專利名稱：來自原核細(xì)胞的重組n-糖基化蛋白的制作方法
來自原核細(xì)胞的重組N-糖基化蛋白
本發(fā)明涉及N- ^f唐基化蛋白的重組，包4舌一種或一種以上引 入的N -糖基化優(yōu)化氨基酸共有序列、編碼這些蛋白的核酸和相 應(yīng)的載體和宿主細(xì)胞。另外，本發(fā)明介紹了所述蛋白、核酸、載 體和宿主細(xì)胞在制備藥物過程中的應(yīng)用。而且，本發(fā)明提供了制 備所述蛋白的方法。
背景技術(shù)：
N -連4妄的蛋白質(zhì)糖基化作用是真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)生的一 種基本的且保守的過程。這一過程對于蛋白質(zhì)折疊、低聚反應(yīng)、 穩(wěn)定性、質(zhì)量控制、分類和分泌物及膜蛋白的傳遞十分重要 (Helenius, A., and Aebi, M. (2004)。 N -連接的聚糖在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 作用Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049).
蛋白質(zhì)糖基化作用對蛋白質(zhì)的抗原性、穩(wěn)定性和半衰期具有 明顯的影響。另外，糖基化作用可以通過色譜法，例如通過結(jié)合 在固相上的外源凝集素配體與蛋白質(zhì)糖基化部分的相互作用幫 助蛋白質(zhì)純化。因此，已經(jīng)有完整的實(shí)施方法在真核細(xì)胞中重組 生產(chǎn)糖基化的蛋白質(zhì)，從而提供生物學(xué)上和藥學(xué)上有效的糖基化 模式。
近幾年，有研究指出， 一種細(xì)菌，食物傳4番病原菌空腸彎曲 桿菌可以N-糖基化其蛋白質(zhì)(參見Szymanski,等人1999年所 著的文獻(xiàn)《空腸彎曲桿菌中普通蛋白糖基化作用的證據(jù)》發(fā)表于 Mol. Microbiol. 32, 1022-1030 )。片唐基^f匕作用所需的4幾理4皮聚集在
所謂pgl區(qū)域的12個(gè)基因編碼。N -糖基化作用的石皮壞影響空 腸彎曲桿菌的侵入和發(fā)病機(jī)理，但在大多數(shù)真核生物中這并不是 致命的(參見BurdaP.和M. Aebi, 1999年發(fā)表的文獻(xiàn)《N — #唐基 化作用的長醇途徑》Biochim Biophys Acta 1426(2):239-57)?？梢?通過在大腸桿菌中同時(shí)重組表達(dá)pgl區(qū)域和受體一唐蛋白來重新組 成空腸彎曲桿菌蛋白的N -糖基化作用(Wacker等人2002年發(fā) 表的文獻(xiàn)《空腸彎曲桿菌中N-連接的糖基化作用沖幾其向大腸桿 菌中的功能性轉(zhuǎn)移》Science 298， 1790-1793 )。
歐洲專利申請第03 702 276.1號(歐洲專利1 481 057)，是本 發(fā)明發(fā)明人的一個(gè)早期的發(fā)明，它教導(dǎo)了一種原核生物體，向此 原核生物體引入一種核酸，來編碼(i)為了在脂質(zhì)體載體中組成 低聚糖的具體的糖基化轉(zhuǎn)移酶，(ii) 一種包括共有序列"N-X-S/T "的重組耙向蛋白質(zhì)，其中X可以是除脯氨酸之外的任何一種 氨基酸，和(iii) 一種空腸彎曲桿菌的低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OTase) 這種轉(zhuǎn)移酶將所述低聚糖共價(jià)連4妄到耙向蛋白質(zhì)的共有序列上。 所述原核生物體產(chǎn)生具有特異性結(jié)構(gòu)的N -聚糖，這種特異性結(jié) 構(gòu)是由具體的糖基化轉(zhuǎn)移酶的種類所決定的。
即使在蛋白質(zhì)中存在的已知的N -糖基化共有序列允許靶向 蛋白質(zhì)，包括空腸彎曲桿菌的低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OTase),在原核 生物體中進(jìn)行N-糖基化重組，^f旦是這些靶向蛋白質(zhì)的N-糖基化 作用往往效率4交j氐。
本發(fā)明的目的是提供蛋白和生產(chǎn)這種具有優(yōu)化的N -糖基 化作用的蛋白的方法和途徑，所述N-糖基化作用可以在原核生 物體內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在重組蛋白中更有效的引入 N-聚糖，從而修飾重組蛋白的抗原性、穩(wěn)定性、生物活性、預(yù) 防和/或治療活性。本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于提供一種宿主細(xì)胞，
所述宿主細(xì)胞能夠在其表面有效展示本發(fā)明的重組N -糖基化 蛋白。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種重組N-糖基化蛋 白，所述N -沖唐基4匕蛋白包4舌一種或一種以上的以下N - #唐基 化優(yōu)化的氨基酸序列
D/E - X - N - Z - S/T,(優(yōu)化的共有序列)
其中，X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸，其 中向至少一種中引入所述局部N-糖基化的氨基酸序列。
令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，向蛋白質(zhì)中引入指定的部分氨基酸序列 (優(yōu)化的共有序列)能夠得到一種蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)通過低聚 糖基轉(zhuǎn)移酶(OST, OTase)在引入位點(diǎn)進(jìn)行有效地N -糖基化，其 中所述低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OST，OTase)來自彎曲桿菌屬細(xì)菌，優(yōu) 選空腸彎曲4干菌。
文中使用的術(shù)語"部分氨基酸序列"是指"優(yōu)化的共有序列"。 優(yōu)化的共有序列通過低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OST, [MWI] OTase)進(jìn)行 N-糖基化，其中所述低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OST, OTase)來自彎曲桿 菌屬細(xì)菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌，所述共有序列比本發(fā)明所屬技術(shù) 4頁;或的5見有沖支術(shù)中常用的共有序列"N - X - S/T "更加有步爻。
通常，術(shù)語"重組N 4#基化蛋白質(zhì)"是指4壬<可一種產(chǎn)生在宿主 細(xì)胞中的異源的聚或 <氐聚肽，所述宿主細(xì)l包不天然地包括編碼所 述蛋白質(zhì)的核酸。在本發(fā)明環(huán)境中，該術(shù)語是指通過在任i"可一種 宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其中所述宿主細(xì)胞例如真核的或 原核的宿主細(xì)力包，Y尤選原核宿主細(xì)力包，例如i矣希氏斥干菌屬、彎曲 桿菌屬細(xì)菌、沙門氏菌、志賀氏菌屬、幽門螺桿菌、《艮單胞菌屬、
桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌、空腸彎曲桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌等等， 其中編碼所述蛋白質(zhì)的核酸已經(jīng)被引入所述宿主細(xì)胞中，且其中 編碼的蛋白質(zhì)通過來自彎曲桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的
OTase進(jìn)行N -糖基化，所述轉(zhuǎn)移酶天然存在于宿主細(xì)胞中或被 重組整入所述宿主細(xì)月包。
依照國際上普遍^妻受的氨基酸字母代碼，縮寫D、 E、 N、 S 和T分別表示天冬氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺、絲氨酸和蘇氨酸。 本發(fā)明蛋白質(zhì)與天然的或現(xiàn)有技術(shù)中記載的蛋白質(zhì)之間的區(qū)別 在于引入了一個(gè)或一個(gè)以上優(yōu)化的共有序列D / E - X - N - Z -SfT,并發(fā)生N-糖基化。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)與天然存在的空 腸彎曲桿菌蛋白質(zhì)的區(qū)別在于，雖然天然存在的空腸彎曲桿菌蛋 白質(zhì)也包含優(yōu)化的共有序列，但他不包含任何一種其他的(引入 的)優(yōu)化共有序列。
優(yōu)化的共有序列的引入可以通過添力口 、刪除和/或耳又 —種或 一種以上氨基酸來完成。為了實(shí)現(xiàn)引入優(yōu)化共有序列的目的而進(jìn) 行的 一種或一種以上氨基酸的添加、刪除和/或耳又代可以通過本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員已知的化學(xué)合成方式來完成，所述本領(lǐng)域普通才支 術(shù)人員已知的化學(xué)合成方式例如固相參與的^^學(xué)肽合成過程。作 為選^奪，本發(fā)明的蛋白，可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組4支術(shù)，優(yōu)選大的多肽 的重組纟支術(shù)來制備。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)，即它們可以在任何一種原核 宿主中高效生產(chǎn)，其中原核宿主包括一種來自彎曲桿菌屬細(xì)菌、 優(yōu)選空腸彎曲桿菌的功能性pgl梯:縱子。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)施 方案，優(yōu)選可供選4奪的來自彎曲桿菌屬細(xì)菌的OTases是大腸彎 曲桿菌和紅嘴鷗彎曲4干菌(參見Szymanski, CM和Wren, B. W. (2005)等人所著的名為《細(xì)菌粘膜病原體中的蛋白質(zhì)糖基化作用》 Nat. Rev. Microbiol. 3: 225- 237 )。當(dāng)所述原核宿主是彎曲桿菌屬
