專利名稱：：借助酶催還原生產(chǎn)旋光醇的方法借助,還原生產(chǎn)旋光醇的方法本發(fā)明涉及通過酶催還原對應(yīng)的酮來制備旋光烷醇的方法，尤其涉及制備(lS)-3-曱基氨基-l-(2-噻吩基)丙-l-醇和(lS)-3-氯-l-(2-噻吩基)丙-l-醇的方法。
背景技術(shù)：
：(lS)-3-甲基氨基-l-(2-噻吩基)丙-l-醇("度洛西汀(Duloxetine)醇")是度洛西汀合成中的結(jié)構(gòu)單元。DuIoxetine㊣是一種目前處于批準階段的藥物，意欲用在抑郁和失禁適應(yīng)癥領(lǐng)域。EP-B-0273658描述了制備對應(yīng)于度洛西汀的堿的方法，包括使2-乙?；绶耘c甲醛和二甲胺以曼尼希反應(yīng)反應(yīng)，還原由此得到的曼尼希堿的酮基以獲得外消旋的(S)-3-N,N-二甲基絲-l-(噻吩-2-基)丙-l-醇，用氟化萘使醇官能團醚化并最終將二甲基氨基基團轉(zhuǎn)化為甲基氨基官能團。想要的萘得，該拆分例如使用旋光酸經(jīng)由鹽或在手性固定相上層析進行。US-5，362，886描述了類似的方法，其包括將S-扁桃酸加至還原酮基后獲得的外消旋丙醇。在該方法中獲得的醇的S對映體用在隨后的反應(yīng)階段中。EP-A-(MS"外也描述了類似于EP-B-0273658的方法。其中，曼尼希堿的酮基通過使用不對稱還原系統(tǒng)LAH-lcb(氫化鋰鋁[(2R，2S)-(-)-4-二甲基M-l，2-二苯基-3-甲基-2-丁醇D被還原為S對映體形式的醇。除了成本以外，其缺點還在于LAH-lcb還原系統(tǒng)的敏感性，其僅穩(wěn)定數(shù)秒鐘。W.J.Wheeler和F.Kuo在JournalofLabelledCompoundsandRadiopharmaceuticals,第XXXVI巻，No.3，第213至223頁中描述了制備度洛西汀的方法。為此，使噻吩-2-羰酰氯與乙烯基三正丁基錫烷在催化量的千氯雙(三苯基膦)鈀(II)存在下在DMPU(二曱基亞丙基脲)中以Stille偶聯(lián)反應(yīng)，得到式(V)的l-(蓉吩-2-基)丙烯酮f、〇赫通過氯化氫處理將其轉(zhuǎn)化為式(VI)的3-氯-l-(瘞吩-2-基)丙-l-酮:以此方式得到的氯丙酮隨后使用手性氧氮雜亞硼烷基(oxazaborylidine)和BH3還原，得到式(VII)的(S)-3畫氯-l-(噻吩誦2-基)丙-l畫醇以此方式得到的醇通過依次與硤化鈉，隨后與曱胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化為(S)-3-曱基氨基-l-(噻吩-2-基)-丙-l-醇。接著依次與氫化鈉，1-氟萘和氯化氬反應(yīng)產(chǎn)生氫氯化物形式的度洛西汀。Hal=囟素。T.Stillger等人在ChemieIngenieurTechnik(74),第1035-1039頁，2002，描述了底物偶合輔因子再生方法，用于酶催和對映選擇地還原5-氧代己酸乙酯，以得到(S)-5-羥基己酸乙酯。因此，本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)立體特異性地還原取代的烷酮如3-甲基氨基-l-(2-噻汾基)丙酮和3-氯-l-(2-噻吩基)丙酮的方法，該反應(yīng)方法意欲能以低廉的方式以及盡可能定量地獲得產(chǎn)物。由于令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，具有脫氫酶活性的酶，尤其是可從固氮弓菌(Azoarcus)屬微生物制備的那些，能夠立體特異地催化上述反應(yīng)并伴隨輔發(fā)明概述因子再生。本發(fā)明主要涉及制備式I的旋光烷醇的方法:A、,/其中n為0至5的整數(shù)；A為任選取代的支化或未支化的Cl-C6烷基或"Cyc"基團，Cyc為任選取代的單或多環(huán)的、飽和或不飽和的碳環(huán)或雜環(huán)，以及R為囟素、SH、OH、N02、NR2R34NR2R3R4+X-，其中R2、R3和W彼此獨立地為氬或低級烷基或低級烷氧基，且X—為抗衡離子，該方法包括在包含式II的烷酮的介質(zhì)中其中n、A和Ri如上所定義，使選自脫氫酶、搭還原酶和羰基還原酶類的酶在還原等價物存在下孵育，其中式II的化合物酶催還原得到式I的化合物，并且在反應(yīng)中消耗的還原等價物通過借助酶(E)使供體醇反應(yīng)獲得對應(yīng)的供體酮而再生，并且所述供體酮從反應(yīng)介質(zhì)中至少部分地移除，以及分離所形成的產(chǎn)物(I)。適合于本發(fā)明的酶(E)尤其是醛-酮還原酶家族的酶、醛-酮還原酶總家族的酶(K.M.Bohren,B.Bullock,B.WermuthandK.H.GabbayJ.Biol.Chem.1989,264,9547-9551)，以及短鏈醇脫氬酶/還原酶(SDR)的酶。后面的酶類例如詳細描述于H.Jornvall，B.Persson，M.Krook，S.Atrian，R.Gonzalez-Duarte，J.JefferyandD.Gosh,Biochemistry,1995，34,第6003-6013頁或U.Oppermann，C.Filling,M.Hult,N.Shafquat，X.Q.Wu，M.Lindh，J.Shafquat,E.Nordling，Y.Kallberg，B.PerssonandH.Jor證ll，Chemico國BiologicalInteractions,2003，143，第247-253頁中。在提及的這些酶類中，短鏈醇脫氳酶是尤其適合的。本發(fā)明的尤其適合的實施方案為在上述方法中4吏用酶(E)，其中E具有多狀序列(i)SEQIDNO:2或(ii)與SEQIDNO:2相比，其中至多25。/。的氬基酸殘基已通過缺失、插入、取4戈或其組合而改變，并且其保留了SEQIDNO:2酶活性的至少50%。在尤其優(yōu)選的實施方案中，該方法用于制備式III的l-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的衍生物，將該化合物酶催還原以得到式III的化合物，并且分離形成的基本上對映體純的產(chǎn)物。優(yōu)選在該方法中使用具有脫氫酶活性的酶，該酶可從固氮弓菌屬、Azonexus、Azospira、Azovibrio、Dechloromonas、高鐵軒菌屬(Ferribaeterium)、Petrobacter、Propionivibrio、Quadricoccus、紅環(huán)菌屬(Rhodocyclus)、Sterolibacterium、陶厄氏菌屬(Thauera)以及動膠菌屬(Zoogloea)的微生物制備。尤其優(yōu)選固氮弓菌屬物種的脫氫酶。由于其M酸序列，固氮弓菌屬物種EbNl的苯基乙醇-脫氫酶可以包括在短鏈醇脫氫酶/還原酶(SDR)中。該酶類例如詳細描述于H.Jornvall，B.Persson,M.Krook，S.Atrian，R.Gonzalez畫Duarte，J.JefferyandD.Gosh，Biochemistry,1995，34，第6003-6013頁或U.Oppermann,C.Filling,M.Hult，N.Shafquat，X.Q.Wu，M.Lindh，J.Shafquat，E.Nordling，Y.Kallberg,B.PerssonandH.Jornvall，Chemico-BiologicalInteractions,2003,143，第247-253頁中。在SDR類中，各個代表的M酸序列可以彼其中Ri-C1或NHCH3，其中，在包含式IV的l-(2-噻吩基)丙酮的衍生物的介質(zhì)中，此差異很大。然而特定的氨基酸或氮基酸區(qū)域已知在SDR類中高度保守。C.Filling,K.D.Berndt，J.Benach，S.Knapp，T.Prozorovski，E.Nordling，R.Ladenstein，H.JornvallandU.Oppermann，JournalofBiologicalChemistry,2002，277，第25677-25684頁描述了重要的保守SDR區(qū)域。固氮弓菌屬物種的實例為Azoarcusanaerobius、Azoarcusbuckelii、Azoarcuscommunis、Azoarcusevansii、Azoarcusindigens、Azoarcustoluclasticus、Azoarcustolulyticus、Azoarcustoluvorans、固氮弓菌屬物種、固氮弓菌屬物種22Lin、固氮弓菌屬物種BH72、固氮弓菌屬物種CC-ll、固氮弓菌屬物種CIB、固氮弓菌屬物種CR23、固氮弓菌屬物種EB1、固氮弓菌屬物種EbNl、固氮弓菌屬物種FL05、固氮弓菌屬物種HA、固氮弓菌屬物種HxNl、固氮弓菌屬物種mXyNl、固氮弓菌屬物種PbNl、固氮弓菌屬物種PH002、固氮弓菌屬物種T以及固氮弓菌屬物種ToNl。