專利名稱：病毒診斷方法及其使用的池的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適于病毒診斷方法中使用的單個(gè)扁平底部型的池
(single flat-based well)。更具體地說(shuō)，該池具有與彎曲的底部相對(duì)的平 面或扁平的底部。本發(fā)明還涉及采用這種單個(gè)池的病毒診斷方法。在該方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，采用了添加有激素和酶的專門研制的組織培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
用于鑒別病毒的常規(guī)診斷過(guò)程包括下述步驟將所選的對(duì)某種病毒易 感的特定細(xì)胞系接種于容器，然后將假定含有病毒的生物樣品接種于該細(xì) 胞培養(yǎng)物。此類生物樣品除了包括其它物質(zhì)外，還包括唾液、尿、排泄物、 腦脊液(CSF)、呼吸液和諸如來(lái)自嘴、鼻腔、咽喉、皮膚和生殖器的化 驗(yàn)樣本。隨后對(duì)接種的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)并考察所述細(xì)胞經(jīng)由病毒^"發(fā) 的細(xì)胞病變效應(yīng)。由于某些病毒僅生長(zhǎng)于某些細(xì)胞，因此可以病毒i秀發(fā)細(xì) 胞病變效應(yīng)(CPE)或未誘發(fā)細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞類型為基礎(chǔ)對(duì)病毒進(jìn)行 鑒別。
對(duì)于此過(guò)程具有大量備選的實(shí)驗(yàn)方案，其包括下述步驟使已接種有 病毒制品的細(xì)胞經(jīng)受胰蛋白酶作用(trypsonisation)以便除去該細(xì)胞，隨 后使用對(duì)源自病毒的多肽具有特異性的單克隆抗體來(lái)檢測(cè)病毒，所述源自 病毒的多肽使用報(bào)道分子，比如熒光素(FITC)分子進(jìn)行標(biāo)記。另外的 備選方案包括在培養(yǎng)管內(nèi)的蓋玻片以便促進(jìn)細(xì)胞的恢復(fù)。
常規(guī)的(或傳統(tǒng)的鼓法)方法使用了接種有適當(dāng)細(xì)胞系的螺旋蓋管 (screw cap tubes)。在細(xì)胞達(dá)到約80%的融合率后，將該管接種適當(dāng)?shù)臉颖?并監(jiān)控CPE長(zhǎng)達(dá)三周。第一周須每天監(jiān)控CPE。第二周和第三周必須減 少監(jiān)控頻率。通常，需要盲傳來(lái)促進(jìn)病毒的恢復(fù)。
由于需要每天對(duì)管進(jìn)行監(jiān)控，因此常規(guī)管法的一個(gè)不利之處在于費(fèi)時(shí) 費(fèi)力。通常，為了避免主觀性，兩名人員通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)相同管的CPE
進(jìn)行檢查。此外，并不是所有病毒均能引起可見的CPE,而且并不是所有 的病毒都能通過(guò)該方法來(lái)檢測(cè)。而且，在常規(guī)的管法中監(jiān)控到的CPE信 息高度依賴于細(xì)胞系的易感性以及病毒產(chǎn)生可見CPE的能力。樣本的毒 性還可能不利地產(chǎn)生類似于病毒CPE的變化，從而得出錯(cuò)誤的結(jié)杲。此 外，某些病毒只有在很長(zhǎng)的時(shí)間周期后才產(chǎn)生CPE(例如細(xì)胞巨化病毒 (CMV))。由于通過(guò)常規(guī)管法獲得的結(jié)果主要是基于CPE檢測(cè)并且不 能按慣例通過(guò)任何其他的方法進(jìn)行確證，因此可能出現(xiàn)不準(zhǔn)確的診斷。常 規(guī)管法的另一個(gè)局限性在于每個(gè)樣本很難使用2個(gè)或3個(gè)以上的管，這可 歸因于其導(dǎo)致的管堆積。例如，僅在第一周，40個(gè)樣本每天就會(huì)產(chǎn)生500 個(gè)管。
快速培養(yǎng)法(shell vial method )是目前本領(lǐng)域4支術(shù)人員用于病毒恢復(fù) 的最先進(jìn)的方法。該方法使用具有半透明蓋子的、直徑為16 mm的5 ml 塑料瓶(快速培養(yǎng)瓶)。適當(dāng)?shù)奶幚碇?，將圓形的(13mm)蓋玻片插 入該瓶。將易感的細(xì)胞系接種于瓶中，所述細(xì)胞系在蓋玻片上單層生長(zhǎng)。 當(dāng)細(xì)胞單層達(dá)到約80-90%的融合率時(shí)，棄去培養(yǎng)基并將所述單層和瓶^妄 種上患者的樣本。隨后，監(jiān)控培養(yǎng)瓶的CPE，之后除去蓋玻片。然后將蓋 玻片固定于顯微鏡的載玻片并使用單克隆抗體染色。
快速培養(yǎng)法的優(yōu)勢(shì)在于接種后可以通過(guò)對(duì)瓶進(jìn)行離心來(lái)促進(jìn)病毒的 恢復(fù)，快速培養(yǎng)法可將獲得結(jié)果所需的時(shí)間長(zhǎng)度縮短至2-3天。此外，使 用快速培養(yǎng)法無(wú)需等待可見的CPE?？梢栽诘诙虻谌斐ドw玻片并使 用適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w進(jìn)行染色且使用抗體抗原染色來(lái)確證結(jié)果。
但是，快速培養(yǎng)法也有一些局限性。由于蓋玻片需要下述的特殊處理 因此快速培養(yǎng)法是耗時(shí)的比如使用清潔劑和丙酮多次洗滌后用蒸餾水洗 滌并滅菌。還必須人工將蓋玻片插入瓶中。此外，需要進(jìn)行熒光免疫染色 時(shí)，該過(guò)程甚至變得更復(fù)雜和耗時(shí)。而且必須棄去快速培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基 并使用特殊的鑷子人工除去蓋玻片、空氣干燥并固定于顯微鏡的載玻片 (使用真空油脂)。由于操作的疏忽，或者無(wú)意地翻轉(zhuǎn)并將顛倒的單層固
