專利名稱：細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入促進(jìn)劑以及導(dǎo)入方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì) 導(dǎo)入促進(jìn)劑,以及采用該導(dǎo)入促進(jìn)劑向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)的方法，更詳細(xì)的 是，使用以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促 進(jìn)劑，向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入精子、細(xì)胞核、核酸、蛋白質(zhì)等細(xì)胞外物質(zhì)的方法，以及 用于該方法的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑。本發(fā)明的一個(gè)特征在于提供通過 以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑的處 理，試圖提高哺乳動(dòng)物卵的受精能力的提高，促進(jìn)精子向哺乳動(dòng)物細(xì)胞卵內(nèi)的導(dǎo)入， 從而促進(jìn)哺乳動(dòng)物的卵子受精的方法。
背景技術(shù)：
在基因治療、生殖醫(yī)療或采用發(fā)育工程的哺乳動(dòng)物的改變的領(lǐng)域中，為了改變生 殖細(xì)胞，將精子、細(xì)胞核、核酸等細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵中。以往，已知有在哺 乳動(dòng)物卵等細(xì)胞中導(dǎo)入基因(核酸)物質(zhì)時(shí)，采用逆轉(zhuǎn)路病毒等載體導(dǎo)入的方法(W097/18318)，在向哺乳動(dòng)物卵導(dǎo)入精子或細(xì)胞核等細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)， 一般采用以玻璃 毛細(xì)管在卵的細(xì)胞膜上鉆孔來注入的方法(intracytoplasmic sperm injection:ICSI)，在 向包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物卵導(dǎo)入精子的方法中，這種ICSI法是主流(特開平5-38345 號(hào)公報(bào))，也被廣泛應(yīng)用于人的不育治療中。不過，作為將細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵 的方法，ICSI法有許多問題。也就是說，人們認(rèn)為ICSI法的問題有(1)在用ICSI法 向哺乳動(dòng)物卵中實(shí)質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)需要技術(shù)上的培養(yǎng)，(2)用ICSI法向哺乳動(dòng)物 卵中導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)的方法成功率低，(3)ICSI法，由于通過用玻璃毛細(xì)管在卵細(xì)胞膜 上開孔進(jìn)行，因此開孔對(duì)胚胎發(fā)生造成不良影響等。但是，由于沒有代替ICSI法的方 法，盡管已經(jīng)指出了以上問題，但目前仍采用ICSI法。另一方面，通過受精進(jìn)行精子向哺乳動(dòng)物卵的導(dǎo)入，但是提出了促進(jìn)精子向哺乳 動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的幾種方法。例如，在特表平8-503705號(hào)公報(bào)中公開了通過給藥胸腺 激素a1等受精促進(jìn)胸腺激素'多肽來促進(jìn)受精，進(jìn)行哺乳動(dòng)物雄性的不育癥的治療的 方法，在特開平9-28721號(hào)公報(bào)中公開了將牛精子與牛卵管上皮細(xì)胞一起培養(yǎng)后，與 牛卵子一起培養(yǎng)使之體外受精，使牛精子的體外受精能力提高的方法。
而且，在特表2001-506225號(hào)公報(bào)中公開了為了促進(jìn)哺乳動(dòng)物的卵子受精，使用血管 緊張素II的方法，特開平6-189650號(hào)公報(bào)中公開了通過使磁力作用于精子和卵子， 使活性提高，試圖提高受孕率的方法，并且，在特表2001-500102號(hào)公報(bào)中公開了使 用在10-12%的甘油的存在下凍結(jié)和解凍的精液懸浮液的通過離心純化的多肽-包括7° ^(SGP-1)和廿求〉 >的一組蛋白質(zhì)的成員的多肽，試圖改善精子-卵子的結(jié) 合并促進(jìn)受精能力。這些均為在哺乳動(dòng)物的卵子受精時(shí)使卵子和精子活性化，以促進(jìn) 其受精的效果為目標(biāo)的方法。另一方面，已知在動(dòng)物'植物'真菌等真核生物的細(xì)胞中，存在著廣泛存在于該細(xì)胞 中的直徑25nm左右的管狀蛋白質(zhì)纖維的稱之為微小管的細(xì)胞器。作為其功能，有絲 分裂裝置的形成，細(xì)胞形態(tài)的形成與維持、鞭毛'纖毛運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的配置、物 質(zhì)輸送、激素分泌、細(xì)胞膜的流動(dòng)性等。尤其是，作為神經(jīng)細(xì)胞中軸突和樹狀突起的 主要構(gòu)成分子存在，作為動(dòng)力蛋白的軌道對(duì)物質(zhì)的輸送起作用。