專利名稱：：生物合成途徑的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及載體或構(gòu)建體的構(gòu)建及用途，所述載體或構(gòu)建體適用于取得對分別編碼有機(jī)體代謝途徑中的兩種或更多種酶的兩種或更多種基因的化學(xué)誘導(dǎo)，以提高重要多酶途徑的所需產(chǎn)物的產(chǎn)量。具體地說，本發(fā)明公開了對這樣的載體或構(gòu)建體的構(gòu)建，所述載體或構(gòu)建體用于植物的聚羥鏈烷酸酯生物合成途徑中的兩種或更多種酶的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明還描述了使用這些載體或構(gòu)建體的植物的生產(chǎn)，以及多酶途徑的所需產(chǎn)物的產(chǎn)量的提高。
背景技術(shù)：
：植物作物是用于生產(chǎn)一系列代謝產(chǎn)物(包括改性的植物油、聚羥鏈烷酸酯、氨基酸、改性的木質(zhì)素、改性的淀粉和營養(yǎng)產(chǎn)物)的所需宿主。通常，這些新產(chǎn)物的產(chǎn)生需要編碼兩種或更多種具有酶活性的多肽的兩種或更多種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。所需要的是，能夠使兩種或更多種轉(zhuǎn)基因在植物發(fā)育周期的一定時(shí)間點(diǎn)上表達(dá)，以便使所需產(chǎn)物的形成達(dá)到最多。在其它情況下，所需要的是，能夠開啟代謝途徑的表達(dá)過程，以減輕由多肽或代謝途徑的產(chǎn)物對植物生長或產(chǎn)量所造成的不利影響。其中可以在綠色植物中經(jīng)濟(jì)且持續(xù)地制備生物塑料的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的發(fā)展不僅有可能顯著地降低生物塑料的成本，而且有可能隔絕co2。聚羥鏈烷酸酯(PHA)是一類可在植物中制備的可生物降解的生物聚合物。植物中PHA產(chǎn)量的所需商業(yè)目標(biāo)是7.5干重(dwt)%至15干重％(參見文獻(xiàn)Y.PoirierandKJ.Grays,in5z'o;o(ye"e^,Y.Doi，A.SteinbuchelEds.(Wiley-VCH，Weinheim;2002),pp.401-435)。迄今為止，已經(jīng)在以下植物種類中成功地生產(chǎn)了PHB，所述植物種類為擬南芥(JraZn'(io戸'"/2"/z'a"a)、甘藍(lán)型油菜(Sra^/ca""戸s)禾口玉蜀黍(Zecrm甲)(參見文獻(xiàn)C.Nawrath"a/,TVoc.TVa".Jccrd.iSW.園91，12760(1994);K.Bohmert"a/,Planta211，841(2000);K丄.Ho腿iei，"a/,尸/awto209,547(1999);Y.PoirierandKJ.Grays,in_5一0/戸&"，Y.Doi,A.SteinbuchelEds.(Wiley-VCH,Weinheim;2002),pp.401-435)。然而，產(chǎn)生超過3dwt%PHB的植物經(jīng)常發(fā)展成萎黃病表現(xiàn)型，和/或不能獲得如普通該植物的大小(參見文獻(xiàn)Bohmert，K.etal.，inA/o/gcw/flr丑/o/ogvfl"<iB/o"c/mo/ogvo/"尸/aw/(9r卯we〃es.H.Daniell,C.D.ChaseEds.(KluwerAcademicPublishers,Netherlands;2004，pp.559-585)。這些因素導(dǎo)致聚合物的總產(chǎn)量較低，并且代表了以植物為基礎(chǔ)來生產(chǎn)PHA的一個(gè)主要障礙。對使用誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控PHB途徑中的單個(gè)基因的表達(dá)來克服總產(chǎn)量較低的問題的嘗試使得基因滲漏所產(chǎn)生的聚合物(leakypolymer)在未經(jīng)誘導(dǎo)的植物中的產(chǎn)量是高的，從而使得經(jīng)誘導(dǎo)的植物仍是矮化的(參見文獻(xiàn)Bohmertet.al.尸/a^尸/z"Zo/.128(4):1282-90,(2002))。因此，本發(fā)明的目的是提供用于對編碼植物作物代謝途徑中的兩種或更多種酶活性物的兩種或更多種基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的載體或構(gòu)建體。本發(fā)明的目的還在于使用這些載體或構(gòu)建體對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以及在抑制與多種途徑中轉(zhuǎn)基因編碼酶(例如可以導(dǎo)致所需產(chǎn)物的形成增多的那些)的組成型表達(dá)有關(guān)的有害效果的同時(shí)，誘導(dǎo)編碼兩種或更多種酶活性物的兩種或更多種轉(zhuǎn)基因的同步表達(dá)，其中所述的兩種或更多種酶活性物是在宿主植物中有效形成所需產(chǎn)物(例如生物聚合物、新型油、改性的木質(zhì)素、改性的淀粉或營養(yǎng)物)所必須的。本發(fā)明的目的還在于通過對葉或根施加化學(xué)誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)所述的這些基因，從而使所述基因表達(dá)，并通過合適的代謝途徑來引導(dǎo)代謝中間產(chǎn)物的循環(huán)，以提高該途徑的產(chǎn)物的產(chǎn)量。本發(fā)明的目的還在于提供化學(xué)誘導(dǎo)劑的應(yīng)用方法，該應(yīng)用方法是通過在植物生長周期過程中在最適的時(shí)間對葉或根施加化學(xué)誘導(dǎo)劑，來提高所需產(chǎn)物的產(chǎn)量，并獲得植物材料和回收所關(guān)注的產(chǎn)物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于引入多酶生物合成途徑中的多基因編碼的酶的方法和構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含兩種或更多種酶的編碼基因，各個(gè)基因都處于誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下，并且各個(gè)基因都具有聚腺苷酸化信號。所述構(gòu)建體用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，在該轉(zhuǎn)基因植物中，當(dāng)施加化學(xué)誘導(dǎo)劑時(shí)，所述酶的表達(dá)增強(qiáng)，并產(chǎn)生了由所述轉(zhuǎn)基因所編碼的多酶生物合成途徑的生物合成產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法使用了這樣的構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含兩個(gè)或更多個(gè)在一個(gè)或更多個(gè)啟動子調(diào)控之下的酶編碼基因，其中所述啟動子是由一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因所表達(dá)出的激活蛋白分子或復(fù)合物所活化的，而所述的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因本身是處于一個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下的并且在隨后進(jìn)行的外部施加化學(xué)制劑過程中被開啟。表達(dá)激活蛋白分子或復(fù)合物的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因可以被包含在含有編碼多酶生物合成途徑中的酶的多個(gè)基因的同一構(gòu)建體中?？晒┻x擇的其它方式是，表達(dá)激活蛋白分子或復(fù)合物的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因可以在不同于含有編碼多酶生物合成途徑中的酶的多個(gè)基因的構(gòu)建體的構(gòu)建體上?？梢允褂锰幱诜腔钚孕问降慕M成型啟動子來表達(dá)激活蛋白分子，其中所述的組成型啟動子是在施加化學(xué)誘導(dǎo)劑之后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问降?。生物合成途徑可以形成許多產(chǎn)物，包括生物聚合物，例如聚羥鏈垸酸酯(PHA)、含脂肪酸的植物油和營養(yǎng)化合物。其它生物合成途徑包括涉及下列過程的途徑三羧酸("TCA")循環(huán)；聚酮化合物合成途徑；類胡羅卜素合成；糖酵解；糖異生；淀粉合成；木質(zhì)素及相關(guān)化合物的合成；起到殺蟲劑、殺真菌劑或抗生素作用的小分子的生成。使用誘導(dǎo)型啟動子來以同步的方式活化編碼生物合成途徑中的基因的轉(zhuǎn)錄使得代謝中間產(chǎn)物在終產(chǎn)物累積的最佳時(shí)間點(diǎn)上形成所需的終產(chǎn)物。附圖簡要說明圖1示出了PHB生物合成途徑。在該途徑中，乙酰輔酶A由(3-酮硫解酶轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A。乙酰乙酰輔酶A還原酶將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為(3-羥丁酰-輔酶A。PHA合成酶將(3-羥丁酰-輔酶A轉(zhuǎn)化為PHB。圖1示出了這樣的植物表達(dá)載體，在該表達(dá)載體中PHB生物合成途徑的全部三個(gè)基因都置于誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下。這些基因的側(cè)翼為3'UTR。所述載體還包含處于以3'UTR作為側(cè)翼的組成型啟動子的調(diào)控之下的效應(yīng)器。該多基因載體還包含處于組成型啟動子的調(diào)控之下的、以3'UTR作為側(cè)翼的選擇性標(biāo)記。圖2示出了通過脂肪酸降解(也稱為為脂肪酸的P-氧化)途徑生成較短鏈長和中等鏈長的PHA的路徑。啟動通過脂肪酸降解來合成PHA的活性物可以選自以下物質(zhì)?；o酶A脫氫酶(反應(yīng)la)、?；o酶A氧化酶(反應(yīng)lb)、過氧化氫酶(反應(yīng)2)、(3-氧化中的a亞基(反應(yīng)3、4和5)、P-氧化中的卩亞基(反應(yīng)6)、具有中等鏈長底物特異性的PHA合成酶(反應(yīng)7)、(3-酮硫解酶(反應(yīng)8)、NADH或NADPH依賴性還原酶(反應(yīng)9)、具有較短鏈長特異性的PHA合成酶(反應(yīng)10)和可以結(jié)合較短鏈長的底物和中等鏈長的底物的反應(yīng)的PHA合成酶(反應(yīng)11)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化合適的基因構(gòu)建體在宿主植物中產(chǎn)生所選擇的活性物。圖3是通過脂肪酸生物合成來生成中等鏈長PHA的途徑的示意圖。啟動通過脂肪酸生物合成來合成PHA的活性物可以選自以下物質(zhì)3-羥?；??；d體蛋白質(zhì)-輔酶A轉(zhuǎn)移酶(反應(yīng)1)、硫酯酶(反應(yīng)2)、酰基輔酶A合成酶(反應(yīng)3)、輔酶A轉(zhuǎn)移酶(反應(yīng)4)、中等鏈長合成酶(反應(yīng)5)、(3-酮硫解酶(反應(yīng)6)、NADH或NADPH依賴性還原酶(反應(yīng)7)和可以結(jié)合較短鏈長的底物和中等鏈長的底物的反應(yīng)的PHA合成酶(反應(yīng)8)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化合適的基因構(gòu)建體在宿主植物中產(chǎn)生所選擇的活性物。圖4是用于生成含有高級月桂酸酯的油料種子的示意性途徑。促使油料中月桂酸酯的含量提高的活性物選自以下物質(zhì)12:0-酰基-載體蛋白質(zhì)硫酯酶(反應(yīng)l)和優(yōu)選12:0-輔酶A的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(反應(yīng)2)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化合適的基因構(gòu)建體在宿主植物中產(chǎn)生所選擇的活性物。圖5示出了植物中生成超長鏈的多不飽和脂肪酸的途徑。啟動植物中所述脂肪酸合成的活性物選自以下物質(zhì)A、延長酶(反應(yīng)1)、厶8-去飽和酶(反應(yīng)2)、/^-延長酶(反應(yīng)3)、A、去飽和酶(反應(yīng)4)和A^延長酶(反應(yīng)5)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化合適的基因構(gòu)建體在宿主植物中產(chǎn)生所選擇的活性物。圖6是在轉(zhuǎn)基因植物中生成P-胡羅卜素(前維生素A)的示意性途徑。啟動由內(nèi)源性植物中間產(chǎn)物二磷酸忙牛兒基忙牛兒酯來生成P-胡羅卜素的活性物可以選自以下物質(zhì)八氫番茄紅素合成酶(反應(yīng)1)、能夠?qū)藲浞鸭t素轉(zhuǎn)化為番茄紅素的胡羅卜素去飽和酶(反應(yīng)2)、八氫番茄紅素不飽和酶(反應(yīng)3)、C-胡羅卜素去飽和酶(反應(yīng)4)和番茄紅素p-環(huán)化酶(反應(yīng)5)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化合適的基因構(gòu)建體在宿主植物中產(chǎn)生所選擇的活性物。圖7示出了在使第三代(T3)31植物的根經(jīng)過濃度增加的Mimic和Intrepid^的浸漬或?qū)ζ淙~施加濃度增加的1^111^@和Intrepicf之后的PHB產(chǎn)率。圖中還示出了4個(gè)樣品的平均誤差和標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖(a)表示使用不同濃度的Mimic^浸漬根部的T331植物中的PHB的產(chǎn)率。圖(b)表示使用不同濃度的1:^叩1(1@浸漬根部的T331植物中的PHB的產(chǎn)率。圖(c)表示對其葉施加Intrepic^的T331植物中的PHB的產(chǎn)率。發(fā)明詳述用于轉(zhuǎn)化多基因的構(gòu)建體所述構(gòu)建體可以包含兩個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)型啟動子、來自兩個(gè)或更多個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因的編碼區(qū)和兩個(gè)或更多個(gè)聚腺苷酸化信號?？晒┻x用的其它方式是，所述構(gòu)建體可以包含一個(gè)或更多個(gè)由激活蛋白分子或部分激活蛋白分子所活化的啟動子、來自編碼蛋白質(zhì)的多基因的編碼區(qū)和一個(gè)或更多個(gè)聚腺苷酸化信號。這些構(gòu)建體可以與包含一個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)型啟動子、來自一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或部分激活蛋白分子的基因的編碼區(qū)以及一個(gè)或更多個(gè)聚腺苷酸化信號的構(gòu)建體聯(lián)合使用。所述構(gòu)建體還可以包含編碼引導(dǎo)肽的序列，例如編碼質(zhì)粒引導(dǎo)肽的序列、編碼線粒體引導(dǎo)肽的序列、編碼過氧化物酶引導(dǎo)肽的序列或者編碼組織特異性肽的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述生物合成途徑中的核酸序列置于多個(gè)誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控之下的構(gòu)建體優(yōu)選包含兩個(gè)或更多個(gè)在5'至3'方向上可操作地連接的元件，其中每個(gè)元件都包含引導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子、編碼蛋白質(zhì)的核酸序列和3'聚腺苷酸化信號序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述生物合成途徑中的核酸序列置于多個(gè)誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控之下的構(gòu)建體優(yōu)選包含第一元件、第二元件和第三元件，其中所述第一元件在5'至3'方向上可操作地連接有引導(dǎo)編碼聚羥鏈烷酸酯合成酶蛋白質(zhì)的第一核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的第一誘導(dǎo)型啟動子、編碼聚羥鏈垸酸酯合成酶蛋白質(zhì)的第一核酸序列和第一3'聚腺苷酸化信號序列；所述第二元件在5'至3'方向上可操作地連接有.