定于顯微鏡的載玻片有可能使蓋玻片破裂，因此蓋玻片的去除是令人厭煩 的。如果接種的細(xì)胞也生長(zhǎng)在蓋玻片底部上，由此造成蓋玻片固定于所述 瓶并使得蓋玻片難以去除的話，那么可能會(huì)引起另 一個(gè)不利因素
(complication)。事實(shí)上，與常規(guī)管法一樣，使用快速培養(yǎng)法不可能每 個(gè)樣本使用2個(gè)或3個(gè)以上的管，這可歸因于管堆積(即，每周40個(gè)樣 本每天會(huì)產(chǎn)生500個(gè)快速培養(yǎng)瓶)。此外，為了覆蓋13 mm的圓形蓋玻 片，熒光免疫染色需要大量的單克隆抗體。
96孔板法是僅在受限制的情況下用于恢復(fù)生長(zhǎng)于相同細(xì)胞系的病毒 的另 一種方法。例如，該池接種LLC-MK2細(xì)胞系時(shí)，副流感病毒還有流 感病毒的恢復(fù)是可能的。96孔板法具有多種優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橛锰囟ǖ臉颖具M(jìn) 行被接種細(xì)胞系的接種時(shí)操作相對(duì)容易。此外，可以在同一板上接種大量 的樣本并且經(jīng)由離心的促進(jìn)作用也是可能的。而且，96孔板法僅需要少 量的培養(yǎng)基(為0.3 ml,而不是快速培養(yǎng)法中使用的1-1.5 ml);可以使 用抗原抗體技術(shù)確證結(jié)果并且該方法還能夠容易地"讀出"所監(jiān)控的CPE。
然而，96孔板法也有其不利之處。其必須將整個(gè)板用于抗原抗體才全 測(cè)，這通常很難實(shí)現(xiàn)以及必須在同一天使用整個(gè)板，甚至當(dāng)樣本的數(shù)目小 于整塊板所需的樣本數(shù)目時(shí)也必須使用整個(gè)板。這就意味著每天必須使用 一套新的不同的板。這就不利地導(dǎo)致了下述情況即檢測(cè)一經(jīng)完成，在結(jié) 果錯(cuò)誤或者延長(zhǎng)接種期后就無(wú)剩余的細(xì)胞可以用于重復(fù)所述過(guò)程。而且， 每塊板通常只可使用 一種或兩種不同的細(xì)胞系并且需將相同類型的樣本 接種于板上。
如澳大利亞創(chuàng)新專利第2001100242號(hào)中所描述的單孔法(Single well methodology)緩解了與以上描述的常規(guī)方法相關(guān)的問(wèn)題，并且提供了一 種用于進(jìn)行病毒診斷的備選的、有效和經(jīng)濟(jì)的方法。該專利的全部公開內(nèi) 容在此完整引入作為參考。
當(dāng)扁平底部型池用于診斷測(cè)定的場(chǎng)合時(shí)，已知其具有某種優(yōu)勢(shì)。特別 地，所述扁平底部型池與所述圓形或彎曲型池相比提供了更為精確的分 析。但是，簡(jiǎn)單的扁平底部型池也具有不利之處，其中在該池的底部趨向 于形成彎液面(meniscus)，從而使接觸該池底部的溶液呈不均勻地分布。
鑒于此，發(fā)明人研究了一種解決這種問(wèn)題的如下所述的扁平底部型池。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了在測(cè)定中使用的扁平底部型池
(flat-based well)，所述池包括:
主室，所述主室具有容納液體樣品的開口 ，側(cè)壁從所述開口和室底部 延伸；和
副室，所述副室由所述主室的所述室底部延伸，并適于容納預(yù)定量的 液體樣品，其中所述副室具有扁平(flat)的底部。
這種布置方式有利地確保了放置在所述副室中的液體樣品不會(huì)從所 述主室的側(cè)壁形成向上的彎液面。相反，放置在所述副室中的液體樣品可 以保持由所述副室朝著所述主室延伸的凸起表面和/或保持由所述副室延
伸入所述主室的凸起表面。這種布置方式還確保存留任何液體樣品的底面 均為扁平型，從而提供如先前在上文中描述的更為精確的分析。
在本發(fā)明的另 一個(gè)實(shí)施方案中提供了池單元，其包括一個(gè)或多個(gè)依據(jù) 本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供了一種進(jìn)行測(cè)定的方法，所述方法 包括使用依據(jù)本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池或使用依據(jù)本發(fā)明的池單元。本發(fā)明的又一方面提供一種檢測(cè)病毒的方法，所述方法包括下述步
驟
提供接種有預(yù)先選擇的細(xì)胞系的如此處所描述的一個(gè)或多個(gè)依據(jù)本 發(fā)明的單個(gè)扁平底部型的池；
將待分析的樣本接種于一個(gè)或多個(gè)池；以及
在所述一個(gè)或多個(gè)池中對(duì)一種或多種預(yù)先選^^的病毒進(jìn)行檢驗(yàn)。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，提供了一種檢測(cè)病毒的方法，所述方法 包括下述步驟
提供接種有適用于接種病毒的細(xì)胞系的如此處所描述的依據(jù)本發(fā)明
的單個(gè)扁平底部型的池；
對(duì)樣本進(jìn)行特異性預(yù)處理以便獲得可能含有待;險(xiǎn)測(cè)病毒的樣品；
用所述樣品接種所述細(xì)胞系； 培養(yǎng)接種的細(xì)胞系；
將所述接種的細(xì)胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復(fù)培養(yǎng)基，所述病毒 恢復(fù)培養(yǎng)基包括添加有至少一種激素和至少一種酶的細(xì)胞培養(yǎng)基；
培養(yǎng)所述接種的細(xì)胞系；以及 分析所述接種的細(xì)胞系中存在的病毒。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供了依據(jù)本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池 或池單元在一全測(cè)中的用途。
測(cè)方法中的用途，所述方法包括下述步驟
提供接種有預(yù)先選擇的細(xì)胞系的如此處所描述的一個(gè)或多個(gè)依據(jù)本 發(fā)明的單個(gè)扁平底部型的池；