通常，微小管通過有 規(guī)則地聚合由a-、 p-微觀蛋白各1分子構(gòu)成的異二聚物而形成，通過伴隨細(xì)胞周期的 進(jìn)行的聚合/解聚反復(fù)消長。而且，這些微小管被微小管結(jié)合蛋白(MAPs、 T蛋白質(zhì))控 制其聚合/解聚，以這些微小管結(jié)合蛋白質(zhì)為底物的蛋白質(zhì)磷酸化酶(激酶)和蛋白質(zhì)脫 磷酸化酶與其控制機(jī)制相關(guān)。由此可知，作用于該微小管系的化合物顯示出細(xì)胞分裂 抑制等各種生物活性。如上所述，微小管是有絲分裂時(shí)將排列在赤道板上的染色體導(dǎo)向兩極的分裂紡錘 絲的主要成分，分裂期間細(xì)胞的形狀、運(yùn)動(dòng)性和附著的維持和包括細(xì)胞內(nèi)輸送的許多 細(xì)胞作用中起著不可缺少的作用(Shiff,P.B. and Horwitz， S.B.，1981 ,"抗癌化學(xué)療法劑 中分子作用和目標(biāo)"的項(xiàng)"微管蛋白化學(xué)療法劑的目標(biāo)"，pp483-507，Academic Press, NY, USA; Glotz，丄S. et al.，1990，Nature，82:1247-1259)。它們?cè)谡{(diào)節(jié)由其它成長因子 與細(xì)胞表面上的受體的相互作用以及它們的相互作用誘導(dǎo)的膜通透性的增殖信號(hào)中十 分重要。對(duì)于受精與細(xì)胞骨架的關(guān)系，也有人進(jìn)行了報(bào)道(MolecularR印roduction and Development,56:89-98,2000)。微管蛋白是微小管的主要構(gòu)成蛋白質(zhì)，是細(xì)胞分裂增殖所不可缺少的蛋白質(zhì)，是 所謂的細(xì)胞骨架的要素。因此，微管蛋白的聚合抑制或解聚與細(xì)胞的分裂增殖相互之 間有著重要的關(guān)系。根據(jù)這種微管蛋白的功能，微管蛋白作為抗癌劑，抗真菌劑，除 草劑的目的是公知的，其與生命科學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用兩方面都深切相關(guān)。作為微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)，迄今為止已經(jīng)知道了許多?，F(xiàn)在，作為總所周知 的用于癌的處置的微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)，有長春生物堿(特開平5-192174號(hào)公 報(bào))。長春生物堿是一種抗癌劑的總稱，由于其成分是從植物提取的，因此與稱之為微
管蛋白的與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和形態(tài)的保持相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制微小管，從而抑制細(xì)胞 分裂。以長春生物堿為代表的物質(zhì)中有長春花堿和長春新堿(丄Med.Chem.34:1998，1991)。長春花堿是長春花(Catharanthus roseus)中包含的生物堿中具有抗腫瘤作用的吲哚生物堿，具有作用于微小管或其構(gòu)成蛋白質(zhì)-微管蛋白， 在中期使細(xì)胞的有絲分裂停止，阻礙細(xì)胞分裂的作用?，F(xiàn)在，長春新堿可用于白血病， 惡性淋巴瘤，小兒腫瘤等，長春花堿可用于非小細(xì)胞癌。長春花堿，近年來已通過合 成法而制造(特開2003-64084號(hào)公報(bào))。此外，作為微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)，已知有根瘤菌素(rhizoxin) (Tetrahedron Lett. ，34:1035,1993) ， - > 7夕7 * > (Biochemistry，28:6984，1989;特開平 6-207264 號(hào)公報(bào))，2- 7 f 'J A * 于、/ D > -4(3H)-才 > (SQO)(丄Med.Chem.，33:1721 ，1990)，八D ^夕* > 1、 2(特開平6-279450號(hào)公報(bào)； 特開平6-279451號(hào)公報(bào))禾卩Pironetin或其衍生物(特開平11-1434號(hào)公報(bào))等許多物質(zhì)， 人們?cè)噲D將它們利用為抗腫瘤劑等。專利文獻(xiàn)1:特開平5-38345號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)2:特開平5-192174號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)3:特開平6-189650號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)4:特開平6-207264號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)5:特開平6-279450號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)6:特開平6-279451號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)7:特開平9-28721號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)8:特開平11-1434號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)9:特開2003-64084號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)10:特表平8-503705號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)11:特表2001-500102號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)12:特表2001-506225號(hào)公報(bào)。 