專利名稱：：天然高產(chǎn)葉酸菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及選擇葉酸高產(chǎn)突變菌抹的方法。本發(fā)明的這些方法中，利用抗葉酸氨甲喋呤(MTX)作為選擇試劑。也提供了含有該突變菌林或這些菌林的衍生物或提取物的食品和食品添加劑組合物。
背景技術(shù)：
：多年來，由于葉酸類似物特別是二氫葉酸還原酶抑制劑在癌癥化學(xué)療法中以及作為抗瘧原蟲藥物的潛在作用，逐漸成為研究的主題。文獻(xiàn)首先報(bào)道的葉酸類似物之一就是LederleLaboratories公司的氨曱喋呤。1948年這個(gè)化合物-故用于治療急性白血病(HUchings,G.H.,Jr,,1989,InVitroCellDevBiol25:303-10)。氨曱喋呤(MTX)的活性基于對(duì)靶酶二氬葉酸還原酶的竟?fàn)幮砸种啤＿@個(gè)酶對(duì)于利用二氫葉酸(DHF)作為底物生成四氫葉酸(THF)及四氫葉酸循環(huán)是必需的。氨甲喋呤的特異性可以通過不同物種中二氳葉酸還原酶的結(jié)構(gòu)差異來解釋(Chang等，1978,Nature275:617-24)。氨曱喋呤抑制細(xì)胞產(chǎn)生足夠的四氫葉酸來生物合成曱硫氨酸、DNA和RNA。但是在嘌呤、胸腺嘧啶、甘氨酸、甲硫氨酸和泛酸(所有這些代謝產(chǎn)物的生物合成都需要四氬葉酸)存在的情況下，細(xì)胞生物合成四氫葉酸的需求會(huì)降低(Harvey，R.J.,1973:JBacteriol114:309-22)。不管是否有依賴型葉酸代謝物，由于四氫葉酸是形成蛋白質(zhì)合成起始所必需的曱硫氨酰-tRNA必不可少的，因此細(xì)胞的生長(zhǎng)在某些方面被氨甲喋呤所抑制(Baumstark等，1977,JBacteriol129:457-71)。乳酸乳球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌這樣的乳酸菌對(duì)于氨曱喋呤和另一個(gè)葉酸類似物甲氧千氨嘧啶的反應(yīng)有高度的可變性。乳酸乳球菌對(duì)兩種抗葉酸物質(zhì)都不敏感(Leszczynska等,1995,應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)61:561-6)。眾所周知，對(duì)于眾多的有機(jī)體,長(zhǎng)期暴露于抗葉酸物質(zhì)可以選擇抗性細(xì)胞類型。幾個(gè)潛在的機(jī)制已經(jīng)被用來解釋真核細(xì)胞系和細(xì)菌對(duì)氨甲喋呤的抗性機(jī)制。Tamura等(1997，Microbiology143:2639-46)研究了海氏腸球菌(Enterococcushirae)產(chǎn)生氨曱喋呤抗性的機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)了幾種表型效應(yīng)(i)葉酸還原酶(FAR)活性增高；(ii)二氫葉酸還原酶(DHFR)活性增加；(Hi)含有兩個(gè)谷氨酰殘基的氨曱喋呤的合成和細(xì)胞內(nèi)駐留的減少；(iv)伴隨葉酸攝入量的減少，氨甲喋呤的攝入量也減少；及(v)葉酸結(jié)合量的減少。在抗性形成過程中，培養(yǎng)基中的葉酸形式會(huì)影響二氫葉酸還原酶和葉酸還原酶活性，以及葉酸的運(yùn)輸。雖然暴露于氨甲喋呤可以用來選擇對(duì)氨甲喋呤抗性增加的細(xì)胞，但是先前的文獻(xiàn)報(bào)道在氨曱喋呤抗性和細(xì)胞的葉酸水平之間沒有聯(lián)系。對(duì)比前面的氨曱蝶呤抗性機(jī)制的描述，本發(fā)明令人驚奇的發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞有另一個(gè)產(chǎn)生氨曱喋呤抗性的機(jī)制產(chǎn)生高水平的葉酸。用氨甲喋呤作為選擇試劑，可以利用這個(gè)發(fā)現(xiàn)篩選和選擇高產(chǎn)葉酸(自發(fā))突變菌抹。這些菌抹尤其是食品級(jí)菌抹，可以用來強(qiáng)化具有葉酸的食品產(chǎn)品。葉酸是可溶性的B族維生素，對(duì)于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能發(fā)揮是必需的。許多食品產(chǎn)品，如面包、谷物、乳制品等都補(bǔ)充葉酸來保證足夠的葉酸攝入量。本發(fā)明的突變菌林可以通過如用突變菌抹進(jìn)行發(fā)酵的方法，用天然的葉酸來強(qiáng)化食品產(chǎn)品。定義本發(fā)明提到的乳酸菌指的是可以產(chǎn)生乳酸，并把乳酸作為最終發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)菌，如乳桿菌、乳球菌、鏈球菌、和雙歧桿菌等一些菌屬。本發(fā)明中的菌抹或分離菌抹可以互換使用，且指的是在生長(zhǎng)或繁殖的時(shí)候，保持遺傳不變的細(xì)菌，包括同一細(xì)菌的繁殖。突變細(xì)菌，或突變菌林或分離菌林指的是自然(自發(fā)的、自然發(fā)生的)突變菌，或在野生型沒有DNA片段的染色體組中含有一個(gè)或多個(gè)誘導(dǎo)突變的菌株。誘導(dǎo)突變指的是通過人為處理引起突變的菌抹，如用化學(xué)突變劑、紫外線或伽馬輻射等。相反，自然或自發(fā)突變是沒有被人為誘變處理的。本發(fā)明的突變菌抹指的是非基因修飾菌，即沒有通過重組DNA技術(shù)修飾的菌林。"野生型菌抹，，或"野生型分離菌抹"指的是沒有發(fā)生突變形式的細(xì)菌，就像剛從自然界發(fā)現(xiàn)的一樣。"葉酸依賴型代謝物"指的是葉酸生物合成或分解的代謝產(chǎn)物或前體，在細(xì)胞存在于氨曱喋呤培養(yǎng)基時(shí)，可以掩蓋細(xì)胞對(duì)氨曱喋呤的敏感性。"氨曱喋呤抑制量"指的是完全抑制細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的氨甲喋呤量。一般而言，對(duì)于原核細(xì)胞，每升培養(yǎng)基至少大約1.25毫克可以對(duì)氨曱喋呤敏感細(xì)胞產(chǎn)生抑制。"總?cè)~S交"指的是菌抹產(chǎn)生的細(xì)胞外(分泌)和細(xì)胞內(nèi)葉酸水平之和。"