專利名稱：繩狀青霉菌的abfB-1基因的制作方法
繩狀青霉菌的abffi-l基因本發(fā)明涉及自繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)分離的abffi-l 基因及由該基因編碼的具有oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的ABFB-1多肽。繩狀青霉菌為踝節(jié)菌屬(Talaromyces ),屬于Aspergilleae科。該微 生物從許多易受空氣或水污染的有機基質(zhì)中分離，表明該真菌具有含量 豐富的水解酶。這種酶混合物在動物飼料中的使用有助于解聚天然有機 物，且可能改善其可消化性。因此W099/57325描述了稱為IMI378536 的產(chǎn)生酶混合物的繩狀青霉菌林，這些酶特別適用作動物飼料。然而， 繩狀青霉菌產(chǎn)生的酶混合物尚未作重要的生化定性。的確，對獲得的發(fā) 酵液通常僅測得有限量的酶活性，如木聚糖酶和P-葡聚糖酶。這些活性 僅反映了混合物中的 一部分酶類。農(nóng)業(yè)上的半分解纖維素化合物構(gòu)成了繼植物組織纖維素之后的第二 大多糖儲備物。該類特征是具有多種多樣的雜多糖，主要代表有木聚糖、 阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖和甘露聚糖?？啡┬问降陌⒗菑V泛 存在于雜多糖，如阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖中。阿拉伯聚糖為聚合物， 以a-l-5 4定與阿拉伯呋喃糖殘基相連接，可在0-2或0-3位被1或2個 阿拉伯糖殘基取代。至于阿拉伯木聚糖，a-L-阿拉伯呋喃糖殘基通過a-l-3 和a-l-2鍵與主要的(3-l-4-吡喃木糖鏈連接。在這些側(cè)鏈上阿拉伯糖殘基 的存在可限制許多工業(yè)應(yīng)用(如增強動物飼料可消化性)中的半分解纖 維素化合物的酶水解作用。裂解a-L-阿拉伯呋喃糖苷4囊的酶可與木聚糖 酶協(xié)作，以允許阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖的水解。因此，阿拉伯糖酶活性(內(nèi)切，外切阿拉伯糖酶以及,主要是a-L-阿拉 伯呋喃糖酶活性)可積極協(xié)同木聚糖酶有助于半分解纖維素化合物的解 聚。半分解纖維素化合物和果膠化合物可代表植物中高達(dá)50%的總糖， 它們構(gòu)成動物的主要能源。這些化合物可消化性的增強與半分解纖維素 化合物中阿拉伯糖殘基取代程度的降低有關(guān)(Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 101: 93-100)。
水解L-阿拉伯糖殘基之間鍵的酶已自微生物如細(xì)菌或絲狀真菌中分離。阿拉伯糖苷酶主要由a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)組成，該酶能 水解來自L-阿拉伯木聚糖或(如阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖的)化合 物的非還原性的a-L-阿拉伯呋喃糖殘基。根據(jù)它們的蛋白質(zhì)序列相似性，已將a-L-阿拉伯呋喃糖酶 (EC3.2.1.55)分為兩個糖苦水解酶的家族(GH51和GH 54)。這兩個家族 因其對包含于多糖中底物的特異性而不同。第 一族(GH 51)包含A型阿拉 伯呋喃糖酶，該酶僅對a-l-5連接的小線性結(jié)構(gòu)阿拉伯呋喃低聚糖起作 用。第二族由B型阿拉伯呋喃糖酶(GH54)組成，該酶催化阿拉伯呋喃低 聚糖化合物側(cè)鏈的a-l,5、 a-l,3和a-l,2 4建的水解。已自許多細(xì)菌及絲狀真菌中將B型阿拉伯呋喃糖酶(ABFB)分離。 曲霉屬(Aspergillus )最具代表性，但也已將它們自木霉屬(Trichoderma ), 青霉菌屬(Penicillium)和鐮孢菌屬(Fusarium)中分離。WO 96/29416、 WO 96/06935、 WO 2004/018662和US 5,989,887描述 黑曲霉阿拉伯呋喃糖酶基因。蛋白質(zhì)序列對比顯示黑曲霉abffi蛋白與繩 狀青霉素(P. funiculosum) ABFB-1蛋白的同一性為72.4%。這些申請 沒有描述任何 一 種多肽在動物營養(yǎng)中應(yīng)用所必需的特征。Clinche et al. (J. Agric. Food Chem., 45, 2379-2383， 1997)已描述三種 來自土曲霉(Aspergillus terreus ) 的可能用于釀酒的a-L-阿拉伯呋喃糖 酶。Gielkens et al.(Microbiology, 145, 735-741, 1999)已描述了構(gòu)巢曲 (Aspergillus nidulans ) abdb基因。白曲霉(Aspergillus kawachii)禾口泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 的abffi基因已#皮Koseki et al.描述(J. of Bioscience禾口 Bioengineering, Vol. 96， No. 3, 232-241， 2003)。這些酶在日本酒shochu的發(fā)酵中具有應(yīng) 用。來自絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei) 的abffi基因已被 Margolles-Clark et al.描述(Applied and Environmental Microbiology, 3840-3846， 1996)。Panagiotou et al.也已描述了兩種來自尖3包鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的細(xì)胞外o;-L-阿拉伯呋喃糖酶(Can J Microbiol. 2003: 49(10): 639-4)。Carvallo et al. (Mycol. Res" 107 (4)， 388-394, 2003)已描述了來自產(chǎn) 紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)的B型ot-L-阿拉伯呋喃糖酶。蛋 白質(zhì)序列比對顯示產(chǎn)紫青霉菌abf-1蛋白與繩狀青霉菌ABFB-1蛋白的 同一性為85.6%。此文沒有描述任何一種多肽在動物營養(yǎng)應(yīng)用中所必需的 特征。然而，Sakamoto et al. (FEBS Letters 560, 199-204, 2004)已描述了產(chǎn) 黃青霉菌(Penicillium chrysogenum) abnx基因，其仍編碼與ABFB活性 不同的阿拉伯糖酶活性。