專利文獻(xiàn)13: W097/18318。非專利文獻(xiàn)1: Shiff，P.B. and Horwitz， S.B.，1981，"抗癌化學(xué)療法劑中分子作用和 目標(biāo)"的項(xiàng)"微管蛋白化學(xué)療法劑的目標(biāo)"，pp483-507，Academic Press, NY, USA。非專利文獻(xiàn)2: Glotz，丄S. et al.，1992, Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,89:7026陽7030。 非專利文獻(xiàn)3: Rowinsky， E. K. et al.， 1990，Nature, 82:1247-1259。 非專禾U文獻(xiàn)4: Molecular Reproduction and Development,56:89-98'2000。 非專利文獻(xiàn)5:丄Med.Chem.34:1998,1991 。 非專利文獻(xiàn)6: Tetrahedron Lett.，34:1035,1993。 非專利文獻(xiàn)7: Biochemistry, 28:6984， 1989。 非專利文獻(xiàn)8:丄Med.Chem.，33:1721,1990。發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的在于，提供在向哺乳動(dòng)物卵中導(dǎo)入精子、細(xì)胞核、核酸、蛋白質(zhì)等 細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物卵可以安全有效導(dǎo)入，并且技術(shù)上容易操作的將細(xì)胞外物 質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的方法。進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入精子 時(shí)，技術(shù)容易且對(duì)哺乳動(dòng)物卵傷害小的精子向哺乳動(dòng)物卵導(dǎo)入的方法。用于解決問題的方法本發(fā)明人對(duì)于向哺乳動(dòng)物卵中導(dǎo)入精子等細(xì)胞外物質(zhì)的方法，進(jìn)行了積極的研究， 其中，發(fā)現(xiàn)用長春花堿等微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)，通過處理哺乳動(dòng)物卵，可以促進(jìn) 卵子和精子的膜融合，不會(huì)在卵細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔，通過融合精子和卵子，可以進(jìn)行受 精，從而完成本發(fā)明。如果要更詳細(xì)地說明，向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入精子等細(xì)胞外物質(zhì)的以往的方法由于 采用以玻璃毛細(xì)管在卵子的細(xì)胞膜上鉆孔的ICSI法，技術(shù)難，成功率低，而且，由于 玻璃毛細(xì)管在卵細(xì)胞膜上打孔，因此對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響。因此，本發(fā)明人在對(duì) 技術(shù)容易且對(duì)卵傷害小的精子導(dǎo)入法進(jìn)行的積極研究中，著眼于促進(jìn)精子與卵子的細(xì) 胞膜間的融合的哺乳動(dòng)物卵用的精子導(dǎo)入促進(jìn)劑的開發(fā)。為了通過精子和卵的融合制作受精卵，細(xì)胞膜間的融合是必須的?？刂剖芫哪?融合的分子機(jī)制的具體情況并不清楚，但是根據(jù)最近的發(fā)明者的研究，漸漸清楚了以 微管蛋白作為構(gòu)成單位的微小管起著重要的作用。因此，對(duì)于微管蛋白的聚合促進(jìn)劑 和抑制劑在受精的膜融合中的效果進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)-長春花堿具有促進(jìn)精子與卵細(xì)胞膜的融合的作用。于是發(fā)現(xiàn)，通過這種藥物處理，可 以不在卵細(xì)胞膜上打孔而導(dǎo)入精子。也就是說，為了研究通過長春花堿處理促進(jìn)膜融合的機(jī)制，研究了長春花堿處理 后體外受精的小鼠卵內(nèi)的膜蛋白質(zhì)的定位。其結(jié)果是，被認(rèn)為控制膜融合的膜4次貫 通型蛋白質(zhì)CD9的定位和野生型不同。根據(jù)迄今為止的研究表明，為了引起受精的膜 融合，必須由精子在卵的細(xì)胞膜上瞬間形成不存在CD9的區(qū)域。清楚了，通過長春花 堿處理，在精子結(jié)合前形成不存在CD9的圓形區(qū)域。但是，精子融合只在不存在CD9 的區(qū)域的中心這一個(gè)區(qū)域發(fā)生。