細(xì)菌、優(yōu)選空腸彎曲桿菌時(shí)，天然存在功能性pgl操縱子。然而， 如本領(lǐng)域之前的研究和上面的描述，pgl操縱子可以被傳遞進(jìn)入
細(xì)胞中并在所述新的細(xì)胞環(huán)境中保持功能性。
術(shù)語"來自彎曲桿菌屬細(xì)菌、優(yōu)選空腸彎曲桿菌的功能性pgl 操縱子"是指編碼功能性彎曲桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌低
聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OTase)和一個(gè)或一個(gè)以上能夠在脂類載體中集 合低聚糖的特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶的核酸簇，其中，所述低聚糖可 以通過O Ta s e從脂類載體中轉(zhuǎn)移到靶向蛋白質(zhì)中，所述靶向蛋白 質(zhì)具有一個(gè)或一個(gè)以上優(yōu)化氨基酸序列D/E-XN-Z-S/T。 應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明中的術(shù)語"來自彎曲桿菌屬細(xì)菌、優(yōu)選空腸彎曲 桿菌的功能性pgl操縱子"不需要涉及單一轉(zhuǎn)錄單位的操縱子。該 術(shù)語僅僅需要在一個(gè)宿主細(xì)胞中存在用于重組蛋白質(zhì)N -糖基化 作用的功能成分。這種成分可以作為一種或一種以上單獨(dú)的 mRNAs轉(zhuǎn)錄并且可以4皮同時(shí)調(diào)節(jié)或分別。例如，本術(shù)i吾也包括-在宿主細(xì)胞基因DNA和質(zhì)粒位點(diǎn)上的功能成分。為了提高效率， 優(yōu)先同時(shí)調(diào)節(jié)并表達(dá)功能性pgH喿縱子的所有成分。
認(rèn)識到以下幾點(diǎn)是非常重要的，即只有功能性低聚糖基轉(zhuǎn) 移酶(OTase)來自彎曲桿菌屬細(xì)菌、優(yōu)選空腸彎曲桿菌；且一種 或一種以上的能夠在脂類載體上集合低聚糖的特異性糖基化轉(zhuǎn) 移酶可以來自宿主細(xì)月包或者可以,皮重^L^ 1入所述宿主細(xì)月包，p舉一 的功能性限制是通過所述糖基化轉(zhuǎn)移酶集合的低聚糖可以通過 OTase乂人脂類載體轉(zhuǎn)移到具有一個(gè)或一個(gè)以上優(yōu)化共有序列的耙 向蛋白質(zhì)中。因此，天然包括特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)l包和 /或非天然存在特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞的選擇，和異源特 異性糖基化轉(zhuǎn)移酶的引入使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠改變在本發(fā)明 蛋白質(zhì)同 一位點(diǎn)進(jìn)行N -糖基化作用時(shí)結(jié)合的N -聚糖。
如上所述，本發(fā)明提供了本發(fā)明蛋白質(zhì)上不同的N-聚糖-模
式設(shè)計(jì)。因此，這些蛋白質(zhì)可以通過其N-聚糖模式相區(qū)別，從而
滿足生物學(xué)、藥學(xué)和純化需要。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)可能包括一個(gè)，也
可以多于一個(gè)，^f尤選至少兩個(gè)、^尤選至少3個(gè)、更4尤選至少5個(gè) 所述N -糖基化優(yōu)化氨基酸序列。
在本發(fā)明蛋白質(zhì)中存在的一個(gè)或一個(gè)以上N 4唐基化優(yōu)化的 氨基酸序列對增加它們的抗原性、增加它們的穩(wěn)定性、改變它們 的生物活性、延長它們的生物半衰期和/或簡化它們的純化過禾呈十 分有利。
優(yōu)化的共有序列在X和Z位置可以包括除了脯氨酸之外的<壬 何一種氨基酸。術(shù)語"任何一種氨基酸"包括常見的和不常見的天 然氨基酸以及合成的氨基酸衍生物和允許通過OTase進(jìn)一步N -^唐基化優(yōu)化共有序列的類似物。優(yōu)選用于X和Z的是天然存在 的常見的和不常見的氨基酸，且X和Z可以是相同的也可以是 不同的。
應(yīng)當(dāng)注意，在本發(fā)明蛋白質(zhì)中，對于每個(gè)優(yōu)化的共有序列X 和Z可以是不同的。
當(dāng)在脂類載體上集合低聚糖用于通過OTase傳遞時(shí)，通過特 異性糖基化轉(zhuǎn)移酶及其相互作用來確定結(jié)合優(yōu)化共有序列的N -聚糖。通過改變存在于理想宿主細(xì)胞中的特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶的 類型和用量，本領(lǐng)域4支術(shù)人員可以i殳計(jì)N-聚糖。
這里定義的N-聚4唐例如可變組合物的單-、寡-或多#唐，該可 變組合物在蛋白質(zhì)中通過N -配糖鍵與s-天門冬酰胺殘基的酰胺
態(tài)氮相連。優(yōu)選地，通過OTase傳遞的N-聚糖在十一葵烯醇-焦 磷酸鹽脂質(zhì)體-載體上集合，所述十一葵烯醇-焦磷酸鹽脂質(zhì)體-載體存在于革蘭氏陰性或陽性細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)"莫上。它們與O抗
原、0多糖和肽聚糖的有關(guān)(Bugg, T. D.， and Brandish, P. E. (1994). From peptidoglycan to glycoproteins: common features of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis. FEMS Microbiol Lett 119, 255-262; Valvano， M. A. (2003). Export of O鄰ecific lipopolysaccharide. Front Biosci 8, S452-471).
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)包括一個(gè)或 一個(gè)以上N-聚糖，所述N-聚糖選自來自彎曲桿菌屬細(xì)菌、優(yōu) 選空腸彎曲桿菌的N -聚糖；寡糖和多糖:帔轉(zhuǎn)入O抗原中在革蘭 氏陰性細(xì)菌中形成的O多糖或在革蘭氏陽性細(xì)菌，優(yōu)選綠膿桿菌 09、 011,大腸桿菌07、 09、 016、 0157和志賀氏痢疾桿菌Ol 中形成的莢膜多糖衍生得到的N -聚糖及其通過插入或刪除糖基 化轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶改變多糖結(jié)構(gòu)得到的工程變體。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)包括兩個(gè) 或兩個(gè)以上不同的N-聚4唐。
侈寸^口, 可6
沉默因子、增強(qiáng)因子和/或減少因子來啟動(dòng)、沉默、增強(qiáng)和/或減 少單獨(dú)的特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子活性，來控制特異性糖基 化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的次數(shù)，從而在相同蛋白質(zhì)上來制備不同的N -聚糖。
講是已知的，在此不作進(jìn)一步論述，
本發(fā)明沒有限制重組蛋白質(zhì)的來源。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選書f生于 哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、病毒、真菌或植物蛋白。更優(yōu)選的，蛋白質(zhì)衍 生于哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的衍生于人蛋白。為了制備本發(fā)明抗原重
組蛋白質(zhì)，尤其是用作疫苗活性組分的蛋白質(zhì)，優(yōu)選的重組蛋白 質(zhì)衍生于細(xì)菌、病毒或者真菌蛋白質(zhì)。
在一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明才是供了一種重組蛋 白質(zhì)其中的蛋白質(zhì)和/或N-聚糖具有治療和/或預(yù)防活性。至少一
個(gè)優(yōu)化的和N 4唐基化的共有序列的引入可以為一種蛋白質(zhì)改進(jìn)
或者引入治療和/或預(yù)防活性。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)和
/或N -聚糖具有免疫活性。在這種情況下，引入的N-糖基化作 用可能對蛋白質(zhì)生物活性帶來一種修飾性影響，和/或與1入新的抗 原位點(diǎn)和/或可以掩蓋蛋白質(zhì),人而避過降解步艱《和/或延長半衰 期。
本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)可以有效地靶向宿主細(xì)胞的外膜和/或 表面，其中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選細(xì)菌，更優(yōu)選革蘭氏陰性細(xì)菌。 為了有助于表面表達(dá)和/或外膜定位，本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)優(yōu)選進(jìn) —步包4舌至少 一 個(gè)多月太序列，該多月太序列能夠革巴向所述重《且蛋白 質(zhì)到細(xì)菌、優(yōu)選革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜和/或細(xì)胞表面上。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)是一種蛋白 質(zhì)，其中所述乾向多肽序列選自由II型信號肽(Paetzel, M., Karla, A., Strynadka, N.C., and Dalbey, R. E. 2002. Signal peptidases. Chem Rev 102: 4549-4580.)或夕卜膜蛋白(參見Wemems, H., and Stahl, S. 2004. Biotechnological applications for surface-engineered bacteria. Biotechnol Appl Biochem 40: 209-228.[mk2])組成的組 中，優(yōu)選的選自由空腸彎曲桿菌OmpHl全長蛋白質(zhì)或信號肽、 空腸彎曲桿菌的JIpA、大腸桿菌外膜蛋白、優(yōu)選OmpS、 OmpC、 OmpA、 OprF、 PhoE、 LamB、 Lpp ' OmpA (—種用于表面表達(dá) 工藝的融合蛋白質(zhì)，參見Francisco, JA1 Earhart, C. F., and Georgiou, G. 1992. Transport and anchoring of beta- lactamase to
