專利名稱：：培養(yǎng)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的裝置。更具體的說，本發(fā)明涉及用于細(xì)胞培養(yǎng)的微流體裝置，更特別用于包括哺乳動物細(xì)胞復(fù)制和/或再生產(chǎn)的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)。在一個應(yīng)用中，本發(fā)明使用來培養(yǎng)用于體外受精(試管受精)的胚胎。
背景技術(shù)：
：微流體技術(shù)是一種用于設(shè)計，模仿，制造和大量生產(chǎn)微系統(tǒng)的技術(shù)，其中該微系統(tǒng)可處理體積小至毫微或者微微升體積的流體，氣體，蒸汽或者液體。有源的和無源的微結(jié)構(gòu)控制流體的流量和混合，從而以快速，成本有效的方式產(chǎn)生物理的，化學(xué)的，生物化的和微生物學(xué)的反應(yīng)。微流體技術(shù)具有一些范圍的應(yīng)用，包括細(xì)胞的培養(yǎng)和高度人工的實驗室處理過程的自動化，例如在單個基片上的體外受精(IVF)。在單個培養(yǎng)裝置中，不同細(xì)胞或者細(xì)胞的不同群例如胚胎的培養(yǎng)會產(chǎn)生某些困難。已經(jīng)證明某些自動分泌，旁分泌和內(nèi)分泌的分子的交換會改善培養(yǎng)細(xì)胞的成功率，并且在不同細(xì)胞之間的流體性的連通被認(rèn)為有益于在培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞。然而，有益之處還存在于在培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞的分離以及不同于其它細(xì)胞的獨特的細(xì)胞的提供。人們已經(jīng)認(rèn)為物理阻擋會允許在細(xì)胞之間的流體性的連通，但是會限制細(xì)胞的摻雜。物理阻擋提供了自動分泌，旁分泌和內(nèi)分泌分子的交換，以及不同細(xì)胞的保持的有益之處。然而，物理阻擋的提供需要利用所需位置強行去除。物理阻擋還經(jīng)常導(dǎo)致阻礙流體輸送的死體積和截留氣體氣泡。而且，物理阻擋還增加在培養(yǎng)處理過程期間需要來交換培養(yǎng)介質(zhì)的時間，并且其中在不同細(xì)胞之間沒有流體性的連通存在，介質(zhì)的交換會是艱苦的以及會暴露細(xì)胞到機械的，熱的和化學(xué)的應(yīng)力下。本發(fā)明設(shè)法克服，或者至少最小化與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。
發(fā)明內(nèi)容在第一方面，本發(fā)明提供培養(yǎng)細(xì)胞使用的裝置，該裝置包括至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室和流體容器，該細(xì)胞培養(yǎng)室具有錐形側(cè)壁并且通過流體通路與流體容器流體連通，該流體通路經(jīng)由在培養(yǎng)室中的孔連接到培養(yǎng)室，該孔小于待培養(yǎng)的細(xì)胞的直徑，從而使得細(xì)胞保持在細(xì)胞培養(yǎng)室的內(nèi)部。在另一個方面，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，該方法包括在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的裝置的至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室中提供培養(yǎng)介質(zhì)以及卵孕化該裝置。圖1A示出了根據(jù)本發(fā)明裝置的示意的透視圖。圖1B示出了從頂部看過去的裝置的平面示意圖。圖1C示出了從底部看過去的裝置的平面示意圖。圖1D示出了通過圖IB的裝置的AA'的示意的橫截面。圖2是通過穿過細(xì)胞培養(yǎng)室的剖視圖。圖3A示出了該裝置的橫截面的側(cè)視圖。圖3B示出了該裝置的橫截面的側(cè)視圖。圖4A示出了細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域的示意平面圖。圖4B示出了細(xì)胞培養(yǎng)室的示意平面圖。圖4C、4D和4E示出了該裝置的變化形式的示意剖面圖。圖5A，5B,5C，5D,5E,5F,5G和5H示出了根據(jù)本發(fā)明的裝置的側(cè)橫截面圖。圖6A-6J示出了根據(jù)本發(fā)明的裝置的側(cè)橫截面圖。