本發(fā)明是基于上述見解形成的，本發(fā)明的方法不僅可在向哺乳動(dòng)物卵中導(dǎo)入精子 時(shí)使用，還可以在向哺乳動(dòng)物卵中導(dǎo)入細(xì)胞核、核酸、蛋白質(zhì)等細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)使用。 也就是說，本發(fā)明由使用以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì) 胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑向哺乳動(dòng)物卵中導(dǎo)入精子、細(xì)胞核、核酸、蛋白質(zhì)等細(xì)胞外物質(zhì) 的方法，以及用于此目的的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑構(gòu)成。進(jìn)而，本發(fā)明 的一個(gè)方式由以下方法構(gòu)成通過使用以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺 乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑的處理，試圖提高哺乳動(dòng)物卵的受精能力，通過促 進(jìn)精子向哺乳動(dòng)物卵中的導(dǎo)入，促進(jìn)哺乳動(dòng)物的卵子的受精的方法。也就是說，具體而言，本發(fā)明由以下內(nèi)容構(gòu)成(1)、以微管蛋白的聚合抑制物 質(zhì)作為有效成分的用于將細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入 促進(jìn)劑；和(2)、上述(1)記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在于微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)為長春花堿；(3)、上述(1)或(2)記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在于細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵中的導(dǎo)入為精子向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入；和(4)、上述(3)記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在于精 子向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入由于哺乳動(dòng)物卵的受精能力的提高而受到促進(jìn)；和(5)、上 述(1)-(4)任一項(xiàng)記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在于哺乳動(dòng)物為 人；和(6)、上述(1)-(4)任一項(xiàng)記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在 于哺乳動(dòng)物為小鼠、大鼠、兔、牛、豬、馬、綿羊和猴中的任意一種。此外，本發(fā)明還由以下內(nèi)容構(gòu)成(7)、細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于在向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)，用以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑處理哺乳動(dòng)物卵；和(8)、上述(7)記 載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于在向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞 外物質(zhì)時(shí)，用長春花堿處理哺乳動(dòng)物卵；和(9)、上述(7)或(8)記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺 乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入是精子向哺乳 動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入；和(10)、上述(9)記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入是通過在哺乳動(dòng)物的體外卵子與精子的融合進(jìn)行的；和(11)、 上述(9)或(10)記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于精子向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入由于哺乳動(dòng)物卵的受精能力的提高而受到促進(jìn)；和(12)、上述(11)記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物卵的受精能力的提高是促進(jìn)精子與卵細(xì)胞膜的融合。


