專(zhuān)利名稱(chēng)：：近反向育種的制作方法近反向育種所述純合生物體可以進(jìn)行雜交而獲得雜種。本發(fā)明特別涉及植物。植物育種是一項(xiàng)人類(lèi)的基本工作，其對(duì)于提供供應(yīng)人類(lèi)食物的馴化物種是極其重要的。因此，植物育種是古老的，并且最初是基于選擇和繁殖那些在局部選擇田地中表現(xiàn)優(yōu)異的植物。當(dāng)代的植物育種高度依賴(lài)于遺傳學(xué)知識(shí)，并且在技術(shù)上得到了諸:i口歡單倍體(doubledhaploid，DH)(參見(jiàn)食'J:i口HaploidsinCropImprovementIIeds;PalmerC，KellerW和KashaK(2005)in:BiotechnologyinAgricultureandForestry56Eds;NagataT，L5rzH和WidholmJ.Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork,ISBN3-500-22224-3)和分子標(biāo)記(參見(jiàn)例如DeVienneed.(2003)MolecularMarkersinPlantGeneticsandBiotechnology.SciencepublishersInc.Enfield，NHUSA.ISBNl-57808-239-0)的方法的支持。有性生殖過(guò)程中的遺傳機(jī)制已經(jīng)進(jìn)化為增加遺傳變異，這增加了物種在變化的環(huán)境中的存活。減數(shù)分裂重組、獨(dú)立染色體分離和交配系統(tǒng)是這方面的主要影響因素。然而，在植物育種中，這些機(jī)制可能起反作用，特別是在當(dāng)遺傳上雜合的植物已被鑒定為具有高的農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)價(jià)值時(shí)的那些情形中。遺傳因子的重新分配導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳上不相似的并因而異質(zhì)的植物，并因此喪失商業(yè)上所期望的性狀。為了對(duì)抗這種效果，植物育種者可以利用許多技術(shù)。一種可能性是無(wú)性繁殖植物，這導(dǎo)致它們的遺傳組成完全保留，因?yàn)橥ㄟ^(guò)有絲分裂僅發(fā)生倍增。對(duì)于許多植物物種，體外組織培養(yǎng)現(xiàn)在正用于無(wú)性繁殖植物，盡管也可以應(yīng)用其他方法如產(chǎn)生體內(nèi)插條(cuttings)。與通過(guò)種子進(jìn)行繁殖相比較，無(wú)性繁殖(vegetativepropagation)的一個(gè)缺點(diǎn)是其為勞動(dòng)密集的，并因而成本高。而且，難以保存植物較長(zhǎng)的時(shí)間(引起后勤問(wèn)題)，并且與植物材料通過(guò)種子進(jìn)行繁殖的情況相比較，病原體如病毒感染植物材料的風(fēng)險(xiǎn)顯著較大。備選地，無(wú)性繁殖可以通過(guò)形成無(wú)性種子(asexualseed)來(lái)完成，這通常稱(chēng)為無(wú)融合生殖?？梢酝ㄟ^(guò)遺傳工程在有性繁殖的植物物種中誘導(dǎo)在許多物種中自然發(fā)生的無(wú)融合生殖。然而目前，負(fù)責(zé)無(wú)融合生殖的不同步驟即未減數(shù)孢子生殖、孤雌生殖和自主胚乳發(fā)育的基因還沒(méi)有被鑒定，并且可能以復(fù)雜的方式相互作用。因而，盡管已經(jīng)廣泛認(rèn)識(shí)到無(wú)融合生殖技術(shù)用于植物育種的潛力很長(zhǎng)時(shí)間了，但是仍需等待這一概念的驗(yàn)證。作為另一個(gè)備選方式，可以利用如WO-03017753中描述的反向育種技術(shù)。反向育種(reversebreeding)是基于通過(guò)遺傳工程來(lái)抑制減數(shù)分裂重組并隨后產(chǎn)生雙單倍體植物(DH)，其源于含有未重組的親本染色體的孢子。這些DH在它們的遺傳組成方面是不同的，只是因?yàn)樵跍p數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生的獨(dú)立的親本染色體分離。因此，足夠的是，利用每個(gè)染色體的一個(gè)共顯性的多態(tài)標(biāo)記來(lái)確定DH或源于其的品系中的哪個(gè)應(yīng)該通過(guò)雜交進(jìn)行組合以重構(gòu)原始起始植物的遺傳組成。如保留，即使其遺傳組成是未知的。然而，這種技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是減數(shù)分裂重組的完全抑制導(dǎo)致第一次減數(shù)分裂過(guò)程中沒(méi)有交叉(chiasmata)并因而導(dǎo)致不合適的染色體分離，這可以導(dǎo)致配子的非整倍性并因而減少了生存力。當(dāng)在第一次減數(shù)分裂過(guò)程中不形成交叉時(shí)，每個(gè)染色體具有獨(dú)立的50%的機(jī)會(huì)移向兩極的任何一端。這意味著產(chǎn)生一個(gè)具有完整染色體組的孢子的理論幾率是(1/2)%其中x表示單倍染色體數(shù)目。平衡配子的頻率因而隨著單倍染色體數(shù)目增加而降低。盡管許多作物物種具有相對(duì)較低的染色體數(shù)目(例如黃瓜每個(gè)單倍體基因組具有7條染色體，菠菜僅具有6條)，但也存在具有相對(duì)商業(yè)上重要的物種，如番茄，其為最大的蔬菜作物之一，其每個(gè)單倍體基因組具有12條染色體。這種技術(shù)性約束顯著地降低了反向育種技術(shù)的效率。因此，本領(lǐng)域?qū)溥x方法存在明顯的需求，所述備選方法使得在有性后代中保留遺傳組成。因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供用于保留親本生物體，特別是親本植物的遺傳組成的方法。在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)利用從未減數(shù)孢子例如可由于第二次分裂重建(SecondDivisionRestitution,SDR)事件而獲得的孢子(所謂的"SDR-0細(xì)胞，，)再生的植物，有可能提供這種方法。該方法也可以在其他除植物以外的非人生物體例如真菌或魚(yú)上，并且使用其他生殖細(xì)胞例如配子來(lái)進(jìn)行。法，所述純合生物體可以進(jìn)行雜交而獲得雜種，所述方法包括a)提供雜合起始生物體；b)讓所述生物體產(chǎn)生源于笫二次分裂重建的SDR-0細(xì)胞；c)從所述SDR-0細(xì)胞再生SDR-0生物體；和d)從如此獲得的SDR-0生物體產(chǎn)生純合生物體。這種方法在it匕將稱(chēng)為"近反向育種(NearReverseBreeding)"。未減數(shù)孢子優(yōu)選由于省略了第二次減數(shù)分裂而形成。這種自然現(xiàn)象稱(chēng)為第二次分裂重建(SecondDivisionRestitution)或SDR。SDR在植物中可以在有性繁殖過(guò)程中與正常的減數(shù)分裂事件一起發(fā)生。本發(fā)明的近反向育種技術(shù)通過(guò)特定地選擇經(jīng)過(guò)自然或經(jīng)改造的SDR而產(chǎn)生的未減數(shù)孢子用于再生來(lái)利用SDR事件。得到的植物，稱(chēng)為SDR-O植物，其大部分是純合的，并在優(yōu)選的實(shí)施方案中用于產(chǎn)生DH。然而，SDR-0植物中的純合性水平也可以通過(guò)近交步驟或第二次SDR事件或其組合來(lái)增加。在起始植物的父本和母本基因組之間是多態(tài)的分子標(biāo)記可用于鑒定那些SDR-0植物和源于其的DH，它們?cè)谒鼈兊倪z傳組成方面基本上互補(bǔ)，并且在雜交后導(dǎo)致最初的起始植物的遺傳構(gòu)成幾乎完全的重構(gòu)。由于在SDR-O事件的形成過(guò)程中和在源于其的DH形成過(guò)程中的減數(shù)分裂重組，因而所述重構(gòu)是"幾乎完全的"。經(jīng)重構(gòu)的雜種將在一定程度上相互之間以及與原始的起始雜種植物在遺傳上不同。然而，與其中DH直接源于正常的減數(shù)分裂事件的情況相比較，這種變異大大減少。