the external surface of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 89: 2713- 2717.)和來自綠膿斥干菌的lnp蛋白質(zhì)所組成的組中。
在其他方面，本發(fā)明涉及一種編碼本發(fā)明重組蛋白質(zhì)的核 酸。優(yōu)選的，所述核酸是一種信使核糖核酸、 一種DNA或一種 PNA,更優(yōu)選的所述核酸是信使核糖核酸或DNA,最優(yōu)選的， 所述核酸是一種DNA。這種核酸可以包4舌編碼所述蛋白質(zhì)的序 列，另外，其他序列，例如調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、纟冬 止密碼子、起始密碼子和通過之前提到的調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)重組蛋白 質(zhì)表達(dá)所需要的基因，等等。術(shù)語"編碼本發(fā)明重組蛋白質(zhì)的核 酸"是指一種核酸，這種核酸包4舌所述編碼序列和4壬選地其他核 酸序列，只要序列信息使核酸在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明的重組蛋 白質(zhì)，所述宿主細(xì)胞包含來自彎曲桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選空腸彎曲沖干 菌的功能性pgl操縱子。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了分離并純化的 核酸，所述核酸與啟動(dòng)子可纟喿作的相連，優(yōu)選連接的啟動(dòng)子選自 由已知可歸納的和構(gòu)成的原核啟動(dòng)子所組成的組，更優(yōu)選四環(huán)素 啟動(dòng)子、阿^立伯lt啟動(dòng)子、7jc楊酸鹽啟動(dòng)子、lac-、 trc-、和tac 啟動(dòng)子 (Baneyx, F. (1999). Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 10， 411-421 ; Billman-Jacobe, H. (1996). Expression in bacteria other than Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 7, 500-504 )。 f斤述可4喿4乍連 ，接的核S臾可以用于，例如，4妾種疫苗。
此外，本發(fā)明的另 一方面涉及一種包4舌本發(fā)明核酸和/或載體 的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的種類并不僅限于它能夠調(diào)節(jié)來自空腸彎
曲讒干菌的功能性pgl操:纟從子和一個(gè)或一個(gè)以上編碼本發(fā)明重組革巴 向蛋白質(zhì)的核酸。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核的宿主細(xì)胞，更優(yōu)選的 是細(xì)菌，最優(yōu)選的是選自由埃希氏桿菌屬、彎曲桿菌屬細(xì)菌、沙 門氏菌、志賀氏菌屬、幽門螺桿菌、H單胞菌屬、桿菌，優(yōu)選大
腸桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌鏈Top10、 W3110、 CLM24、 BL21、 SCM6
和SCM7 (Feldman等人的，(2005).《在大腸才干菌中具有不同的 O抗原脂多糖結(jié)構(gòu)的N -連4妄的蛋白質(zhì)糖基化作用才幾制》Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102， 3016-3021 ; Alaimo, C， Catrein, I., Morf, L., Marolda, C. L., Callewaert, N., Valvano， M. A., Feldman, M. F., Aebi, M. (2006).《改變脂質(zhì)體連接的寡糖的兩個(gè)不同的但— 可互才灸的積J里》EMBO Journal 25, 967 - 976)、和腸道沙門菌鏈 SL3261 (腸道沙門菌LT2 (△ )aroA，參見Hoiseth、 S. K.,和Stocker B.A. 1981,《芳香-依賴型鼠傷寒沙門氏桿菌是非毒性的且有活 性疫苗的效力》和SL3261AwaaL所組成的組中。
在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明宿主細(xì)胞可以靶向外膜 和/或表面顯示本發(fā)明重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是一種重組 革蘭氏陰性細(xì)菌，其中具有i)一種基因型，所述基因型包括一 種核苷酸序列，該核苷酸序列用于編碼a)至少 一 個(gè)天然的或重 特異性糖基轉(zhuǎn)移酶，用于裝配在脂質(zhì)體載體上的低聚糖，b)至少 一個(gè)天然的或重組的來自彎曲桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的 原核低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OTase), c)至少一個(gè)本發(fā)明重組蛋白質(zhì)， 優(yōu)選進(jìn)一步包括一種耙向多肽的蛋白質(zhì)；和ii)一種表現(xiàn)型，該 表現(xiàn)型包括本發(fā)明的重組N -糖基化蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)位于和/或 在革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜上。
用于上述實(shí)施方案的宿主細(xì)l包優(yōu)選地選自由埃希氏斥干菌屬、 彎曲桿菌屬細(xì)菌、志賀氏菌屬、幽門螺桿菌和假單胞菌屬、沙門 氏菌、優(yōu)選大腸桿菌、更優(yōu)選大腸桿菌鏈Top10、 W3110、 CLM24、 BL21、 SCM6和SCM7、和腸道沙門桿菌鏈SL3261 、 SL3749和 SL326iAwaaL (參見Hoiseth, S. K.,和Stocker, B.A. 1981.《芳香 -依賴型鼠傷寒沙門氏桿菌是是非毒性的且有活性疫苗的效力》 Nature 291 :238 -239 )、 SL3749 (Kaniuk, N.A./Vinogradov, E.和 Whitfield, C. 2004.《用于在沙門氏菌中連接O抗原的脂多糖核
心受體結(jié)構(gòu)強(qiáng)度^L范調(diào)查WaaL "連接酶"不是唯一決定受體#爭 異性的決定《i》，JBiol Chem 279 :36470 -36480)。
由于本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)可以單獨(dú)和/或通過引入N -糖基化 作用位點(diǎn)來具有治療或預(yù)防活性，因此可以用于制備藥劑。用于 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的種類不受限制且因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)， 例如EPO、 IFN-a、 TNFala、 IgG、 IgM、 IgA、白細(xì)i包間介素、 細(xì)胞因子，用于疫苗的病毒和細(xì)菌蛋白質(zhì)，如空腸彎曲桿菌蛋白 質(zhì)^又舉凄史例例:^口 HisJ ( Cj0734c)、 AcrA ( Cj0367c)、 OmpHl (Qj0982c)、白喉毒素(CRM 197)、霍亂毒素、綠膿桿菌外源蛋 白，及其具有引入的優(yōu)化N-糖基化的共有序列，用于制備藥劑 (Wyszynska、 A., Raczko、 A. ， Lis, M.、和Jagusztyn畫Krynicka, E.K. ( 2004)。《具有無致病力的沙門氏菌疫苗4朱，能夠傳送空腸 彎曲桿菌72Dz / 92cjaA基因引起人體對野生型彎曲桿菌屬細(xì)菌 入侵的特異性體內(nèi)免疫反應(yīng)的雞口服免疫作用》，Vaccine 22, 1379 - 1389)。
另外，本發(fā)明的核酸和/或載體還可用于制備一種藥劑，優(yōu)選 用于基因治療的藥劑。
此外，本發(fā)明宿主細(xì)胞，優(yōu)選具有包括本發(fā)明N-糖基化重組 蛋白質(zhì)表現(xiàn)型的宿主細(xì)胞位于和/或在細(xì)菌，優(yōu)選一種革蘭氏陰性 細(xì)菌，更優(yōu)選上面列舉的革蘭氏陰性細(xì)菌中的任意 一個(gè)的外膜 上，所述宿主細(xì)胞尤其可用于制備藥劑。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于制備一種用于治療和/或預(yù)防 有需要的患者的疫苗。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明涉及本發(fā)明的核酸和/或載體 在制備用于治療或預(yù)防，優(yōu)選地通過基因治療法治療或預(yù)防有需 要的患者的藥劑中的應(yīng)用。
展示所述N -糖基化重組蛋白質(zhì)的本發(fā)明宿主細(xì)月包尤其可用