尤其優(yōu)選使用固氮弓菌屬EbNl脫氫酶。在該方法尤其優(yōu)選的實施方案中，具有脫氬酶活性的酶選自包含才艮據(jù)SEQIDNO:2的^^酸序列或從其衍生的如下序列的酶，該序列中至多25%、優(yōu)選至多20%、尤其優(yōu)選至多15%、尤其是至多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸殘基已通過缺失、取代、插入或缺失、取代和插入的組合而改變，其中該與SEQIDNO:2相比改變了的多肽序列保留了SEQIDNO:2酶活性的至少50。/。、優(yōu)選65%、尤其優(yōu)選80%、尤其是高于卯％。就此而言，SEQIDNO:2的酶活性是指以對映選擇性方式還原其中R1=Cl的式(IV)的酮以得到通式(III)的(S)醇的能力。用于確定酶活性的精確條件記述在實施例3和4中。本發(fā)明的方法在添加還原等價物，尤其是NADH或NADPH的條件下進行。在反應(yīng)中消耗的還原等價物使用供體醇來再生，優(yōu)選異丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、3-己醇，所述供體醇在反應(yīng)條件下被酶(E)催氧化得到對應(yīng)的供體酮。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所添加的供體醇不僅用來再生消耗的還原等價物，還用作共溶劑。優(yōu)選在液體兩相系統(tǒng)中操作，一相由水或水溶混性溶劑組成，另一相由供體醇組成。所用的*本醇優(yōu)選2-戊醇。還原等價物優(yōu)選以基于使用的每摩爾烷酮(II)為0.001至100mmol，尤其優(yōu)選0.01至1mmol還原等價物的量使用。本發(fā)明的方法包括從反應(yīng)混合物至少部分地移除由于再生消耗的還原等價物過程中的供體醇氧化而產(chǎn)生的供體酮。優(yōu)選從反應(yīng)介質(zhì)中完全移除形成的供體酮。這可以通過多種方式進行，例如經(jīng)由選擇性膜或通過提取或蒸餾方法。優(yōu)選使用蒸餾移除酮。通過蒸餾移除酮常常也引起部分供體醇以及有時也甚至是部分水相被移除。蒸餾導致的這些損失通常通過計量加入額外量的供體醇以及，合適的話，水來彌補。基于反應(yīng)體積，蒸餾速率在0.02。/o/min至2。/o/min,優(yōu)選0.05%/min至1%/min的范圍內(nèi)。反應(yīng)器的夾套溫度優(yōu)選比內(nèi)部反應(yīng)器溫度高5-70開爾文，優(yōu)選高10-40開爾文。該蒸餾在1-500毫巴，優(yōu)選10-200毫巴的壓力下特別好地進行。在優(yōu)選的實施方案中，使通式II的化合物，例如式IV化合物在微生物存在下反應(yīng)，該微生物選自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、乳軒菌科(Lactobacillaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、紅球菌科(Rhodococcaceae)和i若卡氏菌科(Nocardiaceae)的細菌。特別地，所述樣i生物尤其可以是已用編碼具有上述脫氫酶活性的酶的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的重組微生物。本發(fā)明尤其涉及-從自然來源分離或重組制備產(chǎn)生具有脫氫酶活性的酶的微生物，-使所述微生物增殖，-若合適的話，從所述微生物分離具有脫氫酶活性的所述酶或制備包含所述酶的蛋白部分，以及-將根據(jù)階段b)的微生物或根據(jù)階段c)的酶轉(zhuǎn)移至包含式I化合物的介質(zhì)中。本發(fā)明還涉及包含編碼上述多肽的序列的編碼核酸序列。本發(fā)明還涉及包含上述編碼核酸序列的表達盒，其可操作地連接于至少一個調(diào)節(jié)核酸序列。本發(fā)明還涉及包含至少一個這種表達盒的重組載體。本發(fā)明還涉及已用至少一種本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主。最后，本發(fā)明涉及具有如上所述脫氫酶活性的酶或產(chǎn)生所述酶的微生物用于制備式I或III的化合物的用途，涉及其進一步的處理，例如用于制備度洛西汀(式VIII):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(VIII)發(fā)明詳述A.通用術(shù)語和定義除非另有說明，適用以下通用含義"卣素"為氟、氯、溴或碘，尤其是氟或氯。"低級烷基"為具有1至6個碳原子的直鏈或支化的烷基基團，例如曱基，乙基，異丙基或正丙基，正、異、仲或叔丁基，正戊基或2-甲基丁基，正己基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，2-乙基丁基。"低級烯基，，為上述具有2至6個碳原子的烷基基團的單或多不飽和類似物，優(yōu)選單或雙不飽和類似物，雙鍵可位于碳鏈的任何位置。"低級烷氧基，，為上述烷基基團的以氧為末端的類似物。"芳基"為單或多環(huán)的，優(yōu)選單或雙環(huán)的任選取代的芳族基團，尤其是經(jīng)由任何環(huán)位置結(jié)合的苯基或萘基，例如l-或2-萘基。若合適的話，這些芳基基團可以帶有l(wèi)或2個相同或不同的選自上述卣素、低級烷基、低級烷氧基或三氟甲基的取代基。取代的烷酮、(S)-烷醇及其衍生物可根據(jù)本發(fā)明通過酶催化獲得的烷醇為以上式(I)的那些，其中n為0至5的整數(shù)；A為任選取代的支化或未支化的Cl-C6烷基或"Cyc"基團，Cyc為任選取代的單或多環(huán)的、飽和或不飽和的碳環(huán)或雜環(huán)，以及Ri為離素、SH、OH、N02、NR2R3或NR2R3R4+X，其中R2、r3和R4彼此獨立地為氬或低級烷基或低級烷氧基，且X'為抗衡離子。用于酶催合成的上式ii的烷酮是本身已知的化合物，可通過應(yīng)用公知的有機合成方法獲得(參見，例如EP-A-0273658)。在上述化合物中，n優(yōu)選0、l或2，尤其是l。可以提及的A的實例尤其為具有一個、兩個、三個和四個碳原子的烷基基團，例如甲基，乙基，正和異丙基，正、異和叔丁基。基團A還可為單或多取代的，例如單或二取代的。適合的取代基的實例為囟素、低級烷基、低級烯基、低級烷氧基、-OH、-SH、-02或其中W和W如上定義的NR2R3,優(yōu)選卣素或低級烷基?？梢蕴峒暗奶辑h(huán)和雜環(huán)基團Cyc的實例尤其為具有至多4個，優(yōu)選1或2個相同或不同的選自O(shè)、N和S的環(huán)雜原子的單或雙環(huán)基團，優(yōu)選單環(huán)的基團。這些碳環(huán)或雜環(huán)尤其包含3至12、優(yōu)選4、5或6個環(huán)碳原子。可以提及的實例為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基，其單或多不飽和類似物，例如環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚二蜂基；以及具有1至4個選自O(shè)、N和S的雜原子的5至7元飽和或單或多不飽和雜環(huán)基團，若合適的話，雜環(huán)可稠合至另一雜環(huán)或碳環(huán)。尤其必須提及的是衍生自吡咯烷、四氫呋喃、哌啶、嗎啉、吡咯、呋喃、遙汾、p比峻、。米峻、5惡峻、漆喳、吡咬、p比喃、嘧咬、峻漆、p比"秦、苯并呋喃、吲哚和奮啉的雜環(huán)基團。這種情況下，基團Cyc可以經(jīng)由任何環(huán)位置，優(yōu)選經(jīng)由環(huán)碳原子結(jié)合至烷酮或烷醇。適合的Cyc基團的實例為2-塞吩基、3-蓉吩基；2,夫喃基、3-吹喃基；2-p比咬基、3-吡咬基或4-吡咬基；2-蓉喳基、4-^唑基或5-噻喳基；4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-瘞吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻喻基、3-曱基-2-瘞吩基；3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-嚷汾基、2-橫-3-漆哈基、5-橫-3-噻汾基、4-氟-2-蓉喻基、2-溴-3-噻汾基以及4-氯畫2畫蓉喻基?；鶊FCyc還可以為單或多取代的，例如單或二取代的。取代基優(yōu)選位于環(huán)碳原子上。適合的取代基的實例為面素、低級烷基、低級烯基、低級烷氧基、-oh、-sh、-]\02或其中112和R3如上定義的NR2r3,優(yōu)選卣素或低級烷基。W尤其是卣素、NR2R3或NR2R3R4+X-,其中R2、R3以及R2、R3和R4各自彼此獨立地為氫或低級烷基或低級烷氧基，X-為抗衡離子，優(yōu)選R2、W和W中的任意基團為氫。