而且，所述DH在遺傳上是固定的，這意味著沒(méi)有空間用于進(jìn)一步選擇。在該方法中整合SDR事件的優(yōu)勢(shì)是，遺傳互補(bǔ)性的選擇在兩步過(guò)程中進(jìn)行。第一個(gè)步驟集中于染色體的近端區(qū)，即包括著絲粒。第二個(gè)步驟指向染色體的遠(yuǎn)端，即由于重組而發(fā)生交換的那些區(qū)域。這種延緩的遺傳固定減少了復(fù)雜性并增加了發(fā)現(xiàn)大部分互補(bǔ)的基因型的機(jī)會(huì)，特別是當(dāng)分子標(biāo)記可用于選擇時(shí)。這種方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是SDR是一種自然過(guò)程，其在有性繁殖過(guò)程中發(fā)生并且可以就如此利用而無(wú)需進(jìn)一步干擾有性繁殖過(guò)程。圖1和2示意性地圖解說(shuō)明了正常減數(shù)分裂事件(隨后是DH的形成)和SDR事件的不同。在這兩個(gè)圖中描繪了4個(gè)染色體對(duì)，并且同系物以淺色或黑色棒狀結(jié)構(gòu)顯示，其中棒狀物上的黑色圓圏表示著絲粒。該圖僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的原理。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，實(shí)際上所涉及的染色體對(duì)的數(shù)目取決于所涉及的物種。此外，交換(crossing-over)點(diǎn)相關(guān)于它們的數(shù)目/染色體和它們?cè)谌旧w上的位置是可變的。圖1描述了正常的減數(shù)分裂和兩次減數(shù)分裂都發(fā)生后染色體的加倍(其可以是自發(fā)的或誘導(dǎo)的)。在這種情形中，交換導(dǎo)致了每組中有兩個(gè)親本和兩個(gè)重組染色體產(chǎn)生。此外，由于每對(duì)的兩個(gè)同源染色體的獨(dú)立分配，顯然可以形成許多遺傳上不同的孢子/配子。在圖1中，僅描述了該過(guò)程的三種任意的結(jié)果。在從這些孢子再生植物后，可以獲得DH。DH的產(chǎn)生在當(dāng)前的植物育種中是極其重要的并且作為一種已確立的技術(shù)應(yīng)用于大多數(shù)作物。從二倍體孢子再生的植物將進(jìn)一步被稱(chēng)為DH-O，即作為初級(jí)再生體的雙單倍體，所述初級(jí)再生體來(lái)自自發(fā)的或誘導(dǎo)的源自正常減數(shù)分裂事件的二倍體化孢子。術(shù)語(yǔ)"SDR-O"用于來(lái)自缺少第二次減數(shù)分裂的細(xì)胞或孢子的初級(jí)再生體。DH-0植物當(dāng)自花傳粉時(shí)將產(chǎn)生在所有等位基因中在遺傳上100%相同并且完全固定的子代(DH-1)植物。因而，盡管在DH-O植物上形成的孢子(配子)再次進(jìn)行減數(shù)分裂和重組，但是不能發(fā)生基因重排。因此，這意味著這種所謂的"純系"是永久的，因?yàn)椴荒馨l(fā)生分離。然而當(dāng)生長(zhǎng)在不同條件下，例如低或高溫，或例如在不同氣候帶中時(shí)，這種純系可以在表型上顯示不同的表現(xiàn)。然而，所述可以觀察到的差異對(duì)于所述品系的所有"成員"均是有效的，換而言之將不會(huì)有"品系內(nèi)"變異。然而，在不同純系(DH-1)之間可以存在差異，這稱(chēng)為"品系間"變異。圖2描述了SDR事件。與其中自發(fā)的或誘導(dǎo)的染色體加倍在減數(shù)分裂完成后發(fā)生的圖l相反，二倍體孢子的發(fā)生是由于不存在第二次減數(shù)分裂而引起。DH和二倍體SDR植物之間的根本性不同由下列事實(shí)來(lái)舉例說(shuō)明在SDR植物中于不同染色體上存在雜合區(qū)段，而DH是完全純合的。應(yīng)該進(jìn)一步注意，在SDR植物中所有染色體對(duì)相關(guān)于它們的著絲粒區(qū)是純合的。如杲存在雜合性，則其存在于遠(yuǎn)側(cè)的染色體末端。這與稱(chēng)為笫一次分裂重建(FirstDivisionRestitution)或FDR的另一種異常的減數(shù)分裂事件不同，所述FDR的特征在于不存在第一次減數(shù)分裂并且其導(dǎo)致所有染色體對(duì)在著絲粒區(qū)處的雜合性。在圖2所示的理論情形中，分別用于產(chǎn)生DH和SDR的起始植物(供體植物)含有完全雜合的同源染色體。這表示由那些染色體攜帶的基因的所有等位基因是多態(tài)性的。然而，實(shí)際上，這是相當(dāng)不可能的，因而這種情形舉例說(shuō)明了最極端的雜合情形。從圖2中還可以清楚地看出，對(duì)于SDR事件每個(gè)染色體對(duì)的交換點(diǎn)決定了純合基因座和雜合基因座之間的比率。對(duì)于它們的交換位置平均更靠近端粒的那些SDR-事件這種比率增加，而當(dāng)所述交換位置平均更靠近著絲粒時(shí)該比率降低。如果可利用足夠的分子標(biāo)記，對(duì)于每個(gè)SDR事件可容易地測(cè)定這些交換點(diǎn)。每個(gè)染色體臂的交換程度被著絲粒的位置所限制。應(yīng)該進(jìn)一步注意，如果殘留的雜合性相對(duì)較低，則SDR事件類(lèi)似于發(fā)生RIL，s和BIL，s,只是是以雜合的形式。SDR僅僅是更廣泛的一類(lèi)導(dǎo)致未減數(shù)孢子/配子形成的現(xiàn)象的一種形式(Veilleux，PlantBreedingReviews3，253-288(1985)，其描述了形成未減數(shù)配子的機(jī)制并提供了在作物植物中未減數(shù)配子發(fā)生的列表)。那時(shí)，主要公認(rèn)兩種不同類(lèi)別的未減數(shù)配子，即SDR和FDR。最近，已經(jīng)公開(kāi)了第三類(lèi)未減數(shù)配子，稱(chēng)為不定減數(shù)分裂重建(IndeterminateMeioticRestitution,IMR)(Lim等人,(2001)Theor.Appl.Genet.103:219-230)。對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，僅SDR是相關(guān)的。SDR在多種作物中自然發(fā)生，如由Veilleux(同上)以及其他獨(dú)立的研究(LimK等人，(2004)BreedingScience54:13-18)所提出的列表所證明。有趣的是，在辣椒中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將植物暴露于ll'C下48小時(shí)，SDR2n配子(花粉)的頻率從少于1%增加至10.5。/。(平均)(ZhangX等人，(2002)JournalofHorticulturalScience&Biotechnology78:(1)84-88)。據(jù)測(cè)量，SDR發(fā)生的最大頻率為81.3%。因而，通過(guò)外部刺激來(lái)增加SDR事件數(shù)目是可能的。2n孢子或配子的發(fā)生不限于雄配子體，而是還存在證據(jù)表明這也在雌配子體的7jc平上發(fā)生。例如ZagorchevaL(GeneticsandPlantBreeding9(5)，386-399(1976))報(bào)道了在黃瓜中出現(xiàn)大孢子發(fā)生和大配子發(fā)生的偏離。近反向育種利用由SDR而引起的未減數(shù)孢子的發(fā)生以便很大程度地重構(gòu)雜合起始植物材料的遺傳組成?；旧?，為了重構(gòu)原始的雜種植物，可開(kāi)始選擇每條染色體著絲粒區(qū)互補(bǔ)的那些SDR-0植物。這可以通過(guò)使用多態(tài)性分子標(biāo)記對(duì)每條染色體的著絲粒區(qū)進(jìn)行基因分型來(lái)完成。由于SDR-O再生體對(duì)于每條染色體在著絲粒區(qū)處是純合的，因而完全(或部分)互補(bǔ)的植物可以以這種方式容易地鑒定。當(dāng)選取1個(gè)隨機(jī)的SDR-0植物時(shí)發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的SDR-0植物(基于著絲?；パa(bǔ)性，并且不考慮任何殘留的雜合性)的概率是(l/2)x,其中x是染色體的數(shù)目。