食品級(jí)"微生物特別指的是被人或試驗(yàn)動(dòng)物攝入時(shí)，可以認(rèn)為沒有危害的微生物。術(shù)語"包含"可以解釋為特指存在特定的部分、步驟或組分，但不排除一個(gè)或多個(gè)附加的部分、步驟或組分。因此，含有X菌林的組合物可以包含另外的菌林，或其它組分等。同時(shí)，被不定冠詞"a"或""an"修飾的成分不排除有多于一種成分的可能性。除非上下文中明確要求有且只有一個(gè)成分。因此，通常不定冠詞"a"或""an"意思是至少一個(gè)。發(fā)明詳述試驗(yàn)中，無論重組葉酸高產(chǎn)菌抹是否已經(jīng)修改了氨曱。巣呤的敏感性，研究發(fā)現(xiàn)許多植物乳桿菌野生菌林即使在抑制量氨甲喋呤(1.25毫克/升)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約40個(gè)小時(shí)，也不被氨甲喋呤抑制，且與缺乏氨甲喋呤的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度相似。分析這些菌林的葉酸水平，大約5%的菌落與野生菌抹(沒有突變)相比，葉酸產(chǎn)量顯著升高。葉酸總量比野生菌林的葉酸總量(平均)高4%到63%。這個(gè)研究證明氨曱喋呤可以用來有效選擇自然(非基因修飾菌林)葉酸高產(chǎn)菌林。甚至當(dāng)菌林在缺乏氨甲喋呤的培養(yǎng)基上傳代50次以上，仍有對(duì)氨甲喋呤的耐性，這說明菌林對(duì)氨曱。某呤的耐性是由細(xì)菌基因組上的穩(wěn)定(自發(fā))突變引起的。從重組植物乳桿菌可以看出，提高葉酸產(chǎn)量同樣可以導(dǎo)致對(duì)氨曱喋呤的高度耐性，該植物乳桿菌轉(zhuǎn)入了完整的葉酸生物合成基因簇，并將其置于強(qiáng)啟動(dòng)子控制下。這些重組菌抹可以產(chǎn)生高水平的葉酸，而且在缺乏葉酸依賴型代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)氨曱喋呤具有抗性。不限制本發(fā)明的范圍，可以推測(cè)細(xì)胞內(nèi)二氮葉酸水平與累積的氨甲喋呤竟?fàn)幎淙~酸還原酶(DHFR)的活性位點(diǎn)。該發(fā)現(xiàn)被用于開發(fā)快速篩選方法，即通過在氨曱喋呤培養(yǎng)基上生長(zhǎng)來選擇葉酸高產(chǎn)菌林。本研究中鑒定的葉酸高產(chǎn)菌林與野生型產(chǎn)葉酸菌林相比，葉酸水平顯著升高。葉酸高產(chǎn)菌抹的總?cè)~酸量是野生型水平的20-60倍。葉酸高產(chǎn)菌抹的細(xì)胞內(nèi)葉酸量比野生型菌抹的高10到20倍。這種增加的細(xì)胞內(nèi)葉酸水平引起細(xì)胞對(duì)氨曱喋呤的敏感性(即耐性)降低。這可以解釋為什么葉酸高產(chǎn)菌抹的生長(zhǎng)沒有被氨曱喋呤顯著影響。只有當(dāng)培養(yǎng)基不含與葉酸有關(guān)的代謝物時(shí)，才可以觀察到野生型菌抹對(duì)氨甲喋呤的敏感性。本發(fā)明的菌抹因此，給出本發(fā)明突變菌抹的一個(gè)實(shí)施例，該菌林的細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外葉酸總量比野生型高，而且在含有(至少)1.25毫克/升氨曱喋呤且不含葉酸依賴型代謝物(即他們具有氨甲喋呤抗性)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)率至少為0.1優(yōu)選在此生長(zhǎng)條件下，突變菌抹的生長(zhǎng)率與在缺乏氨曱喋呤的相同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的野生型的生長(zhǎng)率(即正常生長(zhǎng))，沒有顯著差別。最重要的是，在所含氨曱喋呤的濃度抑制野生型菌株的情況下，突變菌抹可以顯著生長(zhǎng)。抑制濃度是野生型不能充分生長(zhǎng)所需的氨甲蝶呤濃度。例如圖3,顯示了在氨曱喋呤濃度為1.25,1.5,2.0和2.5毫克/升下，野生菌抹生長(zhǎng)率基本為0(n<0.05h—i),而葉酸高產(chǎn)菌株具有0.lp/小時(shí)以上的生長(zhǎng)率，尤其達(dá)到約0.15^/小時(shí)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基不應(yīng)該補(bǔ)充葉酸依賴型代謝物，因?yàn)楫?dāng)它們存在的時(shí)候，觀察到菌株對(duì)氨甲喋呤的耐性沒有明顯差異，這可能是因?yàn)橐吧梢酝ㄟ^利用培養(yǎng)基中的葉酸代謝產(chǎn)物來補(bǔ)償葉酸的不足。例如適宜的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為改良化學(xué)合成培養(yǎng)基，其中不含甘氨酸、肌苷、乳清酸、胸腺嘧啶脫氧核苷、鳥嘌呤、腺。票呤、尿嘧啶和黃嘌呤。生長(zhǎng)率可以通過不同方法測(cè)定。例如在特定時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)接種了該菌抹或分離菌抹培養(yǎng)基的分光光度值，就可以計(jì)算出生長(zhǎng)率隨時(shí)間的變化規(guī)律。與野生型菌株相比，優(yōu)選包含細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外葉酸含量高的突變菌抹。與野生型相比，優(yōu)選細(xì)胞內(nèi)葉酸的總量比野生型菌抹細(xì)胞內(nèi)葉酸的平均量至少高約4°/。，5%,10%:15%,20%,25%，30%,40%,50%,更優(yōu)選至少高約60%,63%(或更高)。在某些菌種中，野生型菌林的細(xì)胞內(nèi)葉酸水平具有顯著的差異。優(yōu)選分析許多不同野生型菌抹(例如2，3，4,或者更多菌抹)的細(xì)胞內(nèi)葉酸水平，并計(jì)算其平均葉酸水平。測(cè)定分離株或菌株的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外葉酸的總量并通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法定量，如Sybesma描述的干酪乳桿菌(L.casei)微生物學(xué)測(cè)定方法(見例1.3),或通過HPLC或其他已知的方法分析其變異體。