適合的抗衡離子的實例為酸陰離子，如當制備酸加成鹽時所產(chǎn)生的酸陰離子。其實例例如在EP-A-0273658中提到，在這里對其引用?；鶊FW的優(yōu)選實例尤其是氟或氯以及NR2113，其中112和113相同或不同且為氫或曱基、乙基或正丙基；W尤其優(yōu)選是氯或-NH曱基。C.具有脫氫酶活性的合適的酶優(yōu)選的具有脫氫酶活性的酶包含根據(jù)SEQidNO:2的M酸序列。本發(fā)明同樣包括明確公開的具有脫氫酶活性的酶的"功能等價物"，以及它們在本發(fā)明方法中的用途。在本發(fā)明范圍內(nèi)，明確公開的酶的"功能等價物"或同源物為與這些酶不同但是仍具有期望的生物活性，例如底物特異性的多肽。因此，"功能等價物，，例如是指將3-氯-l-(瘞吩-2-基)丙-l-酮還原為對應(yīng)的S醇且具有含列在SEQidNO:2中的氨基酸序列的酶的活性的至少50%、優(yōu)選60%、尤其優(yōu)選75%、極其優(yōu)選90%的酶。功能等價物也優(yōu)選在pH4至10穩(wěn)定，并有利地具有pH5至8之間的最佳pH,以及在20。C至80。C之間的最適溫度。根據(jù)本發(fā)明，"功能等價物"還尤其指這樣的突變體，其在上述氨基酸序列的至少一個序列位置具有不同于明確提及的氨基酸的氬基酸，但是具有上述生物活性之一。"功能等價物，，因此包括可通過一個或多個氨基酸添加、M酸取代、M酸缺失和/或M酸倒位獲得的突變體，所述改變可能在任何序列位置發(fā)生，只要它們導致突變體具有本發(fā)明的性能特征。尤其是當突變體和未改變的多肽的反應(yīng)性模式定性地一致時，亦即以不同的速率被轉(zhuǎn)換相同的底物時也出現(xiàn)功能等價。在下表中可找到適合的JL^酸取代的實例原始殘基取代實例AlaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGinAshGluAspGlyProHisAsn;GinlieLeu;ValLeulie;ValLysArg;Gin;GluMetLeu;liePheMet5Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp^PheValIle^Leu根據(jù)本發(fā)明，"功能等價物"還尤其指這樣的突變體，其在上述氨基酸序列的至少一個序列位置具有不同于明確提及的氨基酸的氨基酸，但是具有上述生物活性之一。"功能等價物，，因此包括可通過一個或多個氨基酸添加、M酸取代、M酸缺失和/或M酸倒位獲得的突變體，所述改變可能在任何序列位置發(fā)生，只要它們導致突變體具有本發(fā)明的性能特征。尤其是當突變體和未改變的多肽的反應(yīng)性模式定性地一致時，亦即以不同的速率被轉(zhuǎn)換相同的底物時也出現(xiàn)功能等價。在以上意義上的"功能等價物"也是所述多肽的"前體，，以及所述多肽的"功能衍生物"和"鹽"。就此而言，"前體"為具有或不具有期望生物活性的多肽的天然或合成前體。用語"鹽"指本發(fā)明蛋白分子的氣基鹽和氨基基團的酸加成鹽。氛基鹽可以以本身已知的方式制備，包括無機鹽，如鈉、铞、銨、鐵和鋅鹽，以及與有機堿，例如胺，例如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等的鹽。類似地，本發(fā)明還涉及酸加成鹽，例如與無機酸如鹽酸或硫酸的鹽和與有機酸如乙酸和草酸的鹽。本發(fā)明多肽的"功能衍生物"也可借助已知技術(shù)在功能性氨基酸側(cè)基上或在它們的N末端或C末端制備。這種類型的衍生物例如包括羧酸基團的脂族酯、羧脧基團的酰胺，該酰胺可通過與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得；自由氨基基團的N-?；苌铮撗苌锿ㄟ^與?；鶊F反應(yīng)而制備；或自由羥基的O-酰基衍生物，該衍生物通過與?；鶊F反應(yīng)而制備。"功能等價物"自然也包括可從其它生物獲得的多肽以及天然產(chǎn)生的變體。例如，可通過序列比較確定同源序列區(qū)域，并且基于本發(fā)明的具體指導可確定等價酶。"功能等價物"也包括本發(fā)明多肽的片段，優(yōu)選獨立結(jié)構(gòu)域或序列基序，其中該片段具有例如期望的生物功能。"功能等價物，，還可以是融合蛋白，其含有任意上述多肽序列或由其衍生的功能等價物以及至少一種在功能上與其不同并且在N末端或C末端功能連接的其它異源序列(即沒有任何實質(zhì)性的融合蛋白部分相互間功能損傷)。這類異源序列的非限定性實例例如為信號肽或酶。包括在本發(fā)明中的"功能等價物"為明確公開的蛋白的同源物。所述同源物與明確公開的M酸序列之一具有至少60%，優(yōu)選至少75%,尤其是至少85%,如90%、95%或99%的同源性，如使用Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法計算的。本發(fā)明同源多肽的同源性百分比尤其是基于本文明確描述的任意M酸序列的總長而言的J(J^酸殘基同一性百分比。在可能的蛋白糖基化情況下，本發(fā)明的"功能等價物"包括去糖基化或糖基化形式以及可通過改變糖基化模式獲得的修飾形式的上述類型的蛋白。本發(fā)明蛋白或多肽的同源物也可以通過突變產(chǎn)生，例如通過點突變或蛋白的截短產(chǎn)生。本發(fā)明蛋白的同源物可通過篩選突變體如截短突變體的組合庫來鑒別。例如，蛋白變體的多樣化庫可以通過在核酸水平的組合突變來產(chǎn)生，例如通過i^l連接合成的寡核苷酸的混合物。有許多方法可用于從簡并寡核普*列制備潛在的同源物庫。可在DNA合成儀中化學合成簡并基因序列，隨后將該合成基因連接到適合的表達栽體中。使用簡并的基因組使在混合物中制備編碼期望的潛在蛋白序列組的所有序列成為可能。合成簡并寡核苷酸的方法對技術(shù)人員來說是已知的(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人，(1984)Science198:1056;Ike等人(1983)NucleicAcidsRes.11:477)?，F(xiàn)有技術(shù)中已知多種篩選已通過點突變或截短而制備的組合庫的基因產(chǎn)物的技術(shù)，以及在cDNA庫篩選具有所選擇的性能的基因產(chǎn)物的技術(shù)。最經(jīng)常使;的篩選大基'因庫(其經(jīng)歷高流通量分析"技術(shù)包括將i因庫克隆進可復制的表達載體中，用得到的載體庫轉(zhuǎn)化合適的細胞并在這樣的條件下表達組合基因，在該條件下對期望的活性的檢測有助于分離編碼所檢測到的產(chǎn)物的基因的栽體?？蓪⑦f推系統(tǒng)突變(REM)(增加庫中的功能性突變體頻率的技術(shù))與篩選試驗組合使用來鑒別同源物(ArkinandYourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等人(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。D.編碼脫氫酶的核酸序列本發(fā)明尤其涉及編碼本發(fā)明具有脫氫酶活性的酶的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。優(yōu)選編碼例如根據(jù)SEQIDNO:2的M酸序列或其特征性部分序列的核酸序列，或優(yōu)選包含根據(jù)SEQIDNO:l核酸序列或其特征性部分序列的核酸序列。本文提及的所有核酸序列可以以本身已知的方式通過化學合成從核苦酸構(gòu)件來制備，例如通過雙螺旋的各個重疊、互補核酸構(gòu)件的片段縮合來合成。例如，寡核苦酸可以以本身已知的方式使用亞磷酰胺化方法化學合成(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896—897頁)。在Sambrook等人(1989)，MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中描述了合成的寡核普酸的組裝，借助DNA聚合酶Klenow片段的填平缺口和連接反應(yīng)以及通用的克隆方法。本發(fā)明還涉及編碼任意上述多肽及其可例如通過使用人工核苷酸類似物得到的功能等價物的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。本發(fā)明涉及分離的編碼本發(fā)明多肽或蛋白或其生物活性部分的核酸分子，以及涉及例如可用作雜交探針或引物以鑒別或擴增編碼本發(fā)明核酸的核酸片段。本發(fā)明核酸分子還可以包含從編碼基因區(qū)域的3，和/或5，端起的未翻譯的序列。本發(fā)明還包括互補于具體描述的核苷酸序列或其部分的核酸分子。本發(fā)明的核苷酸序列使產(chǎn)生可用于在其它細胞類型和生物體中鑒別和/或克隆同源序列的探針和引物成為可能。