將待分析的樣本接種于一個(gè)或多個(gè)池；以及 在所述一個(gè)或多個(gè)池中對(duì)一種或多種預(yù)先選_^的病毒進(jìn)行檢驗(yàn)。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供了依據(jù)本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池 在病毒檢測(cè)方法中的用途，所述方法包括下述步驟
提供接種有適用于接種病毒的細(xì)胞系的如此處所描述的依據(jù)本發(fā)明 的單個(gè)扁平底部型的池；
對(duì)樣本進(jìn)行特異性預(yù)處理以便獲得可能含有待;險(xiǎn)測(cè)病毒的樣品；
用所述樣品接種所述細(xì)胞系；
培養(yǎng)接種的細(xì)胞系；
將樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復(fù)培養(yǎng)基，所述病毒恢復(fù)培養(yǎng)基包括添加 有至少一種激素和至少一種酶的細(xì)胞培養(yǎng)基；
培養(yǎng)所述接種的細(xì)胞系；并
分析所述接種的細(xì)胞系中存在的病毒。 附圖簡(jiǎn)述在非限制性附圖中示出本發(fā)明的實(shí)施方案，其中

圖1是闡釋了池的透視圖的圖示；圖2是闡釋了池的部分側(cè)視圖的圖示；圖3是闡釋了池的仰視圖的圖示；以及圖4是典型的12x8排列的池構(gòu)型的圖示。發(fā)明詳述主室和副室可以采用任何適宜的形式，只要所述副室由所述主室的室 底部延伸。單個(gè)扁平底部型的池可以采用任何適宜的形式，只要容納樣本 的池的底部為扁平型(flat)。例如，該池可以具有圓形、方形、三角形或六 角形的橫截面。此外，該池沿著其高度的橫截面可以是一致的?？蛇x地， 該池可以是朝向其頂端或其底端的錐形。應(yīng)理解的是該池是使用標(biāo)準(zhǔn)的材 料(如用于常規(guī)的微量滴定托盤裝置(micro titre tray assemblies )的材料) 和通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)形成的。優(yōu)選地，所述主室具有正方形的橫截面并且所述副室具有圓形的橫截 面。在此實(shí)施方案中，所述副室的圓形側(cè)面(circular side )的弧優(yōu)選地延 伸至所述主室每一個(gè)側(cè)面(side)的邊緣。這可根據(jù)更好地示出此特征的 附圖進(jìn)行理解。通常，所述副室可以容納總量約為30 pi的預(yù)定體積，以使所述副室 中的液體樣品形成液滴(droplet),所述液滴有利地具有,人所述副室的開口 延伸的凸起表面；并且進(jìn)一步使貫穿副室的液體的深度基本上不變，從而 消除所述液體樣品放置在池中并沿該池的側(cè)壁形成向上的彎液面的不利 之處。優(yōu)選地，所述主室與所述副室的高度比為10:1，而所述主室與所述副
室的寬度比在2:1和1:1之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述池的高度為11 mm，其中包括10 mm高的主室和1 mm深的副室。所述池的寬度通常為 8mm，并且具有約為lmm的壁厚度，而所述副室的內(nèi)部寬度約為6 mm。 因此，所述主室通常允許容納約360 pl的體積而所述副室通常允許容納約 28.3 (il的體積。假設(shè)將該池用于池單元，則這種特定的實(shí)施方案可以同等地^是供多種 優(yōu)勢(shì)，其中將許多池連接在一起并且不單獨(dú)使用。因此，根據(jù)本發(fā)明的備 選實(shí)施方案提供了包括一個(gè)以上的依據(jù)本發(fā)明的池的池單元。例如，池單 元可以是96或48孔板構(gòu)型或者是澳大利亞創(chuàng)新專利第2001100242號(hào)中 所描述的單元。應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，在需要將池插入板中的 一些測(cè)定方法 的場(chǎng)合中，該池可以設(shè)置有促進(jìn)該池與其有待插入的孔板接合的裝置。例 如，該池可以為如上所述的錐形，以便在孔板的貯槽(receptacle)中提供 摩擦配合?？蛇x地，該池可以設(shè)置有與其待插入的板的!i!i槽配套使用的肋 (rib)或凹痕(indentation)或凹才曹(groove)。在某些例子中，所述池在分析期間或搬運(yùn)板的過(guò)程中可能從孔板脫 落。同樣地，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該池包括某種形式的標(biāo)識(shí)，比如彩色 的編碼或標(biāo)記。例如，該池可以具有指明其在斧反上位置(欄和排)的標(biāo)記。為了有助于分析，該池還可以包括設(shè)置有標(biāo)記刻度的扁平底部。例如，(crosshair)。因此，對(duì)四個(gè)部分之一的分析可以^是供對(duì)于整個(gè)扁平底部 分析有用的數(shù)據(jù)。應(yīng)理解的是將扁平底部分成任何數(shù)目可適用于此目的。本發(fā)明的池具有相當(dāng)廣泛的用途。泛泛地說(shuō)，本發(fā)明的池可用于測(cè)定。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解此類纟全測(cè)包括，但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)、細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增技術(shù)、蛋白結(jié)晶技術(shù)、抗病毒易感 性測(cè)試和化學(xué)物質(zhì)及藥物篩選技術(shù)。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的池 可用于病毒診斷測(cè)定。如此處所用，對(duì)測(cè)定的參考應(yīng)理解為對(duì)任何使用微量滴定池的常規(guī)實(shí) 驗(yàn)技術(shù)的參考。