圖7示出了細(xì)胞培養(yǎng)室的標(biāo)記的例子。圖8A示出了底板的示意的透視圖。圖8B示出了底板的示意平面圖。圖8C示出了通過圖8B的裝置的AA'的示意的橫截面。圖9A示出了細(xì)胞培養(yǎng)裝置組件的示意的透^L圖。圖9B示出了細(xì)胞培養(yǎng)裝置組件的示意的橫截面。具體實施例方式本發(fā)明的裝置提供不同細(xì)胞的協(xié)同培養(yǎng)，例如可產(chǎn)生胚胎的細(xì)胞，從而使得共同的培養(yǎng)介質(zhì)能被使用。本裝置還提供一種物理阻擋以制止胚胎的混合。本裝置還提供用于培養(yǎng)介質(zhì)的變化逐漸實施，以便減小培養(yǎng)情況中的突變引起的沖擊。在第一方面，本發(fā)明提供培養(yǎng)細(xì)胞使用的裝置，該裝置包括至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室和流體容器，該細(xì)胞培養(yǎng)室具有錐形側(cè)壁并且通過流體通路與流體容器流體連通，該流體通路經(jīng)由在培養(yǎng)室中的孔連接到培養(yǎng)室，該孔小于待培養(yǎng)的細(xì)胞的直徑，從而使得細(xì)胞保持在細(xì)胞培養(yǎng)室的內(nèi)部。不被限制的情況下，具有錐形側(cè)壁的細(xì)胞培養(yǎng)室的提供允許操作者易于訪問和/或允許較好質(zhì)量的光學(xué)成象。在優(yōu)選實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)室的錐形側(cè)壁相對于細(xì)胞培養(yǎng)室的水平軸傾斜大約45度到大約60的角度。在另一個優(yōu)選實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)室具有另一個側(cè)壁，其相對于細(xì)胞培養(yǎng)室的水平軸傾斜大約80度到大約90度的角度。在進(jìn)一步優(yōu)選實施例中，該裝置包括多個流體性連接的細(xì)胞培養(yǎng)室。在又一個實施例中，該裝置包括多個流體容器，其中每個流體容器被此流體連通并且與細(xì)胞培養(yǎng)室流體連通。在另一個優(yōu)選實施例中，流體容器具有加載口，其具有與一個裝置匹配的壁，例如流體導(dǎo)入裝置。更優(yōu)選，該流體容器具有加載口，其具有與一個裝置匹配的錐形壁，例如流體導(dǎo)入裝置。在一個優(yōu)選實施例中，裝置1可裝配到底板18上并且覆蓋有蓋23(見圖9A)。底板18包括裝配區(qū)19和一系列的1到7個流體容器20(見圖8A,8B)。流體容器20可用來預(yù)先調(diào)節(jié)培養(yǎng)或者需要在孵化期間隨后培養(yǎng)步驟處理的介質(zhì)的溫度和PH值。裝配區(qū)19的直徑可大于裝置1的直徑，因此在裝置1的外圍產(chǎn)生溢出通道17，以收集從細(xì)胞培養(yǎng)室和/或流體容器中溢出的介質(zhì)(見圖9B)。底板18包括外邊緣22，其垂直尺寸充分大以使得操作者可靠的和堅固的握住。更優(yōu)選的，外邊緣22的垂直尺寸是3到8毫米(見圖8C)。蓋23的直徑可以等于或者小于底板18的外邊緣22的直徑(見圖9B)，以改善操作者對裝配的裝置的處理并且減少了在操作期間落下裝配裝置的危險。在裝配狀態(tài)下，蓋23停留在底板18的蓋背脊21上，留出易握住和操縱的外邊緣22。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)室基于符號代碼用標(biāo)簽做標(biāo)記。優(yōu)選的，符號代碼對于裝置的右手和左手操作是可讀的。更優(yōu)選的，該符號代碼從該裝置上方或下方是可讀的。現(xiàn)在參見附圖，圖1A是根據(jù)本發(fā)明的裝置的透視圖。裝置1包括多個細(xì)胞培養(yǎng)室2和流體容器3。圖1D是通過圖1B的裝置1的AA'的橫截面并且示出了流體連接容器3和細(xì)胞培養(yǎng)室2的流體通路4。多種材料可用于制造本發(fā)明的裝置。