這種類型的探針和引物通常包括在"嚴格"條件(見下文)下雜交至本發(fā)明核酸序列有義鏈或?qū)?yīng)反義鏈的至少約12、優(yōu)選至少約25，例如約40、50或75個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列區(qū)域。"分離的"核酸分子從該核酸天然來源中存在的其它核酸分子移除，而且可以基本上無細胞材料或培養(yǎng)基(當其通過重組技術(shù)制備)或者沒有化學前體或其它化學品(當其化學合成)。列信息來分離。例如，可通過使用具體公開的完整序列之一或其部分作為雜交探針并4吏用標準雜交技術(shù)(例如在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2ndedition,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中描述)來從適合的cDNA庫中分離cDNA。此夕卜，包含任意公開的序列或其部分的核酸分子可使用聚合酶鏈式反應(yīng)和基于該序列構(gòu)建的寡核苷酸引物來分離。以此方式擴增的核酸可以被克隆進適合的載體中，并通過DNA測序分析來表征。本發(fā)明的寡核苷酸也可以使用例如自動DNA合成儀通過標準合成方法制備。本發(fā)明的核酸序列原則上可從任何生物體鑒定并分離。有利的是，本發(fā)明的核酸序列或其同源物可從真菌、酵母、古細菌(areheae)或細菌中獲得?？商峒暗募毦鸀楦锾m氏陰性和革蘭氏陽性細菌。本發(fā)明的核酸優(yōu)選從革蘭氏陰性細菌分離，有利的是從a-蛋白細菌，15-蛋白細菌或Y-蛋白細菌分離，尤其優(yōu)選從伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氫菌目(Hydrogenophilales)、嗜曱基菌目(methylophilales)、奈瑟菌目(Neisseriales)、亞硝化單胞菌目(Nitrosomonadales)、普羅卡桿菌目(Procabacteriales)或紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)的細菌分離，極其優(yōu)選從紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)的細菌分離，特別優(yōu)選從固氮弓菌屬分離，特別優(yōu)選從Azoarcusanaerobius、Azoarcusbuckelii、Azoarcuscommunis、Azoarcusevansii、Azoarcusindigens、Azoarcustoluclasticus、Azoarcustolulyticus、Azoarcustoluvorans、固氮弓菌屬物種、固氮弓菌屬物種22Lin、固氮弓菌屬物種BH72、固氮弓菌屬物種CC-ll、固氮弓菌屬物種CIB、固氮弓菌屬物種CR23、固氮弓菌屬物種EB1、固氮弓菌屬物種EbNl、固氮弓菌屬物種FL05、固氮弓菌屬物種HA、固氮弓菌屬物種HxNl、固氮弓菌屬物種mXyNl、固氮弓菌屬物種PbNl、固氮弓菌屬物種PH002、固氮弓菌屬物種T和固氮弓菌屬物種ToNl中分離。尤其優(yōu)選4吏用固氮弓菌屬物種EbNl的脫氬酶。本發(fā)明的核酸序列例如可通過使用常規(guī)的雜交方法或PCR技術(shù)，例如通過基因組庫或cDNA庫而從其它生物體分離。這些DNA序列與本發(fā)明序列在標準條件下雜交。對于雜交而言，有利的是使用例如來自活性位點的保守區(qū)域的短寡核苷酸，該保守區(qū)域可以以技術(shù)人員已知的方式通過與本發(fā)明的脫氫酶比較而鑒別。但是，也可以使用本發(fā)明核酸的較長片段或完整序列來雜交。所述標準*隨使用的核酸(寡核苷酸、較長片段或完整序列)而變化，或取決于用于雜交的核酸類型，DNA或RNA。因此，例如用于DNA:DNA雜交的熔解溫度為約比用于相同長度DNA:RNA雜交體的溫度4氐約10°C。取決于核酸，標準條件例如指42至58°C的溫度，在濃度0.1至5xSSC(1XSSC=0.15MNaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.2)的緩沖水溶液中或另外還存在50%曱酰胺，例如42°C，在5xSSC中，50%甲酰胺。有利的是，用于DNA:DNA雜交體的雜交條件為0.1xSSC以及約20。C至45。C的溫度，優(yōu)選約30°C至45°C。對于DNA:RNA雜交體，雜交條件有利的是0.1xSSC和約30°C至55°C的溫度，優(yōu)選約45°C至55°C。所述的用于雜交的這些溫度為熔解溫度值，例如是對具有約100核苷酸和50%G+C含量，并且無甲酰胺的核酸計算的值。用于DNA雜交的實驗條件描述在專門的遺傳學教科書中，例如Sambrook等人，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989，并且可以4吏用4支術(shù)人員已知的/^式計算，例如作為核酸長度、雜交體類型或G+C含量的函數(shù)計算。關(guān)于雜交，技術(shù)人員可從以下教材中獲得進一步的信息Ausubel等人(eds)，1985,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork;HamesandHiggins(eds),1985，NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(ed)，1991,EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford。本發(fā)明還涉及具體公開的或可衍生的核酸序列的衍生物。因此，本發(fā)明的其它核蔣列可以從SEQIDNO:l衍生，與其不同之處在于添加、取代、插入或缺失單個或兩個或多個核苷酸，但仍然編碼具有期望的性能特征的多肽。本發(fā)明還包括包含"沉默"突變的那些核酸序列，或與具體提及的序列相比基于特定來源生物體或宿主生物體的密碼子選擇而改變的那些核,列，及其天然產(chǎn)生的變體，例如剪接變體或等位基因變體。本發(fā)明還涉及可通過保守核普酸取代(即，所討論的M酸被具有相同電荷、大小、極性和/或溶解性的M酸替換)獲得的序列。本發(fā)明還涉及由于序列多態(tài)性而衍生自具體公開的核酸的分子。作為天然變異的結(jié)果，這些遺傳多態(tài)性可存在于群體內(nèi)的個體之間。這些天然變異通常導致基因的核苷酸序列1至5%的變異。本發(fā)明核酸序列的衍生物例如指等位基因變體，在衍生的氨基酸水平上，其在整個序列區(qū)域上至少40%，優(yōu)選至少60%，極其優(yōu)選至少80、85、卯、93、95或98%同源(關(guān)于氨基酸水平上的同源性，讀者可參見以上與多肽有關(guān)的討論)。有利的是，同源性可以在序列的亞區(qū)域上較高。此外，衍生物也指本發(fā)明核酸序列的同源物，例如真菌或細菌同源物、截短的序列、編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。例如在DNA水平上，它們在所述整個DNA區(qū)域上至少40%，優(yōu)選至少60%,尤其優(yōu)選至少70%，極其優(yōu)選至少80%同源。此外，衍生物例如指與啟動子的融合物。位于所述核苷酸上游的啟動子可以由一個或多個核苷酸替代、插入、倒位和/或缺失而改變，但是不損害啟動子的功能和有效性。另外，所述啟動子的有效性可以通過改變其序列而增加，或啟動子可以被活性更高的啟動子完全替代，包括來自其它生物體的那些。衍生物也指這樣的變體，其起始密碼子上游-1至-1000減基區(qū)域或終止密碼子下游0至1000堿基區(qū)域的核苷酸序列被改變，以便改變，優(yōu)選增加基因表達和/或蛋白表達。本發(fā)明還包括在"嚴格條件"下與上述編碼序列雜交的核酸序列。這些多核苦酸可通過篩選基因組庫或cDNA庫而找到，并且，若合適的話，使用適合的引物通過PCR從其擴增并隨后例如使用合適的探針分離。此外，本發(fā)明的多核苷酸也可以化學合成。這種性能指多核苷酸或寡核苷酸在嚴格條件下與幾乎互補的序列結(jié)合的能力，其中在這些條件下，不會形成非互補配偶體之間的非特異性鍵。為此，所述序列應(yīng)該70-100%,優(yōu)選90-100%互補?；パa序列能夠彼此特異結(jié)合的性能例如用在Northern或Southern印跡技術(shù)中，或用于PCR或RT-PCR中的引物結(jié)合。至少30>§^^長的寡核苷酸通常用于這個目的。例如在Northern印跡技術(shù)中，嚴格條件指4吏用50-70°C，優(yōu)選60-65°C的洗滌溶液，例如含有0.1%SDS的0.1xSSC緩沖液(20xSSC:3MNaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)用于洗脫非特異性雜交的cDNA探針或寡核苷酸。