然而，這些ABFB酶不具備應(yīng)用于動物飼料所需的最適特性。的確，為了可用于動物飼料，ABFB必須具有與處理相容的特性，可 預(yù)期用于該飼料的飼料接受所述處理。特別是，所用酶的活性在處理溫 度和pH條件下必須穩(wěn)定，而且，如果可能，其在制備這些飼料的過程中 以及在消化這些伺料的動物消化系統(tǒng)中的條件下是最佳的。此外，這些酶必須對雜多糖(阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半 乳聚糖)具有廣i普作用(去除分支)，以有效增強動物對飼料的可消化性。 增強飼料可消化性可能提高它們的營養(yǎng)價值。因此，對天然底物阿拉伯 木聚糖和阿拉伯聚糖具有增強的的特異性(立體特異性、對映選擇性)、活 性或親和力的酶對于動物飼料非常重要。本發(fā)明描述了 一種適用于動物營養(yǎng)的繩狀青霉菌L-阿拉伯呋喃糖酶B(ABFB-1)，及編碼該酶的基因。本發(fā)明還涉及保留相同催化特性的ABFB-1的同系物、變異體和片段。有利的是，根據(jù)本發(fā)明的ABFB酶具高最適溫度。 本發(fā)明的另一優(yōu)點在于繩狀青霉菌AFBF-1的表達(dá)在該真菌中在用于誘導(dǎo)纖維素水解酶和半纖維素水解酶的條件(用于生產(chǎn)纖維素水解酶和半纖維素水解酶的工業(yè)型培養(yǎng)基)下被天然高誘導(dǎo)。根據(jù)本發(fā)明的酶也具有其它工業(yè)或工農(nóng)業(yè)用途。特別值得一提的是 通過發(fā)酵處理果汁、造紙、將半分解纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槿剂匣蚧瘜W(xué)制 品、造酒。序列描述SEO ID No. 1:繩狀青霉菌abfB-l基因的基因組序列。 SEO ID No. 2:具有B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性的繩狀青霉菌 ABFB-1多肽的序列。SEO ID No. 3: Xbal-abffi引物。 SEO ID No. 4: HindIII-abfB引物。發(fā)明描述本發(fā)明涉及一種適用于動物營養(yǎng)的多肽，其包括一種選自以下多肽 的多肽畫SEQ ID No. 2的多肽，畫序列介于SEQ ID No. 2的位置28和位置507之間的多肽，-SEQ ID No. 2的多肽片段，其具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性，-一種多肽，其具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且顯示與SEQ IDNo. 2的多肽具有至少90%的同一性。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，選自以下多核苷酸-序列在SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間的多核苷酸， -序列包括在SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間的多核苷酸， -編碼上述多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一個對象為一種多核苷酸，其具有SEQ ID No. 1代表的 序列或與SEQ ID No. 1互補的序列。本發(fā)明還涉及表達(dá)盒，其在轉(zhuǎn)錄方向上包含 -在宿主生物中有功能的啟動子；
-根據(jù)本發(fā)明的多核苦酸；以及 -在相同宿主生物中有功能的終止序列。本發(fā)明另 一個對象為載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和/或根據(jù) 本發(fā)明的表達(dá)盒。本發(fā)明還涉及宿主生物，該生物被根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、根據(jù)本 發(fā)明的表達(dá)盒和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化。在在本發(fā)明的一個實施方案中，宿主生物選自酵母和絲狀真菌。 優(yōu)選地，宿主生物為繩狀青霉菌^^。本發(fā)明還涉及動物的營養(yǎng)添加物，包括根據(jù)本發(fā)明的多肽、根據(jù)本 發(fā)明的宿主生物或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物的發(fā)酵液。 優(yōu)選地，該營養(yǎng)添加物為液體形式或4分末形式。本發(fā)明的另 一 方面為飼料，其包含根據(jù)本發(fā)明的動物營養(yǎng)基質(zhì)和動 物營養(yǎng)添加物。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的ABFB多肽或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物用 于制備動物營養(yǎng)添加物或飼料營養(yǎng)添加物的用途。本發(fā)明的另一個對象是根據(jù)本發(fā)明的ABFB多肽或根據(jù)本發(fā)明的宿 主生物用于水解阿拉伯呋喃低聚糖化合物的a - L -阿拉伯呋喃糖4囊的用途。多肽本發(fā)明因此涉及具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性的ABFB多肽。 優(yōu)選地，將這些多肽分離自繩狀青霉菌。表述"a-L-阿^立伯呋喃糖酶B"應(yīng),皮理解為a-L-阿拉伯呋喃并唐酶 (EC 3.2丄55)B型(GH 54)，其催化包含于阿拉伯呋喃低聚糖化合物側(cè)鏈的 a-l，5、 a-l,3和a-l,2 4建的水解。繩狀青霉菌抹IMI378536的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B由SEQ ID No.2 表示。表述"適用于動物營養(yǎng)的多肽"應(yīng)被理解為其特征使得其適于動物營養(yǎng)的多肽。用于動物營養(yǎng)必需的特;f正特別為pH及溫度，在此pH及溫度