如果要重構(gòu)原始的親本品系，發(fā)現(xiàn)一個(gè)親本的概率是(l/2廣1，而對(duì)于另一親本該概率是(l/2廣。如先前說(shuō)明的，"近親本(nearparental)"品系也可以^人為是回交近交系(Back-crossInbredLines,BIL，s)，借此對(duì)于兩個(gè)親本都產(chǎn)生了漸滲區(qū)段。這些互補(bǔ)的植物隨后可以進(jìn)行雜交以便重構(gòu)原始雜種植物的基因型。然而，既然由于減數(shù)分裂重組，SDR-0植物的染色體臂的遠(yuǎn)端區(qū)域?qū)⑹请s合的(在每個(gè)染色體臂發(fā)生單次交換的情形中)，那么分離將在重構(gòu)的雜種中發(fā)生，這導(dǎo)致一定水平的非均一性。當(dāng)位于互補(bǔ)SDR-G事件的遠(yuǎn)端區(qū)域中的遺傳信息，由于重組在相對(duì)較遠(yuǎn)的染色體位置處發(fā)生并因而基因含量低，或者由于等位基因變異對(duì)表型變異沒(méi)有顯著貢獻(xiàn)，而對(duì)表型變異沒(méi)有顯著貢獻(xiàn)時(shí)，重構(gòu)的雜種將是相對(duì)均一的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生了其中減數(shù)分裂重組只在染色體的最遠(yuǎn)端的端粒區(qū)發(fā)生的SDR-0事件。在這樣的事件中，染色體在物理上重組而不是在遺傳上重組。為了獲得遺傳上完全均質(zhì)的重構(gòu)的雜種植物，從每個(gè)互補(bǔ)的SDR-O事件產(chǎn)生DH。在圖3中示意性地圖解說(shuō)明的這種原理描述了在從來(lái)自圖2的SDR-0事件3再生的植物上發(fā)生的孢子/配子的形成。所形成的孢子可以再生，并且在染色體加倍后可以產(chǎn)生DH。通過(guò)使用分子標(biāo)記，可以選擇在遺傳上與任一種親本品系十分相似的那些DH。這在圖4中通過(guò)已經(jīng)加倍的染色體組來(lái)圖解說(shuō)明。由于分離，這些雙單倍體植物的染色體的遠(yuǎn)側(cè)末端(從重組斷裂點(diǎn)至端粒)將平均含有每個(gè)親本的50%的遺傳信息。當(dāng)兩個(gè)隨機(jī)選取的源于互補(bǔ)的SDR-0事件的雙單倍體植物通過(guò)雜交進(jìn)行組合時(shí)，在重構(gòu)的雜種植物中近側(cè)臂區(qū)將會(huì)是100%雜合的，而遠(yuǎn)側(cè)臂區(qū)將會(huì)是50%雜合的。由于假設(shè)SDR-0事件平均是60%純合的(Carputo，D.等人，(2003)Genetics163，287-294)，具有互補(bǔ)事件的重構(gòu)將導(dǎo)致平均80%的雜合性(100%x60%+50%x40%)和20%的純合性。近端和遠(yuǎn)端交換點(diǎn)之間的純合性將偏向于對(duì)于該區(qū)域來(lái)說(shuō)是純合的SDR-0再生體的基因型，而對(duì)于遠(yuǎn)端交換點(diǎn)來(lái)說(shuō)為遠(yuǎn)端的，純合性將對(duì)于兩個(gè)親本基因型來(lái)說(shuō)是相等的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯然的是，涉及雜合性百分比的上述圖形代表極端的值，即從100%雜合的植物開(kāi)始，這意味著染色體上攜帶的基因的所有等位基因都是多態(tài)性的。實(shí)際上，這是十分不可能的，因而雜合性的百分比平均來(lái)說(shuō)將會(huì)更低。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生雜種的方法，所述方法包括將根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的第一種純合生物體與第一種純合生物體雜交。根據(jù)本發(fā)明，有可能重構(gòu)原始雜種的遺傳構(gòu)成，然而，此外，可以獲得接近所述原始雜種的遺傳構(gòu)成的變體。在第一個(gè)實(shí)施方案中，第二種純合生物體與第一種純合生物體至少部分互補(bǔ)，從而所得的雜種與雜合的起始生物體相似。合適地，與雜合的起始生物體相似包括具有起始生物體的至少50%的雜合性的雜種。優(yōu)選地，雜合性中的相似是50%和100%之間的任何百分比，更特別地，雜合性中的相似是50%和60%之間，優(yōu)選60%和70°/。之間，更優(yōu)選70%和80%之間，更加優(yōu)選80%和90%之間，以及最優(yōu)選90%和100%之間的任何百分比。短語(yǔ)"任何百分比"旨在覆蓋所述范圍內(nèi)的每個(gè)和所有百分比，即使特定的百分比沒(méi)有明確地提到。備選地，選擇第二種純合生物體而使得得到的雜種勝過(guò)原始雜合起始生物體。"原始的雜合起始生物體"是在權(quán)利要求1的步驟a)中使用的生物體。于每個(gè)親本的每條染色體臂內(nèi)的交換點(diǎn)。、通it使用分子標(biāo)記:、在雜交后導(dǎo)致具有相對(duì)較低的雜合性水平的Fl雜種的SDR-0事件以及源于其的DH都可以得以選擇。在這個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于SDR-O事件，應(yīng)該選擇平均具有更多遠(yuǎn)端交換的那些，而對(duì)于DH,應(yīng)該選擇最互補(bǔ)的那些。然而，在另一方面，可以期望選擇在近端和遠(yuǎn)端交換點(diǎn)之間具有相對(duì)較大距離的那些事件，以在可以偏向于任一親本的Fl雜種中引入純合性。從上面看可以清楚，近反向育種使得植物育種者能在很大程度上重構(gòu)雜種植物，但是由于純合的等位基因的不同水平和來(lái)源所引起的顯著變異也可以在試驗(yàn)性F1雜種之間獲得，這可能導(dǎo)致原始(起始)雜種植物的性能的改良。此外，有可能產(chǎn)生僅對(duì)于給定的染色體亞組來(lái)說(shuō)是互補(bǔ)的雜種。這可以通過(guò)選擇那些SDR-0事件來(lái)完成，所述SDR-0事件在它們的著絲?；蛐突A(chǔ)上對(duì)于所期望的染色體對(duì)是互補(bǔ)的，并且對(duì)于其他染色體對(duì)是相同的。從所謂的近替代系(near-substitutionline)產(chǎn)生的這種雜種對(duì)于非互補(bǔ)染色體對(duì)將是大部分純合的，與互補(bǔ)染色體對(duì)相比較而言在染色體的遠(yuǎn)端區(qū)具有相似的雜合性水平。在其最極端的形式中，可以雜交完全非互補(bǔ)的雙單倍體，這導(dǎo)致產(chǎn)生了具有局限于染色體遠(yuǎn)端部分的雜合性的雜種植物。為了將SDR用于近反向育種技術(shù)，可以利用SDR事件的自然發(fā)生或可以通過(guò)例如遺傳工程來(lái)誘導(dǎo)SDR事件。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及回交?；亟皇潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員所述熟知的一個(gè)植物育種術(shù)語(yǔ)，并且其指其中將特定性狀漸滲入至具有所期望的遺傳構(gòu)成(所謂的遺傳背景)的植物品系中的過(guò)程。這一過(guò)程的理想結(jié)果是遺傳上與起始植物品系幾乎相同而僅負(fù)責(zé)所述期望性狀的遺傳因子通過(guò)重組而被加入至其中的植物品系。為了完成這個(gè)目標(biāo)，將攜帶所期望的遺傳背景和所期望的性狀的植物雜交，并從后代中選擇攜帶所述性狀以及盡可能地具有所述遺傳背景的植物。由于每個(gè)回交循環(huán)所期望的遺傳背景的增加平均減半，所以實(shí)際上要進(jìn)行4-5個(gè)育種循環(huán)來(lái)完成回交過(guò)程。近反向育種使得能加速回交，因?yàn)檫_(dá)到純合性的該過(guò)程僅需要兩步。第一個(gè)步驟與傳統(tǒng)的回交過(guò)程相同，即將攜帶所期望的遺傳背景和所期望的性狀的植物雜交。將得到的雜種用于產(chǎn)生SDR-0事件，其可就所期望的性狀和所期望的遺傳背景進(jìn)行選擇，所述所期望的性狀可基于表型或輔助的標(biāo)記，和所述所期望的遺傳背景基于對(duì)于所述遺傳背景特異的著絲粒標(biāo)記。