因此，本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種檢測(cè)病毒的方法，所述方法包括下述步驟4是供接種有預(yù)先選擇的細(xì)胞系的如此處所描述的一個(gè)或多個(gè)依據(jù)本 發(fā)明的單個(gè)扁平底部型的池；將4寺分析的樣本接種于一個(gè)或多個(gè)池；并在所述一個(gè)或多個(gè)池中對(duì)一種或多種預(yù)先選擇的病毒進(jìn)行檢- 驗(yàn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種施行測(cè)定的方法，所述方法 使用如此處所描述的一個(gè)或多個(gè)依據(jù)本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池。該測(cè)定 優(yōu)選地為病毒診斷測(cè)定。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供了一種檢測(cè)病毒的方法，所述方法 包括下述步驟提供接種有適用于接種病毒的細(xì)胞系的如此處所描述的依據(jù)本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池；對(duì)樣本進(jìn)行特異性預(yù)處理以便獲得可能含有待檢測(cè)病毒的樣品；將所述樣品接種于所述細(xì)胞系；培養(yǎng)接種的細(xì)胞系；將所述接種的細(xì)胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復(fù)培養(yǎng)基，所述病毒 恢復(fù)培養(yǎng)基包括添加有至少 一種激素和至少 一種酶的細(xì)胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)所述接種的細(xì)胞系；并分析所述接種的細(xì)胞系中存在的病毒。應(yīng)理解的是，樣品培養(yǎng)基在此方法中通常為已接種有樣品的維持培養(yǎng) 基(maintenance media)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"單個(gè)扁平底部型的池"包括在其范圍內(nèi)的、具有 任何4黃截面形狀的單個(gè)池，只要容納樣本的池的底部是扁平的。在本發(fā)明上下文的病毒診斷方面，單個(gè)扁平底部型池的使用經(jīng)由采用 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(比如倒置熒光顯微鏡法或光學(xué)顯微鏡法)確保了病毒的檢驗(yàn)， 并提供了與檢驗(yàn)如位于具有圓形或稍;微彎曲底部的池底部中的樣品相比
更為精確的結(jié)果。可以提供已經(jīng)接種有預(yù)先選擇的細(xì)胞系的單個(gè)扁平底部型池，所述預(yù) 先選擇的細(xì)胞系將根據(jù)特定病毒或待分析病毒對(duì)于生長(zhǎng)和分離的適應(yīng)性而進(jìn)行測(cè)定。例如，LLC-MK2細(xì)胞系適用于副流感病毒的檢測(cè)，MDCK 可用于流感病毒，HEP-2適用于呼吸道合胞病毒(RSV)以及MRC-5適 用于細(xì)胞巨化病毒(CMV)、單純皰滲病毒(HSV)、腸道病毒和鼻病 毒的檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適合給定病毒生長(zhǎng)和分離的細(xì)胞系。應(yīng)承認(rèn)的是此處描述的接種的單個(gè)扁平底部型池可以適合在所選才奪 的測(cè)定中以即刻使用的形式提供(即，隨時(shí)使用的形式)。本領(lǐng)域沖支術(shù)人 員應(yīng)理解的是，在隨時(shí)使用的形式中，預(yù)先選擇的細(xì)胞系通常具有約 80-卯％的融合率。還應(yīng)理解的是，這樣預(yù)先選擇的細(xì)胞系的保存穩(wěn)定性 將取決于所提供的特定細(xì)胞系。胞。例如，-f旦不限于以任何方式進(jìn)4于的細(xì)胞冷凍過(guò)程，所述細(xì)胞可以在單貯存培養(yǎng)基。在此步驟之后，細(xì)胞可以經(jīng)受冷卻過(guò)程并最終于-70-80°C 貯存。貯存培養(yǎng)基可以含有或者可以不含冷凍保護(hù)劑?？杉尤胭A存培養(yǎng)基 的冷凍保護(hù)劑不受特殊限制且可以包括DMSO和/或血清。本領(lǐng)域4支術(shù)人 員應(yīng)該熟悉適宜的冷凍保護(hù)劑及其用途。并不是所有的細(xì)胞系都可以經(jīng)過(guò) 冷凍過(guò)程存活下來(lái)而且本領(lǐng)域4支術(shù)人員應(yīng)了解哪種細(xì)胞系適用于和不適 用于此目的。應(yīng)認(rèn)識(shí)到以冷凍形式提供的細(xì)胞系隨后應(yīng)經(jīng)受適當(dāng)?shù)慕鈨鲞^(guò)程并且 將貯存培養(yǎng)基替換為病毒恢復(fù)培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是細(xì)胞一 經(jīng)解凍，隨后在如此處所述的本發(fā)明的方法中使用之前，通常生長(zhǎng)至 80-卯％的融合率。對(duì)接受試驗(yàn)的"接種"有細(xì)胞系的扁平底部型池的參考應(yīng)理解為對(duì)于在供病毒診斷測(cè)定使用之前預(yù)先接種有預(yù)先選^r的細(xì)胞系的池的參考?？蛇x地，接種的池實(shí)際上可以在供病毒診斷測(cè)定使用后再進(jìn)行接種。池的接 種步驟可以包括下述子步驟將稀釋的預(yù)先選擇的細(xì)胞系沉積在池中的生 長(zhǎng)培養(yǎng)基上，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞直至細(xì)胞達(dá)到約80-90%的融合率 并將生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換為維持培養(yǎng)基。應(yīng)理解的是，將直接用于特定病毒生長(zhǎng)和分離的多個(gè)池進(jìn)行比較時(shí)， 每個(gè)池中的培養(yǎng)基的體積應(yīng)該是相同的。