下酶具有活性。的確，動物消化系統(tǒng)的pH為酸性，因此酶在此pH時必 須保持活性，這是為了在L-阿拉伯糖殘基的水解中保持其活性。此外， 控制營養(yǎng)添加物或動物飼料中的酶的條件包括處理及高于室溫的溫度。 所用的酶活性因此必須在處理條件下，特別是在所述溫度條件下穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，多肽在酸性pH時，例如低于5,優(yōu) 選低于4時顯示a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個 實施方案,多肽在pH 2與pH 3.5之間時顯示最佳的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，多肽在高于室溫的溫度時顯示a-L-阿 拉伯呋喃糖酶B活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽在40°C與70。C之間，更 優(yōu)選50°C與65°C之間的溫度下具有最佳的a-L-阿拉伯^^喃糖酶B活性。在優(yōu)選的實施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的多肽糖基化。特別是，SEQID No. 2的多肽在氨基酸92和氨基酸376處具有N-糖基化位點。在優(yōu)選的 實施方案中，將SEQ ID No. 2多肽的位置92和376處的天冬酰胺殘基糖 基化。繩狀青霉菌的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B是由真菌分泌到其細(xì)胞外環(huán)境 的酶。SEQIDNo. 2的多肽因此包括27個氨基酸的信號肽。本發(fā)明的對 象還為裂解信號肽后獲得的成熟多肽。特別是，本發(fā)明涉及序列介于SEQ ID No. 2的位置28與位置507之間的多肽。在另 一個實施方案中，SEQ ID No. 2多肽的信號肽可被異源信號肽取代，用于由異源宿主生物表達(dá)和分 泌SEQ ID No. 2的多肽。本發(fā)明還涉及具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的SEQ ID No. 2的 多肽的片段。術(shù)語多肽的"片段"指下述多肽，所述多肽包括其所來源的多肽的一 部分而不是全部。因此，本發(fā)明涉及一種多肽，其包括SEQ ID No. 2多 肽的至少100、 200、 300、 400或500個氨基酸的片段。SEQ ID No. 2的多肽的這一片段保持其a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。 本發(fā)明因此涉及SEQIDNo.2的多肽的生物學(xué)活性片段。術(shù)語"生物學(xué) 活性片段"指保持其所來源的多肽的功能的多肽片段。SEQ ID No. 2的 多肽的生物學(xué)活性片段因此保持繩狀青霉菌ABFB-1多肽的功能。這些 生物學(xué)活性片段具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。制備多肽片段的方法 和測定a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的對象還為多肽，其具有L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且顯示 與SEQIDNo. 2的多肽至少90%的同一性。優(yōu)選地，這些多肽具有與SEQ IDNo. 2的多肽相同的特性，特別是相同的催化特性。優(yōu)選地，這些多肽 分離自繩狀青霉菌的其它抹或其它絲狀真菌?；蛘?，這些多肽可通過例 如定點誘變技術(shù)獲得。本發(fā)明的對象為具有與SEQ ID No. 2的多肽至少90%, 95%, 98% 以及優(yōu)選至少99%相同的氨基酸的多肽。將表述相同的氨基酸理解為兩條序列之間不變的或無變化的氨基 酸。這些多肽與SEQ IDNo. 2的多肽相比可顯示至少一個氨基酸的缺失、 增加或取代。本發(fā)明的對象還為多肽，其顯示與SEQIDNo. 2的多肽的相似性為 至少90%、 95%、 98%,以及優(yōu)選至少99%。將表述相似性理解為蛋白質(zhì)或核酸序列之間相似性的測量。這些多 肽與SEQ ID No. 2的多肽相比可顯示出至少一個氨基酸的缺失、增加或 取代。以分?jǐn)?shù)定量的兩條序列之間的相似程度基于序列同一性和/或序列 保守取代的百分比。員所知。可使用例如載體NTi 9.1.0，比對程序AlignX(聚類w算法(Clustal W algorithm) ) (Invitrogen INFORM AX, http:〃www. invitrogen.com)。優(yōu)選 地，使用默認(rèn)參數(shù)。將根據(jù)本發(fā)明的多肽自其自然環(huán)境分離或純化。多肽可通過各種方 法制備。特別是，這些方法是從自然來源(如天然表達(dá)這些多肽的細(xì)胞) 中純化、通過合適的宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組的多肽及其隨后的純化、通過化 學(xué)合成的生產(chǎn)或，最后，這些不同途徑的組合。這些不同生產(chǎn)方法為本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。因此，可將本發(fā)明的ABFB多肽自繩狀青霉菌分 離。在另一個實施方案中，本發(fā)明的ABFB多肽自表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的 ABFB多肽的重組宿主生物中分離。
本發(fā)明的對象還為融合蛋白、重組蛋白或嵌合蛋白，包括根據(jù)本發(fā) 明的多肽。術(shù)語"多肽"也指被修飾的蛋白質(zhì)和多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽具有ABFB活性并優(yōu)選地保留繩狀青霉菌 ABFB-1酶的催化特性。特別是，這些多肽在60。C和pH 3.4時具有最佳 活性。多核香酸本發(fā)明還涉及編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多核苷酸。優(yōu)選 地，這些多核香酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。根據(jù)本發(fā)明，表述"多核苷酸"理解為單鏈核苷酸鏈或其互補鏈，其可 以是DNA或RNA型或可為互補或基因組DNA型的雙鏈核香酸鏈。優(yōu) 選地，本發(fā)明的多核芬酸為DNA型，特別是雙鏈DNA。術(shù)語"多核苷 酸"也指被修飾的多核苷酸?？蓪⒈景l(fā)明的多核苷酸自其自然環(huán)境分離或純化。優(yōu)選地，本發(fā)明 的多核苷酸可通過Sambrook et al描述的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)或通過化學(xué)合成制備。