第二個(gè)步驟涉及DH的產(chǎn)生，使用分子標(biāo)記就最大量的遺傳背景來(lái)選擇所述DH。近反向育種加快了獲得純合性的過(guò)程，但采用了兩個(gè)選擇步驟。當(dāng)可利用足夠的遺傳標(biāo)記時(shí)，與傳統(tǒng)過(guò)程相比較而言可以有效得多地獲得所期望的回交產(chǎn)物，因?yàn)榭梢燥@著減少耗時(shí)的育種循環(huán)的次數(shù)。使用本發(fā)明的近反向育種方法，可將CMS以十分有效的方式漸滲入所期望的背景中。為了將近反向育種應(yīng)用于CMS轉(zhuǎn)移，CMS供體品系優(yōu)選對(duì)于大量的核遺傳標(biāo)記來(lái)說(shuō)在遺傳上與必需轉(zhuǎn)化為雄性不育的品系不相似，這樣可以更容易地測(cè)定CMS的染色體和可育供體的染色體之間的差異。為了將純系或所期望的近交系(純合的或近乎純合的)轉(zhuǎn)化為相似的但具有CMS背景的品系，通過(guò)用所期望品系的花粉對(duì)所述CMS進(jìn)行授粉來(lái)進(jìn)行第一次雜交。得到的Fl子代含有CMS和所期望品系的50%的染色體。通過(guò)用化學(xué)藥品(例如一氧化二氮)或脅迫條件(例如低溫)處理來(lái)誘導(dǎo)Fl子代植物以在雌核發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行SDR-減數(shù)分裂。SDR也可以在雌核發(fā)育過(guò)程中自然發(fā)生。如果應(yīng)用孤雄發(fā)育，則必須利用恢復(fù)系基因，其可以抑制雄性不育誘導(dǎo)性細(xì)胞質(zhì)的效果。將得到的SDR-O植物用對(duì)于Fl雜種的著絲粒區(qū)來(lái)說(shuō)是多態(tài)的DNA標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析。選擇只含有必須轉(zhuǎn)化為CMS的品系的著絲粒區(qū)的SDR-G植物。如果可以利用大量的覆蓋基因組的區(qū)別性標(biāo)記，那么可以選擇在染色體上平均具有最近端交換位置的那些SDR-O事件。這在單個(gè)步驟中將所選的品系大大地轉(zhuǎn)化為CMS。如果需要，可以重復(fù)該回交循環(huán)。SDR事件的自然發(fā)生可以通過(guò)特定的非生物脅迫條件例如熱或冷休克來(lái)增強(qiáng)。這些脅迫條件已知能增強(qiáng)未減數(shù)二倍體孢子的形成(ZhangX等人，(2002)JournalofHorticulturalScience&Biotechnology78:(1)84-88)。此外，有可能通過(guò)施用一氧化二氮(N20)氣體來(lái)誘導(dǎo)2n花粉的形成(0kazaki，K.等人，(2005)Euphytica，143，101-114)。當(dāng)二倍體孢子通過(guò)雄性減數(shù)分裂產(chǎn)生時(shí)，還有可能通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)來(lái)富集這些細(xì)胞。這樣的技術(shù)本身是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且過(guò)去已經(jīng)應(yīng)用于小孢子(DeslauriersC等人，(1991)FlowcytometriccharacterisationandsortingofculturedBrassicanapusmicrospores.Biochem.Biophys.Acta:1091，165-172)。此外，已知二倍體孢子或花粉在大小上比它們的單倍體同等物要大(LernmiG和NegriV.(1994)Researchon2npollenproductioninLotustenuisanLM.G.V.ofPerugiaUniversity.LotusnewsletterVol;25,pp24-27)。令人驚訝地，二倍體孢子在物理上不同于單倍體孢子這一僅有的事實(shí)使得有可能通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)來(lái)特異地富集二倍體孢子。此外，導(dǎo)致二倍體孢子形成的環(huán)境條件的優(yōu)化可以使用不同的分選技術(shù)來(lái)容易地完成。發(fā)育、雌核發(fā)育或經(jīng)針刺授粉(pricklepollination)的孤雌生殖來(lái)進(jìn)行。當(dāng)應(yīng)用經(jīng)針刺授粉的孤雌生殖時(shí)，使用二倍體花粉，特別是關(guān)于對(duì)于胚乳中母本對(duì)父本基因組的比率的改變具有低耐受力的那些物種來(lái)說(shuō)，可能是有利的。如果不是全部作物的話，對(duì)于大多數(shù)作物，一旦從二倍體孢子再生出植物，分子標(biāo)記可用于確定染色體對(duì)的著絲粒區(qū)是純合的還是雜合的，這分別對(duì)于SDR或FDR事件來(lái)說(shuō)是特征性的。以這種方式，可以容易地選擇SDR事件。使得能夠干擾參與減數(shù)分裂的第二次細(xì)胞分裂的基因功能的不同遺傳方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。這樣的干擾可以通過(guò)誘變或基因轉(zhuǎn)移(transgenesis)來(lái)進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因方法旨在穩(wěn)定或瞬時(shí)引入DM片段，其修飾減數(shù)分裂的第二次分裂從而導(dǎo)致SDR類(lèi)型的二倍體孢子。這種修飾可以通過(guò)干擾參與減數(shù)分裂過(guò)程的遺傳因子，特別是參與第二次細(xì)胞分裂的那些遺傳因子來(lái)進(jìn)行。所述干擾可以基于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)通過(guò)特異地下調(diào)基因表達(dá)來(lái)建立。PTGS可以通過(guò)RNA-干擾(RNAi)或病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)來(lái)完成。在另外一個(gè)方法中，所述干擾可以通過(guò)過(guò)表達(dá)對(duì)于減數(shù)分裂的第二次分裂施加顯性負(fù)影響的蛋白質(zhì)來(lái)建立，從而導(dǎo)致SDR。無(wú)論釆用什么方法，均需要在分子水平上知道靶標(biāo)基因。已經(jīng)描述了導(dǎo)致SDR-類(lèi)型的減數(shù)分裂的馬鈴薯的許多隱性突變體(pcpc、osos、fcfc)(Carputo，D.等人，(2003)Genetics163，287-294)。此外，對(duì)于玉米，elongatel突變導(dǎo)致了第二次減數(shù)分裂的缺失(Barell，PJ和Grossniklaus，U.(2005)PlantJ.43，309-320)。盡管在這些特定實(shí)例中已經(jīng)突變的基因還沒(méi)有在分子水平上被鑒定，但是技術(shù)人員將能夠這樣做，并因而這些基因和其他仍未知的基因是使用分子抑制技術(shù)在靶物種中獲得SDR的極好的候選者。本發(fā)明涉及近反向育種的一般原理，并且不是所有可能的在起始生物體中誘導(dǎo)SDR的實(shí)施方案已經(jīng)得以描述這一事實(shí)對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)是無(wú)關(guān)的。上面描述的基因的備選方案可以在基因如DUET(VenkataReddy等人，(2003)Development130，5975-5987)和CYC1;2(Wang等人，(2004)PlantPhysiology136，4127-4135)中找到，所述基因已經(jīng)對(duì)于擬南芥(^i"W/^;^/、Ma//a/7a)進(jìn)行了描述，并且所述基因在突變后導(dǎo)致異常形式的減數(shù)分裂。在這些突變體中的二倍體減數(shù)分裂產(chǎn)物是SDR樣的，并因而DUET和CYC1;2以及它們?cè)谄渌参镂锓N中的功能同系物是獲得SDR類(lèi)型的減數(shù)分裂的候選靶基因。