在某些實(shí)施方案中，將多個(gè)池接種有預(yù)先選擇的細(xì)胞系以便提供多孔 排列，例如用于96孔板的常規(guī)12x8排列，或者用于48孔板的6x8排列。 可選地，如果期望更大的排列，可以提供諸如14x8的排列。所提供的池 的數(shù)目不受特殊限制。應(yīng)理解的是如果提供了這樣的排列，則通常再次才艮 據(jù)待檢測(cè)的病毒而將不同的細(xì)胞接種于該排列的不同的欄。密封件以使其能夠進(jìn)行運(yùn)輸并防止污染和蒸發(fā)。例如，在多個(gè)池的情況下， 該密封件可以呈蓋子的形式，其安裝在多個(gè)池的全部排列的上方，如標(biāo)準(zhǔn) 的48或96孔板蓋子?？蛇x地，在單個(gè)扁平底部型池的情況下，該密封件 可以采用適合密封單個(gè)池的蓋子的形式。在另外的備選情況下，該密封件 可以為適宜的密封膜。還應(yīng)理解的是，如此處所描述的不管是用于多個(gè)池的蓋子或者是用于 依據(jù)本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池的蓋子均可包括有助于使用的標(biāo)記。例 如，所述蓋子可以包括表示其中含有的細(xì)胞系的符號(hào)或字母。將待分析的樣本接種于 一種或多種細(xì)胞的步驟依據(jù)已知的過(guò)程而進(jìn) 行。例如，該步驟通常包括從有待接種的每個(gè)池中除去適當(dāng)量的維持培養(yǎng) 基，并使通常約為200-300 pl量的樣本上清液沉積入每個(gè)池中。然后將該 池進(jìn)行離心/培養(yǎng)，例如根據(jù)所使用的離心機(jī)類型在35。C下以4000 rpm離 心50-60分鐘。由離心機(jī)取下后，可以通過(guò)例如真空吸引術(shù)從池中除去接種物并替換 為適宜的維持培養(yǎng)基或病毒恢復(fù)培養(yǎng)基。所述病毒恢復(fù)培養(yǎng)基優(yōu)選包括添 加有激素和酶的細(xì)胞培養(yǎng)基。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"待分析的樣本，，包括從受試者獲得的樣品樣本，
所述樣品樣本可能受到病毒感染或未受到病毒感染。因此，樣品可以含有可檢測(cè)的病毒或者無(wú)病毒。適宜的樣品可以由下述物質(zhì)獲得唾液、血清、 尿、排泄物、腦脊液(CSF)、呼吸液，如支氣管肺泡灌洗液與鼻咽吸出 物、和諸如來(lái)自嘴、鼻腔、咽喉、皮膚和生殖器的化驗(yàn)樣本。可以通過(guò)使 用與細(xì)胞系和病毒相容的適宜介質(zhì)進(jìn)行稀釋來(lái)制備使用的樣品樣本。受試者可以是任何可受病毒感染的動(dòng)物物種。例如，受試者可以是禽 類、魚或哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，受試者為哺乳動(dòng)物。適宜的哺乳 動(dòng)物包括養(yǎng)殖動(dòng)物，如綿羊、牛、豬、鹿等等；伴侶動(dòng)物，如狗、貓、兔、 豚鼠等等；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、大鼠、猴等等；圈養(yǎng)動(dòng)物，如動(dòng)物園和人 類圈養(yǎng)的動(dòng)物。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物為人類。在其他的實(shí)施方案中，受試者可 以是禽類，特別是養(yǎng)殖的禽類，如雞和火雞。獲得適用于病毒檢測(cè)的樣品于聲波降解法和離心法。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"病毒恢復(fù)培養(yǎng)基(virus recovery medium)，，或 "病毒恢復(fù)培養(yǎng)基(vims recovery media)，，指用于病毒生長(zhǎng)和分離的培 養(yǎng)基(medium)或培養(yǎng)基(media)。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)配有激素和酶的細(xì)胞 培養(yǎng)基可通過(guò)下述情況有利地優(yōu)化(optimises)病毒恢復(fù)將細(xì)胞系保持 在最大的敏感性以及幫助病毒連接于細(xì)胞壁且在某種情況下，縮短獲得結(jié) 果所需的時(shí)間。酶。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"酶"指蛋白水解酶。在這些實(shí)施方案中， 酶優(yōu)選絲氨酸或天冬氨酸蛋白酶。示例性的酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶或 胃蛋白酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶為胰蛋白酶。加至細(xì)胞培養(yǎng)基的激素并無(wú)限制并且本領(lǐng)域:技術(shù)人員可以確定合適 的激素。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"激素"指皮質(zhì)類固醇，優(yōu)選糖皮質(zhì)激 素。更優(yōu)選地，激素選自地塞米松、氫化可的+>、醋酸可的松、潑尼*>、 氳化潑尼松、甲基氫化潑尼松、倍他米松、氟羥潑尼松龍、倍氯米+>、醋 酸氟氫可的+>、醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)和醛固酮。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，激素為地塞米松。激素可以是合成的或者是天然形成的。 雖然激素和酶的組合是最優(yōu)選的實(shí)施方案，但是可選地，發(fā)現(xiàn)DMSO (二曱基亞砜)和DEAE (右旋糖普)也是有用的。加至培養(yǎng)基的酶的量?jī)?yōu)選在1-5 !ig/ml范圍內(nèi)，并且優(yōu)選約2.5 fig/ml。 培養(yǎng)基中激素的濃度優(yōu)選在10"M-1(^M范圍內(nèi)并且優(yōu)選約10-SM。但是， 在優(yōu)選地塞米松和胰蛋白酶的情況下，發(fā)現(xiàn)添加有約2.5 lig/ml胰蛋白酶 和濃度約為1(T5M的地塞米松的細(xì)胞培養(yǎng)基得到了最佳結(jié)果。