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及多核苷酸，其序列介于SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間。該多核苷酸編碼SEQ ID No. 2的繩 狀青霉菌ABFB-1酶。在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及多核苷酸，其序列介于SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間。該多核苷酸編碼繩狀青霉菌信號肽 裂解后的成熟的ABFB-多肽。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其與序列介于SEQ ID No. 1的位置845與 位置2368之間的多核香酸和/或與序列介于SEQ ID No. 1的位置927與 位置2368之間的多核香酸具有至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%,優(yōu)選地至少99%的同一性。這些多核香酸編碼oc-L-阿^立伯呋喃糖酶 B活性。優(yōu)選地，這些多核香酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相同的核普酸理解為表示兩個核苷酸序列不變或無變化。這些 多核苷酸與對照多核苷酸相比顯示出至少一個核香酸的缺失、增加或取 代。
本發(fā)明還涉及多核苷酸，其與序列介于SEQ ID No. 1的位置845與 位置2368之間的多核苷酸和/或與序列介于SEQ ID No. 1的位置927與 位置2368之間的多核苷酸具有至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%，優(yōu)選至少99%的相似性。這些多核苷酸編碼ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B 活性。優(yōu)選地，這些多核苷酸編碼繩狀青霉菌oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相似性理解為蛋白質(zhì)或核酸序列之間相同之處的測量。這些多 核苦酸與對照多核香酸相比可顯示出至少一個核苷酸的缺失、增加或取 代。以分?jǐn)?shù)定量的兩條序列之間的相似程度基于序列同一性和/或序列保 守取代的百分比。測量和鑒定核酸序列之間的相同程度和相似程度的方法為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知?？墒褂美巛d體NTi載體NTi 9.1.0，比對程序AlignX (聚 類w算法)(Invitrogen INFORMAX, http:〃www.invitrogen. com)。優(yōu)選地, 使用默認(rèn)參數(shù)。優(yōu)選地，與對照多核苦酸具有相似程度的多核苷酸保持對照序列的 功能。在本文情況下，多核苷酸編碼a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其能與序列介于SEQ ID No. 1的位置845 與位置2368之間的多核苷酸和/或與序列介于SEQ ID No. 1的位置927 與位2368之間的多核苦酸選擇性雜交。優(yōu)選地，將選擇性雜交在一般嚴(yán) 格性條件下完成，優(yōu)選在高嚴(yán)格性條件下完成。這些多核苷酸編碼a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性。優(yōu)選地，這些多核苷酸編碼繩狀青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述"能選擇性雜交的序列"被理解為，根據(jù)本發(fā)明，在明顯高于背 景噪音的水平上與對照序列雜交的序列。由能選擇性雜交的序列與對照 序列之間的相互作用產(chǎn)生的信號水平比產(chǎn)生背景噪音的其它DNA序列 的相互作用的信號水平強，通常強10倍，優(yōu)選強100倍。允許選擇性雜 交的嚴(yán)格雜交條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常，在給定pH和給定離 子強度下，雜交和洗滌溫度比對照序列的Tm至少低5°C。通常，用于 15至50個核普酸的多核苷酸的雜交溫度至少為30。C，用于多于50個核 香酸的多核苦酸的雜交溫度至少為60。C。舉例說明，將雜交在以下緩沖 液中完成6x SSC、 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 1 mM EDTA、 0.02% PVP、
0.02%Ficoll、 0.02% BSA、 500嗎/ml變性鮭魚精子DNA。例如在低嚴(yán)格 性的2x SSC、 0.1% SDS緩沖液中，一^殳嚴(yán)格性的0.5x SSC、 0.1% SDS 緩沖液中以及高嚴(yán)才各性的O.lx SSC、0.1% SDS緩沖液中成功地完成洗滌。 當(dāng)然，可將雜交根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它常用方法完成(特別 參見Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 )。優(yōu) 選地，與對照多核苦酸選擇性雜交的多核苷酸保持對照序列的功能。在 本文情況下，多核苷酸編碼ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，其與序列介于 SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間的多核香酸和/或與序列介于 SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間的多核香酸選擇性雜交。本發(fā)明通常涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的多核苷酸。由于遺傳密碼 的筒并，不同多核苷酸可編碼相同的多肽。本發(fā)明的另一對象為序列如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸。SEQ ID No. 1的多核香酸包括位于繩狀青霉菌abffi-1基因開放讀碼框(ORF)側(cè) 翼的序列。特別是，它們是abffi-1基因的啟動子和終止序列?？蓪bfB 基因從其同源調(diào)控序列表達(dá)，特別是在繩狀青霉菌中或其它絲狀真菌中 過表達(dá)。