例如微生物檢測(cè)可以用指示菌(如干酪乳桿菌)，它可以利用測(cè)試菌產(chǎn)生的葉酸生長(zhǎng)。如果測(cè)試菌產(chǎn)生大量的葉酸，指示菌就會(huì)生長(zhǎng)的好，因此生長(zhǎng)一定時(shí)間后，光密度檢測(cè)就會(huì)很高。與此相反，如果測(cè)試菌產(chǎn)生葉酸的量較低，就會(huì)檢測(cè)到較低的光密度值。突變菌株優(yōu)選自發(fā)(自然)突變體，例如它是由用本發(fā)明的方法篩選出來的(見下文)。該菌株可以是對(duì)氨曱喋呤天然敏感的任何種的野生型菌林，如植物乳桿菌(L.plantarum)、干酪乳桿菌或乳酸菌的其他種。對(duì)氨曱喋呤敏感意味著，該菌株在缺乏葉酸依賴型代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，可以被至少1.25毫克/升的氨曱喋呤充分抑制。該菌種是否對(duì)氨甲喋呤敏感可以通過讓該菌在含有補(bǔ)足了氨曱喋呤的培養(yǎng)基和缺乏葉酸依賴型代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而方便的檢測(cè)出來。該菌優(yōu)選食品級(jí)菌，而且在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該菌是從包括乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、明串珠菌屬和鏈球菌屬的組中選出的一個(gè)種。該菌優(yōu)選食品級(jí)的乳酸菌。該菌可以從下面的一組菌中挑選，羅伊氏乳桿菌(Lactobaci1lusreuteri)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、嗜酸乳桿菌(L.acidophi1us)、巻曲乳桿菌(L.crispatus)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、干酷乳桿菌(L.casei)、植物乳桿菌(L.plantarum)、副干酷乳桿菌(L.paracasei)、鼠乳桿菌(L.murinus)、唐氏乳桿菌(L.jensenii)、唾液乳桿菌(L.saiivarius)、小乳桿菌(L.minutis)、短乳桿菌(L.brevis)、雞乳桿菌(L.gallinarum)、淀粉乳桿菌(L.araylovorus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸明串珠菌(Lc.lactis)、有害片球菌(Pediococcusdamnosus)、乳酸片球菌(P.acidilactici)、小片球菌(P.parvulus)、兩岐雙岐桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、長(zhǎng)雙岐桿菌(B.longura)、嬰兒雙岐桿菌(B.infantis)、短雙岐桿菌(B.breve)、青春雙岐桿菌(B.adolescente)、動(dòng)物雙岐桿菌(B.animalis)、雞雙岐桿菌(B.gallinarum)、馬格南雙岐桿菌(B.magnura)和嗜熱雙岐桿菌(B.thermophilum)。在另一個(gè)實(shí)施例中突變菌抹是具有高葉酸且對(duì)氨甲喋呤有抗性的誘導(dǎo)突變株。這種突變抹可以采用與自然突變株相同的篩選方法(如下文所述)得到，包含除了篩選突變基因步驟前的方法。該突變基因步驟包括一個(gè)或多個(gè)已知的突變基因方法，如化學(xué)和/或物理突變劑處理(如N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍，紫外輻射，咖瑪輻射等)。突變后，菌林在含有抑制劑量氨甲喋呤的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分離生長(zhǎng)的菌抹，分析其葉酸含量。然而，在另一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明突變菌抹可以通過基因表達(dá)模式來鑒定。這一點(diǎn)被下面的發(fā)現(xiàn)證實(shí)與野生型相比葉酸產(chǎn)量提高至少50%的耐氨甲喋呤植物乳桿菌(L.plantarum)顯示基因組中的一個(gè)或多個(gè)folC基因2倍(或更多倍)過表達(dá)。folC基因編碼二氬葉酸合成酶。在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的菌抹與編碼葉酸生物合成途徑的酶的一個(gè)或多個(gè)基因的野生型菌林相比顯示過表達(dá)。除直接參與葉酸生物合成的基因外，發(fā)現(xiàn)下列基因也具有較高的轉(zhuǎn)錄水平果糖激酶基因(編碼果糖激酶)、丙酮酸氧化酶基因、乳酸氧化酶基因和丙酮酸脫氬酶基因。與野生型相比二幾丙酮磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(甘油酮激酶基因)轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的菌抹，編碼二氫葉酸合成酶(EC6.3.2.17)、果糖激酶(EC2.7.1.4)、丙酮酸氧化酶(EC1.2.3.3)、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.86)這組基因中的一個(gè)或多個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。另外，該菌林包含編碼二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)移酶(即甘油激酶)(EC.2.7.1.29)的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。術(shù)語"正調(diào)節(jié)"或"負(fù)調(diào)節(jié)"指的是與野生型菌林中的基因相比，mRNA轉(zhuǎn)錄水平的升高或降低。"顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平"指的是與野生型的轉(zhuǎn)錄水平相比，mRNA轉(zhuǎn)錄量增加至少約2倍，優(yōu)選至少約3倍，或甚至約4倍或更多。同樣，"顯著降低轉(zhuǎn)錄水平"指的是比野生型mRNA轉(zhuǎn)錄量減少至少約2倍，3倍等。一個(gè)或多個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平可以用常用分子生物學(xué)方法測(cè)定和定量，如Northern分析和定量反轉(zhuǎn)錄酶(RT-)PCR。由于可以得到這些基因的DNA/cDNA序列信息，因此可以找到適于與靶mRNA或cDNA雜交的引物或探針，并通過常用實(shí)驗(yàn)來分析轉(zhuǎn)錄水平。例如植物乳桿菌的核酸序列(基因組已經(jīng)測(cè)序)可以用于其他菌種的同源基因的鑒定(如計(jì)算分析)，克隆(用基于PCR的方法，基于雜交的方法等)和/或序列測(cè)定。根據(jù)這些基因或其部分基因的核酸序列設(shè)計(jì)引物或探針可以用來檢測(cè)或定量靶基因。可選擇的，轉(zhuǎn)錄模式也可以作為選擇標(biāo)準(zhǔn)(上面提到的一個(gè)或多個(gè)基因增強(qiáng)或減少的轉(zhuǎn)錄水平)。例如首先用初篩來改變細(xì)菌的表達(dá)水平，然后再用氨曱喋呤抗性和/或葉酸水平分析(如下文所述)。同樣，也可以用作下面方法中講到的附加的篩選或選擇步驟(例如在步驟(b)和步驟(c)之間或步驟(d)之后，或者甚至取代步驟(a)和(b))。通過用植物乳桿菌WCFS1的全基因組DNA芯片，比較了所描述的氨曱喋呤抗性菌抹(植物乳桿菌NIZOB2550)與親本菌抹(植物乳桿菌WCFS1,其全序列保存在EMBL數(shù)據(jù)庫，登記號(hào)為AL935263)的轉(zhuǎn)錄模式。提取親本菌林和氨甲喋呤耐性突變抹的總mRNA,然后用反轉(zhuǎn)錄酶處理合成焚光標(biāo)記cDNA。差異標(biāo)記親本菌林和突變抹，然后標(biāo)記cDNA的混合樣品與DNA芯片雜交，以檢測(cè)突變菌林與植物乳桿菌親本菌抹的所有基因的mRNA的相對(duì)豐度。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，在一個(gè)實(shí)施例中，突變菌抹保存在NIZO食品研究所P.O.Box20，6710BAEde,荷蘭CBS,其CBS登記號(hào)為CBS117120(CentraalbureauvoorSchimmelcultures,Uppsalalaan8，3584CTUtrecht,荷蘭)。本發(fā)明的組合物本發(fā)明的另一方面涉及含有上述突變菌抹或其衍生物或提取物的組合物，也涉及生產(chǎn)這些組合物的方法。本發(fā)明的菌抹在適宜條件下培養(yǎng)，任選從培養(yǎng)基中回收，和任選配制成符合預(yù)期用途的組合物。制備這些組合物的方法本身是已知的。優(yōu)選用突變菌林，其衍生物或其提取物來制備含有天然葉酸的食品或食品添加劑。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的組合物適宜于被主體所消耗，該主體優(yōu)選人或動(dòng)物。這些組合物可以采用食品添加劑或完整食品或食品組合物等形式，其中除了本發(fā)明的菌抹外還含有適宜的食品基質(zhì)。此處，食品或食品組合物應(yīng)理解為不但包括固體和半固體組合物，也包括人和動(dòng)物用液體食品，如飲料。食品或食品組合物可以是固體、半固體和/或液體食品或食品組合物，而且特別是可以是奶制品，如發(fā)酵奶制品，包括但不局限于酸奶、酸奶飲料或酪乳。這些食品或食品組合物可以通過已知的方法來制備，如向適宜的食品或食品基質(zhì)中添加適量本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)突變菌林。也可以用于制造含有適量一個(gè)或多個(gè)突變菌抹或其提取物(如部分純化或完全純化的天然葉酸)的食品添加劑。食品添加劑包括維生素片，維生素丸，維生素膠囊或維生素粉，其中含有每日推薦用量的各種維生素，包括葉酸。根據(jù)本發(fā)明使用的這些制品中的合成葉酸通?？梢杂锰烊蝗~酸所取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用活菌來生產(chǎn)食品或食品組合物，如通過發(fā)酵。這樣，本發(fā)明的菌林就可以用已知的方法來生產(chǎn)這些發(fā)酵食品或食品組合物，如利用乳酸菌用已知方法來制備發(fā)酵乳制品。在這些方法中，本發(fā)明的菌林細(xì)胞可以與經(jīng)常用到的微生物聯(lián)合使用，和/或取代經(jīng)常用到的一個(gè)或多個(gè)或部分微生物。例如在生產(chǎn)如酸奶或酸奶飲料這樣的發(fā)酵乳制品時(shí)，本發(fā)明的食品級(jí)突變菌林可以添加或用做部分起子培養(yǎng)物，或者適于在發(fā)酵過程中添加。這種情況下，菌抹的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是食品級(jí)的培養(yǎng)基，如牛奶培養(yǎng)基。另一個(gè)實(shí)施例中，使用的本發(fā)明菌抹可以是死的(即裂解的)，或沒有活性的，或凍干的。根據(jù)本發(fā)明利用一個(gè)或多個(gè)突變菌林生產(chǎn)的組合物，或添加了適量的一個(gè)或多個(gè)菌株的組合物，都含有增強(qiáng)量的由該菌抹產(chǎn)生的天然葉酸。一個(gè)或多個(gè)高產(chǎn)葉酸的菌林可以混合到或連續(xù)加入該組合物中，或者在其生產(chǎn)過程中加入。最終產(chǎn)品中的葉酸總量可以用例如HPLC法分析。本發(fā)明的方法和用途氨曱喋呤被用于選擇細(xì)胞內(nèi)葉酸水平和總?cè)~酸水平都增加的菌抹。在一個(gè)實(shí)施例中提供了選擇細(xì)胞內(nèi)葉酸水平和/或總?cè)~酸水平都增加的菌抹的方法。該方法包括以下步驟(a)在含有氨曱喋呤的培養(yǎng)基上(或內(nèi))培養(yǎng)細(xì)菌，其中所述的培養(yǎng)基中沒有添加葉酸依賴型代謝產(chǎn)物；(b)選擇生長(zhǎng)率(p)至少為O.lii/小時(shí)的菌抹；(c)測(cè)定步驟(b)中所選擇菌林中的葉酸水平；(d)和選擇其葉酸水平高于野生型或其他合適對(duì)照物中的葉酸水平的菌林。