如上所述，僅保持彼此結(jié)合的核酸為高度互補的那些。嚴格條件的建立是技術(shù)人員已知的，并例如描述在Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。E.本發(fā)明構(gòu)建體的實施方案本發(fā)明還涉及包含位于調(diào)節(jié)核酸序列遺傳控制下的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的表達構(gòu)建體；還涉及包含至少一種這些表達構(gòu)建體的載體。本發(fā)明的這類構(gòu)建體優(yōu)選包含特定編碼序列的5，-上游啟動子和3，-下游終止子序列，以及若合適的話，還有其它的常規(guī)調(diào)節(jié)元件，它們在各種情況下都可操作地與編碼序列連接。"可操作的連接"指啟動子、編碼序列、終止子以及合適的話其它調(diào)節(jié)元件的序列排列為這樣的方式，即每種調(diào)節(jié)元件能夠完成其在表達編碼序列中的所需功能。可操作連接的序列的實例為導向序列以及增強子、聚腺苷酸化信號等。其它的調(diào)節(jié)元件包括選擇標記物、擴增信號、復制起點等。適合的調(diào)節(jié)序列例如描述在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。本發(fā)明核酸構(gòu)建體尤其指其中用于本發(fā)明脫氫酶的基因可操作地或功能性地連接至一種或多種調(diào)節(jié)信號，以便調(diào)節(jié)，例如增加該基因的表達的那些。除了這些調(diào)節(jié)序列之外，這些序列的天然調(diào)節(jié)仍可存在于實際結(jié)構(gòu)基因的上游，并且若合適的話，可已經(jīng)遺傳改變以使得天然調(diào)節(jié)關(guān)閉且基因表達增加。但是，核酸構(gòu)建體還可以具有更筒單的設(shè)計，即在編碼序列的上游沒有插入額外的調(diào)節(jié)信號并且天然啟動子連同其調(diào)節(jié)作用未被除掉。作為替代，使天然調(diào)節(jié)序列突變，以便不再有任何調(diào)節(jié)作用且基因的表達增力口。有利的是，優(yōu)選的核酸構(gòu)建體也包含一種或多種以前提及的增強子序列，其功能性地連接于啟動子并使核酸序列的表達增加。其它有利的序列如其它的調(diào)節(jié)元件或終止子也可在DNA序列的3，端插入，本發(fā)明的核酸可以以一個或多個拷貝存在于構(gòu)建體中。如果為篩選所述構(gòu)建體所需，該構(gòu)建體也可以包含其它的標記物，如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷-補足基因。對本發(fā)明方法有利的調(diào)節(jié)序列例如包括在啟動子中，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、Ipp隱lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、^PR或k-PL啟動子，這些啟動子有利地用在革蘭氏陰性細菌中。其它有利的調(diào)節(jié)序列例如包括在革蘭氏陽性啟動子amy和SP02、酵母或真菌啟動子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。就此而言，例如來自異常漢遜酵母(Hansenula)的丙酮自羧酶和甲醇氧化酶啟動子也是有利的。也可能使用人工啟動子來調(diào)節(jié)。為了在宿主生物體中表達，有利的是將核酸構(gòu)建體插入諸如質(zhì)?；蚴删w的栽體中，其使得基因能夠在宿主中最佳表達。除了質(zhì)粒和噬菌體之外，栽體還意味著技術(shù)人員已知的任何其它載體，即，例如，諸如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒的病毒，轉(zhuǎn)座子，IS元件，噬粒，粘粒以及線性或環(huán)形DNA。這些載體可以在宿主生物體中自主復制或隨染色體復制。這些栽體構(gòu)成了本發(fā)明進一步的實施方案。適合的質(zhì)粒的實例為大腸桿菌(E.coli)中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223國3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-Bl、lgtll或pBdCl，鏈霉菌(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢桿菌(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214，棒桿菌(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALSl、pIL2或pBB116，酵母中的2alphaM、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述質(zhì)粒為可能的質(zhì)粒的一小部分。其它質(zhì)粒為4支術(shù)人員熟知，例如可在CloningVectors(Eds.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)—書中找到。為了表達其它存在的基因，有利的是該核酸構(gòu)建體還包含3，-末端和/或5，-末端調(diào)節(jié)序列用于增強表達，對其進行選擇以基于宿主生物體和所選的基因優(yōu)化表達。這些調(diào)節(jié)序列旨在使基因和蛋白表達能夠特異表達。取決于宿主生物體，例如，這可以指僅在誘導后表達或M達，或者立即表達和/或超表達.就此而言，所述調(diào)節(jié)序列或因子可以優(yōu)選有積極影響并由此增強已導入的基因的表達。因此，調(diào)節(jié)元件可以通過使用強轉(zhuǎn)錄信號(例如啟動子和/或增強子)有利地在轉(zhuǎn)錄水平上被增強。但是，除此之外，還可以通過例如改善mRNA的穩(wěn)定性來增強翻譯。在載體的進一步的實施方案中，所述包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或本發(fā)明核酸的載體也可有利地以線性DNA形式引入微生物中，并通過異源或同源重組整合進宿主生物體基因組中。這種線性DNA可由線性化的栽體如質(zhì)粒構(gòu)成，或僅由本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸構(gòu)成。為了能夠在生物體中最佳表達異源基因，有利的是根據(jù)該生物體使用的特定密碼子選擇來改變核酸序列。該密碼子選擇能容易地借助計算機分析所關(guān)注生物體的其它已知基因而確定。本發(fā)明的表達盒通過將適合的啟動子融合到適合的編碼核苷酸序列以及終止子信號或聚腺苷酸化信號中而制備。為此目的，使用通用的重組和克隆凈支術(shù)，例如描述在T.Maniatis,E.F.FritschandJ.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)以及T丄Silhavy,M.L.BermanandLW.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)和A證bel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中的4支術(shù)。為了在適合的宿主生物體中實現(xiàn)表達，將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體有利地插入能使基因在宿主中優(yōu)化表達的宿主特異性載體中。載體為技術(shù)人員所熟知，可以在"CloningVectors，，(PouwelsP.H.等人，Eds"Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。F.本發(fā)明有用的宿主生物體借助本發(fā)明載體或構(gòu)建體，可以制備例如用至少一種本發(fā)明的栽體轉(zhuǎn)化的并可以用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的重組微生物。有利的是，將本發(fā)明的上述重組構(gòu)建體引入適合的宿主系統(tǒng)并表達。在這一點上，優(yōu)選使用技術(shù)人員已知的常見克隆和轉(zhuǎn)染方法，例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等，以便使所述核酸在特定的表達系統(tǒng)中表達。