在另一個實施方案中，例如可將abffi基因在各種宿主生物如細(xì)菌、 酵母和真菌中表達(dá)。在本發(fā)明的SEQ ID No. 1的啟動子控制下或在異源 啟動子的控制下，可將abffi基因在宿主生物中表達(dá)。表達(dá)盒根據(jù)本發(fā)明的 一個實施方案，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的克隆技 術(shù)，將編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的多核苷酸插入表達(dá)盒。該表達(dá)盒包括轉(zhuǎn) 錄和翻譯編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的序列所必需的元件。有利的是，該表達(dá)盒既包括可能引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生多肽的元件，也 包括調(diào)節(jié)該表達(dá)所必需的元件。這些表達(dá)盒在轉(zhuǎn)錄方向上包含-在宿主生物中有功能的啟動子；-根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸；-在相同宿主生物中有功能的終止序列。
啟動子的選擇將依賴于被選擇用于表達(dá)目的基因的宿主生物。 一些啟動 子允許組成型表達(dá)，而其它啟動子則相反為誘導(dǎo)型。在真菌中有功能的啟動子中，可特別提到構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans )甘油醛-3-磷酸脫 氫酶的啟動子(Roberts et al., Current基因t. 15: 177-180, 1989)。在細(xì)菌 中有功能的啟動子中，可特別提到T7噬菌體RNA聚合酶的啟動子 (Studier et al.， Methods in enzymology 185: 60-89, 1990)。在酵母中有功能 的啟動子中，可提到GAL1基因(Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88: 1731-1735， 1991)或釀酒酵母(S. cerevisiae ) GAL4的啟動子以 及ADH啟動子。所有這些啟動子已有文獻描述，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員 所熟^p。將選擇表達(dá)盒用于繩狀青霉菌中的表達(dá)，所述表達(dá)盒例如包括組蛋 白H4.B啟動子、天冬氨酸蛋白酶啟動子或csl13啟動子(WO 00/68401)。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒可額外包括多肽或多核苷酸表達(dá)所必需的任何 其它序列，例如允許分泌宿主生物產(chǎn)生的多肽的調(diào)控元件或信號序列。 特別是，可能使用任何調(diào)控序列，所述調(diào)控序列可能提高插入到表達(dá)盒 中的編碼序列的表達(dá)水平。特別地，根據(jù)本發(fā)明，可與調(diào)控啟動子序列 組合使用其它調(diào)控序列，這些調(diào)控序列位于啟動子與編碼序列如轉(zhuǎn)錄激 活子("增強子")之間?？蓪⒏鞣N各樣的終止序列用于根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒中，這些序列可終止轉(zhuǎn)錄及mRNA的多腺苷酸化?？墒褂迷谒x宿主生物中有功能的任 何終止序列。將選擇表達(dá)盒用于在繩狀青霉菌中的表達(dá)，所述表達(dá)盒例如包括組 蛋白H4.B終止子、天冬氨酸蛋白酶終止子或csl13終止子的 (WO 00/68401)。本發(fā)明的對象還為包含根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的多核苷酸，有利的是 將根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒插入載體。載體
本發(fā)明因此還涉及復(fù)制或表達(dá)載體，所述載體用于轉(zhuǎn)化包含至少一 個多核香酸或一個根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的宿主生物。特別是，該載體可 對應(yīng)為已插入根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒的質(zhì)粒、粘粒、噬茵體或 病毒。構(gòu)建這些載體和將本發(fā)明多核苷酸插入這些載體的技術(shù)為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知。通常，可能使用在宿主細(xì)胞中能保持自身、自主復(fù)制 或增殖的任何載體，以特別誘導(dǎo)多核苦酸或多肽的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人 員將根據(jù)待轉(zhuǎn)化的宿主生物和根據(jù)所用的轉(zhuǎn)化技術(shù)選擇合適的載體。特別是，將本發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化宿主生物，用于在宿主生物中復(fù) 制載體和/或表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括以下步驟-使用包含根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的表達(dá)載體和/或根據(jù)本發(fā)明的多 核苷酸轉(zhuǎn)化宿主生物，-分離宿主生物產(chǎn)生的多肽。宿主生物本發(fā)明的對象還為轉(zhuǎn)化宿主生物的方法，所述方法通過將至少 一個 根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒或載體整合入所述宿主生物來完成。可 將多核苷酸整合入宿主生物的基因組，或多核苷酸能在宿主生物中穩(wěn)定地復(fù)制。轉(zhuǎn)化宿主生物的方法為本領(lǐng)域:技術(shù)人員所熟知，且在文獻中被 4艮好地描述。本發(fā)明還涉及一種宿主生物，其可被根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、表達(dá) 盒或載體轉(zhuǎn)化。特別是，根據(jù)本發(fā)明，表述宿主生物理解為選自細(xì)菌、 酵母和真菌的任何單或多細(xì)胞、低等或高等的生物。表述宿主生物理解為非人生物。有利的是，酵母選自畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisae ) 、 Yarrowia lipolytica 和 Schwanniomyces occidentalis。真菌選自曲霉(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium)，優(yōu)選 選自繩狀青霉菌、Trichoderma reesei、 黑曲霉(Aspergillus niger )、 泡盛 曲霉(Aspergillus awamori )、白曲霉(Aspergillus kawachii)禾口 Trichoderma koningii。在優(yōu)選的實施方案中，宿主生物為繩狀青霉菌抹，其中根據(jù)