-引導(dǎo)編碼乙酰乙酰輔酶A還原酶蛋白質(zhì)的第二核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的第二誘導(dǎo)型啟動子、編碼乙酰乙酰輔酶A還原酶蛋白質(zhì)的第二核酸序列和第二3'聚腺苷酸化信號序列；所述第三元件在5'至3'方向上可操作地連接有引導(dǎo)編碼P-酮硫解酶蛋白質(zhì)的第三核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的第三誘導(dǎo)型啟動子、編碼p-酮硫解酶蛋白質(zhì)的第三核酸序列、第三3'聚腺苷酸化信號序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有表達(dá)生物合成途徑中多個(gè)酶的基因的構(gòu)建體在5'至3'方向上可操作地連接有啟動子，其由激活蛋白分子或者復(fù)合物所活化并引導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；兩個(gè)或更多個(gè)編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列?？晒┻x用的其它方式是，所述構(gòu)建體可以在5'至3'方向上可操作地連接有兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中每個(gè)元件都包含啟動子，其由激活蛋白分子或者復(fù)合物所活化并引導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。所述的這些構(gòu)建體可以與在5'至3'方向上可操作地連接有以下部分的構(gòu)建體聯(lián)合使用，所述部分為誘導(dǎo)型啟動子，其引導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列?？晒┻x用的其它方式是，所述構(gòu)建體可以在5'至3'方向上可操作地連接有兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中每個(gè)元件都包含誘導(dǎo)型啟動子，其引導(dǎo)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)元件在5'至3'方向上可操作地連接有引導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子、一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列、以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少一個(gè)元件在5'至3'方向上可操作地連接有引導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的且由激活蛋白分子或者復(fù)合物所活化的啟動子、兩個(gè)或更多個(gè)分別編碼蛋白質(zhì)的核酸序列以及3'聚腺苷酸化信號序列。可供選用的其它方式是，所述構(gòu)建體包含三個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)元件在5'至3'方向上可操作地連接有引導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子、一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少兩個(gè)元件分別在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或者復(fù)合物活化的引導(dǎo)核酸序列迸行轉(zhuǎn)錄的啟動子、編碼蛋白質(zhì)的核酸序列以及3'聚腺苷酸化信號序列。可以通過使用上述構(gòu)建體對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化并使用任意的種類數(shù)量的試劑(下文將詳細(xì)說明)活化誘導(dǎo)型啟動子，來在植物中制備生物合成產(chǎn)物?？梢允褂枚喾N方法(包括葉面噴撒和根部浸漬)將化學(xué)試劑施加于植物上。A.誘導(dǎo)型啟動子和基因表達(dá)的調(diào)控誘導(dǎo)型啟動子體系要求所關(guān)注的基因及效應(yīng)器盒(effectorcassette)能夠表達(dá)。所關(guān)注的基因被放置在誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下。所述的效應(yīng)器盒由編碼負(fù)責(zé)調(diào)控誘導(dǎo)型啟動子的蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成，其中所編碼的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白或轉(zhuǎn)錄激活蛋白，并且其通常是在組成型強(qiáng)啟動子的調(diào)控之下被表達(dá)出來的(參見文獻(xiàn)C.GatzandI.Lenk，7Ve"^尸/fl^Sc/3:352(1998))。許多用于在細(xì)菌、酵母菌、植物或者哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子是已知的，并且是可得到的。當(dāng)多個(gè)基因被插入到合適的轉(zhuǎn)化載體(許多都是市售可得的)中時(shí)，可以將啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列加入到構(gòu)建體中。例如，有許多植物轉(zhuǎn)化載體可供選擇(參見文獻(xiàn)GeneTransfertoPlants(1995),Potrykus,I.andSpangenberg,G.eds.Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork;"TransgenicPlants:AProductionSystemforIndustrialandPharmaceuticalProteins"(1996),Owen,M.R.L.andPen,J.eds.JohnWiley&SonsLtd.EnglandandMethodsinPlantMolecularbiology-alaboratorycoursemanual(1995),Maliga,P.,Klessig,D.F.,Cashmore,A.R.,Gruissem,W.andVarner,J.E.eds.ColdSpringLaboratoryPress,NewYork)。通常，植物轉(zhuǎn)化載體包含一個(gè)或更多個(gè)處于5'和3'調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下的所關(guān)注的編碼序列，該5'和3'調(diào)節(jié)序列包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子和/或聚腺苷酸化信號以及選擇性或可篩選的標(biāo)記基因。通常需要的5'調(diào)節(jié)序列包括啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA加工信號。在植物中成功使用的誘導(dǎo)型啟動子體系已經(jīng)被廣泛綜述(參見文獻(xiàn)M.Padidam，C群.<9—.尸/W腸/.6,169(2003);R.Wang"a/,TV應(yīng).h.12,529(2003);C.GatzandI.Lenk,7Ve涵尸/挺M3,352(1998))。這些誘導(dǎo)體系可以被化學(xué)制劑等活化，例如四環(huán)素、原始霉素(Pristamycin)、病原體、光、糖皮質(zhì)激素、雌激素、銅、除草劑安全劑、乙醇、IPTG(異丙基-卩-D-l-硫代半乳糖苷)和多種病原體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述啟動子是由蛻皮激素和蛻皮激素類似物活化的。蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子包含蛻皮激素配體結(jié)合域(例如文獻(xiàn)/fe/z.otoWwc面Martinezetal.,1999a中所述)，該蛻皮激素配體結(jié)合域與DNA結(jié)合域(例如源自另一種受體(如糖皮質(zhì)激素受體)的結(jié)合域)和反式活化域(例如VP16反式活化域)結(jié)合。活化蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子的試劑包括蛻皮激素、非類固醇類蛻皮激素類似物(例如雙酰肼分子雙苯酰肼(市售殺蟲劑Mimi^的活性成分)、甲氧蟲酰肼(市售殺蟲劑Intrepid的活性成分))、植物蛻皮類固醇(例如幕黎甾酮A和松甾酮A)、以及昆蟲類固醇激素20-羥基蛻皮激素(參見文獻(xiàn)Lafont,L.&Di纖，L.丄/臟"5W匿e3:7-95(2003))。還可以使用在被光活化前實(shí)際上是無活性的籠蔽P-蛻皮激素(參見文獻(xiàn)Linetal.C/zemz.Wo;&歷0/0g79:1347-1353(2002))。蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)成功地用于植物中，所述植物例如有轉(zhuǎn)基因煙草(參見文獻(xiàn)Martinez"a/,尸/a"Y丄19:97-106(1999))、玉米懸浮細(xì)胞(參見文獻(xiàn)Martinez"a/,A/o/.Ge".Ge"e,.261:546-552(1999))、轉(zhuǎn)基因玉米(參見文獻(xiàn)UngerWTVow.11:455-465(2002))和轉(zhuǎn)基因擬南芥(參見文獻(xiàn)PadidamWa/,C訂reWOp/mon/7a"fSZo/.6:169-177(2003);Koo"a/，尸/a^丄37:439-448(2004"。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子包含糖皮質(zhì)激素配體和DNA結(jié)合域(例如源自人糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合域)。誘導(dǎo)劑包括類固醇化合物，例如地塞米松、氫化可的松和強(qiáng)的松。這些啟動子己經(jīng)成功地用于植物中，所述植物例如有轉(zhuǎn)基因煙草(參見文獻(xiàn)AoyamaandChua，尸/anfJ.11:605-612(1997);Bohner"a/,尸/a"fJ.19:87-95(1999);Gremilone/"/,尸/""/汄37:218-228(2004));煙草懸浮細(xì)胞(參見文獻(xiàn)Schena"a/，尸亂淑/.Jcat/.園88:10421-10425(1991))、轉(zhuǎn)基因擬南芥(參見文獻(xiàn)Lloyd"a/,Sc/ewce266:436-439(1994))、轉(zhuǎn)基因水稻(O而erkerkeM/,尸/朋to213:370-378(2001))、轉(zhuǎn)基因煙草(vV7co"a"a6eW/zam/a/7a)(參見文獻(xiàn)Mori"a/,尸/a"fJ.27:79-86(2001))以及弗吉尼亞松樹(Virginiapine)細(xì)胞培養(yǎng)物(參見文獻(xiàn)TangandNewton,Bo一55:1499-1508(2004))。雌激素誘導(dǎo)型啟動子包含雌激素受體(通常為人雌激素受體)的配體結(jié)合域。誘導(dǎo)劑包括P-雌二醇。雌激素誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)成功地用于植物中，所述植物例如有轉(zhuǎn)基因擬南芥(參見文獻(xiàn)ZUOWa/，尸/a"fJ.24:265-273(2000))、轉(zhuǎn)基因煙草(參見文獻(xiàn):Zuo"a/，尸/虛J.24:265-273(2000))、轉(zhuǎn)基因煙草(參見文獻(xiàn)Guo"a/，尸W丄34:383-392(2003))和玉米懸浮細(xì)胞(參見文獻(xiàn)Bruce"a/,尸/a"fCW/17:65-79(2000))。乙醇誘導(dǎo)型啟動子是基于溝巢曲霉(j印erg〃/w"/Jw/aw)的a/e調(diào)節(jié)子的。乙醇誘導(dǎo)型啟動子己經(jīng)成功地用于植物中，所述植物例如有轉(zhuǎn)基因煙草(參見文獻(xiàn)Caddick"a/,tV"/訓(xùn)W她c/mo/.16:177-180(1998)、Sweetman"a/，尸/a"〖i5—'o/.129:943-948(2002))、轉(zhuǎn)基因馬,令墓(參見文獻(xiàn)Sweetmanefa/,尸/anf尸/^Wo/.129:943-948(2002))、轉(zhuǎn)基因油料種子油菜(參見文獻(xiàn)SweetmanWa/，P/aW尸/z;Ayz》/.129:943-948(2002))、轉(zhuǎn)基因擬南芥(參見文獻(xiàn)RoslanWa/,28:225-235(2001))。除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子可以包括玉米"2-2啟動子。典型的誘導(dǎo)劑包括除草劑安全劑，例如苯磺酰胺和磺酰脲除草劑氯磺隆。除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)成功地用于植物中(參見文獻(xiàn)DeVeylderWa/,P/"WCe〃尸/z"z'o/.38:568-577(1997))。銅誘導(dǎo)型啟動子是基于調(diào)節(jié)釀酒酵母(^cc/^romjc^v/w'a)中銅解毒基因的表達(dá)的調(diào)控元件的。典型的誘導(dǎo)劑是硫酸銅(CuS04)。銅誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)成功地用于植物中，所述植物例如有轉(zhuǎn)基因煙草(參見文獻(xiàn)Mett"a/，iVfl".Jc"J.USA90:4567-4571(1993))。四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子可以由大腸桿菌(五.co//)中的抗四環(huán)素操縱子元件構(gòu)成。此類啟動子可以被用作激活蛋白或阻抑蛋白，并且可以與其它誘導(dǎo)體系聯(lián)合使用，以進(jìn)行雙重調(diào)控。例如，誘導(dǎo)型阻抑蛋白體系可以與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)體系相結(jié)合，以獲得密切調(diào)控的開啟/關(guān)閉轉(zhuǎn)換(參見文獻(xiàn):Bohner"a/，P/a"f丄19:87-95(1999))。四環(huán)素應(yīng)答型啟動子/四環(huán)素調(diào)控型反式激活蛋白(tTA)體系是現(xiàn)有技術(shù)公知的(參見文獻(xiàn)GossenMandBujardH,/VocA^"爿c^/Sc/f/SJ89:5547-5551(1992);Adamsefa/，Afo/.尸/7^rmaco/.55(6):1028-1036(1999))。四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)成功地用于物中，所述植物例如有轉(zhuǎn)基因煙草(參見文獻(xiàn):Bohner"a/,/Vfl^汄19:87-95(1999))和煙草原生質(zhì)體(參見文獻(xiàn)GatzandQuail,Proc.Waf/.JcadSc/.fASJ85:1394-1397(1988))。原始霉素誘導(dǎo)型啟動子是基于由PIP蛋白質(zhì)(天藍(lán)色鏈霉菌。的原始霉素操縱子的阻抑蛋白)構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(PIT)。誘導(dǎo)劑包括鏈陽菌素抗生素原始霉素。原始霉素誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)成功地用于植物中，所述植物例如有煙草懸浮細(xì)胞(參見文獻(xiàn)Frey"肌Wec/z"o/.t&S/oe"g/wee"'"g74:154-163(2001))。病原體誘導(dǎo)型啟動子可以包括來自馬鈴薯的/Vp/-a啟動子。誘導(dǎo)劑包括病原體攻擊，但是所述啟動子響應(yīng)諸如苯并噻二唑(BTH)和水楊酸之類的化學(xué)制劑。病原體誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)成功地用于植物中，所述植物例如有擬南芥和煙草(參見文獻(xiàn)Bohmert"尸/a^尸—.o/.128:1282-1290(2002》。異丙基-卩-D-l-硫代半乳糖苷(IPIG)是大腸桿菌/"c阻抑蛋白的合成型非水解誘導(dǎo)物。研究已經(jīng)表明，IPTG可用于細(xì)胞中誘導(dǎo)由lac阻抑蛋白/操縱子體系調(diào)控的宿主細(xì)胞基因的表達(dá)(參見文獻(xiàn)Wilde"a/，￡細(xì)0/.11，1251-1259(1992);Itzhaki"cz/.淑15:258-265(1997))。可以通過提高誘導(dǎo)劑的效率(通過增強(qiáng)誘導(dǎo)劑的穩(wěn)定性和/或吸收，或者通過增強(qiáng)誘導(dǎo)劑對誘導(dǎo)型啟動子的配體結(jié)合域的親和性)使對所述啟動子的誘導(dǎo)達(dá)到最優(yōu)。對誘導(dǎo)劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾和/或調(diào)配含誘導(dǎo)劑的溶液可以達(dá)到所述的目的。可以通過基因改組技術(shù)來改善配體和/或DNA結(jié)合域和/或通過最低限度的啟動子來提高體系的誘導(dǎo)性從而使誘導(dǎo)型啟動子達(dá)到最優(yōu)。可以選擇植物啟動子以調(diào)控在不同植物組織或細(xì)胞器中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，對于所有不同植物組織和細(xì)胞器而言，所用的選擇方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的(參見文獻(xiàn)Gasser&Fraley，Science244:1293-99(1989))。