于制備疫苗，由于,皮展示的N -糖基化蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞表面上 和接近免疫細(xì)胞，尤其是其親水性N -聚糖的孔附近的大量表達(dá)， 同時(shí)由于活性助劑的存在，宿主細(xì)月包具有一些附加作用，這些助 劑甚至可以在某種程度上進(jìn)行復(fù)制并擴(kuò)增宿主細(xì)胞的疫苗作用。
優(yōu)選地，用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明醫(yī)藥的用途的宿主細(xì)月包是一種一皮減 弱的或一皮殺死的宿主細(xì)月包。
使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞制備藥劑，優(yōu)選疫苗的另 一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是 由于他們的細(xì)胞組分，宿主細(xì)胞可以譯導(dǎo)IgA抗體。
優(yōu)選地，才艮據(jù)本發(fā)明所述宿主細(xì)胞用于在動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng) 物、嚙齒動(dòng)物、綿羊、馬、犬齒、牛、或人體內(nèi)誘導(dǎo)IgA抗體。
優(yōu)選的，所述需要接種疫苗的患者是鳥類、哺乳動(dòng)物或魚， 優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選選自由牛、羊、馬、家犬、貓、和人所組 成的組，最優(yōu)選是人。也優(yōu)選家禽。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及一種藥物組合物，包4舌至少一個(gè)蛋 白質(zhì)，至少一個(gè)核酸，至少一個(gè)載體和/或至少一個(gè)4艮據(jù)本發(fā)明的 宿主細(xì)胞。包括蛋白質(zhì)或宿主細(xì)胞，優(yōu)選減弱或被殺死的宿主細(xì) 胞的藥劑的制備和包括用于基因治療的核酸和/或載體的藥劑的 制備在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。最終藥物組合物的制備方案和其給藥 的方式和細(xì)節(jié)耳又決于4吏用的蛋白質(zhì)、宿主細(xì)月包、核酸和/或載體。
在本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包4舌一種 藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或助劑。
本發(fā)明提供的藥物組合物包括下列成分中的至少 一種(i) 一種重組蛋白質(zhì)、 一種宿主細(xì)胞、 一種核酸和/或一種作為/編碼/ 表達(dá)本發(fā)明重組蛋白的重組載體，和(ii) 一種藥學(xué)上可4妻受的 貝武形劑、纟希釋劑和/或助劑。
合適的賦形劑、稀釋劑和/或助劑在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。 一種 賦形劑或稀釋劑可以是固體材料、半固體材料或液體材料，他們 可以用作活性成分的載體或介質(zhì)。制備組合物領(lǐng)域的普通4支術(shù)人 員才艮據(jù)選4奪產(chǎn)品的特定性質(zhì)、需要治療的疾病或病況、疾病或病 況的階段和其他相關(guān)情況可以很容易的選擇合適的形式和給藥 方式(雷明頓藥物科學(xué)，Mack出版公司(1990))。根據(jù)所選4奪 的藥學(xué)活性化合物的溶解性和化學(xué)性質(zhì)、選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn) 藥學(xué)操作確定藥學(xué)上可接受的稀釋劑或賦形劑的比例和性質(zhì)。所
述藥物可以被制成適于口力良、腸胃外給藥或局部使用的形式，可 以作為片劑、膠嚢、栓劑、溶液、懸浮液等等對患者給藥。本發(fā) 明藥學(xué)上可接受的化合物，盡管其本身是有效的，但是為了更加
穩(wěn)定、方便結(jié)晶、增加穩(wěn)定性等等，也可以-波配制成或者作為其 藥學(xué)上可4妄受的鹽的形式，例如酸加成鹽或減加成鹽的形式纟會藥。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面介紹了用于生產(chǎn)N-連接的糖基化蛋白 質(zhì)的方法，該方法包4舌以下步-驟
a)提供一種重組有機(jī)物，優(yōu)選原核有機(jī)物，這種有機(jī)物包括用于編碼下列物質(zhì)的核酸200680020861.X
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i) 一種來自彎曲桿菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的功能性pgl操縱 子，和
ii) 至少一個(gè)重組目標(biāo)蛋白，該重組目標(biāo)蛋白包4舌一個(gè)或一
個(gè)以上的如下N-糖基化優(yōu)化氨基酸共有序列D/E - X - N - Z -S/T,其中，X和Z可以是除了輔氨酸之外的任意氨基酸，且其中， 至少 一個(gè)所述N-糖基化優(yōu)化的氨基酸共有序列是,皮引入的，且
b)以適于N-糖基化的目標(biāo)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方式培養(yǎng)重組有機(jī)物。
優(yōu)選地，目標(biāo)蛋白質(zhì)是本發(fā)明上述重組蛋白質(zhì)中的一個(gè)。
在本發(fā)明優(yōu)選地方法中，來自彎曲桿菌，優(yōu)選空腸彎曲4干菌 的功能性操縱子pgl包括編碼下列物質(zhì)的核酸
i) 來自彎曲坤干菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的重組OTase，和
ii) 來自彎曲桿菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的重組的或天然的特 異性糖基化轉(zhuǎn)移酶；和/或
iii) 來自除了彎曲桿菌之外的重組的或天然的特異性糖基化 轉(zhuǎn)移酶；
用于在脂質(zhì)載體上組裝寡糖并通過OTase轉(zhuǎn)移成目標(biāo)蛋白。
此外，在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于制備本發(fā)明 宿主細(xì)^^的方法，所述方法包4舌一下步驟i)纟是供了一種革蘭氏 陰性細(xì)菌，ii)向所述細(xì)菌中引入至少一個(gè)4玄香酸序列，所述核 苷酸序列用于編碼a)至少一個(gè)用于在脂質(zhì)體載體上組裝低聚糖 的重組特異性糖基轉(zhuǎn)移酶，和/或b)至少一個(gè)來自彎曲桿菌屬細(xì)
菌、優(yōu)選空腸彎曲桿菌的重組低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(OTase),和/或c ) 至少一個(gè)重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)包4舌一個(gè)或一個(gè)以上下述
N國糖基化優(yōu)化的氨基酸共有序列D/E - X - N - Z - S/T,其中X 和Z可以是任何一種除脯氨酸之外的天然的氨基酸，并且其中至 少一個(gè)所述N -糖基化優(yōu)化氨基酸共有序列是被引入的，和iii) 培養(yǎng)所述細(xì)菌直到至少一個(gè)c)中核苷酸序列編碼的重組N -糖基 化蛋白質(zhì)被放置在革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜中和/或外膜中。
為了實(shí)現(xiàn)上述4尤選的方法，重《且原核生物體或宿主細(xì)月包^尤選 地選自由埃希氏桿菌屬、彎曲桿菌屬細(xì)菌、沙門氏菌、志賀氏菌 屬、幽門螺桿菌、假單胞菌屬、桿菌，優(yōu)選大腸埃希氏桿菌，優(yōu) 選大腸桿菌林ToplO、 W3110、 CLM24、 BL21、 SCM6和SCM7、 和S. enterica林SL3261、 SL3749和SL326iAwaaL。
另 一個(gè)優(yōu)選的用于生產(chǎn)、分離和/或純化本發(fā)明重組蛋白質(zhì)的 方法包括以下步驟a)根據(jù)權(quán)利要求15或16培養(yǎng)宿主細(xì)胞，b) 去掉所述重組革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜和c)復(fù)原所述重組蛋白質(zhì)。
用于去掉細(xì)胞外膜，優(yōu)選原核細(xì)胞外力莫，更優(yōu)選革蘭氏陰性 細(xì)菌細(xì)胞外膜的示范性方法是適當(dāng)?shù)拿复呋幚矸椒?、滲透壓休 克凈化溶解作用和法國熱蒸氣高壓方法。最優(yōu)選的，本發(fā)明涉及 一種方法，其中除了來自彎曲桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的 重組或天然的特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶選自來自細(xì)菌、archea和/或真 核生物的糖基化轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶，其中所述真核生物可以在 宿主細(xì)胞中功能性表達(dá)。


圖1表示了來源于構(gòu)建物A到C (參見實(shí)施例1 )的Lip蛋 白質(zhì)的N -糖基化作用。傳送來自空腸彎曲桿菌功能性pgl操縱子的大腸桿菌Top 10細(xì)胞(Wacker et al" 2002, supra )和編碼構(gòu) 建物A (第2條帶線)、B (第1條帶線)和C (第3條帶線)或 構(gòu)建物C具有突變D121A的突變體(第4條帶線)的質(zhì)粒。表 達(dá)蛋白質(zhì)并從周質(zhì)4是耳又物中純化。圖中顯示的是SDS - PAGE和 考馬斯亮藍(lán)染色劑染色的純化蛋白質(zhì)部分。