(e)任意重復(fù)步驟(b)，(c)和/或(d)步驟(a)中的生長(zhǎng)意思是菌抹與培養(yǎng)基接觸。培養(yǎng)基中含有不同濃度的氨甲喋呤。例如第一輪篩選可以選擇相對(duì)較低的濃度，如1.25，1.5,2.0,2.5毫克/升培養(yǎng)基。接著可以在一個(gè)或多個(gè)這些濃度上生長(zhǎng)分離的菌抹，可以直接篩選其葉酸含量，也可以再進(jìn)行一輪或多輪更高濃度的氨曱喋呤選擇，如用更高的氨曱蝶呤濃度，如4，5,10毫克/升，或更高。選擇過程的嚴(yán)格性可以變化，如只在高濃度有高生長(zhǎng)率的分離菌抹進(jìn)行更嚴(yán)格的選擇，或在相對(duì)較低氨甲喋呤濃度下具有中等生長(zhǎng)速率的分離菌林進(jìn)行較低嚴(yán)格性的選擇。在每個(gè)氨甲喋呤選擇步驟，優(yōu)選分離菌抹在培養(yǎng)基上或內(nèi)生長(zhǎng)至少40個(gè)小時(shí)，更有選生長(zhǎng)50小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。始終都應(yīng)該包括合適的對(duì)照物，如野生型菌林，根據(jù)突變子與對(duì)照(如野生型)生長(zhǎng)狀況的不同來挑選突變株。對(duì)照不必要是野生型菌抹，也可以是先前選擇的菌林。技術(shù)人員可以容易的決定適宜的培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基的適宜pH值和其他參數(shù)。實(shí)際的培養(yǎng)條件由所用菌抹特性決定。根據(jù)所建立的方法，優(yōu)選可以用如96孔板或其它類似的方式，同時(shí)對(duì)大量的分離菌林進(jìn)行篩選。該方法可以用于所有對(duì)氨甲喋呤天然敏感的菌抹。如上所述，利用葉酸類似物氨曱喋呤，人們可以有效選擇和分離天然葉酸高產(chǎn)菌抹，這些菌抹可以用于生產(chǎn)具有增加葉酸含量(自然強(qiáng)化或發(fā)酵強(qiáng)化)的發(fā)酵食品。此處包括所有根據(jù)本方法可以得到并具有顯著提高葉酸水平的細(xì)菌。除非其他聲明，本發(fā)明將采用標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)分子生物學(xué)、病毒學(xué)、微生物學(xué)和生物化學(xué)方法實(shí)施。這些技術(shù)在Sa油rook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社；Sambrook和Russell(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，紐約冷泉港出版社；Ausubel等(1994)的現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，現(xiàn)行方法第一巻和第二巻；Brown(1998)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第二版第一巻和第二巻，學(xué)術(shù)出版社(英國)；寡核普酸合成(N.Gait編)；寡核苷酸雜交(Hames和Higgins編)中都有描述，此處一并作為參考。圖l.在化學(xué)合成培養(yǎng)基(CDM)上培養(yǎng)的植物乳桿菌野生型菌抹(1),帶有質(zhì)粒pNZ7019的植物乳桿菌菌抹(2)和帶有質(zhì)粒pNZ7021的植物乳桿菌菌林(3)的葉酸產(chǎn)量。圖例細(xì)胞外葉酸水平(白條)，細(xì)胞內(nèi)葉酸水平(灰條)，總?cè)~酸水平(黑條)圖2.植物乳桿菌野生型菌林(1),帶有載體pNZ7019的植物乳桿菌菌林(2)和帶有載體pNZ7021的植物乳桿菌菌抹(3)的生長(zhǎng)率。用含有濃度為0,0.3125,0.625,1.25,2.5毫克/升的氨曱喋呤的化學(xué)合成培養(yǎng)基(a)和改良化學(xué)合成培養(yǎng)基(b)測(cè)試三種植物乳桿菌的生長(zhǎng)狀況。圖3.根據(jù)氨曱喋呤抗性篩選的15抹葉酸高產(chǎn)菌林的產(chǎn)葉酸水平。15株菌株的葉酸產(chǎn)量與野生型菌林葉酸產(chǎn)量相比較。實(shí)施例l.材料與方法1.1菌林與培養(yǎng)條件野生型植物乳桿菌WCFS1及其衍生物在含有19克/升(3-磷酸甘油酸鹽(6)的化學(xué)合成培養(yǎng)基或改良的化學(xué)合成培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)。在這種改良化學(xué)合成培養(yǎng)基中，從正?；瘜W(xué)合成培養(yǎng)基中去除了甘氨酸、肌苷、乳清酸、胸腺嘧啶脫氧核苷、鳥嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤。在使用的所有培養(yǎng)基中另外添加8ng/ml氯霉素。在兩種化學(xué)合成培養(yǎng)基中加入濃度范圍為0-10毫克/升的氨曱喋呤(Sipia,氨喋呤)。1.2DNA技術(shù)，質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化本研究中使用的質(zhì)粒見表1。表1<table><row><column>質(zhì)粒</column><column>相關(guān)性質(zhì)</column></row><row><column></column><column>pNZ8148</column><column>氯霉素抗性；含有nisA基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)型載體。</column></row><row><column></column><column>pNZ7019</column><column>氯霉素抗性；pNZ7017衍生質(zhì)粒，含有乳酸乳桿菌葉酸基因簇，并將其置于p印N基因啟動(dòng)子之后(Wegka即等，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué).2004，70:3146—3148)。