本發(fā)明的ABFB多肽,皮表達(dá)或過表達(dá)。在這些生物中，用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化宿主生物和表達(dá)異源蛋白質(zhì)的:技術(shù)一皮廣泛描述于文獻中(Ausubel F.M. et al.， "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1和2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1989; T. Maniatis, E.F. Fritsch， J. Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982)。食品添加劑和飼料-本發(fā)明因此涉及提供a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的食品添加劑。攝 入這種類型酶活性可能增強食品的可消化性并提高其營養(yǎng)價值。表述營養(yǎng)添加物理解為有意地、通常以小量添加至食品以改善其營 養(yǎng)特性或可消化性的物質(zhì)。用于動物的營養(yǎng)添加物可包含例如維生素、 無機鹽、氨基酸和酶。通常，用于動物的營養(yǎng)添加物包括根據(jù)本發(fā)明的多肽,根據(jù)本發(fā)明的 宿主生物或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物的發(fā)酵液。因此，可將具有根據(jù)本發(fā) 明的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多肽自繩狀青霉菌株或自用于制備 動物營養(yǎng)添加物的重組宿主生物中純化或分離?；蛘?，可將繩狀青霉菌 抹或產(chǎn)生AbfB多肽的宿主生物直接用于制備動物用營養(yǎng)添加物。在本 發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將繩狀青霉菌抹或根據(jù)本發(fā)明的宿主生物的培 養(yǎng)上清液或發(fā)酵液用于制備動物用營養(yǎng)添加物。當(dāng)將ABFB多肽通過繩 狀青霉菌株或宿主生物分泌時，該實施方案特別有利。通常，將該培養(yǎng) 上清液濃縮或凍干以制備營養(yǎng)添加物。因此，本發(fā)明還涉及制備ABFB酶的方法，該方法包括以下步驟a) 在用于誘導(dǎo)ABFB表達(dá)的條件下培養(yǎng)繩狀青霉菌株或根據(jù)本發(fā) 明的纟皮轉(zhuǎn)化的宿主生物，b) 分離包括ABFB酶的培養(yǎng)上清液。 然后可將該培養(yǎng)上清液或發(fā)酵液濃縮或凍干以形成食品添加劑或飼料。如果宿主生物在培養(yǎng)基中不分泌ABFB酶，增加打開細(xì)胞并純化細(xì) 胞提取物的步驟可能是必需的。 本發(fā)明的營養(yǎng)添加物包含(X-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，但可能還包 含其它營養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸或無機鹽。根據(jù)本發(fā)明的添加劑增加飼料的可消化性，因此特別有助于更好地 增強基于谷類(小麥、大麥、玉米、燕麥、黑麥等)和基于油渣餅(大 豆、向日葵、油菜籽等)的食物的營養(yǎng)價值。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的營養(yǎng)基質(zhì)和營養(yǎng)添加物的飼料。通 常將這些飼料以膳食或顆粒形式提供，其中加入根據(jù)本發(fā)明的添加劑。表述飼料理解為可作為食物提供給動物的任何事物。飼料包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、根據(jù)本發(fā)明的宿主生物或根據(jù)本發(fā)明 的宿主生物的發(fā)酵液。用于密集的動物育種，這些飼料通常包含營養(yǎng)基質(zhì)和營養(yǎng)添加物。表述營養(yǎng)基質(zhì)理解為構(gòu)成動物飼料配給的主要部分的物質(zhì)，例如由谷 類、蛋白和動物和/或植物來源的脂肪的混合物組成。動物用營養(yǎng)基質(zhì)適合用作這些動物的食物，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常，這些營養(yǎng)基質(zhì)包含例如玉米、小麥、豌豆和大豆。這些營養(yǎng)基質(zhì)適于它們所指定的各種動物的需要。這些營養(yǎng)基質(zhì)可能已經(jīng)包含 營養(yǎng)添加物如維生素、無機鹽和氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于單胃動物，特別是用于家禽和豬的祠料。家禽特別包括蛋雞、broilers、火雞和鴨子。豬特別包括成 豬和小豬。


附圖1:在40。C下，存在5 mM PNPAF時測定ABFB-1酶在Mcllvaine 緩沖系列(pH 2.2至8)中的最佳pH。附圖2:在5 mM PNPAF存在下，測定在最佳pH時ABFB-1酶的最佳溫度。附圖3:當(dāng)PNPAF為0.5 mM至5 mM的范圍時，在pH 3.4和60°C 時，測定ABFB-1的動力學(xué)常數(shù)Km和Vm(l/Vi = f(l/S)。附圖4:根據(jù)繩狀青霉菌生長情況評價abffi-l和abffi-2基因的相對