優(yōu)選的，裝置1是從包括環(huán)烯烴共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PC)、聚曱基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰亞胺(Pl)、聚醚酰亞胺(PEI)、聚二曱基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、醋酸纖維素(CA)、醋酸丁酸纖維素(CAB)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚酰胺(PA)、聚對苯二曱酸丁二醇酯(PBT)、聚醚醚酮(PEEK)、聚對苯二甲酸乙二醇酯乙二醇(PETG)、聚曱基戊烯(PMP)、聚曱醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚砜(PSM)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氯乙烯(PVDC)或者聚偏二氟乙烯(PVDF)或者它們的組合的組中選出的材料進(jìn)行制造。優(yōu)選該選擇的材料具有低的水蒸汽滲透性，低吸水率和/或光透明度。該材料的二氧化碳滲透性通常取決于工藝規(guī)則。該裝置的一個或者所有部分可利用阻擋層涂在一個或者所有表面上，例如聚對二曱苯(帕利靈，Parylene),為了致使散裝材料非細(xì)胞毒素的，以降低散裝材料的吸水率，降低散裝材料的水蒸氣吸收并且保護(hù)散裝材料免于與培養(yǎng)介質(zhì)或者培養(yǎng)油的潛在有害相互作用。根據(jù)本發(fā)明的裝置可采用對本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的微制造技術(shù)進(jìn)行制造，該技術(shù)包括模制技術(shù)，例如熱壓印，印記或者注入模制，或者通過在模具內(nèi)部聚合先驅(qū)聚合體。該裝置1可以制造為單個對象或者包括多個部分，例如包括流體通路和結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)化部分，隔離物和包括底板的部分，它們結(jié)合以形成本發(fā)明的裝置1。該結(jié)構(gòu)化部分可通過微銑銷或者類似的機械微加工制成。在優(yōu)選的實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)室2和流體容器3被銑銷在一個表面上并且流體通路4在另一個面上。如果裝置1由單獨的部分組成，可采用膠粘劑，或者其它的粘合方法，例如熱擴(kuò)散粘合，超聲波焊接，溶劑粘合和激光焊接對這些部分連接。在優(yōu)選的實施例中，流體通路4可采用具有厚度等于流體通路4所需厚度的預(yù)結(jié)構(gòu)化的隔離物實現(xiàn)。例如，流體通路4可利用熱激活帶或壓力激活帶(例如透明膠帶)實現(xiàn)，其定義了流體通路4以及提供在結(jié)構(gòu)化部分和基底部分之間的機械結(jié)合。隔離物結(jié)構(gòu)還可結(jié)合入或者基底部分或者結(jié)構(gòu)化部分上，或者到基底和結(jié)構(gòu)化部分兩者上。本發(fā)明的裝置還用于在每個細(xì)胞培養(yǎng)室2培養(yǎng)單個細(xì)胞，或者在每個細(xì)胞培養(yǎng)室2培養(yǎng)細(xì)胞群。在優(yōu)選的實施例中，單個細(xì)胞可在細(xì)胞培養(yǎng)室中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)室2用于限制細(xì)胞的運動并且保持細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)室2中。細(xì)胞培養(yǎng)室還保持細(xì)胞的唯一地址，以便于通過自動分泌，旁分泌和內(nèi)分泌分子交換的細(xì)胞連通，并且便于介質(zhì)交換。在優(yōu)選的實施例中，微流體表面的親水性可通過諸如等離子體聚合的表面處理技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，紫外線處理，皂化，聚環(huán)氧乙烷移植，表面紋理化處理或者電濕可^^皮應(yīng)用。優(yōu)選的，細(xì)胞培養(yǎng)室2的體積是大約0.1m1到1.5m1。更優(yōu)選的，細(xì)胞培養(yǎng)室2的體積是大約0.1n1到0.3jul。更優(yōu)選的，細(xì)胞培養(yǎng)室2的體積是大約0.125yl。在優(yōu)選實施例中，裝置1包括多個流體連接的細(xì)胞培養(yǎng)室2。為了便于細(xì)胞的加載與卸載，優(yōu)選多個細(xì)胞培養(yǎng)室2是定向為相同的方向(見圖1A，1B，1C和4A)。圖2是穿過細(xì)胞培養(yǎng)室2的橫截面，示出了細(xì)胞培養(yǎng)室2的基底的優(yōu)選尺寸。孔5連4妻到細(xì)胞培養(yǎng)室2和流體通3各4，并且可以為任何形狀。優(yōu)選的，流體通路4的直徑是40到120)am。