轉(zhuǎn)基因的5'端可以被改造成包含編碼質(zhì)?；蚱渌鼇喖?xì)胞細(xì)胞器的引導(dǎo)肽的序列，例如與所述轉(zhuǎn)基因閱讀框相連的質(zhì)粒引導(dǎo)信號。B.生物合成途徑中的酶本發(fā)明提供了用于引入多個(gè)編碼多酶生物合成途徑中的酶的基因的方法和構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含引發(fā)多個(gè)基因序列進(jìn)行表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動子，其中每個(gè)基因序列都編碼生物合成途徑中的不同的蛋白質(zhì)。所述構(gòu)建體還包含效應(yīng)器盒，該效應(yīng)器盒由編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成。此類基因具有聚腺苷酸化信號，并通常被置于組成型強(qiáng)啟動子或組織特異性啟動子的調(diào)控之下。所述構(gòu)建體包含兩個(gè)或更多個(gè)(例如2-12個(gè)、優(yōu)選為2-8個(gè)、更優(yōu)選為2-7個(gè))酶編碼基因，每個(gè)酶編碼基因都處于誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下并都具有聚腺苷酸化信號，并且所述的構(gòu)建體可用于生產(chǎn)這樣的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，在該轉(zhuǎn)基因有機(jī)體中，當(dāng)施加化學(xué)誘導(dǎo)劑時(shí)，所述酶的表達(dá)增強(qiáng)，并產(chǎn)生由所述轉(zhuǎn)基因編碼的一系列酶產(chǎn)物。圖1示出了使用PHB生物合成途徑作為例子對此類構(gòu)建體進(jìn)行的說明。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物是用于生產(chǎn)生物聚合物(例如聚羥鏈垸酸酯(PHA)、含有脂肪酸(具有所需的工業(yè)或營養(yǎng)特性)的植物油或營養(yǎng)化合物)的酶和其它因子。在產(chǎn)物是PHA的情況下，其可以是3-羥基丁酸酯的均聚體或共聚物。在這種情況下，所述轉(zhuǎn)基因可以編碼選自以下的酶(3-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB("短鏈")合成酶、PHA("長鏈")合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸卩-氧化酶。有用的基因是本領(lǐng)域所公知的，并且在(例如)Snell禾口Peoples所著的Afeto6.4:29-40(2002)以及Bohmert等人所著的Mo/ecw/arWo/osvWofec/mo/ogvo尸尸/an(9rea"e//^(H.Daniell，CD.Chase編輯(KluwerAcademicPublishers,Netherlands;2004，第559-585頁))中有所公開，并且在圖2和圖3中也有所概述。PHA合成酶的例子包括具有中等鏈長底物特異性的合成酶，例如來自食油假單胞菌(戶wt^omo^wo/eovoraw)的phaCl(參見專禾'J文獻(xiàn)WO91/00917;Huisman"a/,J.S/o/.CAem.266,2191-2198(1991))或來自銅綠假單胞菌(i^ewAmomwaerwg7'wo5fi0的phaCl(參見文獻(xiàn)Timm,A.&Steinbuchel,A.丄5z'oc/z亂209:15-30(1992));來自真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(力/ca/z'ge"weWro;/zw)的具有較短卒連長特異性的合成酶(參見文獻(xiàn)Peoples,O.P.&Sinskey，A.J.丄CVzem.264:15298-15303(1989));或二亞基合成酶，例如來自普氏莢硫菌(J7n'oc，Mp/e朋/g//)的由phaE禾卩phaC所編碼的合成酶(美國專利No.6,011,144)。其它有用的PHA合成酶基因已經(jīng)從以下物種中分離得到，所述的物種例如有豚鼠氣單胞菌(未rom冊oycflv/w)(參見文獻(xiàn):Fukui&Doi,J.Ba"eno/.779:4821-30(1997))、深紅紅螺菌(i/zoJo^^r〃/wmra6rwm)(美國專利No.5,849,894)、赤紅球菌(7/zc^coccw"w6er)(參見文獻(xiàn)Pieper&Steinbuechel，M，6z-o/.96(1):73-80(1992))和珊瑚諾卡氏菌(7VotW/a(參見文獻(xiàn):Hall"a/"C"".44:687-91(1998))。用于生產(chǎn)3-羥基丁酸酯與較長鏈長(6至14個(gè)碳原子)羥酸的共聚物的具有寬泛底物特異性的PHA合成酶也己經(jīng)從和假單胞菌A33(參見文獻(xiàn)Appl.Microbiol,Biotechnol,42:卯1-909(1995))禾口iS單胞菌61-3(參見文獻(xiàn)Kato"a/,Appl.Microbiol.Biotechnol.45:363-370(1996))中分離得到。PHA合成酶基因和在PHA生物合成中的其它代謝步驟中進(jìn)行編碼的基因的范圍在文獻(xiàn)MadisonandHuisman.vVZ/croZ^o/ogyawJ編ecw/w6油gyieW面63:21-53(1999)中有所描述。(3-氧化中的a亞基屬于多功能酶，其最少具有水合酶活性和脫氫酶活性(參見圖2)。所述亞基還可以具有差向酶活性和A3-順、A2-反異構(gòu)酶活性。P-氧化的a亞基的例子為來自大腸桿菌的FadB(參見文獻(xiàn).-DiRusso，C.C.，J.5""en'o/.1990,172，6459-6468)、來自草莓假單胞菌(尸雄t/頻o應(yīng)的FaoA(參見文獻(xiàn)Sato,S.,Hayashie"/.J.Biochem.1992，111,8-15)和開放閱讀框士714(其含有(3-氧化的多功能a亞基的同源物(GenbankAccession#1788682))。(3-氧化的(3亞基是指能夠與其配偶體a亞基形成多功能酶復(fù)合物的多肽。所述P亞基具有硫解酶活性(參見圖2)。p亞基的例子為來自大腸桿菌的FadA(參見文獻(xiàn):DiRusso，C.C.丄Sa"en'o/.172:6459-6468(1990))、來自草莓假單胞菌的FaoB(參見文獻(xiàn)Sato，S.,Hayashi,M.,Imamura,S.,Ozeki,Y.,Kawaguchi，A,J.S/oc/zew.111:8-15(1992))和￡.co//開放閱讀框f436(其含有p-氧化的a亞基的同源物(GenbankAccession#AE000322;基因b2342))。還原酶是指能夠?qū)3-酮脂酰輔酶A還原為R-3-OH-?；o酶A的酶，例如來自光合細(xì)菌(CArowa/z'wmv/"oyww)的NADH依賴性還原酶(參見文獻(xiàn)Liebergesell,M.,&Steinbuchel,A.Eur.J.209:135-150(1992))、來自真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的NADPH依賴性還原酶(參見文獻(xiàn):Peoples,O.P.&Sinskey，A.J.丄腸/CA亂264:15293-15297(1989))、來自生枝動膠菌(Zoog/owram/gera)的NADPH還原酶(參見文獻(xiàn)Peoples,O.P.&Sinskey,A.J.7kfo/ecw/arM/cro^Wog_y3:349-357(1989))或來自巨大芽孢桿菌(Sac/〃wmega&hww)的NADPH還原酶(美國專利No.6,835，820)。卩-酮硫解酶是指能夠催化乙酰輔酶A和?；o酶A轉(zhuǎn)化為(3-酮脂酰輔酶A的酶，該轉(zhuǎn)化反應(yīng)是可逆的(參見圖2)。這種硫解酶的例子是來自真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的PhaA(參見文獻(xiàn)Pe叩les,O.P.&Sinskey，A.J.J.Bz'o/.C/zem.264:15293-15297(1989))和來自真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的BktB(參見文獻(xiàn):Slater"a/,J5a"en'o/.180(8):1979-87(1998))。酰基輔酶A氧化酶是指能夠?qū)柡王；o酶A轉(zhuǎn)化為A2不飽和酰基輔酶A的酶(參見圖2)。酰基輔酶A氧化酶的例子是來自釀酒酵母(Sacc/m'0m:Kce5ceWw'ae)的POX1(參見文獻(xiàn)Dmochowska"1990,88,247-252)和來自擬南芥的ACXl(GenbankAccession#AF057044)。過氧化氫酶是指能夠?qū)⑦^氧化氫轉(zhuǎn)化為氫和氧的酶。過氧化氫酶的例子是來自銅綠假單胞菌的KatB(參見文獻(xiàn)Brown"a/,J.5a"en'o/./〃6536-6544(1995))和來自￡.co/z'的KatG(參見文獻(xiàn):Triggs-Raine,B.L.&Loewen,P.C.G匿52:121-128(1987))。在轉(zhuǎn)基因編碼的酶的產(chǎn)物是改性油的情況下，所述轉(zhuǎn)基因可以編碼選自以下酶硫酯酶、5-9-去飽和酶、co-3-去飽和酶、co-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和/或三酰甘油生物合成酶。這些酶在許多參考文獻(xiàn)中有所公開，所述參考文獻(xiàn)包括美國專利No.6,140,486;美國專利No.5，955,650;美國專利No.6，433，250;美國專利No.6,051,754;美國專利No,6,635,451;Singh""/，i5/"^尸—.。/.109:1498(1995);Tang"a/，尸/aW尸—'o/.119:364(1999);以及MadiandPrusky，尸/aWPA"fo/.121:1057(1999)。對于工業(yè)用途而言，植物油產(chǎn)物可以具有改善的脂肪酸組成，例如羥酸含量高、油酸含量高或者不飽和脂肪酸的含量較高或較低。用于提高油菜籽油中的月桂酸含量的基因和體系已經(jīng)由Knutzon等人有所描述(參見文獻(xiàn)1999，尸/a^尸/z"/0/.120,739-746)，并且如圖4所示。在植物油產(chǎn)物具有改善的營養(yǎng)性質(zhì)的情況下，它可以具有減少的不飽和脂肪酸含量(例如高級油酸或月桂酸的含量)或者具有增多的長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量。用于增加油料種子中PUFA含量的基因和體系在文獻(xiàn)QiWfl/,A^""eB/o&c/z"o/og少22:739-745(2004)中有所描述，并且概括于圖5中。用于新的油料種子作物生產(chǎn)的其它代謝工程方法在文獻(xiàn)Drexler"a/，J尸/鹿/尸—》/，160:779-802(2003)中有所綜述。轉(zhuǎn)基因編碼的酶的產(chǎn)物也可以是營養(yǎng)化合物，例如P-胡羅卜素(前維生素A)。用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻中的(3-胡羅卜素的基因和體系在文獻(xiàn)Ye"a/,Sc/e"ce287:303-305(2000)中有所描述，并且概括于圖6中。位于誘導(dǎo)型表達(dá)盒內(nèi)的轉(zhuǎn)基因可以編碼選自圖6的反應(yīng)1-5中的酶活性物。C.引導(dǎo)序列轉(zhuǎn)基因(在編碼多個(gè)酶反應(yīng)中的酶的情況下)可以編碼天然多酶復(fù)合物(例如微生物脂肪酸氧化復(fù)合物)，或者(在編碼氨基酸途徑的酶活性物的情況下)可以編碼雙功能酶(例如蘇氨酸生產(chǎn)所涉及的大腸桿菌高絲氨酸脫氫酶-天冬氨酸激酶)。文獻(xiàn)中有很多編碼多功能酶的此類基因的例子。在其它情況下，可以通過基因融合技術(shù)來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，以使其編碼多功能酶，在所述的基因融合技術(shù)中，使用或者不使用接頭序列來融合不同基因的編碼序列，以獲得編碼單個(gè)蛋白質(zhì)的具有單獨(dú)的基因活性的單個(gè)基因。還可以使用分子進(jìn)化技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化這種合成的融合基因/酶的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含多個(gè)編碼多酶生物合成途徑中的酶的基因的構(gòu)建體被置于一個(gè)或更多個(gè)啟動子的調(diào)控之下，所述啟動子是由一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因所表達(dá)的激活蛋白分子或復(fù)合物活化的，所述的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因受到一個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控，并在外部施加化學(xué)制劑之后被開啟。在這種情況下，使用可以增強(qiáng)激活蛋白分子或部分激活蛋白分子的表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)劑來處理轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，該操作隨后能夠在對于生產(chǎn)代謝產(chǎn)物最佳的時(shí)間上提高編碼多酶活性物的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在上述兩個(gè)實(shí)施方案中，理想的是，在植物發(fā)育周期的一定時(shí)間上進(jìn)行所述的誘導(dǎo)來提高所需產(chǎn)物的產(chǎn)量。盡管對根進(jìn)行浸透是有用的選擇(參見文獻(xiàn)Holt"a/.P/a"to.196(2):295-302(1995)，但是優(yōu)選的是，對葉進(jìn)行噴撒來施加化學(xué)誘導(dǎo)劑(參見文獻(xiàn)Tominack,/rox/co/C/z'"rox/co/.38(2):129-35(2000))。代謝產(chǎn)物可以在植物的任何部分中生產(chǎn)代謝產(chǎn)物，所述的任何部分例如有葉、莖、花、種子或它們的任何組合。異源核苷酸序列還可以在編碼待被表達(dá)的酶的區(qū)域內(nèi)包含一個(gè)或更多個(gè)含有引導(dǎo)序列的核苷酸序列。"引導(dǎo)"序列是編碼作為酶的一部分的氨基酸序列或模體的核苷酸序列，所述的氨基酸序列或模體引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入特定的細(xì)胞區(qū)室中，使得所述蛋白質(zhì)定位或區(qū)室化。蛋白質(zhì)中氨基酸引導(dǎo)肽的存在通常導(dǎo)致目的蛋白質(zhì)的全部或部分穿過細(xì)胞器膜并進(jìn)入到細(xì)胞器的內(nèi)部的移位?？晒┻x用的其它方式是，引導(dǎo)肽可以引導(dǎo)目的蛋白質(zhì)保持嵌入在細(xì)胞器的膜上。目的蛋白質(zhì)的"引導(dǎo)"肽或區(qū)域可以包含一串連續(xù)的氨基酸或一組不連續(xù)的氨基酸?？梢赃x擇引導(dǎo)肽，以便將目的蛋白質(zhì)引入植物細(xì)胞器中，所述的植物細(xì)胞器例如有細(xì)胞核、微體(例如過氧化物酶體或特異性過氧化物酶體(如乙醛酸循環(huán)體))、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)涵體、液泡、質(zhì)膜、細(xì)胞壁、線粒體、葉綠體或質(zhì)粒。葉綠體引導(dǎo)肽是可以將蛋白質(zhì)引入葉綠體或質(zhì)粒中的任何肽序列，例如苜蓿核酮糖-二磷酸羰化酶的小亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(參見文獻(xiàn)Khoudiwa/,G匿1997,197，343-351)。過氧化物酶體引導(dǎo)肽是指可以將蛋白質(zhì)引入過氧化物酶體中的任何肽序列(位于N-末端、中間或C-末端)，例如植物C-末端引導(dǎo)三肽SKL(參見文獻(xiàn)Banjoko，A.&Trelease,R.N.尸/朋？戶—'o/.1995，107，1201-1208;T.P.WallaceW<3/，"PlantOrganellularTargetingSequences,"in_P/aWAfo/ecw/ar5油gy,Ed.R.Croy，BIOSScientificPublishersLimited(1993)287-288)，并且植物中的過氧化物酶體引導(dǎo)過程示于文獻(xiàn)M.VolokitaJ7ze361-366(1991)中。D.標(biāo)記基因植物中所用的選擇性標(biāo)記基因包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptll(US5,034,322、US5,530,196)、抗潮霉素基因(US5,668,298)和膦絲菌素的抗性基因ZmKUS5,276,268)。