圖1:表示在本發(fā)明的實(shí)施例中，用微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)-長春花堿處理除去 透明帶的小鼠未受精卵后，與小鼠精子進(jìn)行體外受精的結(jié)果中，融合的精子數(shù)的結(jié)果。圖2:表示在本發(fā)明的實(shí)施例中，用微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)-長春花堿處理除去 透明帶的小鼠未受精卵后，與小鼠精子進(jìn)行體外受精的結(jié)果中，受精的卵的比例的結(jié) 果。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明由以下內(nèi)容構(gòu)成在向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)，用以微管蛋白的 聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑處理哺乳動(dòng)物卵， 向哺乳動(dòng)物卵中導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)。本發(fā)明中，作為哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn) 劑的有效成分使用的微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)，可以使用作為微管蛋白的聚合抑制劑 的公知的微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)。作為微管蛋白的聚合抑制劑，可以例舉有長春生 物堿，作為這種長春生物堿的代表物質(zhì)，可以例舉有長春花堿和長春新堿。作為本發(fā) 明的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑的有效成分，作為特別優(yōu)選者，可以列舉長 春花堿。作為本發(fā)明中作為對(duì)象的哺乳動(dòng)物卵，沒有特別的限制，可以列舉有人，小鼠， 大鼠，牛，豬，馬，綿羊和猴等的卵子。本發(fā)明的細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞卵的方法 可以適用于精子，細(xì)胞核，核酸，蛋白質(zhì)等細(xì)胞外物質(zhì)，但是本發(fā)明的細(xì)胞外物質(zhì)的 導(dǎo)入方法特別適用于精子向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入，可以提供作為有效的哺乳動(dòng)物卵的 受精方法。在本發(fā)明中，用以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外 物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑處理哺乳動(dòng)物卵時(shí)，可以通過在采取卵子后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如，TYH培養(yǎng)基)中培養(yǎng)后，在添加了微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)的培養(yǎng)基中，通過數(shù)小時(shí)的 培養(yǎng)來進(jìn)行。以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些 例示的限制。實(shí)施例1[受精效率通過長春花堿處理而增加]為了研究小鼠未受精卵的受精中微管蛋白的聚合抑制劑的影響，使用長春花堿作 為微管蛋白的聚合抑制劑，用長春花堿處理小鼠未受精卵，調(diào)査其受精能力。(材料和實(shí)驗(yàn)條件) 1.培養(yǎng)組成(g/L)(TYH培養(yǎng)基)NaCI6.976KCI_0.356CaCI20.190KH2P040.162MgS04.7H202.930NaHC032.106葡萄糖1.000丙酮酸鈉0.550青霉素G0.750鏈霉素0.050牛血清白蛋白F-V 4.0001%酚紅1.0ml2.酸性Tyrode液(g/L)NaCI8.00KCI0.20CaCI2-2H200.24MgCI26H200.10葡萄糖1.00用HCI調(diào)配成pH2.5，過濾滅菌。3.培養(yǎng)溫度37°C(實(shí)驗(yàn)操作)1.采卵(1)買入生后8周以上的小鼠，使用前1周使之順應(yīng)伺育環(huán)境。午后8小時(shí)時(shí)，在小鼠腹腔注入平均0.1mLPMS(A t力'制藥(株)動(dòng)物專用七口卜口匕° >)。
(2) 48小時(shí)后，在腹腔注入平均0.1mLHCG(A十力、制藥(株)動(dòng)物專用促性腺激素)。(3) 次日(注入HCG后，14-16小時(shí)后)，使小鼠安樂死，取出卵管膨大部分，回收由卵 丘圍住的卵子，在一滴(100yL)內(nèi)的TYH培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(4) 通過透明質(zhì)酸酶(300pg/ml)處理除去卵丘細(xì)胞。然后，在TYH培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時(shí)。 除去透明帶時(shí)，通過酸性Tyrode液處理除去卵子的透明帶后，在TYH培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3小時(shí)。2. 用微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)進(jìn)行處理用長春花堿(VB)作為微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)處理采集的小鼠未受精卵。作為對(duì) 照，使用微管蛋白的聚合促進(jìn)物質(zhì)紫杉醇(Pac)(商品名taxol)和未處理(對(duì)照)的未受 精卵。