適合的系統(tǒng)例如描ii^CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等人,Eds"WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中。根據(jù)本發(fā)明，也可以制備同源重組微生物。為此，制備這樣的載體，其包含本發(fā)明基因或編碼序列的至少一部分，若合適的話，其中已引入至少一個氨基酸缺失、氨基酸添加或M酸取代以便修飾，例如功能上破壞本發(fā)明的序列(敲除栽體)。所引入的序列也可為來自相關(guān)微生物的類似物或源自例如哺乳動物、酵母或昆蟲來源?；蛘撸糜谕粗亟M的載體也可以這樣i殳計，以使得在同源重組情況下，內(nèi)源基因被突變或以其它方式,皮改變但仍然編碼功能性蛋白(例如，上游的調(diào)節(jié)區(qū)可已經(jīng)改變，以至于內(nèi)源蛋白的表達由此被改變)。本發(fā)明基因的經(jīng)改變的部分位于同源重組載體中。適合于同源重組的載體的構(gòu)建例如描述在Thomas,K.R.andCapecchi,M.R.(1987)Cell51:503中。適合于本發(fā)明核酸或核酸構(gòu)建體的重組宿主生物體原則上為任何原核或真核生物體。有利地，諸如細菌、真菌或酵母的孩i生物被用作宿主有枳i體。有利的是使用革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，優(yōu)選腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)或諾卡氏菌科(Nocardiaceae)的細菌，尤其優(yōu)選埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、瓊脂桿菌屬(Agrobacterium)或紅球菌屬(Rhodococcus)的細菌。極其優(yōu)選大腸桿菌屬和種。此外，其它有利的細菌可在a-蛋白細菌，p-蛋白細菌或Y-蛋白細菌中找到。就此而言，本發(fā)明的宿主生物體優(yōu)選包含在本發(fā)明中描述的并且編碼本發(fā)明具有脫氫酶活性的酶的核酸序列、核酸構(gòu)建體或載體的至少一種。取決于宿主生物體，用于本發(fā)明方法的生物體以技術(shù)人員已知的方式生長或培養(yǎng)。微生物通常在0。C至100。C,優(yōu)選10。C至60。C溫度并且同時通氧氣情況下在液體培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基包含通常為糖形式的碳源、通常為有機氮形式如酵母提取物，或鹽形式如硫酸銨的氮源，微量元素如鐵鹽、錳鹽、鎂鹽，以及若合適的話，還有維生素。就此而言，營養(yǎng)液的pH可以保持或不保持在固定值，即在培養(yǎng)過程中可以調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)。培養(yǎng)可以是分批、半分批或連續(xù)進行。營養(yǎng)物可以在發(fā)酵開始時引入或以半連續(xù)或連續(xù)方式隨后供入。酮可以直接加入到培養(yǎng)物中，或有利地在培養(yǎng)后加入。酶可以通過使用實施例中描述的方法從生物體中分離，或作為粗提取物用于所述反應(yīng)。G.本發(fā)明的多肽的重組制備本發(fā)明還涉及重組制備本發(fā)明多肽或其功能性的生物活性片段的方法，其中培養(yǎng)產(chǎn)生多肽的微生物，若合適的話，誘導多肽的表達并從培養(yǎng)物分離所述多肽。若需要的話，所迷多肽也可以以此方式以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。重組生物體也可通過已知方法培養(yǎng)和發(fā)酵。細菌例如可以在20至40。C的溫度和6至9的pH下在TB培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基中增殖。適合的培養(yǎng)條件例》口詳細4笛述在T.Maniatis，E.F,FritschandJ.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N￥(1989)中。如果多肽被分泌進培養(yǎng)基中，則隨后使細胞破裂并通過已知的蛋白分離方法從裂解液中獲得產(chǎn)物。細胞可以根據(jù)需要通過高頻超聲，通過例如在弗氏壓碎器中的高壓，通過滲透壓，通過去垢劑、水解酶或有機溶劑的作用，通過使用勻漿器或通過以上列出的兩種或更多種方法的組合來破裂。多肽可以使用已知的層析方法，例如分子篩層析(凝膠過濾)，如QSepharose層析，離子交換層析和疏水層析來純化，也可使用其它的常規(guī)方法如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和非變性;^電泳來純化。適合的方法例如描述在Cooper,T.G.,BiochemischeArbeitsmethoden[原稱Thetoolsofbiochemistry],VerlagWalterdeGmyter,Berlin,NewYork或Scopes,R.，ProteinPurification,SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中?？梢杂欣赝ㄟ^使用載體系統(tǒng)或寡核苷酸來分離重組蛋白，該栽體系統(tǒng)或寡核苷酸通過特定核苷酸序列來延伸cDNA，由此編碼經(jīng)改變的多肽或融合蛋白，它們用于例如簡化純化過程。這種類型的適合的修飾例如為用作錨的"標簽"，例如稱為六組氨酸錨的修飾，或可被抗體作為抗原識別的表位(例如描述在Harlow，E.andLane,D.，1988,Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press)。這些錨可以用于將蛋白附著到固體支持物，如聚合物基質(zhì)(其例如可被包裝進層析柱中)，或附著到微量滴定板或其它支持物。同時，這些錨也可以用于鑒別蛋白。所述蛋白也可以通過使用常規(guī)標記物如熒光染料、在與底物反應(yīng)后形成可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的酶標記物或力文射性標記物來鑒別，它們單獨使用或與錨結(jié)合使用來衍生所述蛋白。H.實施本發(fā)明的方法來制備(S)-烷醇根據(jù)本發(fā)明使用的具有脫氫酶活性的酶可以在本發(fā)明方法中作為游離或固定化酶使用。有利的是，本發(fā)明的方法在0-95。C的溫度下，優(yōu)選在10-85。C的溫度下，尤其優(yōu)選在15-75。C的溫度下進行。在本發(fā)明方法中，有利的是pH保持在pH4至12，優(yōu)選pH4.5至9，尤其優(yōu)選pH5至8。在本發(fā)明的方法中，對映體純或手性產(chǎn)物或旋光醇指表現(xiàn)出對映體富集的對映體。在該方法中優(yōu)選實現(xiàn)至少70%ee，優(yōu)選至少80。Aee，尤其優(yōu)選至少90%ee，極其優(yōu)選至少98%ee的對映體純。本發(fā)明的方法可以使用包含本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或載體的生長的細胞。也可以使用靜息細胞或破裂細胞。破裂細胞指例如已經(jīng)通過用例如溶劑處理而變得通透的細胞，或通過酶處理、通過機械處理(例如弗氏壓碎或超聲處理)或通過其它方法而破碎的細胞。以此方式獲得的粗提取物有利地適用于本發(fā)明的方法。本方法還可以使用純化或部分純化的酶。有利地應(yīng)用在反應(yīng)中的固定化微生物或酶也是合適的。當用于本發(fā)明的方法時，在提取前方^^地移除游離生物體或酶，例如通過過濾或離心。在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的產(chǎn)物，例如(lS)-3.甲基氨基-l-(2-噻吩基)丙國l畫醇可有利地通過萃取或蒸餾從含水反應(yīng)溶液獲得。為了增加收率，該萃取可以重復數(shù)次。適合的萃取劑的實例為諸如甲苯、二氯曱烷、醋酸丁酯、二異丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯的溶劑，但不限于這些?；蛘撸诒景l(fā)明方法中產(chǎn)生的產(chǎn)物，例如(lS)-3-曱基M-l-(2-蓉吩基)丙誦l-醇可有利地通過萃取或蒸餾或/和結(jié)晶從反應(yīng)溶液的有樹目獲得。為了增加收率，該萃取可以重復數(shù)次。適合的萃取劑的實例為諸如曱苯、二氯曱烷、醋酸丁酯、二異丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯的溶劑，但不限于這些。在濃縮有機相之后，通?？色@得具有良好化學純度，即高于80%的化學純度的產(chǎn)物。