專利文獻(xiàn)EP0530129Al描述了一種陽性選擇體系，該陽性選擇體系通過使編碼酶(活化加入到生長培養(yǎng)基中的非活性化合物)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，從而能夠使轉(zhuǎn)化的植物比未轉(zhuǎn)化株系長得更快。美國專利No.5,767,378描述了甘露糖或木糖對于轉(zhuǎn)基因植物的陽性選擇的用途?？珊Y選的標(biāo)記基因包括(i-葡糖醛酸酶基因(參見文獻(xiàn)JeffersonWa/,1987,丄6:3901-3907;US5，268，463)和天然或改性的綠色熒光蛋白質(zhì)基因(參見文獻(xiàn)Cubitt"a/，1995,7>e"A腸c/zemScf.20:448-455;Pan"a/,1996,P/a"f戶A"Zo/.112:893-900)。這些標(biāo)記中的一些標(biāo)記具有將某種特性(例如抗除草劑性)引入所關(guān)注的植物中的額外的優(yōu)點(diǎn)，從而在投入方面可提供額外的農(nóng)業(yè)價(jià)值。E.轉(zhuǎn)錄終止序列可以在轉(zhuǎn)錄體的3'末端對聚腺苷酸化信號進(jìn)行改造。聚腺苷酸化信號是指在mRNA被運(yùn)送到細(xì)胞溶膠之前，任何可以導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的mRNA聚腺苷酸化的序列，例如胭脂氨酸合成酶的3'區(qū)域(參見文獻(xiàn)Bevan,M.,Bames，W.M.,Chilton,M.D.iVMc/e〖cL1983，11，369-385)。II.使用構(gòu)建體的方法A.轉(zhuǎn)化用于本文所述方法中的DNA構(gòu)建體包括能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因引入植物中的轉(zhuǎn)化載體。如本文所用，"轉(zhuǎn)基因"是指這樣的有機(jī)體在該有機(jī)中，含有異源核苷酸序列的核酸片段已經(jīng)被引入。優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因有機(jī)體中的轉(zhuǎn)基因是穩(wěn)定的并且是可遺傳的。所述的異源核酸片段可以或不可以被整合到宿主基因組中。幾種植物轉(zhuǎn)化載體選項(xiàng)是可用的，這些植物轉(zhuǎn)化載體包括以下文獻(xiàn)中所述的那些，所述文獻(xiàn)有"GeneTransfertoPlants"(Potrykus等人編輯)Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork(1995);"TransgenicPlants:AProductionSystemforIndustrialandPharmaceuticalProteins"(Owen等人編輯)JohnWiley&Sons有限公司England(1996);禾口"MethodsinPlantMolecularBiology:ALaboratoryCourseManual"(Maliga等人編輯)ColdSpringLaboratory出版社，NewYork(1995)。植物轉(zhuǎn)化載體通常包含一種或更多種處于5'和3'調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下的所關(guān)注的編碼序列，其中所述的5'和3'調(diào)節(jié)序列包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子和/或聚腺苷酸化信號和選擇性或可篩選的標(biāo)記基因。對于由單個(gè)轉(zhuǎn)錄體形成的兩個(gè)或更多個(gè)多肽的表達(dá)而言，可以將另外的RNA加工信號和核酶序列經(jīng)改造插入到所述的構(gòu)建體中(美國專利No.5,519,164)。這種方法具有將多個(gè)轉(zhuǎn)基因定位在單個(gè)基因座處的優(yōu)點(diǎn)，這在隨后進(jìn)行的植物育種工作中是有利的。另一種方法是使用載體通過同源重組來特異性地轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒染色體(美國專利No.5,545,818)，在這種情況下，可以利用質(zhì)?；蚪M的原核性，并可以插入多個(gè)作為操縱子的轉(zhuǎn)基因?？梢允褂枚喾N方法和多種植物組織來完成使用所述載體對合適的農(nóng)作物宿主進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。用于本文所公開的方法中的代表性植物包括蕓苔屬(包括甘藍(lán)型油菜、蕪菁、埃塞俄比亞芥和芥菜)、擬南芥、玉米、大豆、棉籽、向日葵、棕櫚、椰子、紅花、花生、芥子(包括白芥)、甘蔗和亞麻。作為生物質(zhì)收獲的作物也可用于本文所公開的方法中，所述作物例如有青飼料玉米(silagecorn)、紫花苜蓿、柳枝稷、高梁或煙草。用于使用所述載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的代表性組織包括原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈傷組織、葉碟、花粉和分生組織。代表性的轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、生物射彈法、微注射法、電穿孔法啊、聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法和硅纖維介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(參見文獻(xiàn)美國專利No.5,464,765;"GeneTransfertoPlants"(Potrykus等人編輯)Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork(1995);"TransgenicPlants:AProductionSystemforIndustrialandPharmaceuticalProteins"(Owen等人編輯)JohnWiley&Sons有限公司England(1996);禾口"MethodsinPlantMolecularBiology:ALaboratoryCourseManual"(Maliga等人編車茸)ColdSpringLaboratoryPress,NewYork(1995))?？梢酝ㄟ^許多報(bào)道的方法(參見文獻(xiàn)US5,015,580、US5,015，944、US5,024,944、US5,322,783、US5,416,011、US5,169,770)對大豆進(jìn)行轉(zhuǎn)化。已經(jīng)報(bào)道了許多轉(zhuǎn)化方法用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米植物，所述轉(zhuǎn)化方法包括花粉轉(zhuǎn)化法(US5，629，183)、硅纖維介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(US5,464,765)、原生質(zhì)體電穿孔法(US5,231,019、US5,472,869、US5,384,253)、基因槍法(US5，538，877、US5，538,880)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(EP0604662Al禾PWO94/00977)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法是特別優(yōu)選的，這是因?yàn)槭褂眠@種方法更容易獲得轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的單整合事件，由此極大地有利于隨后進(jìn)行的植物育種。通過粒子轟擊法可以對棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化(US5,004,863和US5,159,135)。使用粒子轟擊法和農(nóng)桿菌感染法的組合方法可以對向日葵進(jìn)行轉(zhuǎn)化(EP0486233A2和US5,030,572)。通過粒子轟擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法可以對亞麻進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用生物射彈介導(dǎo)法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法可以對柳枝稷進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見文獻(xiàn)Richards"a/.P/aWCe〃20:48-54(2001);Somleva"ct/.OopScz'e"ce42:2080-2087(2002))。甘蔗的轉(zhuǎn)化方法也己經(jīng)有所描述(參見文獻(xiàn)Franks&Birch.JP/""/P/y^'o/.18,471-480(1991);PCTWO2002/037951)。用于實(shí)施本發(fā)明的重組酶技術(shù)包括cre-lox、FLP/FRT和Gin體系?？蓪⑦@些技術(shù)用于本文所描述的目的所通過的方法在以下文獻(xiàn)中有所描述，所述文獻(xiàn)例如有US5，527，695;DaleandOw,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10558-10562;Medberry"a/,1995，7V"c/e/c23:485-490。在使用上述任何一種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化之后，可以使用以下方法來獲得使轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物，所述方法為在選擇性培養(yǎng)基上選擇己經(jīng)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；使已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生以便產(chǎn)生不同的植物；選擇轉(zhuǎn)基因得到表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物，其中所述的轉(zhuǎn)基因在所需的組織和細(xì)胞的位置中產(chǎn)生了所需含量的所需多肽。B:生物合成產(chǎn)物的生產(chǎn)多種酶的表達(dá)可用于改變植物的代謝，以便(例如)提高營養(yǎng)性氨基酸的含量(參見文獻(xiàn)FalcoWi5/Wec/2朋/og少13:577(1995))、改變木質(zhì)素的代謝(參見文獻(xiàn)Baucher"a/.O".Sz'oc/zem.Mo/.38:305-350(2003))、改變油的成分(參見文獻(xiàn)DrexlerWa/.J.尸/a"fP/yw'o/.160:779-802(2003))、修飾淀粉或產(chǎn)生聚羥鏈垸酸酯聚合物(參見文獻(xiàn)HuismanandMadison,M/c^Zh'o/"m^Afo/.Aev.63:21-53(1999)及其中的參考文獻(xiàn))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是生物聚合物，例如聚羥鏈垸酸酯(PHA)、含有脂肪酸(具有所需工業(yè)或營養(yǎng)特性)的植物油或滋補(bǔ)化合物。PHA生物聚合物的生產(chǎn)將植物改變成產(chǎn)生PHA生物聚合物是如何使用這些構(gòu)建體的優(yōu)選例子。所述的PHA生物聚合物包括其單體組分不同且物理性質(zhì)范圍較廣的一大類聚酯(參見文獻(xiàn)MadisonandHuisman,1999;Dudesha/.TVog.Sc/25:1503-1555(2000))?？梢酝ㄟ^操控植物的天然代謝以便在聚合物發(fā)生累積的細(xì)胞器中產(chǎn)生3-羥基?；o酶A(PHA合成酶的底物)，來在植物中產(chǎn)生短鏈PHA、中鏈PHA以及較短鏈長PHA和中等鏈長PHA的共聚物。這通常需要兩種或更多種重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，以及所附有的合適的細(xì)胞器引導(dǎo)信號。可以由通過單轉(zhuǎn)化事件而引入到植物中的單個(gè)的構(gòu)建體同步表達(dá)所述的蛋白質(zhì)。通常，通過使一個(gè)或更多個(gè)單體單元聚合(例如，酶聚合)來形成PHA。這種單體單元的例子包括(例如)3-羥基丁酸酯、羥基乙酸、3-羥基丙酸酯、3-羥基戊酸酯、3-羥基己酸酯、3-羥基庚酸酯、3-羥基辛酸酯、3-羥基壬酸酯、3-羥基癸酸酯、3-羥基十二烷酸酯、3-羥基十二烯酸酯、3-羥基十四烷酸酯、3-羥基十六烷酸酯、3-羥基十八烷酸酯、4-羥基丁酸酯、4-羥基戊酸酯、5-羥基戊酸酯、6-羥基己酸酯。在一些實(shí)施方案中，所述PHA具有至少一個(gè)化學(xué)式為-OCRiR2(CR3R4)nCO的單體單元。n是零或整數(shù)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等)。！^、R2、R3禾QR4各自為氫原子、飽和烴基或不飽和烴基。&與R2、113和R4分別相同或不同。112與Rp113和R4分別相同或不同，113與R2、&和114分別相同或不同，R4與R2、113和R,分別相同或不同。在一些實(shí)施方案中，所述PHA是均聚物。這種均聚物的例子包括聚-4-羥基丁酸酯、聚-4-羥基戊酸酯、聚-3-羥基丙酸酯、聚-3-羥基丁酸酯、聚-3-羥基己酸酯、聚-3-羥基庚酸酯、聚-3-羥基辛酸酯、聚-3-羥基癸酸酯和聚-3-羥基十二垸酸酯。在一些實(shí)施方案中，所述？11八是包含兩個(gè)或更多個(gè)不同單體單元的共聚物。這種共聚物的例子包括聚-3-羥基丁酸酯-co-S-羥基丙酸酯、聚-S-羥基丁酸酯-co-S-羥基戊酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-3-羥基己酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-4-羥基戊酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-6-羥基己酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-3-羥基庚酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-3-羥基辛酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-3-羥基癸酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-S-羥基十二垸酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-00-3-羥基辛酸酯-(:0-3-羥基癸酸酯、聚-3-羥基癸酸酯-co-3-羥基辛酸酯和聚-3-羥基丁酸酯-co-3-羥基十八垸酸酯。所述的PHA可以具有相當(dāng)于至少約500道爾頓(例如，至少約10，000道爾頓、至少約50,000道爾頓)禾口/或小于約2,000,000道爾頓(例如，小于約1,000,000道爾頓、小于約800,000道爾頓)聚苯乙烯重均分子量的重均分子量。如本文所用，重均分子量是通過凝膠滲透色譜法(例如使用氯仿作為PHA樣品的洗脫劑和稀釋劑)來測量的?？梢允褂镁郾揭蚁┓肿恿繕?biāo)準(zhǔn)得到用于確定分子量的校準(zhǔn)曲線。在其中所述PHA是聚-3-羥基丁酸酯共聚物(例如聚3-羥基丁酸酯-co-3-羥基丙酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯、聚-3-羥基丁酸酯-co-3-羥基己酸酯和/或聚-3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯、聚-3-羥基丁酸酯^0-3-羥基辛酸酯-^-3-羥基癸酸酯《0-3-羥基十二烷酸酯)的某些實(shí)施方案中，大部分單體單元是3-羥基丁酸酯(例如至少約50%的單體單元是3-羥基丁酸酯、至少約60%的單體單元是3-羥基丁酸酯)。在細(xì)菌中，各種PHA單體是通過特定的途徑生產(chǎn)的。在短側(cè)基的PHA的情況下，涉及三種酶(3-酮硫解酶(參見圖2中反應(yīng)8)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(參見圖2中反應(yīng)9)和PHA合成酶(參見圖2中反應(yīng)10)。較短鏈長PHA的合成酶通常使包含4-羥基和5-羥基酸單元的C3-C5的羥基酸單體發(fā)生聚合。在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了這種生物合成途徑，所述細(xì)菌例如有羅爾斯通氏菌(ia/Wom'aew"op/za)、協(xié)腹產(chǎn)堿桿菌(J/ca//gwe5/afiw)、生枝動膠菌等(參見文獻(xiàn)Madison,L.L.&Huisman，G.W.Af/"o6/o/owA/o/ecw/ar別o/ogyiev/ews，1999,63,21-53)?？梢酝ㄟ^單轉(zhuǎn)化事件將促進(jìn)較短鏈長PHA合成的活性物引入到宿主植物中。如果需要的話，可以將編碼酶的基因融合到編碼肽引導(dǎo)信號的DNA序列中，其中所述的肽引導(dǎo)信號將成熟蛋白質(zhì)(在剪切后形成)引導(dǎo)到特定的細(xì)胞區(qū)室中。