圖2表示了不同蛋白質(zhì)的N-糖基化作用分析，在CLM24細(xì) 胞中(Feldman et al., ( 2005).在大腸埃希氏桿菌中用不同的O抗 原脂多糖結(jié)構(gòu)引發(fā)N -連接的蛋白質(zhì)糖基J匕作用。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3016 - 3021)或ToplO細(xì)月包中(E纟且第1-6條帶) 或SCM7細(xì)月包中(Alaimo, C, Catrein, I., Morf， L., Marolda, C. L. Callewaert, N. Valvano, M. A., Feldman, M. F., Aebi, M. ( 2006).用 于改變脂質(zhì)體-連接寡糖的兩個(gè)不同但可互換的機(jī)理.EMBO Journal 25, 967 - 976) (E組，第7、 8條帶)表達(dá)來自質(zhì)粒中的所 述蛋白質(zhì)，分析所述蛋白質(zhì)通過空腸彎曲桿菌pgl才喿縱子(Wacker et al., 2002, supra)進(jìn)行的序列特異性N -糖基化作用。顯示的是 SDS - PAGE分離的周質(zhì)才是取物，所述周質(zhì)4是取物一皮轉(zhuǎn)入硝4匕纖 維膜并用特異性抗血清目測4企驗(yàn)。在組A-D中，最上面的組顯 示具有抗AcrA免疫血清的免疫印跡探針(Wacker et al. 2002, supra; Nita - Lazar， M.， Wacker， M., Schegg， B.， Amber， S., and Aebi, M. ( 2005).細(xì)菌N -連接的蛋白質(zhì)糖基化作用需要但并不 只需要N畫X畫S / T共有序列.Glycobiology 15， 361 - 367)，然而 底部的組顯示具有R12免疫血清的免疫印跡4笨4十(Wacker et al" 2002， supra)。 +和-表示細(xì)胞中存在功能性或突變體pgl操縱子。 組A包含可溶性野生型AcrA的樣品，所述樣品帶有pelB信號順 序和己histag (第1、 2條帶)、AcrA - N273Q (第3、 4條帶)、 和AcrA - D121A (第5條帶)。組B: AcrA (第1 、 2條帶)、AcrA -T145D (第3條帶)、AcrA - N123Q畫N273Q - T145D (第4、 5 條帶)。組C: AcrA - F115D - T145D(第1、 2條帶)、AcrA - N123Q
-N273Q國N272D (第3、 4條帶)。組D: AcrA - N273Q (第1 、 2條帶)、AcrA-N273Q - F122P (第3、 4條帶)。組E: CtxB (第 1、 2條帶)、CtxB國W88D (第3、 4條帶)、CtxB - Q56 / DSNIT (第5、 6條帶)和CtxB - W88D - Q56 / DSNIT。
圖3表示了 OmpHl上多重糖基化位點(diǎn)的機(jī)制。AwaaL抹 SCM6與質(zhì)粒pACYCpgl (編碼整個(gè)pgl位點(diǎn))和表達(dá)野生型 OmpHl (第1條帶)，OmpHlN139s — myc (第2條帶)，OmpHl
kgn—n1t ' (,fgdd—dsnh' —myc(第3條帶)QmpH 1
h畫)-翻丁— myC (第4條帶)，QmpH ，哉rgd—麗'—myc (第
5條帶)，OmpHl KQN-nlt. rgd-n工hfgdd—ds臘—myc (第6條帶)或
OmpHlRGD—NIT v83T-myc (第7條帶)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。細(xì)胞在有 氧條件下生長，分析前用0.5%阿拉伯糖誘變3小時(shí)。在如材料 和方法部分所述，平衡培養(yǎng)基的光學(xué)密度之后，TCA沉淀全細(xì)胞 溶菌液。用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二 氟乙烯膜上。第一組，以抗myc tag抗體為纟笨針的全細(xì)胞〉容菌液 的免疫印跡。下面一組，以聚糖-特異性抗血清為探針的全血 溶菌液免疫印跡。右邊顯示了未進(jìn)行外唐基化的和糖基化的 OmpHl 。
圖4,表達(dá)不同OmpHl變體的細(xì)胞的熒光顯^f敖鏡方法。包 含野生型OmpHl及其變體表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌林CLM24或 SCM6的培養(yǎng)基被平衡為OD6冊為0.25 /ml。用磷酸緩沖液(PBS ) 洗滌細(xì)胞兩次，將100 pl pH為7.4的細(xì)胞懸浮液倒在成凝膠狀的 玻璃斧反上，在增濕室中室溫條件下(RT)培養(yǎng)30分。全細(xì)月包免 疫熒光標(biāo)記的所有隨后的步驟都在增濕室中，室溫條件下進(jìn)4亍。 除去未結(jié)合的細(xì)胞，再室溫條件下用4%包含磷酸纟爰沖液的多聚 甲醛固定剩余物30分鐘。重要的是，通常認(rèn)為多聚甲醛不能夠 使細(xì)胞可滲透化但能夠通過完整的細(xì)胞膜使細(xì)胞保持
compartimentalization。用石粦酉臾纟爰沖液洗滌固定細(xì)l包兩；欠并在包含 5 °/0 BSA磷酸緩沖液的封閉液中重懸浮。封閉后，所述細(xì)胞與抗 —myc單克隆鼠IgG ( 1 : 50, Calbiochem )和/或#元—聚4唐抗血 清(1 : 4000 ) —起在100 juL包含5 % BSA的磷酸纟爰沖液中i咅養(yǎng) 1小時(shí)。用100 iaL "壽酸纟爰沖液洗滌細(xì)胞兩次，每次5分鐘并與結(jié) 合FITC (1 :250， Jackson lmmunoresearch Laboratories)的第二#元一 兔抗體和/或結(jié)合 Cy3 (1 :250, Jackson lmmunoresearch Laboratories)的抗-鼠抗體一起在100 jiL包含5 % BSA的磷酸 緩沖液中培養(yǎng)l小時(shí)。如果需要的話，在第二抗體培養(yǎng)過程中用 4, 6- 二氨基一2—苯基吲咮(DAPI) (Sigma) ( 0.5 (ig/ml ) 對細(xì)菌dna染色。從細(xì)胞磷酸緩沖液中洗去第二抗體，通過使 用封片劑(Vector實(shí)驗(yàn)室)將蓋片蓋在玻璃板上封固培養(yǎng)基并用 指甲油密封。使用Axioplan2顯微鏡(Carl Zeiss)進(jìn)行熒光顯微鏡 方5條。4吏用Adobe Photoshop CS2片反處J里圖片。SCM6會田月包表達(dá) OmpHl (A組)，OmpHl NI39S ( B組)，OmpHlC2°s ( C組)，OmpHl
KGN—NIT HFGDD—DSNIT ( d組 )OmpHl NIT,HFGDD—DSNIT (E組 )
OmpHl KFN-NIT RGD-NIT(F組)，0mpHlvs3T'KGN—N1T ( G組),和 OmpHl kgn-nhtrgd—nit,hfgdd—dsnit(h組)。第1欄是第2、 3、 4 欄圖片的合并，是在黑色背景下由灰色調(diào)表示。第2欄是由于 DAPI染色在灰色背景下顯示藍(lán)熒光，第3欄從聚糖特異性熒 光中顯示綠熒光，第4欄/人抗-myc染色中顯示紅熒光。
下面的實(shí)施例能夠進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不以任何方式作 為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例
AcrA作為模型蛋白的篩選，用于優(yōu)化N -糖基化
為了優(yōu)化N-糖基化所需的受體蛋白，在空腸彎曲桿菌并唐蛋
白AcrA ( Cj0367c )上進(jìn)4亍詳細(xì)的研究。AcrA是一種由350個(gè)氨 基酸殘基組成的周質(zhì)脂蛋白。已有文獻(xiàn)表明，向周質(zhì)部分分泌^f旦 并不錨地脂質(zhì)體的分泌物是糖基化作用所必需的(Nita-Lazar et al., 2005, supra)。當(dāng)在有5個(gè)5替在的N—連4姿的lt基^匕sequons (Nl 17, N123, N147, N273, N274)的大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，輸出信號 即可以是天然的AcrA信號序列也可以是異源的PeIB信號，其中 五個(gè)sequons中的兩個(gè)(N123和N273 (Nita-Lazar et al., 2005, s叩ra))可以在空腸彎曲桿菌和大腸桿菌中4吏用。選4奪AcrA作為 模型的原因是AcrA是唯一具有詳細(xì)的可利用結(jié)構(gòu)信息的空腸彎 曲桿菌的周質(zhì)N-糖基化蛋白。最近公開了來自革蘭氏陰性細(xì)菌 纟錄膿^干菌的AcrA同》矣^f本，MexA蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(Higgins et al., (2004)。細(xì)菌藥物流出泵周質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)，Proc. Natl. Acad. Sci. U SA101，9994-9999)。兩種蛋白都是所謂的周質(zhì)流出泵蛋白的 成員(PEP, (Johnson, J. M. and Church, G. M. (1999).不同蛋白質(zhì) 家族細(xì)菌流出泵周質(zhì)蛋白和外膜蛋白陣列和結(jié)構(gòu)的預(yù)測丄Mol. Biol. 287， 695-715))。拉長的分子包含三個(gè)線性排列的亞區(qū)a-螺旋、反向巻曲螺旋，該亞基在結(jié)構(gòu)域的底部結(jié)合在一起，隨后 是一種卩—桶區(qū)i或。在結(jié)晶中未包4舌23-28個(gè)N -末端殘基和 95-101個(gè)C -末端殘基。MexA和AcrA蛋白質(zhì)序列具有29.3 % 的同源性和50 %的相似性。因此，這兩個(gè)蛋白基本上表現(xiàn)出相 似的全4斤疊。
實(shí)施例1引發(fā)糖基化作用的肽初級序列的說明
眾所周知，石危辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與綠膿桿菌的MexA區(qū)域相似， 因此在空腸彎曲4干菌AcrA中形成一種緊密i也蛋白，該蛋白可以 在大腸4干菌種單《蟲的表達(dá)(參見Berg, A., and de Kok, A. (1997). 2-氧酸脫氫酶多酶復(fù)合物。石危辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)i或的中心作用.Biol.