細(xì)胞培養(yǎng)室2具有錐形側(cè)壁6,其相對于細(xì)胞培養(yǎng)室2的水平軸傾斜大約45度到大約60的角度。該細(xì)胞培養(yǎng)室2通常還具有另一個側(cè)壁7，其相對于細(xì)胞培養(yǎng)室2的水平軸稍微傾斜成大約80度到大約90度的角度。側(cè)壁的錐形允許容易制造，制止氣泡的形成和/或輔助光學(xué)檢驗。細(xì)胞培養(yǎng)室2的上邊緣8和下邊緣9通常^皮倒圓，例如，以幫助流體流動和/或避免氣泡。在細(xì)胞培養(yǎng)室2中的孔5(圖2)可通過提供重疊銑削深度(例如，用于細(xì)胞培養(yǎng)室2的銑削深度和用于流體通路4的銑削深度的總和大于結(jié)構(gòu)化部分的厚度)或者通過在兩個銑削結(jié)構(gòu)之間鉆出孔5來實現(xiàn)。該鉆孔可通過例如傳統(tǒng)的機械打孔或者通過激光微觀構(gòu)造實現(xiàn)?？蛇x擇的，該孔5在細(xì)胞培養(yǎng)室的形成期間通過注入模制形成(例如通過放置適當(dāng)構(gòu)造的插入物進(jìn)入注射模具以形成孔5)。在優(yōu)選實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)室2被標(biāo)記。細(xì)胞培養(yǎng)室2的標(biāo)記可通過字母數(shù)字代碼，基于符號的代碼，條形碼，點代碼或者通過可讀的任何其他這種方法,優(yōu)選通過利用反轉(zhuǎn)的或者傳統(tǒng)的顯微鏡的光學(xué)檢驗(參見圖7)。優(yōu)選的，標(biāo)簽對于裝置的左手^和右手操作是可讀的:和/或用于從上面或者下面讀出。在優(yōu)選的實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)室2在其基底具有大約200ym到大約600Mm的直徑。更優(yōu)選的，細(xì)胞培養(yǎng)室2在其基底具有大約300Mm到大約500jum的直徑。優(yōu)選的，多個流體容器提供在裝置1中，其中每個流體容器優(yōu)選彼此流體連通以及與細(xì)胞培養(yǎng)室2流體連通。該流體容器3可用于流體從細(xì)胞培養(yǎng)室2的進(jìn)入和流出兩者。流體容器3可包括在其上邊緣的旋轉(zhuǎn)鎖定(luerlock)配件，圍繞它的上環(huán)的O形環(huán)，與優(yōu)選流體導(dǎo)入裝置(例如實驗室移液管)匹配的錐形進(jìn)入口和/或圍繞它的上環(huán)的臨時密封裝置，以幫助在流體容器3中交換流體。流體容器3可具有集成的芯吸裝置，例如海綿。優(yōu)選的，芯吸裝置可被集成，從而芯吸裝置的下側(cè)的位置定義了細(xì)胞培養(yǎng)室2的所需的裝填高度。在優(yōu)選的實施例中，諸如步級或者標(biāo)記的流體體積指示器形成在流體容器3的壁上以指示流體體積。在優(yōu)選的實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)噴射入流體容器3中。從流體容器3開始，細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)優(yōu)選通過毛細(xì)流動或者通過外加電壓差異經(jīng)由流體通路4流入到細(xì)胞培養(yǎng)室2的孔5中，并且隨后填滿細(xì)胞培養(yǎng)室2。在細(xì)胞培養(yǎng)室2中的流體水平通常直接取決于噴射流體體積。流體水平可通過諸如重力進(jìn)行平衡。未被理論限制，從上面利用培養(yǎng)介質(zhì)填充細(xì)胞培養(yǎng)室2將幾乎確定地捕集細(xì)胞培養(yǎng)室2中的氣泡，并且因此制止成功的細(xì)胞培養(yǎng)。從下面填充細(xì)胞培養(yǎng)室2克服了捕集氣泡的問題。圖3A和3B示出了裝置1的橫截面的側(cè)視圖并且在圖3A中示出了應(yīng)用到流體容器3中的介質(zhì)10。圖3B示出了介質(zhì)10從流體容器3流動通過流體通路4，并且從下面填充細(xì)胞培養(yǎng)室2。圖4B是細(xì)胞培養(yǎng)室2的平面示意圖并且示出了細(xì)胞培養(yǎng)室2通常具有至少兩個側(cè)壁，它們傾斜成大約30度到大約90度的角度。圖4C,4D和4E是穿過細(xì)胞培養(yǎng)室2的橫截面示圖，并且示出了用于錐形側(cè)壁6的不同結(jié)構(gòu)，該側(cè)壁6相對于細(xì)胞培養(yǎng)室2的水平軸傾斜大約45度到大約60的角度。該細(xì)胞培養(yǎng)室2通常還具有另一個側(cè)壁7，其相對于細(xì)胞培養(yǎng)室2的水平軸稍微傾斜成大約80度到大約90度的角度。