中等鏈長側(cè)基的PHA是通過許多不同的假單胞菌生產(chǎn)的。羥酰輔酶A單體單元可以衍生自脂肪酸(5-氧化途徑(參見圖2)和脂肪酸生物合成途徑(參見圖3)。然后，通過PHA合成酶將所述的單體單元轉(zhuǎn)化為聚合物，其中所述的PHA合成酶具有偏好C6-C14的較大單體單元的底物特異性(參見圖2中反應(yīng)7、圖3中反應(yīng)5和文獻(xiàn)Madison,L.L.&Huisman,G.W.Mz'cro6z'o/ogyMo/ecw/a;-5z.o/ogyieWevv5，1999,63,21-53)。通過單轉(zhuǎn)化事件，可以將促進(jìn)由脂肪酸p-氧化途徑合成中等鏈長PHA的活性體引入宿主植物中，所述活性體選自圖2反應(yīng)l-7中所述的酶。如果需要的話，可以將編碼所述酶的基因融合到編碼肽引導(dǎo)信號的DNA序列中，所述肽引導(dǎo)信號將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到特定的細(xì)胞區(qū)室中。PHA合成和脂肪酸生物合成之間的酶連接(enzymaticlink)在惡臭假單胞菌(尸"W麵o"w戶W")和銅綠假單胞菌中的已經(jīng)有所報(bào)道(參見圖3中反應(yīng)1)。編碼酶(據(jù)信，此類酶負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移來自脂肪酸生物合成的碳)的基因座被命名為phaG(參見文獻(xiàn)RehmWW，丄腸/.C7z亂1998,273,24044-24051;WO98/06854;U.S.5,750,848;Hoffmann,N,Steinbuchel,A.,Rehm，B.H.A.FEMS,M'cro^'o/ogy2000，184,253-259)。美國專利No.6,586,658描述了用于由脂肪酸生物合成途徑生產(chǎn)PHA的其它的基因。通過單轉(zhuǎn)化事件，可以將促進(jìn)由脂肪酸生物合成途徑合成中等鏈長PHA的活性體與構(gòu)建體一起引入到宿主植物中，其中酶選自圖3反應(yīng)1-3中所述的那些。如果需要的話，可以將編碼所述酶的基因融合到編碼肽引導(dǎo)信號的DNA序列中，所述肽引導(dǎo)信號將成熟蛋白質(zhì)引導(dǎo)到特定的細(xì)胞區(qū)室(例如質(zhì)粒)中。還可以在具有PHA合成酶(具有較廣的底物特異性)的細(xì)菌中生產(chǎn)包含較短鏈長側(cè)基和中等鏈長側(cè)基的共聚物(參見圖2中的反應(yīng)11和圖3中的反應(yīng)5)。例如，假單胞菌A33(參見文獻(xiàn)jpp/.MfcroWo/.腸&c/mo/.1995,42，901-909)、假單胞菌61-3(參見文獻(xiàn):Kato"a/，M/croZ/o/.S/Wec/mo/.1996,45,363-370)禾口普氏英硫菌(美國專利No.6，0U,144)都具有PHA合成酶，據(jù)報(bào)道這些PHA合成酶可以生產(chǎn)較短鏈長單體單元和中等鏈長單體單元的共聚物。通過單轉(zhuǎn)化事件，可以將促進(jìn)較短鏈長側(cè)基和中等鏈長側(cè)基的共聚物的形成的活性體引入宿主植物中，并且所述活性體可編碼能夠催化脂肪酸降解途徑的反應(yīng)1-11(參見圖2)和脂肪酸生物合成途徑的反應(yīng)1-8(參見圖3)的多肽。如果需要的話，可以將編碼這些多肽的基因融合到編碼肽引導(dǎo)信號的DNA序列中，所述肽引導(dǎo)信號將成熟蛋白質(zhì)引導(dǎo)到特定的細(xì)胞區(qū)室(例如質(zhì)粒)中。結(jié)合3-羥基戊酸酯的其它的途徑在專利文獻(xiàn)PCTWO98/00557(Grays等人)中有所描述。結(jié)合4-羥基丁酸酯的其它的途徑在專利文獻(xiàn)PCTWO98/36078(Dennis和Valentin)以及PCTWO99/14313(Huisman等人)中有所詳述。在以工業(yè)規(guī)模由植物生產(chǎn)PHA之前，應(yīng)當(dāng)使具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的作物中聚合物的生產(chǎn)達(dá)到最優(yōu)。己經(jīng)對一些具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的作物進(jìn)行了初步研究(關(guān)于綜述參見Bohmert"a/,2004MetabolicEngineering:PlastidsasBioreactors,Afo/eci</cfrSZo/ogvBfo"c/mo/offvof尸/。wfOgawe〃g5:H.DaniellandC.D.Chase，Editors.KluwerAcademicPublishers:Netherlands,p.559-585)，包括玉米中PHB的生產(chǎn)(參見文獻(xiàn)Poirier&Gruys，2002,Productionofpolyhydroxyalkanoatesintransgenicplants.In5/opo(y附e;^,A.Steinbiichel,Editor;Wiley-VHCVerlagGmbH:Weinheim.p.401-435)以及轉(zhuǎn)基因油菜和大豆種子中PHB的生產(chǎn)(參見文獻(xiàn)Gruys等人的PCTWO98/00557)。在這些研究中，所觀察到的聚合物的含量對于聚合物的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)而言太低了。具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的作物中PHA生產(chǎn)的優(yōu)化采用了對多種酶、引導(dǎo)信號和生產(chǎn)位點(diǎn)進(jìn)行篩選的方法，直到獲得針對具有所需組成的聚合物的高產(chǎn)途徑為止。如果多個(gè)基因以單轉(zhuǎn)化事件的方式被插入，則這是可以被簡單化的任務(wù)。多基因表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建用于降低傳統(tǒng)育種方法(需要使轉(zhuǎn)基因植物具有農(nóng)業(yè)用途)的復(fù)雜性。通過參照以下非限定性實(shí)施例將進(jìn)一步理解本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:質(zhì)粒的構(gòu)建所有的DNA操作(包括PCR、DNA測序、轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒純化)均使用(例如)Sambrook等人所著的MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory出版社，紐約(1989))中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。pUC18-C4PPDK-AAA-RBS包含35S-C4PPDK啟動子(參見文獻(xiàn)Chiuefa/.Cw".6:325(1996))、編碼來自豌豆的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亞基的信號肽和成熟蛋白質(zhì)的最初的24個(gè)aa的DNA(參見文獻(xiàn):Coruzzi"a/.J腸/C/z亂258(3):1399-1402，(1983))、編碼三個(gè)aa接頭的DNA(包含允許所需轉(zhuǎn)基因融合的X6aI限制性位點(diǎn))、以及胭脂氨酸合成酶基因的3'終止子(參見文獻(xiàn)Bevane^/.W"c/e/cJczA11(2):369-85(1983))。使用以下多步驟方法構(gòu)建該質(zhì)粒。將寡核苷酸BamXbaNot-A與BamXbaNot-B退火，并連接到預(yù)先經(jīng)S"m//1和I酶切過的質(zhì)粒pUC18-35S-C4PPDKsGFPnos上(參見文獻(xiàn)ChiuWCw".A'o/,6:325(1996))。將所得質(zhì)粒命名為pUC18-35S-C4PPDK-BXNP-nos。核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶葉綠體引導(dǎo)信號和成熟蛋白質(zhì)最初的24個(gè)aa是使用引物PEATSC和PEATSR擴(kuò)增由從豌豆(P&wm^"vwm)Progress#9膨脹的嫩綠葉得到的基因組DNA而得到的。將擴(kuò)增所得的0.34kbp片段克隆到pUC18-35S-C4PPDK-BXNP層nos的5"w//I禾DZ6flI{立點(diǎn)處，從而開》成質(zhì)粒pUC18-35S-C4PPDK-P丄s.nos。為了從豌豆引導(dǎo)信號中除去內(nèi)含子，使用印/zI和M/eI酶切質(zhì)粒pUC18-35S-C4PPDK-P丄s.nos。將接頭P.ts.nointronA禾B接頭P丄s.nointronB退火，并連接到pUC18-35S-C4PPDK-P丄s,nos的S;/zI和Af/eI位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pUC18-C4PPDK-rbcs-nos。為了進(jìn)行植物表達(dá)，通過使用QuikChange定點(diǎn)突變試劑盒(可得自位于美國加利福尼亞州LaJolla市的Stratagene公司)將現(xiàn)有的TCCATGG序列變?yōu)锳AAATGG，以形成質(zhì)粒pUC-C4PPDK-AAA-RBS-nos來使來自質(zhì)粒pUC18-C4PPDK-rbcs-nos的信號序列的起始位點(diǎn)對于植物表達(dá)最優(yōu)化。pCAM(RBCS-連接)衍生自雙元載體pCAMBIA2300(得自位于澳大禾!j亞Canberra市的CenterforApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)，并且該pCAM(RBCS-連接)包含之前所述的用于質(zhì)粒pUC18-C4PPDK-AAA-RBS的啟動子、信號序列和終止子片段。使用以下多步驟方法構(gòu)建質(zhì)粒pCAM(RBCS-連接)。通過分別使寡核苷酸IA與IB以及2A與2B退火，制備出雙鏈合成接頭1和2。禾U用唯一的￡coi/和X/zo/位點(diǎn)，從質(zhì)粒pUC-C4PPDK-AAA-RBS-nos上切除所述的啟動子、信號序列和終止子。將所得的l.lkbp片段與接頭1和2退火，從而制備含有啟動子、信號序列和終止子的DNA片段，該含有啟動子、信號序列和終止子的DNA片段的5'端側(cè)翼為//z>u/III、I、尸acI、Z/upI限制性位點(diǎn)而其3'端側(cè)翼為I、I、爿jcI、爿vrII和SacI位點(diǎn)。將所得片段克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA2300的I和i/z'WIII位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pCAM(RBCS-連接)。通過使用引物AB-F和A-R擴(kuò)增得自pAeT10的戶力"基因(參見文獻(xiàn)PeoplesandSinskey,C/z亂264(26):15293-7.(1989))來制備pCAM(A)。將所得片段克隆到pCAM(RBCS-連接)的ZkI和尸^I位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出/^^4基因的豌豆引導(dǎo)信號的翻譯融合體。通過以下方法構(gòu)建pCAM(B)，所述方法為使用之前所述的用于構(gòu)建pCAM(A)的方法，通過使用引物B-F和AB-R擴(kuò)增得自pAeT10的//za5基因(參見文獻(xiàn)PeoplesandSinskey,JS/o/C/zem.264(26):15293-7.(1989))，并將所得的DNA片段克隆到pCAM(RBCS-連接)中。通過以下方法構(gòu)建pCAM(C)，所述方法為通過使用引物C-F和C陽R擴(kuò)增得自pCMYS106(—種以pUC19(參見文獻(xiàn)Yanisch-Perrone^/，Gwe33:103-119(1985))為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有雜交的食油假單胞菌/生枝動膠菌合成酶基因(美國專利6,316，262))的合成酶基因。使用義Z^I和A^'I酶切所得的PCR產(chǎn)物。將所得片段克隆到與pCAM(RBCS-連接)的義MI和I位點(diǎn)的相匹配的粘性末端處，以得到pCAM(C)。使用兩步法構(gòu)建pCAM(C+A+B)。通過使用5'"W萬I和3'JwII位點(diǎn)從pCAM(A)中切下盒、鈍化其&WI位點(diǎn)并將該插入物克隆到pCAM(B)的JvrII位點(diǎn)和鈍化的I位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pCAM(A+B)。通過使用5'SW5I和3'^vrII位點(diǎn)從pCAM(A+B)中切下p/zW和；/m5盒、鈍化其&WI位點(diǎn)并將該插入物克隆到pCAM(C)的^vrII和鈍化的J"I位點(diǎn)內(nèi)處，從而構(gòu)建出pCAM(C+A+B)。這種組成型PHB表達(dá)載體被命名為CAB。pNEB(greA)—使用AcI和尸meI酶切，從pCAM(A)(參見文獻(xiàn)Kourtz"a/，尸/aW倫/ec/mo/.3:435-447,(2005))中切下組成型硫解酶表達(dá)盒，其包含35S-C4PPDK啟動子、質(zhì)粒引導(dǎo)信號、硫解酶基因和聚腺苷酸化信號。將所得片段克隆到pNEB193(得自位于美國馬薩諸塞州Beverly市的NewEnglandBiolabs公司)的爿^I禾口尸meI位點(diǎn)內(nèi)，以得到pNEB(A)。使用Ill和鈍化的WcoI酶切，從pBL221.9GRE6中切下糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型最小啟動子6gre-6035SCaMV(參見文獻(xiàn)Martinez"a/，P/aWJ.19:97-106(1999))。將所得片段克隆到pNEB193的I禾nJIII位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pNEB(greMP)。采用SeamlessClomngTM技術(shù)(得自位于美國加利福尼亞州LaJolla市的Stratagene公司)將pNEB(A)的組成型啟動子35SC4PPDK換為pNEB(greMP)的誘導(dǎo)型啟動子。使用引物L(fēng)K50禾nLK51以含有唯一的3'和5'五aw11041限制性位點(diǎn)的方式由pNEB(greMP)擴(kuò)增得到誘導(dǎo)型最小啟動子，所述的引物L(fēng)K50禾口UC51如下LK50GACTG)(SEQIDNO:1)，LK51ATG)(SEQIDNO:2)。LK52GACAACAGTCAGCCGTGCCTCTAGG)(SEQIDNO:3)LK53GGCCG)SEQIDNO:4使用引物L(fēng)K52和LK53以所得片段由唯一的3'和5'￡am11041位點(diǎn)的作為側(cè)翼的方式對幾乎整個(gè)pNEB(A)質(zhì)粒(包含載體主鏈、質(zhì)粒引導(dǎo)信號、硫解酶基因和聚腺苷酸化信號，但是不包含35S-C4PPDK組成型啟動子)進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)基本上按照生產(chǎn)商所建議的方法進(jìn)行。使用￡am11041酶切所得PCR產(chǎn)物，并連接生成pNEB(greA)。通過篩選位點(diǎn)來鑒定正確的產(chǎn)物，所述位點(diǎn)位于誘導(dǎo)型最小啟動子中，但不存在于組成型啟動子中。使用5W萬I和Z6flI酶切pCAM(greA)、pCAM(greB)和pCAM(greC)-pNEB(greA)，從而產(chǎn)生包含糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GRE)、來自花椰菜花葉病毒的最小35S啟動子(-60MP)和RBCS引導(dǎo)信號(TS)的GRE-60MP-TS片段。通過仏^BI和義kI酶切除去pCAM(A)、pCAM(B)或pCAM(C)的組成型啟動子和引導(dǎo)信號(參見文獻(xiàn)Kourtz"尸/"W》z.o^/mo/.3:435-447(2005))。將所得載體連接至'JGRE-60MP-TS片段上，從而產(chǎn)生pCAM(greA)、pCAM(greB)和pCAM(greC)。pCAM(CgreAB)—使用5^5I和」vrII酶切，從pCAM(greA)中切下包含最小誘導(dǎo)型啟動子、信號序列和硫解酶/^Z^基因的誘導(dǎo)型硫解酶盒g(shù)reA。鈍化5W5I位點(diǎn)，并將所得的粘性-鈍化的片段克隆到pCAM(C)的^wII和鈍化的AcI位點(diǎn)處，從而產(chǎn)生pCAM(CgreA)。使用相同的方法，將組成型還原酶盒加入pCAM(CgreA)中，從而產(chǎn)生pCAM(CgreAB)、pCAM(C)禾卩pCAM(B)。pUC18-C4PPDK-AAA-RBS包含35S-C4PPDK啟動子(參見文獻(xiàn)Chiueffl/,C"rr5z'o/.6:325(1996))、編碼來自豌豆的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亞基的信號肽和成熟蛋白質(zhì)的最初的24個(gè)aa的DNA(參見文獻(xiàn):Coruzzi"a/,/B/o/C/^m.258(3):1399-1402(1983))、編碼三個(gè)aa接頭的DNA(包含允許所需轉(zhuǎn)基因融合的Z6aI限制性位點(diǎn))、以及胭脂氨酸合成酶基因的3'終止子(參見文獻(xiàn)BevaniVwc/"'cJc油i".11(2):369-85(1983))。