但是，在萃取后，含有該產(chǎn)物的有機相也可僅部分濃縮并可以結(jié)晶產(chǎn)物。為此，有利的是將溶液冷卻到0。C至10。C的溫度。該結(jié)晶也可直接從有機溶液或從水溶液進行。結(jié)晶的產(chǎn)物可再懸浮于相同或不同溶劑中以重新結(jié)晶和再結(jié)晶。如果必要，隨后的至少進行一次的有利的結(jié)晶可以進一步增加產(chǎn)物的對映體純度。上述的后處理類型使得本發(fā)明方法的產(chǎn)物以60至100%、優(yōu)選80至100%、尤其優(yōu)選90至100%的收率(基于用于該反應(yīng)的底物，例如3-甲基#^-1-(2-噻吩基)丙-1-酮)分離。分離的產(chǎn)物特征在于>90%，優(yōu)選>95%，尤其優(yōu)選>98%的高化學純度。此外，產(chǎn)物具有高的對映體純度，若合適的話，其可通過結(jié)晶有利地進一步增加。本發(fā)明的方法可分批、半分批或連續(xù)操作。所述方法可以方4更地在例如在Biotechnology,第3巻，第2版，Rehm等人Eds.，(1993)中，尤其是第二章所描述的生物反應(yīng)器中進行。以上的說明和以下的實施例僅用于解釋本發(fā)明。本發(fā)明也包括多種可能的改進，這對技術(shù)人員而言是顯而易見的。本發(fā)明方法的優(yōu)點在于式(I)的旋光烷醇的特別高的收率和烷酮(II)的基本上定量的轉(zhuǎn)化。實驗部分實施例1:借助合成的寡核苷酸克隆固氮弓菌屬物種EbNl苯乙醇脫氫酶固氮弓菌屬物種EbNl苯乙醇脫氫酶的基因序列已保存在數(shù)據(jù)庫(GenbankID25956124，區(qū)域25073至25822)中。通過已知方法從其合成所述基因的寡核普酸衍生自苯乙醇脫氫酶基因的核酸序列。表l總結(jié)了所述寡核苷酸的DNA序列。圖3表明了各個寡核苷酸相對于整個固氮弓菌屬物種EbNl苯乙醇脫氫酶基因的位置。制備合成基因的方法已描述在例如Y.P.Shi，P.Das,B.Holloway，V.Udhayak腿ar,丄E.Tongren，F(xiàn).CandalS.Biswas,R.Ah腦d，S.E.HasnainandA，A.Lai,Vaccine2000，18，第2902-2914頁中。所得到的序列與發(fā)表的序列相同。將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切核酸酶Ndel和BamHI消化并克隆進已經(jīng)相應(yīng)消化的pDHE19.2載體(DE19848129)中。將連接混合物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌XL1Blue(Stratagene)。將pDHEEbNl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌菌林TG10pAgro4pHSG575(TG10:大腸桿菌TGI的RhaA衍生物(Stratagene);pAgro4:Takeshita，S;Sato,M;Toba，M;Masahashi，W;Hashimoto畫Gotoh，T(1987)Gene61，63-74;pHSG575:T.Tomoyasu等人,(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。將重組的大腸桿菌稱為大腸桿菌LU11558。表l用于制備固氮弓菌屬物種EbNl苯乙醇脫氫酶的合成基因的寡核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>將等摩爾量(各UOng)的引物MKeO387和MKeO388混合。使用PfuTurbo聚合酶(RocheAppliedScience)和以下的溫度梯度程序按照標準Stratagene方案進行PCR:95。C5min;95。C45sec,55。C45see,以及72。Clmin,30循環(huán)；72。C10min.;10。C，直至4吏用。通過瓊脂糖凝膠電泳(1.2o/oE畫Gel，Invitrogen)和柱層才斤(GFX試劑盒，AmershamPharmacia)分離PCR產(chǎn)物(0.75kB)，！^測序(測序引物MKe0387和MKe0388)。所得到的序列與發(fā)表的序列相同。將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切核酸酶Ndel和BamHI消化并克隆進也已經(jīng)相應(yīng)地消化的pDHE19.2栽體(DE19848129)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌XL1Blue(Stratagene)。以此方式獲得的質(zhì)粒pDHEEbNl中的插入為SEQIDNO:l中顯示的核餅列，其中該插入通過對對應(yīng)的克隆測序來揭示。將pDHEEbNl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌菌抹TGIOpAgro4pHSG575(TG10:大腸桿菌TG1的RhaA衍生物(Stratagene);pAgro4:Takeshita，S;Sato,M;Toba，M;Masahashi，W;Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gene61，63-74;pHSG575:T.Tomoyasu等人(2001)，MoLMicrobiol.40(2)，397-413)。將重組的大腸桿菌稱為大腸桿菌LU11558。實施例3:大腸桿菌LU11558重組苯乙醇脫氫酶的提供在37。C下將大腸桿菌LU11558在100ml錐形瓶(擋板)中在20ml的LB-Amp/Spec/Cm(100照/L氨千西林；100pg/L大觀霉素；20pg/L氯霉素)、0.1mMIPTG、0.5g/L鼠李糖中培養(yǎng)18h，以5000*g離心10min，用10mMTRIS*HCl，pH7.0洗滌一次并在2ml相同緩沖液中再懸浮。通過用0.7ml的玻璃珠(d二0.5mm)在振動磨中將大腸桿菌LU11558細胞漿破裂(3x5min,在冰上中間冷卻)來制備無細胞的蛋白粗提取物。實施例4:大腸桿菌LU11558重組脫氫酶活性的測定在每種情況下，將6種轉(zhuǎn)化體在37°C下在100ml錐形瓶(擋板)中在20ml的LBAmp/Spec/Cm(100照/LAmp;100照/LSpec;20照/LCm)、0.1mMIPTG、0.5g/L鼠李糖中培養(yǎng)18h，以5000*g離心10min，用10mMTRIS/HC1，pH7.0洗滌一次并在2ml相同緩沖液中再懸浮。將100ml的細胞懸浮液在搖動下在卯0nl含有50pl/ml葡萄糖DH、100mM葡萄糖、100mMNaCl、1mMNADH、1mMNADPH的50mMMESpH6以及10mM3-氯-l-(漆汾-2-基)丙-l-酮中孵育20分鐘。反應(yīng)混合物以類似于實施例4的方式進行分析。平均而言，產(chǎn)生了0.13mM的3-氯-l-(蓉吩-2-基)丙-1-醇，對應(yīng)于6.6U/L的培養(yǎng)懸浮液活性。在含有已通過用0.7ml的玻璃珠(d-0.5mm)在振動磨中使細胞破裂(3x5miii，在冰上中間冷卻)獲得的粗提取物的類似反應(yīng)混合物中，測量到0.21mM的3-氯-1-(漆吩-2-基)丙-l-醇，對應(yīng)于10.7U/L的活性。在培養(yǎng)過程中沒有添加鼠李糖的對照實驗中，沒有檢測到3-氯-l-(瘞吩-2-基)丙-l-醇。實施例5:分析3誦氯-l-(瘞汾-2-基)丙畫l畫酮和3國氯畫l-(緣喻-2畫基)丙-l畫醇可通過HPLC測定3-氯-l-(嚷哈-2-基)丙-l-酮和3-氯-l-(塞汾-2-基)丙-l-醇的濃度。取決于對固定相和流動相的選擇，除了濃度以外也可測定ee值。a)非手性分析使用以下系統(tǒng)來定量反應(yīng)固定相ChromoltihSpeedRODRP18,50*4，6jnm,Merck(Darmstadt,Germany),力口熱至450C流動相洗脫液A:10mMKH2PO4，pH2.5洗脫液B:乙腈梯度0-0.5min，35%B;0.5-1.0min35至80%B;1.0-1.2min80%B;1.2-1.3min80%-35%B;1.3-2.0min35%B;流速1.5ml/min檢測230和260nm的UV檢測4亭留時間3-氯-l-(瘼汾-2-基)丙-l-酮約1.6min3-氯-l-(嘍汾-2-基)丙-l-醇約1.3min使用可靠材料生成校正系列，基于此可確定未知樣品的濃度。b)手性分析固定沖目ChiracelOD-H，250*4，6pm，Daicel，力口熱至40oC流動相洗脫液A:正己烷洗脫液B:異丙醇無梯度，2.5%B流速1.0ml/min檢測230和260nm的UV檢測停留時間3-氯-l-(塞吩-2-基)丙-l-酮約9.5min(lS)-3畫氯曙l-(蓉汾-2國基)丙畫l-醇約16.6min(1R)-3-氯-l-(噢汾-2-基)丙-l-醇約18.3min使用可靠材料生成校正系列，基于此可確定未知樣品的濃度。