圖4E示出了變化形式，其中細(xì)胞培養(yǎng)室2的上邊緣8和下邊緣9通常被倒圓。細(xì)胞培養(yǎng)室2的通常的深度，300到2000μm還一皮指示出。在優(yōu)選實施例中，在使用時，在細(xì)胞培養(yǎng)室2中的介質(zhì)大體上由物質(zhì)覆蓋，例如細(xì)胞培養(yǎng)油，諸如石蠟基油，諸如Cook⑧悉尼試管受精培養(yǎng)油或者硅樹脂基油，以最小化蒸發(fā)。優(yōu)選如果使用培養(yǎng)油，細(xì)胞不會接觸到培養(yǎng)油。優(yōu)選的，流體容器3中的介質(zhì)還大體上由物質(zhì)覆蓋，例如細(xì)胞培養(yǎng)油，諸如石蠟基油，諸如Cook⑧悉尼試管受精培養(yǎng)油或者硅樹脂基油，以最小化蒸發(fā)。在另一個方面，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，該方法包括在才根本發(fā)明的第一方面的裝置的至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室中提供培養(yǎng)介質(zhì)以及孵化該裝置。圖5是裝置1的側(cè)橫截面示圖和用于在細(xì)胞培養(yǎng)室2中改變介質(zhì)的優(yōu)選方法的示意流程圖。圖5示出了細(xì)胞11的群體，例如胚胎，其位于細(xì)胞培養(yǎng)室2中。在圖5A中，細(xì)胞培養(yǎng)油12已經(jīng)分層在細(xì)胞培養(yǎng)室2的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)14上，使得該培養(yǎng)油12大體上覆蓋培養(yǎng)介質(zhì)的表面。代替的介質(zhì)13被應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)室2并且通過培養(yǎng)油12擴(kuò)散(圖5B)。原來的介質(zhì)14經(jīng)由細(xì)胞培養(yǎng)室2中的孔吸出細(xì)胞培養(yǎng)室2并且通過流體通路4運動到流體容器3中。原來的介質(zhì)14通過例如移液管或者使用注射器(圖5C),通過從流體容器3除去原來介質(zhì)14而從細(xì)胞培養(yǎng)室2中吸出。一旦原來的介質(zhì)14的大部分已經(jīng)移去，在細(xì)胞培養(yǎng)室2中的介質(zhì)的水平返回到所需的水平。在優(yōu)選的實施例中，代替的介質(zhì)13通過例如，注射器或者移液管(圖5E，5F)在培養(yǎng)油層之下注入。原來的介質(zhì)14經(jīng)由細(xì)胞培養(yǎng)室2中的孔吸出細(xì)胞培養(yǎng)室2并且通過流體通路4運動到流體容器3中。原來的介質(zhì)14通過例如移液管或者使用注射器(圖5G),從流體容器3除去原來介質(zhì)14而從細(xì)胞培養(yǎng)室2中吸出。一旦原來的介質(zhì)14的大部分已經(jīng)移去，在細(xì)胞培養(yǎng)室2中的介質(zhì)的水平返回到所需的水平(圖5H)。在優(yōu)選的實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)通過移液管，芯吸或者泵吸^U虎體容器3中引入和除去。下面是相關(guān)于圖6的利用本發(fā)明的裝置的一種方式的一般說明，用于在胚胎的植入接受者的生殖道之前胚胎的體外生長。限定體積的Cook⑧悉尼試管受精分裂介質(zhì)15(Cook⑧悉尼試管受精分裂介質(zhì)是合成的碳酸氫鹽緩沖液介質(zhì)，其包含抗氧化劑，非必需氨基酸和人血清白蛋白，但是沒有葡萄糖(見表l))被注射入流體容器3中。從那里，它或者通過毛細(xì)流動或者通過施加壓力從下面填充細(xì)月包培養(yǎng)室。對介質(zhì)體積進(jìn)行選擇，從而使得流體的上部水平低于細(xì)胞培養(yǎng)室2的上邊緣。然后胚胎采用移液管吸入細(xì)胞培養(yǎng)室2中。諸如石蠟或者硅樹脂基油12的IVF培養(yǎng)油應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)室2區(qū)域和流體容器3中，從而使得它大體上覆蓋在細(xì)胞培養(yǎng)室2和流體容器3中的介質(zhì)表面。然后裝置1在需要的時間(通常48到72小時)被孵化。限定體積的Cook⑧悉尼試管受精胚泡介質(zhì)16(Cook⑧悉尼試管受精胚泡介質(zhì)是碳酸氬鹽緩沖液介質(zhì)，其包含必需的和非必需的氨基酸、葡萄糖和人血清白蛋白以促進(jìn)早期胚胎到的胚泡生長(見表2))被應(yīng)用入細(xì)胞培養(yǎng)小室2中。