使用以下多步驟法構(gòu)建這種質(zhì)粒。將寡核苷酸BamXbaNot-A和BamXbaNot-B進(jìn)行退火，并連接到質(zhì)粒pUC18-35S-C4PPDKsGFPnos中(參見文獻(xiàn)Chiu"a/，Cwr.5/o/.6:325(1996))，所述質(zhì)粒在先被1和Wo/I酶切過。將所得質(zhì)粒命名為pUC18-35S-C4PPDK-BXNP-nos。核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶葉綠體引導(dǎo)信號和成熟蛋白質(zhì)最初的24個(gè)aa是使用引物PEATSC和PEATSR擴(kuò)增由從豌豆Progress#9膨脹的嫩綠葉得到的基因組DNA而得到的。將擴(kuò)增所得的0.34kbp片段克隆到pUC18-35S-C4PPDK-BXNP-nos的5am//I和Z6aI位點(diǎn)處，從而形成質(zhì)粒pUC18-35S-C4PPDK-P.t.s.nos。為了從豌豆引導(dǎo)信號中除去內(nèi)含子，使用I和M/eI酶切質(zhì)粒pUC18-35S-C4PPDK-P丄s.nos。將接頭P丄s.nointronA和接頭P.ts.nointronB退火，并連接到pUC18-35S-C4PPDK-P.t.s.nos的SpAI和M/eI位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pUC18-C4PPDK-rbcs-nos。為了進(jìn)行植物表達(dá)，通過使用QuikChange定點(diǎn)突變試劑盒(可得自位于美國加利福尼亞州LaJolla市的Stratagene公司)將現(xiàn)有的TCCATGG序列變?yōu)锳AAATGG，從而形成質(zhì)粒pUC-C4PPDK-AAA-RBS-nos，來使來自質(zhì)粒pUC18-C4PPDK-rbcs-nos的信號序列的起始位點(diǎn)最優(yōu)化。pCAM(RBCS-連接)衍生自雙元載體pCAMBIA2300(得自位于澳大禾1」亞Canberra市的CenterforApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)，并且該pCAM(RBCS-連接)包含之前所述的用于質(zhì)粒pUC18-C4PPDK-AAA-RBS的啟動子、信號序列和終止子片段。使用以下多步驟方法構(gòu)建質(zhì)粒pCAM(RBCS-連接)。通過分別使寡核苷酸IA與IB以及2A與2B退火，制備出雙鏈合成接頭1和2。禾'J用唯一的￡coi/和Z/zo/位點(diǎn)，從質(zhì)粒pUC-C4PPDK-AAA-RBS-nos上切除所述的啟動子、信號序列和終止子。將所得的l.lkbp片段與接頭1和2退火，從而制備含有啟動子、信號序列和終止子的DNA片段，該含有啟動子、信號序列和終止子的DNA片段的5'端側(cè)翼為///m/III、I、尸acI、ZAoI限制性位點(diǎn)而其3'端側(cè)翼為I、PacI、J_scI、爿vrII和SacI位點(diǎn)。將所得片段克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA2300的SacI和歷'm/III位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pCAM(RBCS-連接)。通過使用引物AB-F禾tlAB-R擴(kuò)增得自pTRC(AB)(—種包含;7/w^卞/2"S融合基因的質(zhì)粒)的/7/2a4-;7/2aB融合基因(參見文獻(xiàn)WO00/06747;Kourtz"a/，尸/a"ZS/o/ec/mo/.3:435-447,(2005))來構(gòu)建pCAM(AB)。將所得片段克隆到pCAM(RBCS-連接)的Z6aI和I位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出p/K^-p/za5基因與豌豆引導(dǎo)信號的翻譯融合體。通過使用引物AB-F和A-R擴(kuò)增得自pAeT10的p/mj基因(參見文獻(xiàn)PeoplesandSinskey,J腸/C7z譜.264(26):15293-7.(1989))來制備pCAM(A)。使用之前所述的用于pCAM(AB)的方法將所得片段克隆到pCAM(RBCS-連接)中。通過以下方法構(gòu)建pCAM(B)，所述方法為通過使用引物B-F和AB-R擴(kuò)增得自pAeT10的p/wS基因(參見文獻(xiàn)PeoplesandSinskey，75/。/C/zem.264(26):15293-7.(1989))，并使用之前所述的用于構(gòu)建pCAM(AB)的方法將所得的DNA片段克隆到pCAM(RBCS-連接)中。通過使用引物C-F和C-R擴(kuò)增得自pCMYS106(參見文獻(xiàn)Kourtz,"a/.,(2005)尸/"^S/W"/mo/.3:435-447)的合成酶基因，從而構(gòu)建出pCAM(C)。使用Z6fll和7Vw'I酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物。將所得片段克隆到與pCAM(RBCS-連接)的義6"I和尸wl位點(diǎn)的相匹配的粘性末端上，從而構(gòu)建出pCAM(C)。通過使用5'5WSI和3'JwII位點(diǎn)由pCAM(AB)上切下戶/z^4-尸/z"5盒，從而構(gòu)建出pCAM(C+AB)。鈍化SW;5I位點(diǎn)并將所得的DNA片段克隆到pCAM(C)的」vrII和鈍化的J"I位點(diǎn)處。使用兩步法構(gòu)建pCAM(C+A+B)。通過使用5'S"5I和3'」vrII位點(diǎn)從pCAM(A)中切下盒、鈍化其I位點(diǎn)并將所得的插入物克隆到pCAM(B)的」vrII位點(diǎn)和鈍化的JwI位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pCAM(A+B)。通過使用5'BWBI和3'JvrII位點(diǎn)從pCAM(A+B)中切下p/z"和j^aB盒、鈍化其I位點(diǎn)并將該插入物克隆到pCAM(C)的爿vrII和鈍化的AcI位點(diǎn)內(nèi)處，從而構(gòu)建出pCAM(C+A+B)。pCAM(greCgreAgreB)—使用I禾Q爿wII酶切，從pCAM(greA)上切下包含最小誘導(dǎo)型啟動子、信號序列和硫解酶p/zM基因的誘導(dǎo)型硫解酶盒g(shù)reA。鈍化SI位點(diǎn)并將所得粘性-鈍化的片段克隆到pCAM(greC)的JvrII和鈍化的AscI位點(diǎn)處，從而產(chǎn)生pCAM(greCgreA)。使用相同的方法，將誘導(dǎo)型還原酶盒加入pCAM(greCgreA)中，從而產(chǎn)生pCAM(greCgreAgreB)。pNEB(e35Sgrvhnos)—使用5am//I酶切，從pMF6GRVP16HEcR中切下包含糖皮質(zhì)激素DNA結(jié)合域、VP16反式活化域和綠棉鈴蟲Wm5ce似)蛻皮激素受體的嵌合的蛻皮激素受體，其中所述的pMF6GRVP16HEcR為一種pGRVHEcR質(zhì)粒的包含內(nèi)含子的pMF6(參見文獻(xiàn)Goffw"/,(19卯)，五AffiOJ9:2517-2522)的衍生物，如Martinez及其同事所述(參見文獻(xiàn)MartinezWa/,(1999b)P/aW/"19:97-106)。將所得片段克隆到pNEB193的S"mi/I位點(diǎn)處，從而產(chǎn)生pNEB(grvh)。使用I和用于鈍化的SWZI酶切，從pCAM2300(得自位于澳大利亞Canberra市的GAMBIA公司)中切下來自花椰菜花葉病毒(e35SCaMV)啟動子的雙倍增強(qiáng)啟動子35S。將所得片段克隆到pNEB(grvh)的五coRV和WcoI位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pNEB(e35Sgrvh)。通過使用」"I酶切切下所述載體的3'AyeI位點(diǎn)，再使用DNA聚合酶IKlenow片段進(jìn)行鈍化，接著，使用T4DNA連接酶再連接載體，從而構(gòu)建出pNEB(e35SgrvhA^yc7)。使用寡核苷酸nosF禾DnosR，通過PCR從pMF6GRVP16HEcR上除去胭脂氨酸合成酶基因的3'UTR，所述的寡核苷酸nosF和nosR如下nosF(SEQIDNO:5)，nosHCCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCG)(SEQIDNO:6)。這些弓l物將5'尸acI位點(diǎn)和3'I、II以及Z6aI位點(diǎn)引入nos片段中。將所得PCR產(chǎn)物克隆到pNEB(e35SgrvhA4M)的PacI和^7。I位點(diǎn)處，從而構(gòu)建出pNEB(e35Sgrvhnos)。pCAM(CgreABgrvh)和pCAM(greCgreAgreBgrvh)—通過^vrII和鈍化的印eI酶切，從pNEB(35S-grvh-nos)中切下包含嵌合的蛻皮激素受體、組成型啟動子和聚腺苷酸化序列的效應(yīng)器盒。將所得片段克隆到pCAM(CgreAB)和pCAM(greCgreAgreB)的II和鈍化的J"I位點(diǎn)中，從而產(chǎn)生pCAM(CgreABgrvh)和pCAM(greCgreAgreBgrvh)。實(shí)施例2:植物的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)將PHB生產(chǎn)的完整途徑所需要的基因(包含p-酮硫解酶(硫解酶)、NADPH乙酰乙酰輔酶A還原酶(還原酶)和PHA合成酶(合成酶)的基因)分別置于35S蛻皮激素誘導(dǎo)型最小啟動子的調(diào)控之下，將所得基因與質(zhì)粒引導(dǎo)信號融合，并克隆到基于pCAMBIA(可得自位于澳大禾ij亞Canberra市的CentreforApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)的包含嵌合的蛻皮激素受體的多基因質(zhì)粒(參見文獻(xiàn)A.Martinez,C.Sparks,CA.Hart，J.Thompson,I.Jepson,尸/a^丄19:97,(1999))。這種三基因誘導(dǎo)型構(gòu)建體被命名為31。被命名為II的單基因誘導(dǎo)型構(gòu)建體包含處于誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下的硫解酶，但是與所述31構(gòu)建體不同，其在組成型35S-C4PPDK啟動子的調(diào)控之下表達(dá)還原酶和合成酶基因(參見文獻(xiàn)W.Chiuetal，C鮮.腸/.6:325,(1996))。按照Clough和Bent所述的方法(參見文獻(xiàn)SJ.Clough,A.F.Bent，J.16:735(1998))進(jìn)行的擬南芥的轉(zhuǎn)化如下使用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化土壤桿菌菌株GV3101/pMP卯(參見文獻(xiàn)KonczandSchell,Mo/.Ge".Ge"e〃"204:383-396(1986))的電感受態(tài)細(xì)胞，并在含有慶大霉素和卡那霉素的LB平板上分離單菌落。在20°C、70%濕度以及16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的循環(huán)的條件下，使擬南芥ColumbiaCoI-0(得自位于美國得克薩斯州RoundRock市的LehleSeeds公司)在土壤中生長。使用Clough和Bent在P/gW/.16:第735頁(1998)中所述的土壤桿菌介導(dǎo)的浸花法來轉(zhuǎn)化植物。收獲來自成熟長角果的種子，將其滅菌，并置于含有1AxMurashige基本有機(jī)培養(yǎng)基(得自位于美國馬里蘭州Rockville市的LifeTechnologies公司)、0.7%的瓊脂、IxGamborg's維生素B5(得自位于美國密蘇里州St.Louis市的Sigma公司)和卡那霉素(50叫/mL)的選擇性平板上。將該平板在4r溫育2天，然后將其轉(zhuǎn)移到2(TC、70%濕度以及16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的循環(huán)條件下。7天后，將綠色的卡那霉素抗性幼苗移至土壤中，并在相同的生長條件下溫育直到植物適合于分析為止。使擬南芥植物生長，直到它們達(dá)到常規(guī)生長條件下的完整尺寸為止。在約30天達(dá)到成熟時(shí)，使用誘導(dǎo)劑經(jīng)根部浸漬或葉面施加處理該植物。所用的誘導(dǎo)劑包括雙苯酰肼、Mimic^和Intrepid?？梢允褂檬惺鄣臍⑾x劑Mimic和Intrepid(可得自位于美國阿肯色州Monticello市的UAPTimberland公司和位于美國馬薩諸塞州Hatfield市的PolinaChemicalCompounds公司)作為誘導(dǎo)劑，這是因?yàn)樗鼈兏髯缘幕钚猿煞?雙苯酰肼和甲氧蟲酰肼)為非類固醇類蛻皮激素類似物。根部浸漬法包括在lAxHoaglands肥料溶液(得自位于美國密蘇里州St.Louis市的Sigma公司)中將誘導(dǎo)劑稀釋至所需的濃度，并將lOmL所得溶液直接施加到每一株擬南芥植物的土壤中。在葉面施加法中，首先使用lAxHoaglands肥料溶液洗滌植物。然后將稀釋后的誘導(dǎo)劑直接噴撒在擬南芥植物的葉面上，直到葉面飽和并有液滴滴下。誘導(dǎo)劑的根部浸漬和葉面施加每周重復(fù)兩次，進(jìn)行三周，直到植物生出種子。實(shí)施例3:植物PHB的分析和提取按照之前所述的方法實(shí)施使用尼羅藍(lán)染色的熒光顯微鏡法(參見文獻(xiàn)Poirier"a/，6We"ce256:520-523，(1992))，但有一些修改。使用剃須刀片盡可能薄地切割葉組織，并在pH為8的處于0.1MKH2P04中的3%仲甲醛(得自位于美國賓西法尼亞州Ft.Washington市的ElectronMicroscopySciences公司)中固定3小時(shí)。用水洗滌固定樣品，并使用之前經(jīng)過過濾的1%尼羅藍(lán)(得自位于美國密蘇里州St.Louis市的Sigma公司)溶液在室溫下染色5分鐘。然后用水洗滌樣品，并使用8%的醋酸脫色。用水再洗滌樣品兩次。在裝有ZeissHBO100熒光附件和20xPh-I透鏡的ZeissAxiolab光學(xué)顯微鏡上通過熒光顯微鏡法觀察樣品，其中所述的20xPh-I透鏡使用了以下濾光裝置激發(fā)器HQ545/30、分光器Q5701p、發(fā)射器D590/20(得自位于美國佛蒙特州Brattleboro市的ChromaTechnology公司)。通過使用了KodakEliteChrome100膠巻的ZeissMC80DX顯微照相機(jī)記錄圖像。基本上按照Kourtz等人所述的方法(參見文獻(xiàn)KourtzWP/aW3:435-447(2005))進(jìn)行植物聚合物的分析，但具有以下修改。在使用丁醇分解使干燥的植物材料衍生化以及使用水除去雜質(zhì)之前，省去涉及植物材料預(yù)洗滌的初始步驟。使用裝有DB-225MS柱和防護(hù)裝置的處于所選的離子監(jiān)測模式的Agilent5973GC/MS，通過氣相色譜法/質(zhì)譜法分析所得的有機(jī)相。3-羥基丁酸丁酯的所選離子是87amu、89amu禾B43.1amu。對于PHB提取而言，誘導(dǎo)型了431擬南芥植物被處理成葉面施加0.5mM的lmrepid。在使用標(biāo)準(zhǔn)的無水方案提取PHB之前，取得組織并使其干燥。實(shí)施例4:在經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的TiII和M擬南芥植物中PHB的產(chǎn)率采用葉面施加0.5mMIntrepid的方法對86株30日齡的第一代T,轉(zhuǎn)基因成熟植物和108株30日齡的^轉(zhuǎn)基因成熟植物的全部植株進(jìn)行處理或不對它們進(jìn)行處理，其中所述的86株30日齡的第一代T,轉(zhuǎn)基因成熟植物是使用II構(gòu)建體之一轉(zhuǎn)化的，而所述的108株30日齡的Ti轉(zhuǎn)基因成熟植物是使用31構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。通過使用誘導(dǎo)劑進(jìn)行處理，三基因誘導(dǎo)型構(gòu)建體31發(fā)生表達(dá)的植物積累了高達(dá)10dwt。/。的PHB。有趣的是，產(chǎn)生PHB最多的經(jīng)處理的31植物在誘導(dǎo)過程中發(fā)生萎黃病，但是在未處理的植物中未觀察到這種表現(xiàn)型。未處理的31植物不能積累高于0.37dwtM的PHB，它們平均比相同構(gòu)建體發(fā)生表達(dá)的經(jīng)處理的植物少產(chǎn)生6倍dwt%的PHB(參見表I)。與此形成對比的是，使用II構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物不能積累較高含量的PHB，該植物在誘導(dǎo)劑存在或不存在的條件下產(chǎn)生少于0.039dwte/。的PHB(參見表I)。該結(jié)果是未預(yù)料到的，這是因?yàn)镮I構(gòu)建體的誘導(dǎo)型硫解酶盒參與了產(chǎn)生31植物中較高含量的PHB。另外，之前已經(jīng)顯示，在組成型硫解酶存在的條件下，II構(gòu)建體的組成型還原酶和合成酶盒能夠催化組成型擬南芥植物產(chǎn)生11.5dwt。/。的PHB。