長春花堿(VB)的處理，以2(HiM長春花堿溶液(TYH培養(yǎng)基)，通過1小時(shí)培養(yǎng) 進(jìn)行處理，紫杉醇(Pac)的處理以10yM紫杉醇(Pac)溶液(TYH培養(yǎng)基)通過同樣的培 養(yǎng)1小時(shí)進(jìn)行處理。3. 體外受精用微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)-長春花堿(VB)處理小鼠未受精卵后，與小鼠精子進(jìn)行 體外受精。使用微管蛋白的聚合促進(jìn)物質(zhì)-紫杉醇(Pac)和未處理(對(duì)照)的未受精卵作為 對(duì)照。隙果〗(使用透明帶除去卵的情況)為了定量精子與卵的融合效率，用微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)-長春花堿(VB)，微管 蛋白的聚合促進(jìn)物質(zhì)-紫杉醇(Pac)處理除去了透明帶的小鼠未受精卵后，或在未處理 (對(duì)照)中，進(jìn)行與小鼠精子的體外受精的結(jié)果示于圖1。圖中，表示體外受精(透明帶 除去卵，受精后1小時(shí))的結(jié)果。圖中，白條表示融合的精子數(shù)。1小時(shí)后的融合的精 子數(shù)，VB(長春花堿)處理卵最多，紫杉醇(Pac)處理的未受精卵，由于精子難以融合， 因此多數(shù)精子附著于卵子表面而無法融合。(使用透明帶非除去卵的情況)用微管蛋白的聚合抑制劑-長春花堿對(duì)沒有進(jìn)行除去透明帶等特殊處理的排卵后 的小鼠未受精卵立即進(jìn)行處理后，進(jìn)行與小鼠精子的體外受精。結(jié)果示于圖2。在該 實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)使用具有融和抑制效果的抗小鼠CD9抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠的情況是，百 分之二左右的卵由于未成熟以及過于成熟而無法受精。但是，通過2細(xì)胞期胚的數(shù)目來研究受精效率，與未處理卵相比，長春花堿處理卵中受精效率上升百分之二。如下 所述，未成熟卵中，通過用長春花堿處理，可以與精子融合，因此認(rèn)為通過用長春花 堿處理，精子與卵的融合效率提高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示即使在用長春花堿處理的未成熟卵和過成熟卵中，也可與精子融合。而且，即使在用具有融合抑制效果的抗小鼠CD9抗體處理的卵中，通過長春花堿的處理也可使融合效率提高。 (受精效率由于長春花堿處理而增加)用微管蛋白的聚合抑制劑-長春花堿處理小鼠未受精卵后，進(jìn)行與小鼠精子的體外 受精的結(jié)果是，與未處理組相比，受精效率增加兩個(gè)百分比。小鼠的情況是，由于兩 個(gè)百分比左右的卵未成熟，因此無法與精子融合。但是，即使在未成熟卵中，通過用 長春花堿處理，可以與精子融合。(用紫杉醇進(jìn)行的處理)一旦用微管蛋白的聚合促進(jìn)劑-紫杉醇(Pac)處理小鼠未受精卵，精子與卵膜的融 合就受到抑制。如果用電子顯微鏡研究卵膜的形態(tài)，觀察到很多變形的微絨毛。(通過長春花堿處理形成精子融合區(qū)域)研究通過長春花堿處理促進(jìn)膜融合的機(jī)制。調(diào)査長春花堿處理后，使之體外受精 的小鼠卵中的膜蛋白質(zhì)的定位。如果用微管蛋白的聚合抑制劑-長春花堿進(jìn)行處理，形 成卵膜內(nèi)的CD9的定位不發(fā)生變化的圓形區(qū)域。圓形區(qū)域的個(gè)數(shù)根據(jù)卵而不同，為 1-6個(gè)。而且，在該圓形區(qū)域中心，確認(rèn)了精子與1個(gè)卵子融合。這表明為了精子融 合，微管蛋白必須解聚。也就是說，在上述結(jié)果中，被認(rèn)為控制膜融合的膜4次貫通型蛋白質(zhì)CD9的定位 與野生型不同。根據(jù)迄今為止的研究清楚了，為了引起受精的膜融合，精子必須在卵 的細(xì)胞膜上瞬間形成不存在CD9的區(qū)域。通過長春花堿處理，清楚了精子結(jié)合前，形 成不存在CD9的圓形區(qū)域。而且，精子的融合在不存在CD9的圓形區(qū)域的中心只有 1個(gè)。而且，存在半透膜的卵的受精中，由于存在多精排除機(jī)構(gòu)，確認(rèn)導(dǎo)入的精子限 于1個(gè)。根據(jù)這些結(jié)果，清楚了通過長春花堿處理卵膜的特定的區(qū)域，不用玻璃毛細(xì) 管也可以將精子導(dǎo)入卵內(nèi)。工業(yè)上利用的可能性如果根據(jù)本發(fā)明的方法，可以提供在將精子，細(xì)胞核，核酸，蛋白質(zhì)等細(xì)胞外物 質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵時(shí)，可以對(duì)哺乳動(dòng)物卵安全有效地導(dǎo)入，并且技術(shù)簡單的向哺乳動(dòng) 物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)的方法。尤其是，本發(fā)明的方法，使用作為將精子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的方法，不使用以往的ICSI法等特殊的裝置，技術(shù)簡單且不會(huì)像ICSI法那樣的用玻璃毛細(xì)管在卵子的細(xì)胞膜上開孔的，不損傷哺乳動(dòng)物卵，就可以將精子導(dǎo)入哺 乳動(dòng)物卵。