Chem. 378, 617-634 )。為了在大腸桿菌中枱r-瞼那個(gè)受體肽序列在 pgl機(jī)制帶來的N -糖基化作用中是必不可少的，使用了 AcrA 的石克辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該區(qū)域用作分子架向周質(zhì)中傳遞不同場i也 的肽并在體內(nèi)呈遞癥合pgl才幾制。
因此，構(gòu)建編碼;石危辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Lip)的質(zhì)4立并與OmpA 信號序列進(jìn)行N-末端融合(Choi， J. H., and Lee, S. Y. (2004). ^f吏 用大腸#干菌分泌和月包外生產(chǎn)重組蛋白質(zhì).Appl Microbiol Biotechnol 64, 625-635),與hexa histag進(jìn)行C 一末端融合。在阿 拉伯糖啟動(dòng)字的控制下開始克隆，進(jìn)行基因表達(dá)。選4奪Lip區(qū)域 邊界氨基酸位點(diǎn)，從而在MexA的同一位點(diǎn)表現(xiàn)硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu) 域區(qū)域邊界。為了不同的肽接受N-聚糖的能力，在Lip區(qū)i或兩 個(gè)錘頭狀部分之間插入序列。該序列由包括空腸彎曲桿菌AcrA 的N -糖基化位點(diǎn)N 123的序列組成。所得的開放閱讀框由編碼 OmpA信號序列、N -末端AcrA錘頭狀部分(D60-D95,氨基酸 序列的數(shù)目是指成熟AcrA多肽序列的數(shù)目)、包含不同天然AcrA 糖基化N 123位點(diǎn)的序列(見下面)、C -末端AcrA-Lip (L167 -D 210)《垂頭狀部分和C-末端his-tag序列所組成。
通過使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)完成質(zhì)粒的構(gòu)建。在Lip兩部分 中間插入不同長度的三個(gè)包含AcrA天然N 123糖基化位點(diǎn)的序 列會產(chǎn)生三個(gè)不同的ORFs:
構(gòu)建物A包含A118-S130, 4尋到一種序列為
MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGD隨KGQTLFIEQDQASKDF NRSKALFSQLDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSWWWW H (sequence 1〉.
的蛋白質(zhì)(序列1 )。
構(gòu)建物B包含F(xiàn)122-E138，；彈到一種序列為
MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDQFNRSK ALFSQSAISQKELDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSWWW HWH (sequence 2).
的蛋白質(zhì)(序列2)。
構(gòu)建物C包含D121 -A127，得到一種序列為
MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFHEQDQDFNR SKALDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSHHHHHW (sequence 3).
的蛋白質(zhì)(序歹'J 3)。
序列的劃線部分表示OmpA信號肽，單獨(dú)劃線的殘基由于克 隆而引入的，或?yàn)榱耸沟鞍踪|(zhì)對降解作用有抵抗力而引入的。黑 體字相當(dāng)于AcrA N 123的糖基化作用位點(diǎn)。斜體字hexa -histag。在質(zhì)粒pEC415骨架中，在阿拉伯糖啟動(dòng)子的控制下表達(dá) 相應(yīng)基因(Schulz, H., He誕cke, H.，和Thony - Meyer, L. ( 1998). 血紅素陪伴分子的原型對細(xì)爿包色素C成熟作用是必要的。Science 281, 1197 - 1200)。到檢驗(yàn)三個(gè)序列中的哪個(gè)引發(fā)了 Lip蛋白質(zhì)的 糖基化作用，進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。傳送pACYCpg /或pACYCpg / mut ( Wacker et al" 2002, supra)的大腸才干菌Top 10細(xì)月包 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)和編碼構(gòu)建物A、 B或C的質(zhì) 粒在包含氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中生長直到37度下 OD值為0.5。為了感應(yīng)現(xiàn)象，加入1 / 1000體積的20 %阿拉伯 糖(w/v)液劑繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)月包2小時(shí)。然后通過離心作用收集細(xì) 胞并在20 mM Tris / HCI， pH為8.5, 20 %蔗糖(w / v ) 、 1 mM乙 二胺四乙酸、lmMPMSF、禾口 1 g/1 ( w/v)溶菌酶中重,斤懸浮 并在40度下培養(yǎng)1小時(shí)。得到周質(zhì)提取物之后制成球丸，并用1
/ 9體積(v / v )的10x緩沖液A ( 3 M NaCI, 0.5 M Tris / HC1, pH 8.0和0.1 M 口米p坐)#希釋，同時(shí)添力口 MgS04到2.5 mM。 乂人在1￡ 沖液A中的Amersham Pharmacia Biotech ( Uppsala, Sweden)中"f吏 用1mlNi-瓊脂糖凝膠色譜柱進(jìn)行Ni-親合純化。在包含0.25M 咪唑的緩沖液A中洗4是蛋白質(zhì)。
圖1顯示了/人Ni -純化的周質(zhì)沖是耳又物中洗:提出的考馬斯亮藍(lán) 染色的聚丙烯酰胺凝膠的峰值部分。表達(dá)分析表明構(gòu)建物B生產(chǎn) 了一種重要的單一蛋白質(zhì)種類(圖1，第1條帶)。構(gòu)建物A和 C產(chǎn)生除了重要蛋白質(zhì)之外的具有減慢電泳遷移率的第二蛋白帶 (圖1,第2、 3條帶)。通過MALDI - TOF / TOF (未顯示)i正 明大的蛋白質(zhì)種類的確,皮糖基化。在構(gòu)建物B中不存在^f旦在構(gòu)建 物A和C中存在的唯一的氨基酸是D121,天冬氨酸殘基2位點(diǎn) N -末尾連接到糖基化的N123。這說明D121通過OTase對糖基 化過程起了重要的作用。為了-瞼證D121對糖基化作用是必不可 少的，天冬氨酸殘基在構(gòu)建物C中突變?yōu)楸彼?。表達(dá)分4斤只產(chǎn) 生一個(gè)蛋白帶(圖l，第4條帶)，因此表示了 D121對于糖基 化作用是重要的。此外，人工肽顯示的蛋白質(zhì)可以被糖基化，這 一事實(shí)表示D / E - X - N - Y - S / T型的短肽包含所有用于空腸 彎曲桿菌-進(jìn)行N -糖基化作用的信息。
實(shí)施例2實(shí)施例1的核實(shí)AcrA - D121A在N 123位點(diǎn)沒有
進(jìn)行糖基化
為了證實(shí)肽顯示方法的發(fā)現(xiàn)，在全長可溶性AcrA蛋白質(zhì)121 位點(diǎn)(D121A,那就是說在糖基化N 123之前的2位殘基)上插 入天冬氨酸到丙氨酸的突變，該實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中進(jìn)行無論位點(diǎn) N123是否可以被糖基化。為了4全驗(yàn)這些，表達(dá)AcrA-D121A并 分析它的糖基化作用狀態(tài)。為了分析， -使用一種引發(fā)的AcrA。 這不同于原始空腸彎曲桿菌基因的地方在它包含用于向周質(zhì)中
分泌的PeIB信號順序(Choi and Lee, 2004, supra)和用于純化的 C-末端hexahistag。已經(jīng)表明，這種AcrA變體被分泌、信號肽-裂解和糖基化為脂質(zhì)體固定器、天然蛋白質(zhì)(Nita - Lazar et al., 2005, supra)。以下是可溶性AcrA蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列
MKYLLPTAAAGLLLLMQPAMAMHMSKEEAPKIQMPPQPVTTMSAKSEDLPLSFTYPAK
LVSDYDVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDKFKASVDSAYGQALMAKATFE
NASKDFNRSKALFSKSAISQKEYDSSLATFNNSKASLASARAQLANARIDLDHTEIKAPF
DGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADFFISDTDKLNLVRNTQSGKWDLDSIHA
NLNLNGETVQGKLYRDSVIDANSGTVKAKAVFDNNNSTLLPGAFATITSEGFIQKNGFK