通過篩選另外的235株TJI植物對II構(gòu)建體的進(jìn)一步分析表明，在進(jìn)行和不進(jìn)行誘導(dǎo)劑雙苯酰肼的葉面施用的條件下，植物分別能夠產(chǎn)生2.5dwt。/。和2.6dwt。/。的PHB。通過對最優(yōu)的TJI植物的72株子代T2進(jìn)行分析，證實(shí)了所述構(gòu)建體具有能夠以非誘導(dǎo)型的模式促進(jìn)PHB產(chǎn)生的能力。在誘導(dǎo)劑存在和不存的條件下，經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的T2II植物分別積累了平均為4.2土2.5dwt。/。和4.7±1.4dwt。/。的PHB。綜上所述，這些結(jié)果表明除非PHB產(chǎn)生途徑的全部基因被同時(shí)誘導(dǎo)，否則不能發(fā)生最佳誘導(dǎo)型PHB的生產(chǎn)。表I.在經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的TiII和31擬南芥植物中PHB的產(chǎn)率。經(jīng)處理的植物經(jīng)過葉面施加0.5mM的Intrepid。表I也示出了平均誤差和標(biāo)準(zhǔn)誤差。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實(shí)施例5:經(jīng)0.1mMMimi^根部浸漬的或未經(jīng)處理的T231植物的幼嫩組織中PHB產(chǎn)量的提髙將31植物使用O.lmM的Mimic通過根部浸漬(該技術(shù)被認(rèn)為可以通過根部來促進(jìn)蛻皮甾類的同化作用)進(jìn)行處理(參見文獻(xiàn)E.Unger"a/,7>a"&11，455(2002);Schena"a/，TVoc.Wgt".88,10421(1991))。選擇用于該研究的植物包括31植物7、11和12的T2子代。己經(jīng)表明當(dāng)使用lmMMimk^進(jìn)行噴撒時(shí)，這些L31植物積累了約2dwt%的PHB。T2植物表現(xiàn)型的分析顯示未經(jīng)處理的株系7植物在18天的過程中保持綠色和健康。與此形成對比的是，根部浸漬的株系7植物的幼齡葉表現(xiàn)為矮化的萎黃病表現(xiàn)型，該表現(xiàn)型具有植物的整個(gè)葉組織組成性地產(chǎn)生高含量的PHB的特征(參見文獻(xiàn)K.Bohmert"a/,P/a^a211,841,(2000))。在最初施用1^11^@的12天內(nèi)，隨著綠色且健康的正常大小的植物產(chǎn)生出異常的較小的黃色葉片，經(jīng)處理的誘導(dǎo)型植物所表現(xiàn)出的所述表現(xiàn)型很快變得明顯起來。株系ll和株系12的植物也得到了類似的結(jié)果。表現(xiàn)型的這種變化不能直接歸因于Mimic及其成分的負(fù)反應(yīng)，這是因?yàn)槭褂每蛰d體pCAM2300轉(zhuǎn)化的對照植物在使用Mimi浐進(jìn)行根部浸漬的過程中仍保持為綠色和健康。此外，生產(chǎn)PHB的組成型對照植物(CAB)在處理過程中保持萎黃病，與老葉組織成一定比例地產(chǎn)生幼齡葉，并且表現(xiàn)出與未經(jīng)處理的CAB植物類似的表現(xiàn)型。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明使用Mimi)進(jìn)行根部浸漬誘導(dǎo)了用于產(chǎn)生PHB所需的基因的表達(dá)，并且這些數(shù)據(jù)還表明所導(dǎo)致的PHB產(chǎn)生的增加引起了異常的較小的萎黃病葉子的產(chǎn)生。對如上所述的這些植物進(jìn)行GC/MS定量分析。未經(jīng)處理的株系7、ll和12植物含有少于2dwt。/。的PHB，但是在來自相同株系的經(jīng)處理的植物的幼齡葉中積累了超過14dwt。/。的PHB(參見表II)。平均計(jì)算，T231株系7植物的幼嫩組織中所觀察到的dwt。/。PHB含量是來自相同株系的未經(jīng)處理的植物的幼嫩組織中所檢測出的dwt%PHB含量的12倍。T231株系11和12植物也得到了類似的結(jié)果，這些植物表現(xiàn)為經(jīng)處理的幼齡葉中PHB積累量是未經(jīng)處理的幼嫩組織的14倍。對單獨(dú)的株系7植物中的聚合物含量的檢測表明在根部浸漬21天后，幼齡葉中的PHB的含量增加到37倍(參見表III)。來自株系ll和12的經(jīng)處理的幼嫩組織中記錄了聚合物產(chǎn)量分別增加到179倍和316倍(參見表in)。平均計(jì)算，來自經(jīng)處理的T2株系7、11和12植物的幼嫩組織分別積累了來自相同植物的較老組織的1.7倍、2.8倍和2.0倍的PHB(參見表II)。例如，最佳丁2株系的ll植物在經(jīng)處理的幼齡葉中積累了超過14dwty。的PHB，但是在較老組織中僅積累了7.0dwt。/。的PHB(參見表II)。表II.從使用0.1mMMimiZ進(jìn)行根部浸漬的或未經(jīng)處理的T231植物收集的幼齡葉和老葉中的PHB含量表II示出了最佳植物的PHB的產(chǎn)率。表II示出了IO個(gè)樣品的PHB含量的平均誤差和標(biāo)準(zhǔn)誤差。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表III.使用0.1mMMimic^進(jìn)行根部浸漬的或未經(jīng)處理的T231植物的幼嫩組織中PHB產(chǎn)量的提髙<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例6:使用濃度增加的Mhni(^和Intrepic^進(jìn)行根部浸漬和葉面施加的T331植物中PHB的收率使用濃度增加的Mimk^對最佳的T231植物株系7-32、7-39、11-106、11-108、12-113和12-119的子代進(jìn)行根部浸漬。通過加入O.OlmM那樣少量的]\^01&@來誘導(dǎo)產(chǎn)生聚合物，但是用O.lmM(株系7-32、7-39和11-106)或者l.OmM(株系11-108、12-113和12-119)的Mimk^進(jìn)行處理使得PHB的產(chǎn)量增多(參見圖7A)。例如，在沒有誘導(dǎo)劑時(shí)，株系11-108不能產(chǎn)生PHB，但是在分別使用O.OlmM和lmM的Mimic⑧進(jìn)行處理時(shí)，株系11-108平均積累了1.94±0.44%和3.13±0.38dwt。/。的PHB。在誘導(dǎo)劑不存在時(shí)，株系7-32和7-39中聚合物的積累含量較低表明這些株系是發(fā)生基因滲漏的。在使用1他—(1進(jìn)行根部浸漬的實(shí)驗(yàn)中得到了類似的結(jié)果。在使用O.OlmMIntrepic^進(jìn)行處理時(shí)產(chǎn)生的PHB的含量較低，但是使用O.lmM(株系11-106)、0.5mM(株系12-119)禾口l.OmM(株系7-32)的111化？1(1@可得產(chǎn)率提高的PHB(參見圖7B)。例如，株系12-119植物的平均PHB含量由未經(jīng)處理的植物中的0.43土0.17dwt%PHB分別增加到使用O.lmM111^1(1@進(jìn)行浸漬的植物中的2.12±0.60dwt%PHB和使用0.50mMIntrepicf進(jìn)行浸漬的植物中的4.02±0.82chvt%PHB。在所有情況下，在使用Intrepi(f進(jìn)行根部浸漬的植物中的聚合物的產(chǎn)量都超過在經(jīng)Mimic處理的植物中觀察到的聚合物的產(chǎn)量(參見圖7A-B)。這種發(fā)現(xiàn)，再結(jié)合甲氧蟲酰肼的預(yù)知的較高水溶性，可以表明葉面施加Intrepid②能夠誘導(dǎo)比使用Intrepid和Mimic⑧的根部浸漬技術(shù)中所觀察到的更高含量的PHB。使用0至l.OmM的Intrepic^通過葉面施用來處理T331株系7-32、11-106禾卩12-119。施用0.5mM的Intrepid⑧足以誘導(dǎo)植物株系7-32和11-106達(dá)到最高的聚合物產(chǎn)率，但是需要l.OmM的Intrepid誘導(dǎo)植物株系12-119達(dá)到最多的PHB產(chǎn)率(參見圖7C)。例如，株系7-32植物的平均PHB含量由未經(jīng)處理的植物中的1.65±0.23dwt%PHB分別增加到使用O.lmM111^1(1@進(jìn)行噴撒的植物中的2.59±0.41dwt%PHB和使用0.5mMIntrepid②進(jìn)行噴撒的植物中的7.57±2.60dwt%PHB。在使用0.5mMIntrepid⑧進(jìn)行噴撒時(shí)，最佳的T3植物(被命名為31-7-32-5)共積累11.5dwt。/。的PHB?？傮w而言，使用Intrepid⑧進(jìn)行葉面施加處理的植物比使用Mimi^或者Intrepid進(jìn)行根部浸漬的植物積累了更多的PHB(參見圖7A-C)。31-7-32-5植物沒有表現(xiàn)出其親本的明顯的矮化萎黃病幼齡葉表現(xiàn)型，但是31-7-32-5植物在相對正常大小的萎黃病幼齡葉和中齡葉中積累了PHB。老齡葉明顯保持綠色，但確實(shí)表現(xiàn)出生產(chǎn)PHB的某些萎黃病特征。綜上所述，這些結(jié)果表明通過多次傳代仔細(xì)選擇植物(與誘導(dǎo)劑的濃度、組成以及施加方法的最優(yōu)化方式相結(jié)合)可以使聚合物的總產(chǎn)率的提高。另外，這些結(jié)果證實(shí)通過葉面施加市售的殺蟲劑可以誘導(dǎo)產(chǎn)生PHB所涉及的整個(gè)途徑。權(quán)利要求1.一種用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中每個(gè)元件在5′至3′方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3′聚腺苷酸化信號序列。2.權(quán)利要求1所述的重組載體，其中各個(gè)元件中的所述誘導(dǎo)型啟動子選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子、原始霉素誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子、雌激素誘導(dǎo)型啟動子、銅誘導(dǎo)型啟動子、除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子、乙醇誘導(dǎo)型啟動子、異丙基-(3-D-l-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子。3.權(quán)利要求2所述的重組載體，其中所述啟動子是由化合物活化的蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子，所述化合物選自蛻皮激素、雙苯酰肼、甲氧蟲酰肼、幕黎甾酮A、松甾酮A、昆蟲類固醇激素20-羥基蛻皮酮和籠蔽P-蛻皮激素。4.權(quán)利要求1所述的重組載體，其中各個(gè)元件中的所述啟動子是相同的啟動子。5.權(quán)利要求1所述的重組載體，其中各個(gè)元件中的所述啟動子是不同的啟動子。6.權(quán)利要求1所述的重組載體，其中所述的兩個(gè)或更多個(gè)元件包含編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自(3-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸P-氧化酶。7.權(quán)利要求1所述的重組載體，其中所述的兩個(gè)或更多個(gè)元件包含編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自硫酯酶、S-9-去飽和酶、co-3-去飽和酶、co-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。8.—種用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；兩個(gè)或更多個(gè)分別編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。9.一種用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中每個(gè)元件在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。10.權(quán)利要求8或9所述的重組載體，其中所述核酸序列編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自(3-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸(3-氧化酶。11.權(quán)利要求8或9所述的重組載體，其中所述核酸序列編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自硫酯酶、S-9-去飽和酶、(o-3-去飽和酶、co-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。12.權(quán)利要求8或9所述的重組載體，其中所述啟動子是四環(huán)素應(yīng)答型啟動子。13.—種用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，其用于指導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；兩個(gè)或更多個(gè)分別編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。14.一種用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體包含三個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少兩個(gè)所述元件分別在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。15.權(quán)利要求13或14所述的重組載體，其中所述的誘導(dǎo)型啟動子選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子、原始霉素誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子、雌激素誘導(dǎo)型啟動子、銅誘導(dǎo)型啟動子、除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子、乙醇誘導(dǎo)型啟動子、異丙基-(3-0-1-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子；所述激活蛋白分子或復(fù)合物是四環(huán)素調(diào)控型反式激活蛋白；并且所述的由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子是四環(huán)素應(yīng)答型啟動子。16.權(quán)利要求13或14所述的重組載體，其中由所述核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自P-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸(3-氧化酶。17.權(quán)利要求13或14所述的重組載體，其中由所述核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自硫酯酶、5-9-去飽和酶、co-3-去飽和酶、co-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。18.—種用于在植物中進(jìn)行表達(dá)的權(quán)利要求8、9、13或14中任意一項(xiàng)所述的載體。19.一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中每個(gè)元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。20.權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中各個(gè)元件中的所述誘導(dǎo)型啟動子選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子、原始霉素誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子、雌激素誘導(dǎo)型啟動子、銅誘導(dǎo)型啟動子、除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子、乙醇誘導(dǎo)型啟動子、異丙基-p-D-l-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子。21.權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的啟動子是由化合物活化的蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子，所述化合物選自蛻皮激素、雙苯酰肼、甲氧蟲酰肼、幕黎甾酮A、松甾酮A、昆蟲類固醇激素20-羥基蛻皮酮和籠蔽|3-蛻皮激素。22.權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中各個(gè)元件中的所述啟動子是相同的啟動子。23.權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述啟動子是蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子。