</column></row><row><column></column><column>pNZ7020</column><column>氯霉素抗性；pNZ8148衍生質(zhì)粒，p印N基因啟動(dòng)子取代了nisA基因啟動(dòng)子。</column></row><row><column></column><column>pNZ7020a</column><column>氯霉素抗性；PNZ7020衍生質(zhì)粒，含有植物乳桿菌folB基因到截短的folP基因的部分葉酸基因簇。</column></row><row><column></column><column>pNZ7021</column><column>氯霉素抗性；pNZ7Q20a衍生質(zhì)粒，含有folB到f。lP的植物乳桿菌的完整葉酸基因簇。</column></row><table>pNZ8148載體是一個(gè)空的載體，其含有乳酸鏈球菌肽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，一個(gè)多克隆位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)氯霉素抗性標(biāo)記。pNZ8148載體衍生化，并且用已建立的方法分離了植物乳桿菌染色體組DNA。利用PfxDNA聚合酶(Invitrogen,佩斯里，英國)在MastercyclerPCR儀(E卯endorf，漢堡，德國)中進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)采用如下的循環(huán)94'C變性30秒(第一個(gè)循環(huán)變性3分鐘)，45。C褪火25秒，68'C下每1000個(gè)堿基延伸1分鐘，以上步驟總共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。載體pNZ8148用Sphl和BglII消化，去除乳酸鏈球菌肽啟動(dòng)子。同時(shí)，用Sphl和BglII從載體pNZ7017上切下乳酸乳桿菌pepN基因的組成型啟動(dòng)子(VanAlen-B。errigter等，1991.應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué).57:2555-61)。然后將兩個(gè)片段用T4DNA連接酶(Invitrogen)連接起來，所得到的質(zhì)粒命名為載體pNZ7020。用下面的引物從植物乳桿菌染色體DNA上擴(kuò)增其葉酸基因簇(i)folBKpn-F(5，-GAAAGAGGCTGGGTACCATTATGGGCATGATTC-3，)，它5'端有一個(gè)Kpnl限制性位點(diǎn)，延伸覆蓋fo舊基因的起始密碼子；和(ii)反向引物L(fēng)pfPxba-R(5'-CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG-3，)，其5，端有一個(gè)Xbal限制性位點(diǎn)，從而允許在folC基因終止密碼子和載體間進(jìn)行融合。擴(kuò)增的DNA片段用Xbal和Kpnl進(jìn)行消化，從而產(chǎn)生一個(gè)截短的folB-folP基因簇(folP有一個(gè)Xbal限制性位點(diǎn))。載體pNZ7020也用Xbal和Kpnl進(jìn)行消化，然后用T4DNA連接酶將上述兩個(gè)片段連接起來，得到的載體命名為pNZ7020a。丟失的folP基因片段用下列引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增lpfP-F(5，-CATGGCATCGATATTGAACGAATTG-3，)和lpffxba-R啟動(dòng)子(5，-CTTAACCCCATCTAGACGTAATATCG-3')。擴(kuò)增的DNA片段用Xbal進(jìn)行消化。載體pNZ7020a也用Xbal進(jìn)行消化，然后用堿性磷酸酶(PharmaciaBiotech)磷酸化以阻止自連。兩個(gè)用Xbal消化過的DNA片段用T4DNA連接酶連接起來，插入片段的方向用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，得到的載體命名為pNZ7021。然后將三個(gè)載體，如表l中所示，轉(zhuǎn)入具有ylgG基因的乳酸乳桿菌NZ9000感受態(tài)細(xì)胞。接著，小量制備這三種載體后，用已建立的方法將其轉(zhuǎn)入植物乳桿菌。1.3微生物學(xué)檢測(cè)葉酸產(chǎn)量三個(gè)基因重組植物乳桿菌菌抹的葉酸水平用前面所述的干酪乳桿菌微生物學(xué)檢測(cè)方法(Sybesma等，2003.應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)69:3069-76.)進(jìn)行分析。1.4菌林生長(zhǎng)性能檢測(cè)用微量滴定板檢測(cè)三個(gè)具有不同載體的植物乳桿菌菌林的生長(zhǎng)率。用分光光度計(jì)(SPECTRAmax,分子儀器公司，太陽谷，加利弗尼亞，美國)檢測(cè)三抹菌在％孔微量滴定板上35個(gè)小時(shí)的生長(zhǎng)狀況。生長(zhǎng)狀況檢測(cè)采用兩種培養(yǎng)基，每一種構(gòu)建體在兩種培養(yǎng)基上以下列氨曱喋呤的濃度梯度為0,0.3125,0.625,1.25,2.5毫克/升進(jìn)行三個(gè)平行分析。1.5高產(chǎn)葉酸菌抹的選擇含有pNZ8148的野生型植物乳桿菌WCFS1在含有2.5毫克/升氨甲喋呤的改良化學(xué)合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)，但這些生長(zhǎng)培養(yǎng)基是裝在96孔微量滴定板中的。96孔微量滴定板培養(yǎng)三天后，將每個(gè)96孔微量滴定板的部分培養(yǎng)物等量裝入兩個(gè)新的含有10毫克/升氨曱喋呤的改良化學(xué)合成培養(yǎng)基的96孔微量滴定板中。每個(gè)步驟中，原始的微量滴定板加入60%甘油，在-80℃冰箱保存。甘油保存的微量滴定板用于接種突變的或在新鮮的改良化學(xué)合成培養(yǎng)基上適應(yīng)的細(xì)胞。288林氨曱喋呤抗性培養(yǎng)物的葉酸水平用快速篩選法檢測(cè)。