VPQIGVKQDQNDVYVLLVKNGKVEKSSVHISYQNNEYA隨GLQNGDKIILDNFKKIQVG
SEVK日GAQLEWWWWWW (s叫uence 4)
劃線的殘基是PeIB信號肽，斜體字的是hexa-histag,粗體 的是在N 123和N273上兩個(gè)天然的糖基化作用位點(diǎn)。在pEC415 質(zhì)斗立(Schulzetal., 1998)中，構(gòu)建一種包含上述ORF蛋白質(zhì)的質(zhì) 粒來生產(chǎn)pAcrAper。 檢驗(yàn)AcrA和其突變體糖基化作用狀態(tài)的試驗(yàn)(見下文)如下所述在大腸4干菌CLM24(Feldmanetal" 2005， supra)細(xì)胞指數(shù)生長期用0.02%阿拉伯糖誘導(dǎo)AcrA表達(dá)，其中所 述大腸桿菌CLM24細(xì)月包包含活'1"生或非活性形式質(zhì)4立-bome pgl 操縱子(pACYCpg / pACYCpg / mut,參見(Wacker et al" 2002， supra))和編碼AcrA的質(zhì)粒(pAcrAper )。在四小時(shí)感應(yīng)3見象之 后，如上所述制備周質(zhì)才是取物并通過聚丙烯酰胺凝月交電泳、電轉(zhuǎn) 化和用抗AcrA免疫血清或R12免疫血清免疫纟企測的方法進(jìn)行分 析。后者對于空腸彎曲桿菌包含蛋白質(zhì)的N -聚糖具有特異性 (Wacker et al" 2002, supra)。
圖2A的頭兩個(gè)條帶顯示了在不存在功能性pgl操縱子和存 在功能性pgl操縱子情況下的AcrA。在三個(gè)存在功能性pgl操縱 子的情況下只有一個(gè)色帶缺失(圖2A,頂部組)。這相當(dāng)于未糖 基化的AcrA (第1條帶)和非、單和二糖基化的AcrA (第2條 帶)。在條帶2種巨大蛋白質(zhì)的糖基化通過R12蛋白印跡進(jìn)行確
認(rèn)(第2條帶，底部組)。當(dāng)突變體AcrA - N273Q進(jìn)行同樣地 表達(dá)時(shí)，在功能性糖基化作用pgl操縱子(第3條帶)存在的條 件下只有單糖基化的AcrA被4企測到。在不存在功能性pgl地點(diǎn) 的情況下才企測到未糖基化的AcrA (第4條帶)。突變體AcrA畫 D121A的分析只生產(chǎn)兩個(gè)條帶，其中之一被糖基化(第5條帶) 如在第3條帶用AcrA-N273Q觀察到的。這說明D121對于在位 點(diǎn)123 - 125進(jìn)行有效的糖基化作用是必不可少的。
實(shí)施例3向AcrA中引入人工糖基化位點(diǎn)
為了檢驗(yàn)引入的天冬氨酸殘基是否能夠產(chǎn)生糖基化位點(diǎn)，可 溶性AcrA的N 117和N 147位點(diǎn)中未使用的-2位糖基化位點(diǎn)#皮 換成天冬氨酸(F 115D， T145D),從而產(chǎn)生AcrA突變體。然 后檢測修飾后的糖基化位點(diǎn)是否可以被如權(quán)利要求2所述的實(shí)驗(yàn) 糖基化。這兩種突變體分別#皮插入到可溶性AcrA的野生型序列 中或一皮插入到雙突變體中，所述雙突變體中刪除了兩個(gè)4吏用的糖 基化位點(diǎn)(N 123Q和N 273Q)。制備經(jīng)過4小時(shí)i秀變的培養(yǎng)基 的周質(zhì)4是耳又物，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并用蛋白印記法(圖 2B)沉淀。如參照物一樣，野生型糖基化AcrA和未沖唐基化的 AcrA樣品在同一個(gè)凝膠上實(shí)驗(yàn)(第1條帶和第2條帶)。T 145D 突變體影響N 147-S 149的天然未使用的糖基化序列-2位點(diǎn)。 AcrA - T 145與抗AcrA抗血清進(jìn)行的蛋白印記得到四條條帶， 其中最高的具有比在第2條帶的雙糖基化蛋白質(zhì)更慢的電泳移動(dòng) 率(見圖2B中的第3條帶)。R12印記實(shí)驗(yàn)確定了第四帶是三 糖基化的AcrA。盡管對抗AcrA具有低的強(qiáng)度，但是最大的帶產(chǎn) 生特異性R12抗血清糖基化作用最強(qiáng)的信號。當(dāng)相同的突變體 AcrA — T 145D在不存在天然N —糖基化序列(AcrA — N 123Q — N 273Q-T145D)的條件下表達(dá)時(shí)，在功能性pgU喿至從子存在的 條件下只檢測到單糖基化的AcrA (圖2B,第4條帶)，在不存
在功能性pgl操縱子的條件下則不能檢測到(第5條帶)。這說明在第4條帶中的重帶進(jìn)行了糖基化，因此，通過筒單的引入T145D突變體可以產(chǎn)生一種優(yōu)化的糖基化作用位點(diǎn)(DFNNS)。
為了進(jìn)一步確定可以通過在-2位插入天冬氨酸殘基來引入糖基化作用位點(diǎn)，改變天然未使用的位點(diǎn)N 117 - S 119和N 274 - T 276來優(yōu)化N -糖基化作用。為了這個(gè)目的，產(chǎn)生了進(jìn)一步的突變(圖2C) 。 AcrA —F 115D-T 145D在上述系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)生5種蛋白質(zhì)，這五種蛋白質(zhì)可以被抗-AcrA抗血清(第 2條帶)檢測到。這一結(jié)果暗示同一個(gè)AcrA分子上可以發(fā)生4 個(gè)糖基化作用。當(dāng)用空腸彎曲桿菌N-聚糖-特異性R12抗血 清進(jìn)行檢測時(shí)，可以檢測到5個(gè)帶的梯度。最弱的帶是未糖基化的AcrA,因?yàn)樵跊]有進(jìn)行糖基化時(shí)也存在于該帶(第1條帶)， 最強(qiáng)信號的最高結(jié)果可能是由于四重糖基化AcrA的五個(gè)抗原決定蔟造成的。因此，兩個(gè)引入的位點(diǎn)(在N 117和N 147)和兩 個(gè)原有的使用位點(diǎn)(N 123和N273 )被使用且通過pgl機(jī)制被糖 基化。AcrA - N123Q - N 273Q - N 272D在存在或不存在pgl操縱子條件下的表達(dá)表示了 一種第三人工引人的糖基化位點(diǎn)，N 274 (DNNST),該第三人工引入的糖基化位點(diǎn)也可以被pgl操 縱子識別(圖2C,第3和第4條帶)。
上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即空腸彎曲桿菌OTase識別的細(xì)菌N -凈唐基化作用位點(diǎn)部分地由與真核共有序列相同的共有序列(N-X-S/T,其中X^P)組成，但另外在-2位點(diǎn)加入天門冬氨酸對于提高其功效是必須的。另外，這說明通過重組引入這種優(yōu)化的共有序列，可以在理想的位點(diǎn)凈唐基化蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4在優(yōu)化的N-糖基化作用序列中-1位的確認(rèn) 為了檢測細(xì)菌糖基化位點(diǎn)的-1位顯示與真核生物+ 1位相同的限制作用，進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)-驗(yàn)(Imperiali， B., and Shannon, K. L. (1991). Differences between Asn - Xaa — Thr -包含肽之間的區(qū) 別寡^f唐4爭移酶溶液構(gòu)造和底物ff為的比4交Biochemistry 30, 4374隱4380; Rudd, P. M., and Dwek, R. A. (1997).糖基化作用蛋 白質(zhì)的異源成《分和3D構(gòu)造.Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 32, 1-100)。 +1位的脯氨酸殘基抑制糖基化作用從而限制肽。為了才企 —驗(yàn)在-1位置是否也能觀察到相似的作用，向第二天然位點(diǎn)敲除的 點(diǎn)突變中的第 一天然使用位點(diǎn)中引入脯氨酸殘基(AcrA - N 273Q -F 1.22P)。 AcrA - N 273Q的控制表達(dá)表明在功能性pgl才喿縱子 存在的情況下的單糖基化蛋白質(zhì)(圖2D,第1和2條帶)。然 而，AcrA - N 273Q - F 122P并沒有進(jìn)行糖基化(圖2D,第3和 4條帶)。這說明當(dāng)在天門冬氨酸和-2位負(fù)電荷殘基之間有脯氨 酸殘基的時(shí)候，脯氨酸抑制細(xì)菌N-糖基化作用。
通過空腸彎曲桿菌pgl機(jī)制被糖基化的所有已知位點(diǎn)的序列陣表明他們都在—2位點(diǎn)包括D或E (Nita-Lazar et al., 2005, s叩ra; Wacker et al., 2002, supra; Young et al.， (2002).革蘭氏陰性細(xì)菌中多重糖蛋白上存在的N -連4妄的聚糖的結(jié)構(gòu)，Campylobacter jejuni. J. Biol. Chem. 277, 42530—42539)。因此，可以確定，細(xì)菌的糖基化共有序列可以被位于-2位的負(fù)電荷氨基酸優(yōu)化，產(chǎn)生 D/E - X - N - Z - SfT,其中X & Z # P.