定量差異表達(dá)。 實施例L-阿拉伯呋喃糖酶B活性測定的發(fā)展在包含0.15% provasoy和0.3%纖維素的混合添加劑的M2培養(yǎng)基上 將繩狀青霉菌培養(yǎng)40小時后，測定L-阿拉伯呋喃糖酶活性。在培養(yǎng)48 小時和72小時時收集樣品。培養(yǎng)在200ml錐形瓶中完成，使用了50ml 體積。通過在50 mM pH 5的乙酸鈉緩沖液中水解5 mM對硝基苯基-(L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)測定活性。將50 |ul培養(yǎng)上清液與在50。C預(yù)熱 的250 iil底物將育15分鐘。加入500 |id 0.5 MNaOH停止反應(yīng)。在405 nm 處測定對硝基苯基(PNP)的釋放，使用的摩爾消光系數(shù)為 17 000M-l.cm-l。將酶單位定義為在上,述條件下每分鐘水解1 )umol PNPAF的酶的量。對于繩狀青霉菌培養(yǎng)物，在培養(yǎng)48 h后我們獲得 20mU.ml-l,在培養(yǎng)72 h后獲得112 mU.ml-l 。這些結(jié)果與文獻一致，的 確對于黑曲霉，根據(jù)培養(yǎng)中使用的誘導(dǎo)物，觀察到100至600mU.ml-l 等級的活性。將繩狀青霉菌abffi ORF克隆進釀酒酵母從繩狀青霉菌的基因組 DNA開始，借助引物 (HindlII-abfB/Xbal-abffi)通過PCR擴增abffi基因，應(yīng)用以下條件(94。C 30 sec; 62°C 30 sec;在72。C 1 min 30 sec)進行30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物 克隆入商品化載體pGEM-T(tm)easy中。PCR引物對的序列XbaI陽abfB-l: >5，-TCTAGAATGTTTCCAAGAATAAAACCAG-3，<HindIII-abffi-1: >5，-AAGCTTTCATGCAAAGGCAGTCT-3，<將1534 bp的HindlII/Xbal片段自載體 pGEM-T切除，在 HindlII/Xbal位點亞克隆入穿梭載體pJL52(placl95-PGK/CYCl)。對于異 源表達(dá)，abffi基因因此受編碼磷酸甘油酸酯激酶(釀酒酵母)的基因的
組成性PGK啟動子和編碼細(xì)胞色素C氧化酶活性的基因的CYC1終止 子(釀酒酵母)的控制。將新的表達(dá)盒稱為pOT-Ol。酉良酒酵母林JF弁1194(CEN.PK113-5D)是來源于帶有ura 3-52營養(yǎng)缺 陷型的CEN.PK 122抹的克隆，以表達(dá)載體pOT-02轉(zhuǎn)化(乙酸鋰/熱激法)。 在無尿嘧啶的選擇性平板(URA3標(biāo)記)上，以表型互補選擇轉(zhuǎn)化株。選捧6個轉(zhuǎn)化抹以測試培養(yǎng)上清液中阿拉伯呋喃糖酶B活性的存 在。在50ml無尿嘧啶的YNB培養(yǎng)基(除野生型對照株外)中，將轉(zhuǎn)化 才朱培養(yǎng)24小時。以上文描述的方法測定培養(yǎng)上清液中的阿拉伯呋喃糖酶 活性。最佳pH的確定將來源于繩狀青霉菌的編碼阿拉伯呋喃糖酶B活性的abffi-l基因 克隆入釀酒酵母中。在幾個轉(zhuǎn)化4朱中4企查阿拉伯呋喃糖酶B活性的存在 后，選擇一種轉(zhuǎn)化抹并在生長24h后測定培養(yǎng)上清液中的ABFB活性。 在200 ml錐形瓶(工作體積50 ml)中完成培養(yǎng)。在Mcllvaine緩沖系列(pH 2.2至8.0)中存在5 mM p-硝基苯基 -ot-L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)時測定活性。將80(il培養(yǎng)上清液與在 40。C預(yù)熱的320 |al底物孵育10 min。加入1 ml 1M Na2C03停止反應(yīng)。在 405 nm"處測定p-硝基苯基的釋放。將一個酶單位定義為上述條件下每 分鐘水解1 iumol PNPAF的酶量?；钚郧€如圖1所示。在pH 3.4時 ABFB-1具有最佳活性，并且在pH 5時保持65%的活性。最佳溫度的測定使用相同的流程，我們確定了 ABFB-1活性的最佳溫度。在pH3.4 的各個溫度下將酶在Mcllvaine緩沖液中孵育10min?；钚郧€如圖2 所示。繩狀青霉菌ABFB-1在60。C時具有最佳活性。因此ABFB-1具有 高于所述ABFB的最適溫度。如果選擇酶ABFB-1的最適pH和溫度(pH3.4 和60。C),則觀察到ABFB-1的活性為在pH 5和40°C的乙酸鹽緩沖液中測定的活性的4倍(424 mU vs 102 mU)。 K^和V!的測定在上面確定的最佳條件下，通過測量PNPAF隨著時間的水解測定 ABFB-1的動力學(xué)常數(shù)(Km和Vm)。在pH 3.4緩沖液中，建立0.5與5 mM范圍的底物(PNPAF)濃度。 在60°C監(jiān)控水解的動力學(xué)10分鐘。將結(jié)果根據(jù)雙反推法(double inverse method ) (Lineweark和Burk)處理，如圖3所示。ABFB-1的Km值為1 mM。通過比較，文獻中這類酶的Km值根據(jù) 所研究的屬和真菌的種類在0.05至1.2 mM范圍變化。在上述條件下 ABFB-1具有521 mol PNPAF/mo1酶/min的最大水解速度(Vm)。測定ABFB-1酶的分子量為確定ABFB-1酶的分子量，將源于基本培養(yǎng)基的生長突變體(釀 酒酵母)的培養(yǎng)上清液濃縮200倍，在100°C煮沸5分鐘變性，然后儲 存于SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。在野生型菌抹中觀察到細(xì)胞外蛋白質(zhì)的量極低。對于突變體， ABFB-1酶被分泌在培養(yǎng)上清液中。主要是與釀酒酵母細(xì)胞外蛋白的基本 水平有關(guān)。分子量的確定借助于尺寸標(biāo)記物SeeBlue (Invitrogen)完成。結(jié)果表示 于表1中。子貞測的MW在凝膠上評價的MWABFB-15365表1:以Kda計的ABFB-1分子量我們比較通過算法載體NTi預(yù)測的分子量與變性SDS-PAGE凝膠電