這種方法基于前面講到的正常微生物學(xué)檢測(cè)方法，但做了一些改變。在這種快速篩選法中，野生型菌林的葉酸產(chǎn)量與突變菌林的葉酸產(chǎn)量相比較。對(duì)野生型產(chǎn)生葉酸的指示菌抹的培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致相對(duì)較低的光密度。高產(chǎn)葉酸菌株的指示菌抹的光密度會(huì)比野生型下培養(yǎng)的高。讓指示菌林產(chǎn)生較高光密度的菌林用干酪乳桿菌微生物學(xué)檢測(cè)法再進(jìn)行分析。2.結(jié)果2.1重組菌抹在普通化學(xué)合成培養(yǎng)基上研究攜帶pNZ8148質(zhì)粒和基因構(gòu)建質(zhì)粒pNZ7019和pNZ7021的野生型植物乳桿菌菌抹的葉酸產(chǎn)量。含有pNZ8148空載體的植物乳桿菌WCFS1的葉酸產(chǎn)量為100納克/毫升培養(yǎng)基(圖1.)。攜帶質(zhì)粒pNZ7019(乳酸乳桿菌葉酸生物合成基因簇)的植物乳桿菌的葉酸產(chǎn)量達(dá)到2000納克/毫升培養(yǎng)基(圖1.)。比野生型葉酸產(chǎn)量高大約20倍。用pNZ7021載體轉(zhuǎn)化植物乳桿菌WCFS1得到的菌抹葉產(chǎn)生6000納克每毫升培養(yǎng)基的葉酸產(chǎn)量，其中pNZ7021載體攜帶有植物乳桿菌的葉S吏合成基因簇(圖1.)。接著，在有葉酸依賴型代謝產(chǎn)物和沒有葉gi依賴型代謝產(chǎn)物的化學(xué)合成培養(yǎng)基上，在一定氨曱喋呤濃度范圍內(nèi)，比較葉酸高產(chǎn)菌林和野生型菌抹的特定生長(zhǎng)率(圖2.)。在葉酸依賴型代謝產(chǎn)物存在下，測(cè)試菌抹均不被氨曱喋呤顯著抑制。在所有的氨曱喋呤濃度下，攜帶pNZ7021質(zhì)粒的植物乳桿菌的生長(zhǎng)率與其他兩個(gè)菌抹相比較低。培養(yǎng)基中不存在葉酸依賴型代謝產(chǎn)物的情況下，情況完全不同。在該培養(yǎng)基上，葉酸高產(chǎn)菌株與野生型相比明顯具有氨曱喋呤抗性(圖2b.)。當(dāng)改良的化學(xué)合成培養(yǎng)基中含氨曱喋呤濃度為2.5毫克/升時(shí)，觀察到野生型菌抹生長(zhǎng)被完全抑制，而兩個(gè)葉酸高產(chǎn)菌林在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。在氨甲喋呤濃度為0到2.5毫克/升之間時(shí)，觀察到野生型植物乳桿菌菌抹的生長(zhǎng)抑制與氨曱喋呤的劑量相關(guān)。這些結(jié)果表明，如果在合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行分析，葉酸高產(chǎn)菌抹具有氨甲喋呤抗性。因此氨甲喋呤可以用于區(qū)別野生型菌林與葉酸高產(chǎn)菌抹。2.2野生型菌株野生型植物乳桿菌WCFS1在含有2.5毫克/升氨甲喋呤的改良化學(xué)合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)(大于40小時(shí))，結(jié)果其培養(yǎng)物顯著生長(zhǎng)。如果該培養(yǎng)物用含有2.5毫克/升氨曱喋呤的新鮮改良化學(xué)合成培養(yǎng)基稀釋，結(jié)果培養(yǎng)物立即生長(zhǎng)。從該培養(yǎng)物中挑取單菌落來檢測(cè)該自然突變林是具有增強(qiáng)的氨甲喋呤抗性還是發(fā)生了暫時(shí)適應(yīng)性。在含有2.5毫克/升氨甲喋呤改良化學(xué)合成培養(yǎng)基中接種從氨甲喋呤抗性培養(yǎng)物中挑取的單菌落。然后，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基分成兩部分；一個(gè)培養(yǎng)物在含有2.5毫克/升氨甲喋呤改良化學(xué)合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)50代，另一個(gè)培養(yǎng)物在不含氨曱喋呤的改良化學(xué)合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)50代。培養(yǎng)50代后，兩個(gè)培養(yǎng)物重新轉(zhuǎn)移到含有2.5毫克/升氨曱喋呤改良化學(xué)合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)。不同處理的兩個(gè)培養(yǎng)物在此培養(yǎng)基上都有相當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)率，這顯示氨曱喋呤抗性表型是有穩(wěn)定突變引起的。我們從含有2.5毫克/升或10毫克/升氨曱喋呤的培養(yǎng)物中挑取了288個(gè)菌落。用快速前篩選方法，分析了這些菌落的葉酸高產(chǎn)水平。通過這種快速檢測(cè)，與野生型相比，288個(gè)菌落中的5個(gè)具有較高的葉酸水平。接著，這5個(gè)培養(yǎng)物接種于含有2.5毫克/升氨曱喋呤改良化學(xué)合成培養(yǎng)基平板上。每個(gè)平板上分離三個(gè)單菌落，保存菌林并用下面的方法進(jìn)行葉酸產(chǎn)量分析。檢測(cè)15個(gè)陽性菌落培養(yǎng)物的葉酸水平(圖3.)。其平均葉酸水平比野生型高20%到60°/。。為了確證所有的菌落都是植物乳桿菌，用RAPD對(duì)其進(jìn)行了分析。所有的被檢菌落都與其親本具有高度相似性。2.3轉(zhuǎn)錄模式利用全基因組轉(zhuǎn)錄模式分析寡核普酸芯片技術(shù)，鑒定了氨甲喋呤抗性突變林植物乳桿菌NIZOB2550(從植物乳桿菌WCFS1衍生而來)中，與野生型相比明顯被上調(diào)或下調(diào)的基因。用改良化學(xué)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)植物乳桿菌WCFS1和NIZOB2550,且濁度(OD6oo)為l時(shí)，收獲細(xì)胞，提取mRNA。mRNA樣品處理后，用于DNA芯片分析。與父本菌抹相應(yīng)基因比較，氨甲喋呤抗性菌林表達(dá)基因表達(dá)過程中，特異性mRNA的相對(duì)豐度成倍改變。