因此，本發(fā)明特定實(shí)施方案的方法采用了包括細(xì)胞培養(yǎng)基的病毒恢復(fù) 培養(yǎng)基，所述細(xì)胞培養(yǎng)基添加有2.5嗎/ml的胰蛋白酶和濃度為10-5]\4的 地塞米松?？梢砸罁?jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基無(wú)特殊的限制。例如，這些細(xì)胞培 養(yǎng)基可以包括培養(yǎng)基199、 DMEM、 RPMI-1640或MEM-EAGLE。然而， 如同易于公認(rèn)的，存在大量可以有助于細(xì)胞生長(zhǎng)和本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容 易獲得的不同的培養(yǎng)基。但是，根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，細(xì)胞培養(yǎng)基為 MEM-EAGLE。細(xì)胞培養(yǎng)基可以添加支持細(xì)胞和病毒生長(zhǎng)的添加劑，并且此類添加劑 為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。已知特定的細(xì)胞系和/或病毒可能需要用于最佳 生長(zhǎng)和發(fā)育的特異性添加劑。示例性的添加劑包括L-谷氨酸、氨基酸、 抗生素、血清、Hanks平衡鹽、如D-葡萄糖的糖類、無(wú)機(jī)鹽、維生素、苯 基紅、如HEPES的緩沖液以及如Tween 80的表面活性劑。以上描述的病毒恢復(fù)培養(yǎng)基可以在用于鑒別病毒的常規(guī)診斷過(guò)程中 使用，所述常規(guī)診斷的例子如常規(guī)的管法和快速培養(yǎng)法?？蛇x地，病毒恢 復(fù)培養(yǎng)基可以在此處描述的本發(fā)明的方法中使用。在本發(fā)明的方法中使用的病毒恢復(fù)培養(yǎng)基可以用于多種不同病毒的 恢復(fù)，所述病毒適用于細(xì)胞培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到此類病毒包括， 但不限于呼吸道病毒、副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A,B(Inf A,B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AD)、鼻病毒(RH)、細(xì) 胞巨化病毒(CMV)以及來(lái)自腸道病毒(ENT)的病毒，所述腸道病毒 由?？刹《?、科沙奇病毒、腸道病毒與脊髓灰質(zhì)炎病毒組成；還有非呼吸 道病毒，所述非呼吸道病毒的例子有，但不限于單純皰滲病毒(HSV)1,2、
水痘帶狀皰滲病毒(vzv)、風(fēng)滲、腮腺炎、麻瘆、輪狀病毒和多瘤病毒。在本發(fā)明的方法中，可以使用已知的條件將接種的細(xì)胞與有待分析的樣本進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可以將接種的細(xì)胞在37。C培養(yǎng)一段時(shí)間以使細(xì)胞 感染病毒，所述時(shí)間如45-90分鐘，特別是60分鐘。可以在培養(yǎng)箱中施 行培養(yǎng)或者可以使用離心法施行培養(yǎng)。可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī);險(xiǎn)測(cè)方法來(lái)檢測(cè)病毒，所述常規(guī)檢測(cè)方法 諸如免疫檢測(cè)技術(shù)、常用的分子技術(shù)；所述免疫檢測(cè)技術(shù)的例子有免疫熒 光法、染色、CPE的顯像，所述常用的分子技術(shù)的例子有多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。為了制備用于考察的池，依據(jù)常規(guī)的方法學(xué)通常采用多次洗滌步驟。例如，通常除去維持培養(yǎng)基并將細(xì)胞在池中進(jìn)行空氣干燥。然后可以將該池充滿例如冷的曱醇-丙酮混合物(l:2的比例)并在-25。C固定15分鐘。在除去混合物后，該池可以再次進(jìn)行空氣千燥。隨后可以根據(jù)有待檢測(cè)的病毒將特異性的單克隆抗體加入每個(gè)池中，并根據(jù)需要將該池進(jìn)行培養(yǎng)。然后可以棄去所述單克隆抗體并再次洗滌該池。該過(guò)程可以使用二抗重 智久o在最終的空氣干燥后，將1-2滴熒光封固劑加入池中并檢查熒光的強(qiáng) 度(contents )?，F(xiàn)在參考示出本發(fā)明實(shí)施方案的附圖。參考圖1,有待依據(jù)本發(fā)明使用的特定優(yōu)選實(shí)施方案的扁平底部型池 10包括橫截面為方形的主室11和一黃截面為圓形的副室12。所述副室12 乂人所述主室11的室底部13延伸。這樣，所述副室的開口 14由所述主室 的室底部13界定。所述副室12的外壁15的弧形延伸至所述主室11的每 個(gè)壁16的外側(cè)(圖3最佳地示出)。主室11的一個(gè)壁16包括凹槽17,所述凹槽17用于容納有待將池10 放入的孔板(未顯示)的協(xié)同操作部分。這就使得池10牢固地鎖入板中 并解決了與池10由所述一反脫離相關(guān)的問(wèn)題。副室12具有預(yù)先確定的體積，從而使其能夠容納液體樣品并使該液