由于低的比重，IVF培養(yǎng)油U將上升到Cook⑧悉尼試管受精胚泡介質(zhì)16層的頂部。然后一些量的介質(zhì)從流體容器3中取出，優(yōu)選通過芯吸，移液管吸或者泵吸。該處理過程可重復(fù)，直到所有的Cook⑧悉尼試管受精分裂介質(zhì)或者完全地除去或者稀釋到需要體積，例如細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的總體積的5%。在培養(yǎng)介質(zhì)交換之后，油層12停留靠在細(xì)胞培養(yǎng)室2中的介質(zhì)的頂部。然后裝置l在需要的時間(通常48到72小時)被孵化。該胚胎可以通過，例如移液管吸，如所需的從細(xì)胞培養(yǎng)室2中吸出。在另一個實施例中，限定體積的Cook⑧悉尼試管受精分裂介質(zhì)15被注射入流體容器3中。從流體容器3開始，介質(zhì)通過毛細(xì)流動或者通過施加壓力從下面填充細(xì)胞培養(yǎng)室。對介質(zhì)體積進(jìn)行選擇，從而使得流體的上部水平低于細(xì)胞培養(yǎng)室2的上邊緣。試管受精培養(yǎng)油，諸如石蠟或者硅樹脂基油12應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)室2和流體容器3中。然后裝置被用熱的方法和以化學(xué)方法平衡(通常在孵卵器中)。然后胚胎被移液管吸入低于油層的細(xì)胞培養(yǎng)室2中。然后，裝置l在需要的時間(通常48到72小時)適當(dāng)?shù)乇环趸?。在另一個實施例中，限定體積的Cook⑧悉尼試管受精分裂介質(zhì)15被注射入流體容器3中。從流體容器3開始，介質(zhì)通過毛細(xì)流動或者通過施加壓力從下面填充細(xì)胞培養(yǎng)室。沒有另外的試管受精培養(yǎng)油被使用。然后裝置被用熱的方法和以化學(xué)方法平衡(通常在孵卵器中)。然后胚胎被移液管吸入細(xì)胞培養(yǎng)室2中。然后，裝置1在需要的時間(通常48到72小時)適當(dāng)?shù)乇环趸?。?表1Cook⑧悉尼試管受精分裂介質(zhì)<table><row><column>氯化鈉</column><column>慶大霉素</column><column>L-天冬酰胺一水合物</column></row><row><column>氯化鉀</column><column>乙二胺四乙酸二鈉鹽</column><column>L-天冬氨酸</column></row><row><column>正磷酸二氫鉀</column><column>L－?；撬?lt;/column><column>L-谷氨酸</column></row><row><column>硫酸鎂</column><column>L-谷氨酸鹽</column><column>L-脯氨酸</column></row><row><column>碳酸氬鈉</column><column>氨基乙酸</column><column>L-絲氨酸</column></row><row><column>丙酮酸鈉</column><column>工藝用水</column><column>人血清白蛋白</column></row><row><column>半乳酸鈣</column><column>L-丙胺酸</column><column></column></row><table>表2<table><row><column>表2Cook⑧悉尼試管受精胚泡介質(zhì)</column></row><row><column>氯化鈉</column><column>L-?；撬?lt;/column><column>L-蛋氨酸</column></row><row><column>氯化鉀</column><column>工藝用水</column><column>L-酪氨酸二鈉二水合物</column></row><row><column>正-舞酸二氬鉀</column><column>氨基乙酸</column><column>L-色氨酸</column></row><row><column>石克酸鎂</column><column>L-半胱氨酸二鈉一水合物</column><column>L-丙胺酸</column></row><row><column>碳酸氬鈉</column><column>L-精氨酸</column><column>L-纈氨酸</column></row><row><column>丙酮酸鈉</column><column>