另外一個(gè)候選耙基因是TETRASPORE/STUD(Yang等人，(2003)PlantJ.34，229-240),其在敲除后導(dǎo)致減數(shù)分裂后細(xì)胞分裂的缺失。tetraspore/stud突變體的小孢子的二倍體再生體可以是SDR樣的。一旦已經(jīng)獲得SDR-O植物，可以進(jìn)一步在分子上進(jìn)一步對(duì)它們進(jìn)行表征。最初，可以測(cè)定著絲粒區(qū)的單倍型，這提供了對(duì)于SDR-O植物之間同源染色體的互補(bǔ)性水平的了解。依靠該應(yīng)用，可以選擇完全或部分互補(bǔ)的SDR-O植物。隨后，可將所述SDR-O植物用于產(chǎn)生更密集的單倍型圖語(yǔ)。這可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分子分型技術(shù)來(lái)完成。實(shí)例是RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Beckmann，J.S.和Soller，M(1983)Theor.andA卯i.Genet.67，35-43))、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(Welsh,J.和McClelland,M.(1990)NucleicAcidsRes.19，961-866))、AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)Vos，P.等人(1995)NucleicAcidsRes.23，4407-4414))或SFP(單特征多態(tài)性(Borovitz，J.等人,(2003)GenomeResearch13,513-523)。可以使用這些技術(shù)而無(wú)需預(yù)先知道DNA多態(tài)性的性質(zhì)。如果將DM多態(tài)性表征為例如SNP，則可以利用許多SNP檢測(cè)技術(shù)(Kwok，P丄和Chen，X(2003)Curr.IssuesMol.Biol.5，43-60)。單倍型圖語(yǔ)可用于選擇植物以用于DH生產(chǎn)。關(guān)于在SDR-O起始植物中是雜合的區(qū)域，所獲得的DH可被鑒定為單倍型。這種分析提供了可用于操控F1雜種中雜合性/純合性比率的遺傳信息，并且其提供了選擇Fl雜種基因組純合區(qū)的任一親本起源的這一可能性。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)純合生物體的至少一種互補(bǔ)組合(雜交后可以'再合成，起始生物體的組合)的概率是給定物種的單倍染色體數(shù)目x和從雜合起始生物體產(chǎn)生的純合生物體數(shù)目k的函數(shù)。當(dāng)給定的作物物種的單倍染色體數(shù)目表示為x時(shí)，僅考慮接近交換點(diǎn)的染色體區(qū)域并因而包括著絲粒區(qū)，從那種作物物種的植物獲得的SDR-0基因型的最大數(shù)目是2'。從該群體隨機(jī)選取的一對(duì)SDR-0植物或源于其的DH植物在雜交后，導(dǎo)致形成具有與產(chǎn)生所述SDR-O事件的基因型(原始基因型)近乎相等的基因型的Fl雜種的概率是(2x-1)/2X。如果產(chǎn)生了總數(shù)為k的SDR-O植物，那么2個(gè)遺傳上截然不同的可以雜交的SDR-0植物或源于其的DH植物存在l/2k(k-l)種組合。任意隨機(jī)選取的2個(gè)SDR-0植物或源于其的DH植物的組合為互補(bǔ)的概率是1//。因而，任何隨機(jī)選取的2個(gè)SDR-O植物或源于其的DH植物的組合不是互補(bǔ)的概率是I-1//-(2X-1)/2X。如果有k個(gè)SDR-0或源于其的DH,則可以得到!/2k(k-l)種組合，并因而在該SDR-0群體或源于其的DH內(nèi)不能發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的植物的概率是((2M)/20('^—m。該分析的結(jié)果顯示于下面表1中。表l:使用近反向育種技術(shù)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)互補(bǔ)的SDR-O或源于其的DH的至少一種組合的概率，該概率作為單倍染色體數(shù)目x和可利用的隨機(jī)產(chǎn)生的SDR-0植物數(shù)目k的函數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>該分析顯示，根據(jù)本發(fā)明，使用單倍染色體數(shù)目為7的植物物種如黃瓜的48個(gè)SDR-O植物或源于其的DH，單倍染色體數(shù)目為9的植物物種如花椰菜的128個(gè)SDR-0植物或源于其的DH，以及單倍染色體數(shù)目為12的植物物種如番茄、甜瓜和甜椒的256個(gè)SDR-O植物或源于其的DH，可以以高的概率極大地再合成原始的基因型為Fl雜種。這些數(shù)字說(shuō)明了這樣一個(gè)事實(shí)對(duì)于這些作物物種應(yīng)用近反向育種所需的SDR-0植物的數(shù)目是相對(duì)較低的，并因而這些數(shù)目的產(chǎn)生是高度可行的，尤其是在工業(yè)環(huán)境中。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，對(duì)任何已知了單倍染色體數(shù)目的植物物種都可以這樣計(jì)算。本申請(qǐng)中使用的"SDR-0植物或細(xì)胞"旨在涉及從未減數(shù)配子產(chǎn)生的植物和細(xì)胞。這樣的未減數(shù)配子可以反過(guò)來(lái)是第二次分裂重建(SDR)事件的結(jié)果，但是也可以是導(dǎo)致形成二倍體的異常形式減數(shù)分裂的產(chǎn)物。本發(fā)明因而提供了使用從SDR或SDR樣未減數(shù)配子再生的生物體(特別是植物)以及它們的子代的手段，例如用于基因型重構(gòu)目的、用于產(chǎn)生近互補(bǔ)親本品系、用于產(chǎn)生近染色體置換品系以及用于通過(guò)引入純合和雜合的基因組區(qū)段來(lái)優(yōu)化F1雜種。本發(fā)明將進(jìn)一步在隨后的非限制性實(shí)施例中進(jìn)行闡迷，所述實(shí)施例涉及以下附圖圖5顯示了黃瓜的典型F2植物的AFLP模式。每條水平線代表1個(gè)單獨(dú)的植林。每一豎欄表示一連鎖群。淺灰色部分表示雜合區(qū)域，黑色和暗色區(qū)域表示各自的純合區(qū)域。圖6顯示了黃瓜的典型DH系的AFLP分析。每條水平線代表l個(gè)單獨(dú)的植林。每一豎欄表示一連鎖群。正如在DH中所預(yù)期的，僅存在黑色和暗色區(qū)域，而不存在淺灰色部分。圖7顯示了黃瓜中典型SDR-O植物的AFLP分析。每條水平線代表l個(gè)單獨(dú)的植抹。每一豎欄表示一連鎖群。淺灰色部分表示雜合區(qū)域，黑色和暗色區(qū)域表示各自的純合區(qū)域。圖8顯示了從用低溫處理的辣椒植物收集的花粉。圖A表示通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到的經(jīng)冷處理的植物的花粉，而圖B代表對(duì)照植物的花粉。實(shí)施例實(shí)施例1在通過(guò)雌核發(fā)育獲得的黃瓜(&^邁"ya"'^^L.)植物中發(fā)生相對(duì)較低水平的雜合性的證明通過(guò)根據(jù)EP-374755在黃瓜中產(chǎn)生單倍體和雙單倍體，通過(guò)使用AFLP分析(根據(jù)EP-534858進(jìn)行)發(fā)現(xiàn)，在所預(yù)期的雙單倍體中，某這在圖5、6和7中得到了很好的證明，所述附圖顯示，最初假定的雙單倍體(圖6)仍然含有雜合部分，根據(jù)定義這不可能在真正的雙單倍體中。該實(shí)施例表明，通過(guò)黃瓜中的雌核發(fā)育可以獲得DH,但是另外獲得了顯示出一些雜合性區(qū)域的植物。與F2代相比較，這種雜合性水平大大降低了，并因而極有可能是由SDR樣的機(jī)制引起的。實(shí)施例2甜沐權(quán)(Ca;s/c咖a/m"咖L.)中未減數(shù)孢子/配子形成的增強(qiáng)為了增加未減數(shù)孢子/配子形成的頻率，應(yīng)用冷脅迫作為誘導(dǎo)劑。