體樣品有利地形成具有凸起表面的液滴，所述凸起表面自副室的開口 14延伸。這與置于池中并由該池的側(cè)壁形成向上的彎液面的液體樣品相比， 確保了穿過(guò)副室的液體的深度基本上不變。而在所對(duì)比的那樣情況下，形 成彎液面的池各面上的液體深度基本上大于彎液面最低點(diǎn)處的池中部的 液體深度。優(yōu)選地，池的高度X為llmm,其中包括主室的10mm高度Y和副 室的lmm深度Z。該池的整個(gè)寬度W通常為8 mm,并且具有約為1 mm 的壁厚T。因此，內(nèi)部寬度Wi約為6mm。主室通常界定約360 pl的體積 而副室通常界定約28.3 ^的體積。圖4示例性地展示典型的12x8孔板構(gòu)型(即2x6x8)的一個(gè)例子， 包括待檢測(cè)病毒的列表、相關(guān)的細(xì)胞系和每種細(xì)胞系的除去天數(shù)。該板由 96個(gè)依據(jù)本發(fā)明的單個(gè)扁平底部型池組成。如圖4所示，該板可以按照以下順序接種不同的細(xì)胞系1-3欄 LLC-MK24、 5欄 MDCK6欄 Hep27欄 A5498欄 RK139-12欄 MRC-5以此模式設(shè)置的板將允許選擇諸如下述的病毒，但不限于呼吸道病 毒副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A,B (InfA,B) 、 RSV、腺 病毒(AD)、鼻病毒(RH)、細(xì)胞巨化病毒(CMV)和來(lái)自腸道病毒(ENT) 的病毒，所述腸道病毒由?？刹《?Eco)、科沙奇病毒(cox)、腸道病 毒(Ent)與脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polio )組成；以及但不限于非呼吸道病毒—— 單純皰瘆病毒(HSV) 1,2與水痘帶狀皰滲病毒(VZV)。在另外的實(shí)施例中，6x8孔板的構(gòu)形可以由按下述順序接種的細(xì)胞系 組成1-3欄 A 5494-6欄 MRC-5這可允許例如以下病毒的檢測(cè)，例子有CMV、 HSV1，2、 VZV、 AD以及來(lái)自腸道病毒屬的那些病毒。最后，14x8孔的構(gòu)形允許最終用于病原體的;f企測(cè)，所述病原體如PI 1,2,3,4、 InfA,B、 RSV、 AD、 RH、 ENT(Echo、 cox、 Ent、 Polio) 、 HSV 1,2、 VZV、風(fēng)滲、腮腺炎、麻滲、輪狀病毒、多瘤病毒以及其他使用合 適的細(xì)胞系的病原體病毒。由于池的獨(dú)立的性質(zhì)，可以根據(jù)適用于正在討論的特定病毒4企測(cè)的時(shí) 間表來(lái)選4奪除去的細(xì)胞系。特別地，取A排進(jìn)行舉例，如果期望檢測(cè)PI 1 -4， 則在第二天除去池A1至A3。同樣地，如果期望檢測(cè)Inf A,B,則在第二 天除去池A4和A5。然而，如果需要檢測(cè)腸病毒，則隨后在合適的天數(shù) (1-3)除去池All。單個(gè)池的獨(dú)特性質(zhì)使得這種選擇除去和病毒^r測(cè)更 加容易進(jìn)行?，F(xiàn)在參考使用本發(fā)明一個(gè)方面的試劑盒所可能采取的特定的過(guò)程，，使用真空滅菌的玻璃巴斯德吸管從有待接種的所有池中吸出培養(yǎng)基。 在大的細(xì)長(zhǎng)容器中處置巴斯德吸管是方便有利的。使用 一次性吸管使孔板的合適數(shù)目的池接種有約每池150-200 )il的樣 本。剩余的樣本在-7(TC保存。然后將蓋重新放置在板上并于板中接種的 池上方記錄日期。然后將板在數(shù)字天平上稱重并使用平衡板和平衡卡進(jìn)行平衡直到所 有的板等重(+/- 0.5g)并且能夠在離心機(jī)中平衡。離心機(jī)在約37。C下 并以3500 rpm運(yùn)行60 min。然后^f吏用真空滅菌的巴斯德吸管分別/人每個(gè) 池中吸出樣本，并且將每個(gè)池填滿病毒恢復(fù)培養(yǎng)基BAC,其中每個(gè)樣本 均使用干凈的一次性吸管。隨后在最后的樣本接種后通過(guò)將板小心地;故入C02培養(yǎng)箱并在37°C 培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)七天來(lái)使樣品在37。C的C02培養(yǎng)箱(5% )中的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)。通過(guò)使用特異性的單克隆抗體，可以有利地將熒光免疫染色用于單個(gè)
池中特定病毒的4企測(cè)。通常，隨后的過(guò)程如下使用真空吸引器從合適的池中除去培養(yǎng)基并使用專用的鑷子從該板除去所述池并轉(zhuǎn)移入不同的支架。然后將這些物體空氣干燥3分鐘。之后 將300 ^的冷丙酮和甲醇的混合物(2:1 )加至每個(gè)池并允許在-20。C固定 15分鐘。隨后棄去固定液并將樣品再次空氣干燥2-3分鐘。接著往每個(gè)池 中加入特異性的單克隆抗體( 一抗)并將蓋有蓋子的板置入適當(dāng)?shù)奈恢弥校?且將樣品在37。C培養(yǎng)30分鐘。然后從培養(yǎng)箱中移出樣品并且分別往池中 添加磷酸鹽緩沖液(PBS)。隨后棄去PBS。此過(guò)程重復(fù)四次以上。再次 將樣品空氣干燥3分鐘，之后往每個(gè)池中加入對(duì)所述單抗具有特異性的二 抗。該步驟后，再次進(jìn)行樣品的培養(yǎng)，繼之使用如上所述的PBS重復(fù)處 理且最后使用雙蒸水洗滌。然后加入少量(l滴)專門制備的封固劑并在 熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。也可以采用一步熒光免疫染色法。除非上下文另有要求，否則遍及本說(shuō)明書和隨后的權(quán)利要求的詞匯 "包括(comprise )"及其變體如"包括(comprises )，，和"包括(comprising )，， 應(yīng)理解為包含所規(guī)定的整體或整體組合或步驟而不排除任何其他的整體 或整體組合或步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，除了專門描述的之外，可以對(duì)本文描述的本 發(fā)明進(jìn)行變化和改進(jìn)。應(yīng)該理解的是本發(fā)明包括所有這樣的變化和改進(jìn)。 本發(fā)明還包括在說(shuō)明書中分別涉及或標(biāo)明的或者共同涉及或標(biāo)明的所有 步驟、特征、組合物和化合物，以及任意兩種或多種所述步驟或特征的任 意組合和全部組合。
權(quán)利要求
