。12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞被至少一種如權(quán)利要求2至8中任意一項定義的多核苷酸進(jìn)行了遺傳工程改造。13.如權(quán)利要求11或12所述的宿主細(xì)胞，其中，表達(dá)了選自下述組的蛋白或其功能等同物或其同源物，所述組由畫SEQIDNO:81、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105-SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145-SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197構(gòu)成。14.如權(quán)利要求11至13中任意一項所述的宿主細(xì)胞，其中，選自下述組的蛋白或其功能等同物或其同源物欠表達(dá)或被打斷，所述組由-SEQIDNO:37、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73和SEQIDNO:41畫SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:33、SEQIDNO:121畫SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:45-SEQIDNO:49、SEQIDNO:201構(gòu)成。15.如權(quán)利要求11至14中任意一項所述的宿主細(xì)胞，當(dāng)在20小時的溫育時間后，在靜止細(xì)胞方法中測量時，其能以3001118/1或更多的量從0-山梨糖醇直接生產(chǎn)維生素C。16.如權(quán)利要求11至14中任意一項所述的宿主細(xì)胞，當(dāng)在20小時的溫育時間后，在靜止細(xì)胞方法中測量時，其能以800mg/l或更多的量從L-山梨糖直接生產(chǎn)維生素C。17.如權(quán)利要求11至16中任意一項所述的宿主細(xì)胞，其是原核細(xì)胞，其選自Pseudomonas,Pantoea,Escherichia,Corynebacterium,Ketogulonicigenium以及乙酸細(xì)菌，例如Gluconobacter,Acetobacter或Gluconacetobacter，優(yōu)選地Acetobactersp.,Acetobacteraceti,Gluconobacterfrateurii,Gluconobactercerinus,Gluconobacterthailandicus,Gluconobacteroxydans構(gòu)成的組，優(yōu)選地，Gluconobacteroxydans，更優(yōu)選地，GluconobacteroxydansDSM17078。18.—種方法，用于生產(chǎn)如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，所述方法包括如下步驟用權(quán)利要求2至8中任意一項定義的多核苷酸對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，以下述方式改變這些多核苷酸序列中的至少一種，所述方式使得所述微生物生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率提高。全文摘要本發(fā)明涉及新鑒定出的、能直接生產(chǎn)L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)的微生物。本發(fā)明還涉及包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼維生素C合成中涉及的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術(shù)工具在從微生物生產(chǎn)維生素C中的用途，其中對所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對微生物中生產(chǎn)所述發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率有著直接或間接的影響。本發(fā)明還包括使用多核苷酸和經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的方法/工藝。本發(fā)明還涉及經(jīng)過遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維生素C的用途。文檔編號C12N9/04GK101208428SQ200680011688公開日2008年6月25日申請日期2006年2月10日優(yōu)先權(quán)日2005年2月11日發(fā)明者克里斯廷·托佩爾,克里納·豪克,奈杰爾·約翰·芒希亞,安佳·穆利,安妮·弗蘭克希斯·梅耶,巴斯蒂恩·切弗雷克斯,康妮·李,新城雅子,波圖斯·皮埃特·科克曼,瑪麗-加布里埃爾·布澤林奧里夫,瑪麗娜·哥德爾范,迪克·希珀,阿德里安努斯·維爾赫穆斯·赫曼努斯·沃勒布里吉特,馬卡斯·戈瑟,馬諾拉·達(dá)魯埃格申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司