我們比較通過算法載體NTi預(yù)測的分子量與變性SDS-PAGE凝膠電 泳遷移獲得的分子量。我們觀察到SDS-PAGE對酶分子量預(yù)測過高。凝 膠上顯示的發(fā)散的電泳譜帶的確表明了酶的高度糖基化(O和N糖基化)。 糖基化發(fā)生在正在表達(dá)的生物中的蛋白質(zhì)加工過程中。繩狀青霉菌中abffi-l基因的表達(dá)情況分析繩狀青霉菌具有兩種編碼B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶的基因abffi-l 和abffi-2基因。比較了這些基因在各種繩狀青霉菌培養(yǎng)條件下的表達(dá)情 況。在誘導(dǎo)纖維素分解的和半纖維素分解酶(M2型工業(yè)生長培養(yǎng)基)的 條件下和非生產(chǎn)條件下(基本的葡萄糖培養(yǎng)基MO)培養(yǎng)繩狀青霉菌。在生 長40h后，停止培養(yǎng)，回收菌絲，然后提取總RNA。通過測定260nm 和280nm處的吸光度(260/280比率〉1.8),評價RNA的數(shù)量和質(zhì)量。 在兩種各自的條件下(MO和M2),通過實時定量PCR定量編碼B型阿拉 伯呋喃糖酶(ABFB-1和ABFB-2)活性的轉(zhuǎn)錄物水平。在兩種條件下以編碼繩狀青霉菌微管蛋白(tub-l)的基因作為對照。該 基因編碼對細(xì)胞完整性必需的結(jié)構(gòu)蛋白。通常將這個基因用作對照基因 是因為不管應(yīng)用何種培養(yǎng)條件(普遍存在的)，其表達(dá)水平不變。為每種基因(abffi-l、 abffi-2和tub-l)設(shè)計用于定量PCR的特異引物。 在兩種生長條件(MO和M2)下，逆轉(zhuǎn)錄2|iig總RNA。為了確定用于擴 增目的基因的最佳條件(定量PCR法的限制以及這些引物對的效率)，連 續(xù)稀釋來自逆轉(zhuǎn)錄的互補DNA。標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果如表2和圖4所示。
<formula>formula see original document page 22</formula>表2: abfB-1和abffi-2基因的差異表達(dá)值為繩狀青霉菌生長條件的函數(shù)編碼分解纖維素的和半分解纖維素活性的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已有描 述。這些基因的表達(dá)易受培養(yǎng)微生物的碳和氮源的性質(zhì)和/或復(fù)雜性的影 響。已報道在葡萄糖存在時這些基因的轉(zhuǎn)錄受到高度抑制。此調(diào)控通過 分解代謝阻遏蛋白CreA完成，所述CreA特異地與這些基因的啟動子結(jié) 合并阻斷其轉(zhuǎn)錄。在我們通過PCR定量abffi-1和abffi-2信使的試驗中， 這兩種基因在葡萄糖(MO)條件下的表達(dá)水平非常低。這與文獻一致，因纖維素的底物)i有基礎(chǔ)表達(dá)水平。在mo、條件下:得的結(jié)果與:獻'一致:就abffi-1基因的表達(dá)而言，觀察到比MO條件下獲得的基底水平高107 倍的誘導(dǎo)因子，而abfb-2基因并未過表達(dá)。
權(quán)利要求
1.適用于動物營養(yǎng)的多肽，特征在于其包括一種選自以下多肽的多肽-SEQ ID No.2的多肽，-序列介于SEQ ID No.2的位置28和位置507之間的多肽，-SEQ ID No.2的多肽片段，具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，-一種多肽，其具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，且顯示與SEQ IDNo.2的多肽至少90％的同一性。
2. 編碼a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性的多核香酸，其特征在于其選 自以下多核苦酸-序列包括在SEQ ID No. 1的位置845與位置2368之間的多核苷酸，-序列包括在SEQ ID No. 1的位置927與位置2368之間的多核苷酸，-編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸。
3. 多核苷酸，特4正在于其具有SEQ ID No. 1的序列或與SEQ ID No. 1互補的序列。
4. 表達(dá)盒，特征在于在轉(zhuǎn)錄方向上包括 -在宿主生物中有功能的啟動子； -根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸；以及 -相同宿主生物中的終止序列。
5. 包括根據(jù)權(quán)利要求2-3中任一項的多核苷酸和/或根據(jù)權(quán)利要求4 的表達(dá)盒的載體。
6. 用根據(jù)權(quán)利要求2-3中任一項的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求4的表 達(dá)盒和/或根據(jù)權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化的宿主生物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的宿主生物，特征在于宿主生物選自酵母和絲狀真菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的宿主生物，特征在于其為繩狀青霉菌株。
9. 動物用營養(yǎng)添加物，特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求l的多肽。
10. 動物用營養(yǎng)添加物，特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一 項的宿主生物和/或根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項的宿主生物的發(fā)酵液。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9-10中任一項的動物營養(yǎng)添加物，特征在于其為 液體形式或粉末形式。
12. 飼料，特征在于其包含動物用營養(yǎng)基質(zhì)和根據(jù)權(quán)利要求9-11 中任一項的動物用營養(yǎng)添加物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項的宿主生 物用于制備動物用營養(yǎng)添加物或飼料的用途。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項的宿主生 物用于水解阿拉伯呋喃J氐聚糖化合物的ot-L-阿拉伯呋喃糖4囊的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼B型α-L-阿拉伯呋喃糖酶的繩狀青霉菌abfB-1基因。該α-L-阿拉伯呋喃糖酶可以摻入用于動物的營養(yǎng)添加物或食品中，因為其促進可消化性并從而促進營養(yǎng)價值。
文檔編號C12N15/56GK101171336SQ200680015044
公開日2008年4月30日 申請日期2006年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月4日
發(fā)明者奧里佛·圖拉斯, 奧里佛·諾爾, 讓-瑪麗·弗朗索瓦, 讓-路克·帕羅 申請人:安迪蘇法國聯(lián)合股份有限公司