實施例6:大腸桿菌LU11558重組脫氫酶活性的測定在每種情況下，將6種大腸桿菌LU11558轉(zhuǎn)化體在37°C下在100ml錐形瓶(擋板)中在20ml的LBAmp/Spec/Cm(100fig/LAmp;50jig/LSpec;10照/LCm)、0.1mMIPTG、0.5g/L鼠李糖中培養(yǎng)18h，以5000*g離心10min,用10mMTRIS/HC1，pH7.0洗滌一次并在2ml相同緩沖液中再懸浮。將100ml的細胞懸浮液在搖動下在卯0pl含有50pl/ml葡萄糖DH、100mM葡萄糖、100mMNaCl、1mMNADH、1mMNADPH的50mMMESpH6以及10mM3-氯-l-(噢汾-2-基)丙-l-酮中孵育20分鐘。反應(yīng)混合物以類似于實施例4的方式進行分析。平均而言，產(chǎn)生了0.13mM的3-氯-l-(噻吩-2-基)丙-l-醇，對應(yīng)于6.6U/L的培養(yǎng)懸浮液活性。在含有已通過用0.7ml的玻璃珠(d-0.5mm)在振動磨中使細胞破裂(3x5min,在水上中間冷卻)獲得的粗提取物的類似反應(yīng)混合物中，測量到0.21mM的3-氯-l-(噻吩-2-基)丙-l-醇，對應(yīng)于10.7U/L的活性。在培養(yǎng)過程中沒有添加鼠李糖的對照實驗中，沒有檢測到3-氯-1-(漆吩-2-基)丙-1-醇。實施例7:使用重組固氮弓菌屬物種EbNl脫氫酶以及2-戊醇制備(S)-3-氯-1畫(逸吩-2-基)丙畫1國醇在0.75L反應(yīng)器中，在250rpm和40。C下將大腸桿菌LU11558靜息細胞(1畫20g/L生物量)與0.2mMNAD+和185mM3畫氯-1畫(遂汾-2誦基)丙-1-酮(12.5ml)在221ml的50mMKH2P04和250ml的2-戊醇中攪拌。通過用5MNaOH滴定將反應(yīng)保持在pH5.5。通過HPLC分析監(jiān)測反應(yīng)，直至在有枳4目中TACA濃度為50-350mM。實施例8:使用重組固氮弓菌屬物種EbNl脫氫酶以及2-戊醇制備(S)-3-氯誦1匿(瘞汾畫2-基)丙畫1隱醇在4L反應(yīng)器中，在250rpm和40°C下將大腸桿菌LU11558靜息細胞(1-20g/L生物量)與0.2mMNAD+和370mM3-氯-l-(蓉汾-2-基)丙-l-酮(200ml)在1432ml的50mMKH2P04和2000ml的2-戊醇中攪拌。通過用5MNaOH滴定將反應(yīng)保持在pH5.5。通過HPLC分析監(jiān)測反應(yīng)，直至在有W目中TACA濃度為100-650mM。實施例9:使用重組固氮弓菌屬物種EbNl脫氫酶以及2-戊醇制備(S)-3-氯-1國(漆汾-2-基)丙-1-醇在4L反應(yīng)器中，在250rpm和40。C下將大腸桿菌LU11558靜息細胞(1畫20g/L生物量)與0.2mMNAD+和370mM3畫氯-l畫(遙吩-2-基)丙國l-酮(200ml)在1432ml的50mM10^04和2000ml的2-戊醇中攪拌。通過用5MNaOH滴定將反應(yīng)保持在pH5.5。應(yīng)用約85毫巴的真空和50-70°C的夾套溫度。在反應(yīng)過程中連續(xù)地再引入以2-10ml/min的蒸餾速率獲得的水和2-戊醇蒸餾物量。通過HPLC分析監(jiān)測反應(yīng)，直至在有機相中TACA濃度為300-700mM。除了0-30%的剩余部分外，3-氯-1-(蓉吩-2-基)丙-1-酮反應(yīng)。實施例10:使用重組固氮弓菌屬物種EbNl脫氬酶以及2-戊醇制備(S)-3-氯-l-(噻汾-2-基)丙-l-醇在0.75L反應(yīng)器中，在250rpm和40。C下將大腸桿菌LU11558靜息細胞(1-20g/L生物量)與0.2mMNAD+和200mM3-氯-1-(瘞吩-2-基)丙-1-酮(12.5ml)在221ml的50mM10^04和250ml的2-戊醇中攪拌。通過用5MNaOH滴定將反應(yīng)保持在pH5.5。通過HPLC分析監(jiān)測反應(yīng)，直至在有機相中TACA濃度為50-320mM。權(quán)利要求1.一種制備式I的旋光烷醇的方法其中n為0至5的整數(shù)；A為任選取代的支化或未支化的C1-C6烷基或“Cyc”基團，Cyc為任選取代的單或多環(huán)的、飽和或不飽和的碳環(huán)或雜環(huán)，以及R1為鹵素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4彼此獨立地為氫或低級烷基或低級烷氧基，且X-為抗衡離子，所述方法包括在包含式II的烷酮的介質(zhì)中其中n、A和R1如上所定義，使選自脫氫酶、醛還原酶和羰基還原酶類的酶在還原等價物存在下孵育，其中式II的化合物酶催還原得到式I的化合物，并且在反應(yīng)中消耗的還原等價物通過借助酶(E)使供體醇反應(yīng)獲得對應(yīng)的供體酮而再生，并且所述供體酮從反應(yīng)介質(zhì)中至少部分地移除，以及分離所形成的產(chǎn)物(I)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述酶(E)為醇脫氫酶。3.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述酶(E)具有多肽序列(i)SEQIDNO:2或(ii)與SEQIDNO:2相比，其中至多25。/。的氬基酸殘基已通過缺失、插入、取代或其組合而改變，并且其保留了SEQIDNO:2酶活性的至少50%。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于制備式III的l-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(iii)6h其中！^-Cl或NHCH3，其中，在包含式IV的l-(2-噻吩基)丙酮的衍生物的介質(zhì)中:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>將該化合物酶催還原得到式III的化合物，并且分離所形成的基本上對映體純的產(chǎn)物。5.才艮據(jù)前述;f又利要求中任一項的方法，其中所述酶選自固氮弓菌屬的微生物的酶。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述酶由根據(jù)SEQIDNO:l的核酸序列或其功能等價物編碼。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所使用的供體醇為2-戊醇。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在反應(yīng)過程中從供體醇形成的供體酮通過蒸餾從所述反應(yīng)介質(zhì)中至少部分地移除。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述供體酮在反應(yīng)過程中通過蒸餾從酶反應(yīng)器中移除。10.根據(jù)前述4又利要求中任一項的方法，其中所迷式II的化合物在選自腸桿菌科、假單胞菌科、根瘤菌科、乳桿菌科、鏈霉菌科、紅球菌科和諾卡氏菌科細菌的微生物存在下反應(yīng)。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述微生物為已用編碼根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的定義的酶的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的重組微生物。12.具有如下多肽序列的酶(E)在制備式I或III的化合物中的用途iSEQIDNO:2或ii與SEQIDNO:2相比，其中至多25。/。的氨基酸殘基已通過缺失、插入、取代或其組合而改變，并且其保留了SEQIDNO:2酶活性的至少50%。13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，用于制備度洛西汀的方法中。全文摘要本發(fā)明涉及通過酶催還原對應(yīng)的酮來制備式(I)的旋光烷醇的方法，尤其是制備(1S)-3-甲基氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇和(1S)-3-氯-1-(2-噻吩基)丙-1-醇的方法。文檔編號C12P17/00GK101171339SQ200680015588公開日2008年4月30日申請日期2006年3月3日優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日發(fā)明者B·阿哈特茨,J·道韋爾,M·凱塞勒,M·布羅伊爾,R·施蒂默爾申請人:巴斯福股份公司