L-異亮氨酸</column><column>L-天冬氨酸</column></row><row><column>半乳酸4丐</column><column>L-組氨酸</column><column>L-天冬酰胺一水合物</column></row><row><column>慶大霉素</column><column>L-賴氨酸</column><column>L-谷氨酸</column></row><row><column>D-葡萄糖</column><column>L-亮氨酸</column><column>L-絲氨酸</column></row><row><column>L-谷氨酸鹽</column><column>L-苯基丙氨酸</column><column>L-脯氨酸</column></row><row><column>人血清白蛋白</column></row><table>例子本發(fā)明的適用性通過試圖跟隨如上所述的規(guī)程從2細(xì)胞階段(包含僅僅2個相同尺寸細(xì)胞的胚胎)到胚泡階段(采用由細(xì)胞薄層環(huán)繞的分裂腔的大約4天年紀(jì)的胚胎)生長老鼠胚胎進(jìn)行驗證。根據(jù)說明書的裝置通過微銑削用聚曱基丙烯酸甲酯(PMMA)制造。部件涂有聚對二曱苯C并且通過熱擴(kuò)散粘合結(jié)合在一起。該裝置使用凈化水沖洗進(jìn)行清潔，以除去任何潛在的微粒污染物。雌性老鼠被排卵過量并且與配種雄性交配。它們在隨后的幾天犧牲并且2細(xì)胞胚胎從輸卵管中除去。這些胚胎被放置在裝置的細(xì)胞培養(yǎng)室中，其已經(jīng)充滿了平衡的培養(yǎng)介質(zhì)。同時，大約20個2細(xì)胞胚胎被放置入標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，其已經(jīng)填滿了合理數(shù)量的相同的平衡培養(yǎng)介質(zhì)。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)皿中的胚胎充當(dāng)對照樣品，以說明在胚胎生存能力和環(huán)境條件中的變換。然后測試和對照樣品兩者(分別為根據(jù)本發(fā)明的裝置和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的培養(yǎng)皿)用于在5-6%二氧化碳富集的大氣中，在37攝氏度下孵化"小時。在72小時之后，每個胚胎的發(fā)育階段被記錄并且對于試樣和對照樣品分別計算已經(jīng)達(dá)到胚泡階段的胚胎的百分比。然后，對于試樣的百分比結(jié)果用對照樣品的百分比結(jié)果來標(biāo)準(zhǔn)化。如果已經(jīng)達(dá)到胚泡發(fā)展階段的2細(xì)胞胚胎的標(biāo)準(zhǔn)化百分比是80%或者更高，該裝置認(rèn)為已經(jīng)通過老鼠胚胎試驗。根據(jù)本發(fā)明的該裝置的原型已經(jīng)滿足此標(biāo)準(zhǔn)，因此已經(jīng)通過試驗。在此整個說明書中，單詞"包括"或者其變換包含"和"由…構(gòu)成"將理解為意味著包括所指的元件，整體或者步驟，或者元件，整體和步驟的組，而不是排除了其它任何的元件，整數(shù)或者步驟或者元件、整數(shù)或者和步驟的組。在此說明書中提到的所有出版物在此作為參考結(jié)合。已經(jīng)包括在本發(fā)明中的文件，作用，材料，裝置和物品等等的所有討論僅僅為了提供用于本發(fā)明的背景。不認(rèn)為允許的是任何或者所有這些內(nèi)容形成現(xiàn)有4支術(shù)基礎(chǔ)或者是在相關(guān)于本發(fā)明的領(lǐng)域中的公知常識，當(dāng)它在本申請的每個權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前存在于澳大利亞或者別處時。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是在具體實施例所示的對本發(fā)明所進(jìn)行的許多的變化和/或修改沒有脫離如概括描述的本發(fā)明的精神或者范圍。因此，這些實施例在各方面認(rèn)為是示例的而不是限制的。權(quán)利要求1.一種使用來培養(yǎng)細(xì)胞的裝置，該裝置包括至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室和流體容器，該細(xì)胞培養(yǎng)室具有錐形側(cè)壁并且通過流體通路與流體容器流體連通，該流體通路經(jīng)由在培養(yǎng)室中的孔連接到培養(yǎng)室，該孔小于待培養(yǎng)的細(xì)胞的直徑，從而使得細(xì)胞保持在細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)。