因此，本發(fā)明，在使用基因治療，生殖醫(yī)療或發(fā)育工程的哺乳動(dòng)物的改變 的領(lǐng)域中，為了受精和生殖細(xì)胞的改變，作為將精子，細(xì)胞核，核酸，蛋白質(zhì)等細(xì)胞 外物質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵的有力的手段，可以預(yù)計(jì)在該領(lǐng)域的發(fā)展中會(huì)做出很大的貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1、用于將細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物卵的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在于微管 蛋白的聚合抑制物質(zhì)為長春花堿。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在 于細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵中的導(dǎo)入為精子向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征在于精子 向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入由于哺乳動(dòng)物卵的受精能力的提高而獲得促進(jìn)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征 在于哺乳動(dòng)物為人。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)記載的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì)導(dǎo)入促進(jìn)劑，其特征 在于哺乳動(dòng)物為小鼠、大鼠、兔、牛、豬、馬、綿羊和猴中的任意一種。
7、 細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于在向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì) 胞外物質(zhì)時(shí)，用以微管蛋白的聚合抑制物質(zhì)作為有效成分的哺乳動(dòng)物卵用細(xì)胞外物質(zhì) 導(dǎo)入促進(jìn)劑處理哺乳動(dòng)物卵。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于在 向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)，用長春花堿處理哺乳動(dòng)物卵。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征 在于細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入是精子向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在于 細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入是通過在哺乳動(dòng)物的體外卵子與精子的融合進(jìn)行 的。
11、 根據(jù)權(quán)利要求9或10記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特 征在于精子向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)的導(dǎo)入由于哺乳動(dòng)物卵的受精能力的提高而獲得促進(jìn)。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11記載的細(xì)胞外物質(zhì)向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入的方法，其特征在 于哺乳動(dòng)物卵的受精能力的提高是促進(jìn)精子與卵細(xì)胞膜的融合。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在向哺乳動(dòng)物卵導(dǎo)入精子、細(xì)胞核、核酸、蛋白質(zhì)等細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)，可以對(duì)哺乳動(dòng)物卵安全有效地導(dǎo)入，并且技術(shù)上容易向哺乳動(dòng)物卵內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞外物質(zhì)的方法。通過使用長春堿等微管蛋白的聚合抑制劑，可以促進(jìn)卵子與精子的膜融合，而不在卵細(xì)胞膜上形成孔，通過融合精子和卵子，可以進(jìn)行受精。本發(fā)明的方法不僅可以在精子導(dǎo)入于哺乳動(dòng)物卵時(shí)使用，還是在向哺乳動(dòng)物卵中導(dǎo)入精子、細(xì)胞核、核酸、蛋白質(zhì)等細(xì)胞外物質(zhì)時(shí)使用。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101160398SQ200680012870
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2006年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者宮戶健二, 宮戶真美, 阿久津英憲 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)