為此，根據(jù)Zhang等人，(2002)JournalofHorticulturalScienc6&Biotechnology78，84-88，將含有成熟前的花芽并在23。C下生長(zhǎng)的有花甜椒植林暴露于ll'C下5天。這種冷擊后，采集花芽并且通過(guò)用解剖鑷和解剖刀打開(kāi)花藥來(lái)提取花粉。隨后將花粉轉(zhuǎn)移至顯微鏡栽玻片上，并用一滴乙酸洋紅就生存力進(jìn)行染色。將蓋玻片放在懸浮液上面，并用光學(xué)顯微鏡觀察所述懸浮液。作為對(duì)照，從在23。C下生長(zhǎng)的甜椒植株收集花粉。圖8顯示了從冷處理的植物(8A)相對(duì)于從對(duì)照植物(8B)收集的花粉的形態(tài)學(xué)的代表性實(shí)例。可以看出，對(duì)于經(jīng)冷處理的植物，具有增加的大小(表明來(lái)源于未減數(shù)孢子)的花粉的數(shù)目大大增加。在這個(gè)特定的實(shí)例中，據(jù)估計(jì)，由于冷處理，未減數(shù)孢子的％升高至25。因此，顯示出，通過(guò)溫度脅迫來(lái)增強(qiáng)未減數(shù)孢子的形成是十分可行的。實(shí)施例3通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)富集在甘藍(lán)(^"a^icsWe/^ceaL.)中自然發(fā)生的二倍體孢子對(duì)于甘藍(lán)(以及其他植物種)，已知二倍體孢子比單倍體孢子大。為了確定使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)富集二倍體孢子是否可行，制備從二倍體和四倍體植物獲得的孢子的不同混合物。通過(guò)下列方式來(lái)分離花粉在援沖溶液(8.2g/LNaCl,1,9g/LNa2HP04.2H20，0.3g/LNaH2PO,2H20，pH=7.4)中研磨花芽(大小為3-4mm),隨后經(jīng)過(guò)110)im過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將細(xì)胞用提取緩沖液洗滌兩次并計(jì)數(shù)。以下單倍體對(duì)二倍體細(xì)胞比例制備下列混合物i:i、io:l和100:1。分選基于粒度、生存力和大小這些參數(shù)來(lái)進(jìn)行。對(duì)于所有比率并基于所述三個(gè)參數(shù)中的每一個(gè)，獲得對(duì)二倍體細(xì)胞的富集。在接下來(lái)的試驗(yàn)中，基于上述參數(shù)對(duì)天然的單倍體小孢子群體進(jìn)行分選。發(fā)現(xiàn)，可以分選出二倍體小孢子，據(jù)估計(jì)所述二倍體小孢子在所述小孢子群體中以0.7%的頻率存在。圖9顯示了與正常的單倍體小孢子相比較，在該試驗(yàn)中獲得的經(jīng)純化的二倍體小孢子(較低的行)，該試驗(yàn)通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察。照片蒙Ing.N.Vennik;TN0Leiden(TheNetherlands)允許而獲得。實(shí)施例4可用于下調(diào)候選靶基因Tetraspore的RNA干擾載體的構(gòu)建為了下調(diào)特定植物物種中候選靶基因的活性，可以利用RNA干擾。為此，將擬南齊的Tetraspore的DNA片段插入至pKANNIBAL(Wesley等人，(2001)ThePlantJournal27，581—590)中，這樣一旦在植物中表達(dá)后就形成RNA分子，該RNA分子可以自身折回，因而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其引發(fā)了同源RNA的特異性降解。載體pKANNIBAL含有一個(gè)位于CaMV35S啟動(dòng)子下游的內(nèi)含子，并在上游形成章魚(yú)堿合酶多腺苷酸化信號(hào)。在該內(nèi)含子的任一側(cè)放置了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，其使得能夠方便地以相互倒轉(zhuǎn)的方向插入對(duì)應(yīng)于RNA干擾耙的DNA的左臂和右臂。一旦轉(zhuǎn)錄后，該內(nèi)含子通過(guò)剪接而除去，并且所述左臂和右臂相互折回而形成雙鏈RNA。分離兩個(gè)cDNA片段，其對(duì)應(yīng)所述基因的5，-末端(588bp,正向引物5，-ACCTCCGAGAACTCCGTTAAG-3，;反向引物:5,-TGCCTGCTTTCTACCACTTC-3，)和所述基因的中間部分(679bp,正向引物5，-TTCTCAAGTGGCAAGGTGTC-3，;反向引物:5，-ATCCCTCTTTGGTGGAGTAG-3，)。在每個(gè)片段的兩側(cè)都產(chǎn)生限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，其使得能夠?qū)⑺鯿DNA片段作為反向重復(fù)插入pKANNIBAL中。兩個(gè)片段的左臂都被改造成XhoI-KpnI片段，而兩個(gè)片段的右臂都被改造成HindII-XbaI片段。在最后一個(gè)步驟，將完成的發(fā)夾盒(含有所述兩個(gè)Tetraspore序列作為反向重復(fù))分開(kāi)插入稱(chēng)為pART27的二元載體的T-DNA中，所述二元載體含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因作為用于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記。T-DNA的完整性通過(guò)序列分析來(lái)確認(rèn)。將得到的二元載體(關(guān)于5，-片段被命名為pRZ226，以及關(guān)于3，-片段^皮命名為pRZ219)用三親交配過(guò)程(triparentalmatingprocedure)轉(zhuǎn)移至根瘤土壤桿菌(^ro6a"er/咖f咖e尸ac/e/7s)中。當(dāng)克隆的候選靶基因的片段和需要通過(guò)RNA干擾進(jìn)行下調(diào)的特定基因之間的序列相似性太低時(shí)，上面描述的方法可用于制備類(lèi)似構(gòu)建體，其含有與需要下調(diào)的基因足夠同源的DM片段。實(shí)施例5用pRZ226和pRZ219轉(zhuǎn)化擬南芥將含有所述植物轉(zhuǎn)化載體pRZ226和pRZ219的根瘤土壤桿菌C58菌林于29。C下在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，所述LB培養(yǎng)基含有鏈霉素(100mg/L)和壯觀霉素(300mg/L)以選擇所述栽體，以及含有利福平(40mg/L)和慶大霉素(25mg/L)以選擇所述根瘤土壤桿菌C58的背景。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，大部分如Desfeux等人，(2000)PlantPhysiology123，895-904所述，使用擬南芥花浸漬(floraldip)法。將所述細(xì)菌細(xì)胞重懸浮于花浸漬溶液(每升milliQ中有50g蔗糖+500silwettL-77表面活性劑)中。將含有多個(gè)花芽的抽莒植物浸沒(méi)于含有0D在1.0和1.5之間的土壤桿菌細(xì)胞的浸漬溶液中5-10秒，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。孵育后，將植物裝在塑料容器中以在低光照條件下保持高濕度1天，隨后讓種子在所述植物上生長(zhǎng)。通過(guò)讓經(jīng)表面消毒的種子在鋪于半強(qiáng)度MS平板上的0.1%瓊脂糖中發(fā)芽來(lái)選擇轉(zhuǎn)化體，所述MS平板含有50mg/L卡那霉素。將卡那霉素抗性的幼苗轉(zhuǎn)移至溫室中的土壤中。實(shí)施例6甘藍(lán)中自然發(fā)生的SDR事件就二倍體植物的發(fā)生對(duì)通過(guò)遠(yuǎn)源雜交在攜帶Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育性(CMC)的紅球甘藍(lán)(^rfl^/cso/eraces)上產(chǎn)生的雜種進(jìn)行篩選，所述二倍體植物在表型上與原始紅球甘藍(lán)CMS植物近乎相同，并且因而是體內(nèi)雌核發(fā)育的結(jié)果。