24.權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中各個(gè)元件中的所述啟動子是不同的。25.權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的兩個(gè)或更多個(gè)元件包含編碼酶的核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自(3-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸P-氧化酶。26.權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的兩個(gè)或更多個(gè)元件包含編碼酶的核酸序列，所述酶選自硫酯酶、5-9-去飽和酶、w-3-去飽和酶、Q-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。27.—種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞包含用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；兩個(gè)或更多個(gè)分別編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。28.—種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞包含用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中每個(gè)元件在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。29.權(quán)利要求27或28所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的核酸序列編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自P-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸(3-氧化酶。30.權(quán)利要求27或28所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的核酸序列編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自硫酯酶、5-9-去飽和酶、co-3-去飽和酶、①-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。31.權(quán)利要求27或28所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的啟動子是四環(huán)素應(yīng)答型啟動子。32.—種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞包含用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；兩個(gè)或更多個(gè)分別編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。33.—種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞包含用于在生物合成途徑中的酶的表達(dá)的重組載體，該重組載體包含三個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少兩個(gè)所述元件分別在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列。34.權(quán)利要求32或33所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)型啟動子選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子、原始霉素誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子、雌激素誘導(dǎo)型啟動子、銅誘導(dǎo)型啟動子、除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子、乙醇誘導(dǎo)型啟動子、異丙基-(3-D-l-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子；所述激活蛋白分子或復(fù)合物是四環(huán)素調(diào)控型反式激活蛋白；并且所述的由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子是四環(huán)素應(yīng)答型啟動子。35.權(quán)利要求32或33所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述的核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自..P-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸卩-氧化酶。36.權(quán)利要求32或33所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自硫酯酶、5-9-去飽和酶、co-3-去飽和酶、co-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。37.—種用于在植物中制造生物合成產(chǎn)物的方法，該方法包括a)將重組載體引入植物中，所述重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中每個(gè)元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；以及b)使用誘導(dǎo)劑活化所述的誘導(dǎo)型啟動子。38.權(quán)利要求37所述的方法，其中各個(gè)元件中的所述誘導(dǎo)型啟動子選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子、原始霉素誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子、雌激素誘導(dǎo)型啟動子、銅誘導(dǎo)型啟動子、除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子、乙醇誘導(dǎo)型啟動子、異丙基-(3-D-l-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子。39.權(quán)利要求38所述的方法，合物活化的蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子，苯酰肼、甲氧蟲酰肼、幕黎甾酮A、羥基蛻皮酮和籠蔽P-蛻皮激素。40.權(quán)利要求37所述的方法，相同的啟動子。41.權(quán)利要求37所述的方法，不同的啟動子。其中所述的誘導(dǎo)型啟動子是由化，所述化合物選自蛻皮激素、雙、松甾酮A、昆蟲類固醇激素20-其中各個(gè)元件中的所述啟動子是其中各個(gè)元件中的所述啟動子是42.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動子是通過經(jīng)葉面噴撒或根部浸漬的化學(xué)制劑活化的。43.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的生物合成產(chǎn)物是聚羥鏈烷酸酯，并且所述的兩個(gè)或更多個(gè)元件包含編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自P-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸(3-氧化酶。44.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的生物合成產(chǎn)物是經(jīng)改性的油，并且所述的兩個(gè)或更多個(gè)元件包含編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自硫酯酶、5-9-去飽和酶、(O-3-去飽和酶、0D-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。45.—種用于在植物中制造生物合成產(chǎn)物的方法，該方法包括a)將兩個(gè)或更多個(gè)重組載體引入植物中，其中至少一個(gè)所述的重組載體在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少一個(gè)所述重組載體在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；兩個(gè)或更多個(gè)分別編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；以及b)使用誘導(dǎo)劑活化所述的誘導(dǎo)型啟動子。46.—種用于在植物中制造生物合成產(chǎn)物的方法，該方法包括a)將兩個(gè)或更多個(gè)重組載體引入植物中，其中至少一個(gè)所述的重組載體在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少一個(gè)所述的重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中各個(gè)元件分別在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；以及b)使用誘導(dǎo)劑活化所述的誘導(dǎo)型啟動子。47.—種用于在植物中制造生物合成產(chǎn)物的方法，該方法包括a)將單個(gè)重組載體引入植物中，所述單個(gè)重組載體包含兩個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；兩個(gè)或更多個(gè)分別編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；以及b)使用誘導(dǎo)劑活化所述誘導(dǎo)型啟動子。48.—種用于在植物中制造生物合成產(chǎn)物的方法，該方法包括a)將單個(gè)重組載體引入植物中，所述單個(gè)重組載體包含三個(gè)或更多個(gè)元件，其中至少一個(gè)所述元件在5'至3'方向上可操作地連接有誘導(dǎo)型啟動子，其用于指導(dǎo)一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或復(fù)合物的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；一個(gè)或更多個(gè)編碼激活蛋白分子或者復(fù)合物的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；并且至少兩個(gè)所述元件分別在5'至3'方向上可操作地連接有由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子，該啟動子用于指導(dǎo)核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白質(zhì)的核酸序列；以及3'聚腺苷酸化信號序列；以及b)使用誘導(dǎo)劑活化所述誘導(dǎo)型啟動子。49.權(quán)利要求45-48中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物合成產(chǎn)物是聚羥鏈烷酸酯，并且由所述的核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自(3-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸(3-氧化酶。50.權(quán)利要求45-48中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的生物合成產(chǎn)物是經(jīng)改性的油，并且由所述核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自硫酯酶、5-9-去飽和酶、o-3-去飽和酶、co-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。51.權(quán)利要求45-48中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)型啟動子選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子、原始霉素誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子、雌激素誘導(dǎo)型啟動子、銅誘導(dǎo)型啟動子、除草劑安全劑誘導(dǎo)型啟動子、乙醇誘導(dǎo)型啟動子、異丙基-p-D-l-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子；所述激活蛋白分子或復(fù)合物是四環(huán)素調(diào)控型反式激活蛋白；并且所述的由激活蛋白分子或復(fù)合物活化的啟動子選自四環(huán)素應(yīng)答型啟動子、原始霉素誘導(dǎo)型啟動子。52.權(quán)利要求45-47中任意一項(xiàng)所述的方法，其中由所述的核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自(3-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶、PHB合成酶、PHA合成酶、蘇氨酸脫水酶、脫水酶、異構(gòu)酶、丙酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A合成酶、羥酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脂肪酸合成酶和脂肪酸卩-氧化酶。53.權(quán)利要求45-48中任意一項(xiàng)所述的方法，其中由所述核酸序列編碼的所述蛋白質(zhì)選自硫酯酶、5-9-去飽和酶、-3-去飽和酶、co-6-去飽和酶、脂肪酸延長酶、羥化酶和三酰甘油生物合成酶。54.權(quán)利要求45-48中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)型啟動子是通過經(jīng)葉面噴撒或根部浸漬的化學(xué)制劑活化的。全文摘要本發(fā)明提供了用于引入編碼多酶生物合成途徑中的酶的多個(gè)基因的方法和構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含兩個(gè)或更多個(gè)編碼酶的基因，所述的每個(gè)基因都處于誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下，并且所述的每個(gè)基因都具有聚腺苷酸化信號。所述構(gòu)建體用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，在該轉(zhuǎn)基因植物中，當(dāng)施加化學(xué)誘導(dǎo)劑時(shí)，酶的表達(dá)增強(qiáng)，并且產(chǎn)生了由所述轉(zhuǎn)基因編碼的一系列酶的生物合成產(chǎn)物?？梢允褂眠@樣的構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含兩個(gè)或更多個(gè)酶編碼基因，該酶編碼基因處于一個(gè)或更多個(gè)啟動子的調(diào)控下，所述啟動子由一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因所表達(dá)的激活蛋白分子或復(fù)合物所活化，所述的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因本身處于一個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下，并且所述的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因在外部施加化學(xué)制劑之后被開啟。表達(dá)激活蛋白分子或復(fù)合物的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因可以被包含在含有編碼多酶生物合成途徑中的酶的多個(gè)基因的相同的構(gòu)建體中?？晒┻x擇的其它方式是，表達(dá)激活蛋白分子或復(fù)合物的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因可以在與編碼多酶生物合成途徑中的酶的多個(gè)基因不同的構(gòu)建體中?？梢允褂锰幱诜腔钚孕问降慕M成型啟動子來表達(dá)激活蛋白分子，其中所述的組成型啟動子是在施加化學(xué)誘導(dǎo)劑之后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问降摹Ｎ臋n編號C12N15/82GK101184846SQ200680016911公開日2008年5月21日申請日期2006年3月16日優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日發(fā)明者克里斯蒂·D·斯內(nèi)爾,勞拉林·庫爾茨,奧利弗·P·皮普爾斯申請人:梅塔波利克斯公司