轉(zhuǎn)錄分析顯示與父本菌林相比，氨曱喋呤抗性菌林編碼二氫葉酸合成酶的基因folCl,與野生型相比明顯上調(diào)4倍(見表2.)。二氪葉酸合成酶將谷氨酸偶聯(lián)在二氫蝶酸上形成二氫葉酸，二氫葉酸是氨甲喋呤的結(jié)構(gòu)類似物，也是二氫葉酸還原酶的底物。通過folQ基因的過表達(dá)，產(chǎn)生較多的二氫葉酸合成酶，導(dǎo)致較高的細(xì)胞內(nèi)二氫葉酸水平，從而反過來與氨曱喋呤竟?fàn)幎淙~酸還原酶。這顯示了突變抹中的氨曱喋呤抗性機(jī)制，也可以解釋為什么在氨曱喋呤不存在的時(shí)候這些突變抹產(chǎn)生較高水平的葉酸。植物乳桿菌WCFS1有兩個(gè)folC基因(folCl和folC2)。有趣的是，在氨曱喋呤抗性突變林中只有folCl被上調(diào)。這個(gè)基因不位于功能基因簇中。與此相反，foia位于葉酸生物合成基因簇中。除了folC，在氨曱喋呤抗性菌林中，一些其它代謝基因(編碼果糖激酶，丙酮酸氧化酶，6-磷酸-p-葡萄糖苦酶的基因)也被上調(diào)了(見表2.)。與父本菌抹相比，在突變菌株中，編碼甘油酮激酶(二羥基丙酮磷酸轉(zhuǎn)移酶)的三個(gè)基因(daklA,daklB和dak2)被下調(diào)了。表2.與植物乳桿菌WCFS1相比，植物乳桿菌NIZ0B2550中被上調(diào)或下調(diào)的基因。<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權(quán)利要求1.突變菌株，其特征在于，與野生型菌株相比，所述突變菌株的細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外葉酸含量提高，且當(dāng)在含有1.25毫克/升氨甲喋呤和缺乏葉酸依賴型代謝物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，所述突變菌株的生長(zhǎng)率至少為每小時(shí)0.1μ。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變菌抹，其特征在于，所述的突變菌林是自發(fā)突變體或誘導(dǎo)突變體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變菌抹，其特征在于，與編碼葉酸合成途徑中的酶的一個(gè)或多個(gè)野生型基因相比，所述突變菌^^朱顯示過表達(dá)。4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的突變菌抹，其特征在于，與野生型相比，從用于編碼二氫葉酸合成酶，果糖激酶，丙酮酸氧化酶，和6-磷酸-p-葡萄糖苦酶的基因中選擇出來的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)被上調(diào)至少約2倍。5.根據(jù)權(quán)利要求l,2或4所述的突變菌林，其特征在于，與野生型相比，用于編碼二幾基丙酮磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因的表達(dá)被下調(diào)至少約2倍。6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的突變菌林，其特征在于，所述突變菌抹的葉酸總量比野生型菌株的葉酸總量高至少10%。7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的突變菌抹，其特征在于，所述菌林選自植物乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、巻曲乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠乳桿菌、詹氏乳桿菌、唾液乳桿菌、小乳桿菌、短乳桿菌、雞乳桿菌、淀^f分乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、腸膜明串珠菌、乳酸明串珠菌、有害片球菌、乳酸片球菌、小片球菌、兩岐雙岐桿菌、長(zhǎng)雙岐桿菌、嬰兒雙岐桿菌、短雙岐桿菌、青春雙i咬桿菌、動(dòng)物雙岐桿菌、雞雙歧桿菌、馬一各南雙歧桿菌和嗜熱雙岐桿菌。8.植物乳桿菌菌林CBS117120。9.含有根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的菌林的組合物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述組合物可以是食品組合物或食品添加劑組合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述食品組合物是發(fā)酵食品組合物。12.利用氨甲喋呤選擇細(xì)胞內(nèi)葉酸和總?cè)~酸水平都增加的菌林。13.選擇細(xì)胞內(nèi)葉酸和/或總?cè)~酸水平都增加的菌林的方法，所述方法包括如下步驟(a)在含有氨甲喋呤的培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)菌，其中所述培養(yǎng)基中沒有添加葉酸依賴型代謝物，(b)挑選生長(zhǎng)率至少為每小時(shí)o.1μ的菌林，(C)測(cè)定步驟(b)中所選菌抹的葉酸水平，并選擇與野生型相比葉酸水平提高的菌抹，(d)任意重復(fù)步驟(a),(b)和/或(c)。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有至少1.25毫克/升氨曱喋呤，且所述菌林在所述培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至少40小時(shí)。全文摘要本發(fā)明涉及具有高葉酸水平且耐氨甲喋呤的突變菌株。同時(shí)本發(fā)明也提供了含有這些菌株的食品或食品添加劑組合物，以及分離這些突變菌株的方法。文檔編號(hào)C12N1/00GK101203599SQ200680014049公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2006年3月1日優(yōu)先權(quán)日2005年3月1日發(fā)明者亨德里庫斯·韋格卡樸,威廉·邁因德特·德·沃斯,艾爾特·約翰尼斯·斯密德申請(qǐng)人:荷蘭Csm有限公司