可基于它們的表型容易地與真正的雜種植物相區(qū)分的這些植物確實(shí)經(jīng)鑒定具有低的頻率。這些植物通過(guò)孤雌生殖而源于自發(fā)加倍的減數(shù)配子，或源于未減數(shù)配子。為了區(qū)分這些可能性，使用AFLP(根據(jù)EP-534858進(jìn)行)來(lái)分析源于這些植物的DM。該分析證明了存在相對(duì)較低頻率的雜合基因座，這表明這種植物源于未減數(shù)配子。該實(shí)施例顯示出，通過(guò)甘藍(lán)中的體內(nèi)雌核發(fā)育，可獲得具有相對(duì)較低水平的雜合性的植物，所述雜合性可能是由SDR樣的機(jī)制引起的。圖IO顯示了來(lái)源于未減數(shù)配子的甘藍(lán)植物的AFLP指紋圖譜。灰色線條表示來(lái)自一個(gè)親本的純合標(biāo)記召喚(call)，暗灰色來(lái)自另一親本。淺灰色表示雜種標(biāo)記基因座。實(shí)施例7玉米中的近反向育種將核酸整合入玉米的基因組中是本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，并且已經(jīng)描述了如何完成該過(guò)程的方法(EP-801134;US-5,489，520;EP-97.114654.3)。使用在這些專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的轉(zhuǎn)化方法中的任何一種，引入核酸序列，其對(duì)參與第二次減數(shù)分裂的基因，特別是elongatel(Barell，PJ和Grossniklaus，U.(2005)PlantJ.43，309-320)產(chǎn)生特異抑制效果，并因而導(dǎo)致SDR類(lèi)型的異常減數(shù)分裂事件發(fā)生。由于轉(zhuǎn)基因核酸序列整合的不同基因組位點(diǎn)，所獲得的SDR-事件的頻率有時(shí)候在獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體之間不同。在另一試驗(yàn)中，通過(guò)用低溫處理玉米植抹，或通過(guò)如Kato，A和Birchier，JA(2006)J.Hered.1，39-44所述，施加一氧化氮?dú)怏w來(lái)增加SDR孢子的頻率。由于所述抑制性核酸的活性或者應(yīng)用了低溫或一氧化氮處理，產(chǎn)生了許多SDR類(lèi)型的小孢子或大孢子?；赟DR小孢子在大小上與正常單倍體小孢子相比較而言較大這樣一個(gè)事實(shí)，通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)或焚光激活細(xì)胞分選術(shù)來(lái)富集如此產(chǎn)生的細(xì)胞群體中存在的SDR-0小孢子。由于SM-事件而產(chǎn)生的小孢子或大孢子含有一套二倍染色體。這些二倍體小孢子或大孢子是用于產(chǎn)生SDR-0再生體的起始材料。物。在這種情形中，獲得了含有單倍體胚的種子，參見(jiàn)例如RotarencoV(2002)Productionofmatroclinousmaizehaploidsfollowingnaturalandartificialpollinationwithahaploidinducer.MaizeGeneticsCooperationNewsLetter76:16。上述的用于產(chǎn)生DH玉米植物的方案也應(yīng)用于從SDR-Q細(xì)胞產(chǎn)生SDR-0玉米胚，所述了在SDR-0谷粒的胚乳中的母本和父本基因組之間獲得正確的平衡，還利用四倍體誘導(dǎo)品系。在其中應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移來(lái)誘導(dǎo)SDR的特定試驗(yàn)中，含有單個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體是優(yōu)選的。在獲得含有極大地抑制第二次減數(shù)分裂的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因品系后，將該品系用于雜交以避免反復(fù)的轉(zhuǎn)化事件。在那種情況中，含有單倍體配子的正?；ǚ鄣念l率低但仍足以用于雜交。在一個(gè)進(jìn)一步的試驗(yàn)中，使用了由啟動(dòng)子控制的抑制性核酸構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子可通過(guò)例如地塞米松來(lái)化學(xué)請(qǐng)導(dǎo)(Bohner，S.等人，(1999)PlantJ.19，87-95)。然后按常規(guī)從小孢子獲得玉米中的單倍體(PescitelliS和PetolinoJ(1988)PlantCellReports7:441-444;Co謹(jǐn)nsM等人，(1989)PlantCellReports7:618-621;PescitelliS等人，(1989)PlantCellReports7:673-676;ButerB(1997)Invitrohaploidproductioninmaize.In:InVitroHaploidProductioninHigherplants,vol4，37-71.KluwerAcademicPublishers.Eds.;SJain,S10Sopory&RVeilleux)。獲得(RotarencoV(2002)MaizeGeneticsCooperationNewsLetter76:16)。在這種情形中，獲得了含有單倍體胚的種子。將上述用于產(chǎn)生DH玉米植物的方案應(yīng)用于從SDR-0細(xì)胞產(chǎn)生SDR-0玉米胚，所述SDR-0細(xì)胞的形成是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移或通過(guò)本實(shí)施例中詳細(xì)說(shuō)明的其他處理方法來(lái)誘導(dǎo)。關(guān)于每條染色體的著絲粒區(qū)，用分子標(biāo)記來(lái)對(duì)所述SDR-0玉米植物進(jìn)行遺傳表征，所述分子標(biāo)記對(duì)于在原始的起始植物中的這些區(qū)域來(lái)說(shuō)是多態(tài)性的。為了檢測(cè)所述多態(tài)性，使用了選自CAPS、dCAPS、Invader、pyrosequencing、taqman的不同技術(shù)。因而，鑒定了就著絲粒區(qū)的標(biāo)記得分而言對(duì)于所有染色體對(duì)來(lái)說(shuō)互補(bǔ)的SDR-0玉米植物對(duì)。然后將這樣的SDR-0玉米植物對(duì)用于產(chǎn)生每抹SDR-0互補(bǔ)植物的雙單倍體植物。將從每林互補(bǔ)SDR-0植物獲得的單獨(dú)的DH成對(duì)雜交，即用于產(chǎn)生玉米Fl雜種的兩個(gè)DH源于互補(bǔ)SDR-0事件中的任一個(gè)?；ヒ椎剡M(jìn)行這種雜交。將如此產(chǎn)生的Fl雜種在田間試驗(yàn)中評(píng)估農(nóng)學(xué)性能，其中起始Fl雜種用作對(duì)照。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本發(fā)明的近反向育種獲得的雜種的農(nóng)學(xué)性能與原始雜種的性能相似。實(shí)施例8黃瓜中的近反向育種對(duì)于黃瓜來(lái)說(shuō)雌核發(fā)育是一種完全確立的技術(shù)，并根據(jù)EPQ374755中描述的方法來(lái)進(jìn)行。當(dāng)根據(jù)EP0374755進(jìn)行應(yīng)用時(shí)在雌核發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的自發(fā)性SDR事件導(dǎo)致形成具有一些殘留雜合性的二倍體再生體。這些SDR-0黃瓜植物用AFLP分析來(lái)鑒定，所述AFLP分析根據(jù)EP534858中提供的方法進(jìn)行。關(guān)于每條染色體的著絲粒區(qū)，用分子標(biāo)記來(lái)對(duì)如此獲得的SDR-O黃瓜植物進(jìn)行遺傳表征，所述分子標(biāo)記對(duì)于在原始的起始植物中的這些區(qū)域來(lái)說(shuō)是多態(tài)性的。