1.一種適合在測(cè)定中使用的單個(gè)扁平底部型的池，所述池包括(i)主室，所述主室具有容納液體樣品的開口；側(cè)壁從所述開口和室底部延伸；和(ii)副室，所述副室從所述主室的所述室底部延伸，并適于容納預(yù)定量的所述液體樣品，其中所述副室具有扁平的底部。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)扁平底部型的池，其中所述主室具有 方形的橫截面而所述副室具有圓形的橫截面。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單個(gè)扁平底部型的池，其中所述池設(shè) 置有促進(jìn)與其內(nèi)插入所述池的孔;i^接合的裝置。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的單個(gè)扁平底部型的池，其中所述池是錐形 以便在所述孔板的貯槽中提供摩擦配合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的單個(gè)扁平底部型的池，其中所述池設(shè)置有 與所述孔板的所述貯槽配合使用的肋或凹痕或凹槽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的單個(gè)扁平底部型的池，其中所述池 包^fe標(biāo)識(shí)形式。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的單個(gè)扁平底部型的池，其中所述扁平的底 部設(shè)置有適用于輔助分析的標(biāo)記刻度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)所述的單個(gè)扁平底部型的池，其接種有在 病毒恢復(fù)培養(yǎng)基中的預(yù)先選擇的細(xì)胞系，所述接種的池提供用于冷凍或者 隨時(shí)可使用。
9. 一種池單元，其包括一個(gè)以上的如權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)所述的單個(gè) 扁平底部型的池。
10. —種施行測(cè)定的方法，所述方法包括使用如權(quán)利要求l-8任一項(xiàng) 所述的單個(gè)扁平底部型的池或者使用如權(quán)利要求9所述的池單元。
11. 一種檢測(cè)病毒的方法，所述方法包括下述步驟 (i )提供接種有預(yù)先選"^的細(xì)胞系的一個(gè)或多個(gè)如權(quán)利要求1-8任一 項(xiàng)所述的單個(gè)扁平底部型的池；(ii) 將待分析的樣本接種于一個(gè)或多個(gè)池；以及(iii) 在所述一個(gè)或多個(gè)池中對(duì)一種或多種預(yù)先選擇的病毒進(jìn)行檢驗(yàn)。
12. —種檢測(cè)病毒的方法，所述方法包括下述步驟(i )提供接種有適用于接種病毒的細(xì)胞系的如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所 述的單個(gè)扁平底部型的池；(ii )對(duì)樣本進(jìn)行特異性預(yù)處理以便獲得可能含有待檢測(cè)病毒的樣品；(iii) 將所述樣品接種于所述細(xì)胞系；(iv) 培養(yǎng)所接種的細(xì)胞系；(v) 將所接種的細(xì)胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復(fù)培養(yǎng)基，所述 病毒恢復(fù)培養(yǎng)基包括添加有至少一種激素和至少一種酶的細(xì)胞培養(yǎng)基；(vi) 培養(yǎng)第(v)步所得的所述接種的細(xì)胞系；以及(vii) 分析第(vi)步所得的所述細(xì)胞系中存在的病毒。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)所述的單個(gè)扁平底部型的池或者根據(jù)權(quán) 利要求9所述的池單元在測(cè)定中的用途。
14. 根據(jù)權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)所述的單個(gè)扁平底部型的池在病毒檢測(cè) 方法中的用途，所述方法包括下述步驟(i )提供接種有預(yù)先選擇的細(xì)胞系的一個(gè)或多個(gè)如權(quán)利要求1-8任一 項(xiàng)所述的單個(gè)扁平底部型的池；(ii) 將待分析的樣本接種于一個(gè)或多個(gè)池；以及(iii) 在所述一個(gè)或多個(gè)池中對(duì)一種或多種預(yù)先選擇的病毒進(jìn)行檢驗(yàn)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的單個(gè)扁平底部型的池在病毒檢測(cè) 方法中的用途，所述方法包括下述步驟(i )提供接種有適用于接種病毒的細(xì)胞系的如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所 述的單個(gè)扁平底部型的池；(ii )對(duì)樣本進(jìn)行特異性預(yù)處理以便獲得可能含有待檢測(cè)病毒的樣品；(iii) 將所述樣品接種于所述細(xì)胞系；(iv) 培養(yǎng)所接種的細(xì)胞系；(v) 將所接種的細(xì)胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復(fù)培養(yǎng)基，所述 病毒恢復(fù)培養(yǎng)基包括添加有至少一種激素和至少一種酶的細(xì)胞培養(yǎng)基；(vi) 培養(yǎng)第(v)步所得的所述接種的細(xì)胞系；以及(vii) 分析第(vi)步所得的所述細(xì)胞系中存在的病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適于病毒診斷方法使用的單個(gè)扁平底部型的池。更具體地說(shuō)，該池具有與彎曲的底部相對(duì)的平面或扁平的底部。本發(fā)明還涉及采用這種單個(gè)池的病毒診斷方法。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，采用了添加有激素和酶的專門研制的組織培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12M1/18GK101163787SQ200680013020
公開日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月10日
發(fā)明者羅伯特·亞歷山大 申請(qǐng)人:羅伯特·亞歷山大