2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中該裝置包括多個流體連接的細(xì)胞培養(yǎng)室。3.如權(quán)利要求2所述的裝置，其中該裝置包括多個流體容器，其中每個流體容器彼此流體連通并且與細(xì)胞培養(yǎng)室流體連通。4.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的裝置，其中該裝置由從包括環(huán)烯烴共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PC)、聚曱基丙烯酸曱酯(PMMA)、聚對苯二曱酸乙二醇酯(PET)、聚酰亞胺(Pl)、聚醚酰亞胺(PEI)、聚二曱基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、醋酸纖維素(CA)、醋酸丁酸纖維素(CAB)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚酰胺(PA)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚醚醚酮(PEEK)、聚對苯二甲酸乙二醇酯乙二醇(PETG)、聚曱基戊烯(PMP)、聚曱醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚石風(fēng)(PSM)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氯乙烯(PVDC)或者聚偏二氟乙烯(PVDF)或者其組合的組中選出的材料制造。5.如權(quán)利要求4所述的裝置，其中該裝置的一個或者所有部分利用諸如聚對二曱苯的阻擋層涂在一個或所有的表面上。6.如權(quán)利要求1到5中任一項所述的裝置，其中該錐形側(cè)壁相對于細(xì)胞培養(yǎng)室的水平軸傾斜大約45度到大約60的角度。7.如權(quán)利要求1到6中任一項所述的裝置，其中細(xì)胞培養(yǎng)室具有另一個側(cè)壁，該另一個側(cè)壁相對于細(xì)胞培養(yǎng)室的水平軸傾斜大約80度到大約90度的角度。8.如權(quán)利要求1到7中任一項所述的裝置，其中該流體容器具有加載口，該加載口具有與流體導(dǎo)入裝置匹配的錐形壁。9.如權(quán)利要求1到8中任一項所述的裝置，其中細(xì)胞培養(yǎng)室基于符號代碼用標(biāo)簽標(biāo)記，其中符號代碼對于裝置的左手或者右手操作是可讀的。10.如權(quán)利要求9所述的裝置，其中該符號代碼從該裝置上方或下方是可讀的。11.一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，該方法包括在根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項所述的裝置的至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室中提供培養(yǎng)介質(zhì)以及孵化該裝置。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中從下面填充該至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室。全文摘要本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的裝置。該裝置包括至少一個細(xì)胞培養(yǎng)室和流體容器。該細(xì)胞培養(yǎng)室具有錐形側(cè)壁并且通過流體通路與流體容器流體連通，該流體通路經(jīng)由在培養(yǎng)室中的孔連接到培養(yǎng)室，該孔小于待培養(yǎng)的細(xì)胞的直徑，從而使得細(xì)胞保持在細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)。文檔編號C12M3/00GK101208422SQ200680013685公開日2008年6月25日申請日期2006年2月23日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者D·S·奧布賴恩,J·L·格拉芬格,J·P·黑斯,J·W·斯皮特爾,M·D·索洛蒙,M·許尼曼申請人:威廉·A·庫克澳大利亞股份有限公司