為了檢測(cè)所述多態(tài)性，使用了選自CAPS、dCAPS、Invader、pyrosequencing、taqman的已知技術(shù)。這導(dǎo)致了SDR-0黃瓜植物對(duì)的鑒定，所述黃瓜植物對(duì)就著絲粒區(qū)的標(biāo)記得分而言對(duì)于所有染色體對(duì)來(lái)說(shuō)是互補(bǔ)的。隨后根據(jù)EPG374755中描述的方法，將這樣的SDR-O黃瓜植物對(duì)用于產(chǎn)生每林SDR-O互補(bǔ)植物的DH植物。丟棄自發(fā)發(fā)生的SDR事件，并僅將真正的雙單倍體植物用于進(jìn)一步的步驟中。如果獲得了單倍體植物，就將染色體數(shù)目加倍，例如通過(guò)應(yīng)用秋水仙素。所迷的染色體加倍也可以自發(fā)發(fā)生。隨后，將從每林互補(bǔ)SDR-0植物獲得的單獨(dú)的DH植物成對(duì)雜交，即用于產(chǎn)生黃瓜Fl雜種的兩個(gè)DH源于互補(bǔ)SDR-0事件中的任一個(gè)?；ヒ椎剡M(jìn)行這種雜交。將如此產(chǎn)生的Fl雜種在試驗(yàn)中評(píng)估農(nóng)學(xué)性能，其中起始F1雜種用作對(duì)照。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本發(fā)明的近反向育種獲得的雜種的農(nóng)學(xué)性能與原始Fl雜種的性能相似。權(quán)利要求1.用于從雜合非人生物體產(chǎn)生純合非人生物體的方法，所述純合生物體可以進(jìn)行雜交而獲得雜種，所述方法包括a)提供雜合起始生物體；b)讓所述生物體產(chǎn)生源于第二次分裂重建的SDR-0細(xì)胞；c)從所述SDR-0細(xì)胞再生SDR-0生物體；和d)從如此獲得的SDR-0生物體產(chǎn)生純合生物體。2.權(quán)利要求l的方法，其中產(chǎn)生SDR-0細(xì)胞而不干擾起始生物體。3.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生所述SDR-0細(xì)胞的生物體經(jīng)選擇而顯示出高于平均的第二次分裂重建。4.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生所述SDR-0細(xì)胞的生物體經(jīng)遺傳修飾而顯示出高于平均的第二次分裂重建。5.權(quán)利要求5的方法，其中所述遺傳修飾是暫時(shí)的。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述遺傳修飾是通過(guò)將增加生物體中第二次分裂重建事件數(shù)目的遺傳元件穩(wěn)定地整合入基因組中。7.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生所述SDR-0細(xì)胞的生物體受到環(huán)境脅迫而顯示出高于平均的第二次分裂重建。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述環(huán)境脅迫選自溫度脅迫、N02、一氧化二氮N20或它們的組合。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述純合生物體通過(guò)雙單倍體技術(shù)、近交、第二次分裂重建或其組合來(lái)制備。10.用于產(chǎn)生雜種的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求l-9中任一項(xiàng)產(chǎn)生的第一種純合生物體與第二種純合生物體雜交。11.權(quán)利要求10的方法，其中第二種純合生物體與第一種純合生物體至少部分互補(bǔ)，這樣得到的雜種與所述雜合起始生物體類(lèi)似。12.權(quán)利要求11的方法，其中與所述雜合起始生物體的類(lèi)似包括具有至少50%的起始生物體的雜合性的雜種。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述雜合性的類(lèi)似是50%-100%之中的任何百分?jǐn)?shù)。14.權(quán)利要求11、12或13的方法，其中所述雜合性的類(lèi)似是50%-60%之中，優(yōu)選60%-70%之中，更優(yōu)選70%-80°/。之中，更加優(yōu)選80%-90%之中，以及最優(yōu)選90%-100°/。之中的任何百分?jǐn)?shù)。15.權(quán)利要求10的方法，其中選擇第二種純合生物體，從而使得得到的雜種優(yōu)于所述雜合起始生物體。16.權(quán)利要求10的方法，其中選擇第二種純合生物體，從而使得僅一亞群的其染色體與第一種純合生物體的對(duì)應(yīng)染色體互補(bǔ)。17.權(quán)利要求16的方法，其中剩下的染色體在第一種和第二種純合生物體之間是相同的。18.用于在具有所期望的遺傳背景的生物體中漸滲入性狀的方法，所述方法包括下述步驟a)將具有所期望的遺傳背景的第一種生物體與具有所期望的性狀的第二種生物體雜交以獲得雜合起始生物體；b)讓所述生物體產(chǎn)生源于第二次分裂重建的SDR-0細(xì)胞；c)從所述SDR-0細(xì)胞再生SDR-0生物體；d)選擇具有所期望的性狀和所期望的背景的SDR-O生物體；和e)從所選擇的SDR-0生物體產(chǎn)生純合生物體。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述SDR-0細(xì)胞是如權(quán)利要求2-8中所定義的而獲得的。20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述純合生物體通過(guò)雙單倍體技術(shù)、近交、第二次分裂重建或其組合來(lái)制備。21.權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇是基于目視檢查或借助于分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行。22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體是植物。23.可通過(guò)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法而獲得的純合非人生物體。24.可通過(guò)權(quán)利要求10-21中任一項(xiàng)的方法而獲得的雜種非人生物體。25.權(quán)利要求23或24的非人生物體，其中所述生物體是植物。26.來(lái)自權(quán)利要求23、24或25的生物體的子代。27.來(lái)自權(quán)利要求23、24或25的生物體或者權(quán)利要求26的子代的細(xì)胞。28.來(lái)自權(quán)利要求23、24或25的生物體或者權(quán)利要求26的子代的組織。全文摘要本發(fā)明涉及用于從雜合非人生物體產(chǎn)生純合非人生物體的方法，所述純合生物體可以進(jìn)行雜交而獲得雜種，所述方法包括提供雜合起始生物體；讓所述生物體通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生SDR-0細(xì)胞，所述細(xì)胞源于第二次分裂重建；從所述SDR-0細(xì)胞再生SDR-0生物體；以及從如此獲得的SDR-0生物體產(chǎn)生純合生物體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生雜種的方法，所述方法包括將根據(jù)上面的方法產(chǎn)生的第一種純合生物體與第二種純合生物體雜交。此外，本發(fā)明提供了通過(guò)這些方法可獲得的純合非人生物體和雜種非人生物體。本發(fā)明特別涉及植物。文檔編號(hào)C12N15/82GK101160404SQ200680012445公開(kāi)日2008年4月9日申請(qǐng)日期2006年3月2日優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日發(fā)明者C·M·P·梵鄧恩,R·H·G·迪克斯申請(qǐng)人:瑞克斯旺種苗集團(tuán)公司