實(shí)施例5非空腸彎曲桿菌蛋白的N -糖基化作用
為了證明初級序列已足夠滿足細(xì)菌N-糖基化作用的需要， 使用上述方法來檢驗(yàn)是否非空腸彎曲桿菌蛋白可以被糖基化。使 用霍亂毒素B亞基(CtxB )作為糖基化作用的目標(biāo)。在霍亂弧菌
中擴(kuò)增相應(yīng)的基因乂人而4吏其在N -末端包4舌編碼OmpA信號序 列的編碼序列，在C —末端包4舌hexahistag,如實(shí)施例1中的A 到C一樣。在實(shí)施例1中使用的質(zhì)粒中克隆所得到的DNA代替 構(gòu)建物A。 W88到D或在W88之后插入D的點(diǎn)突變產(chǎn)生一種優(yōu) 化的糖基化作用位點(diǎn)(DNNKT)。在來自空腸彎曲桿菌功能性 pgl區(qū)域存在和不存在的條件下，在大腸桿菌或其他細(xì)菌類型中 表達(dá)包含信號序列和his-tag的野生型和W88D CtxB蛋白。當(dāng)來 自ToplO細(xì)胞的周質(zhì)l是耳又物用聚丙烯酰胺^0交電泳、電轉(zhuǎn)化和用 CtxB抗血清進(jìn)行連續(xù)免疫印跡時(shí)，只有CtxB W88D在pgl區(qū)域 背景下產(chǎn)生高的糖基化帶(圖2E，比較第3和第4條帶)。通 過取代CtxB的G54或Q56,即在環(huán)結(jié)構(gòu)的其中之一中(后者表 示為CtxB-Q56/DSNIT)引入共有序列(DSNIT),其中所述 環(huán)結(jié)構(gòu)據(jù)^艮道對CtxB結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合活性有貢獻(xiàn)。圖 2E的第5和第6條帶顯示基因工程蛋白質(zhì)(例如包括DSNIT肽 序列而不是在Top 10中表達(dá)的Q 56序列的構(gòu)建物)具有低的移 動(dòng)率因此當(dāng)按照上面描述的方法進(jìn)行分析時(shí)，能夠糖基化細(xì)胞 帶，其中，所述細(xì)胞具有糖基化作用能力不屬于糖基化作用缺陷 型。這還說明，包含兩種4喿作的CtxB，即在W88之后插入D和 用DSNIT取代Q56的CtxB在SCM 7細(xì)月包中#1雙斗唐基化(Alaimo et al., EMBO Journal 25: 967-976 (2006) ) ( E組，第7和第8條 帶)。在第7條帶中表示的雙糖基化的蛋白質(zhì)CtxB是經(jīng)過N產(chǎn) 親和純化的，并才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)4亍月交內(nèi)胰蛋白酶化作用之后用 ESI- MS/MS分析。4企測到期望的糖基化作用，從而確定，通過 突變或插入本發(fā)明的用于細(xì)菌N-糖基化作用(未顯示)的優(yōu)化 的共有序列，非空腸彎曲桿菌蛋白質(zhì)可以進(jìn)行細(xì)菌N-糖基化作 用。適于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其他合適的大腸桿菌菌抹是W 3110， CLM 24, BL 21 (Stratagene, La JoIIa, CA, USA), SCM6和SCM7。
這里4吏用的CtxB蛋白的氨基酸序列如下所示(劃線的是重
組OmpA信號序列，4牛體的是hexa —histag,黑體的是W88):
MKKTAIAIA跳AGFATVAQATPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT FKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISM ANGSHWWHWH (sequence 5)
實(shí)施例6向空腸彎曲4干菌外月莫蛋白OmpHl中引入人工的N
-糖基化作用位點(diǎn)
細(xì)菌的N - ^唐基化作用的一種潛在的應(yīng)用在于在細(xì)菌宿主 細(xì)胞表面上展示聚糖，/人而將顯性與基因型相連并因此選4奪特異 性基因型突變體。為了說明N —聚糖可以在外膜蛋白質(zhì)表面呈 遞，制備基因工程OmpHl蛋白使其含有多個(gè)本發(fā)明優(yōu)化的共有 位點(diǎn)。如已知晶體結(jié)構(gòu)所述，將這些位點(diǎn)制備在蛋白的環(huán)區(qū)域 (Muller, A., Thomas, G. H., Horler, R., Bra皿igan, J.A.， Blagova, E" Levdikov, V.M., Fogg, MJ., Wilson, K.S.， and Wilkinson, A.J. 2005. An ATP-binding cassette-type cysteine transporter in Campylobacter jejuniinferred from thestructureof an extracytoplasmic solute receptor protein. Mol. Microbiol. 57: 143-155)。之前的實(shí)^驗(yàn)表明，通過V83T, K59N — G60I —N61T, R l謂-G 191 1 — D 192T和H 263D - F 264S — G 265N — D 266I-D 267T突變可以產(chǎn)生最佳的糖基化作用位點(diǎn)。為了表面顯 示，需要對這些引入位點(diǎn)的不同結(jié)合作用進(jìn)4亍評1介，乂人而確定最 佳N -聚糖-特異性樣品。在編碼質(zhì)粒構(gòu)建物的野生型OmpHl 中產(chǎn)生結(jié)合作用并用與AcrA相似的方法進(jìn)行^全測。圖3表示了 多種OmpHl變體的分析，其中所述OmpHl變體在存在野生型 糖基化作用序列子之外還包括多重糖基化作用序列子。產(chǎn)生帶有 三(第3、 4、 5和7條帶)到四個(gè)糖基化作用序列子的OmpHl 變體。 一種只帶有一個(gè)糖基化作用序列子的野生型OmpHl和缺 乏用于糖基化作用的重要天門冬氨酸的突變體也包括在本實(shí)驗(yàn)中。這里4企測的所有的變體不只顯示高水平的糖基化功效，還利 用了每一個(gè)糖基化作用序列子。用彎曲桿菌屬N-聚糖特異性免
疫血清確定實(shí)^r結(jié)果(圖3，下面一組)。
下面表示了空腸彎曲一干菌(81 — 176菌4朱)OmpHl蛋白的蛋 白質(zhì)序列，其附有i+體字的myc tag:
MKKILLSVLTTFVAWLMCGGNSDSKTLNSLDKIKQNGVVRIGVFGDKPPFGYVDEKG NNQGYDIALAKRIA^ELFGDE瞎QFVLVEAANRVEFLKS瞎D"LANFTQTPERAEQV DFCLPYMKVALGVAVPKDSNITSVEDLKDKTLLLNKGTTADAYFTQDYPNIKTLKYDQNT ETFAALMDKRGDALSHDNTLLFAWVKDHgDFKMGIKELGNKDVIAPAVKKGDKELKEFI DNLIIKLGQEQFFHKAYb:ETLKAHFGDDVKADD\A/l￡GGKIL￡6KyS￡￡。" equence 6):: ■
在蛋白質(zhì)中，天然糖基化作用位點(diǎn)是黑體的，加下劃線的是 信號序列。
實(shí)施例7:空腸彎曲桿菌N-聚糖在大腸桿菌細(xì)胞外膜上 OmpHl上的表面展示
為了回答多重^f唐基化的OmpHl變體是否可以在細(xì)菌細(xì)月包表 面上展示的問題，對能夠表達(dá)不同OmpHl變體的細(xì)菌細(xì)胞 CLM24或SCM6 (也是SCM7 AwaaL)進(jìn)行免疫熒光試-險(xiǎn)。野生 型OmpHl和缺失對糖基化作用^艮重要的天門冬氨酸變體^皮包括 在實(shí)驗(yàn)中。另外，構(gòu)建C20S突變體從而在周質(zhì)中保持蛋白質(zhì)， 因此在實(shí)驗(yàn)中作為參照物，對用多聚甲醛處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫染 色。多聚曱醛固定的細(xì)月包不會石皮壞細(xì)月包結(jié)構(gòu)或 compartimentalization。 C 一 Myc -和N - glycan -特異性免疫血 清與相應(yīng)的二級抗體結(jié)合，連接到FITC和Cy3上，分別用于檢 測細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)(紅熒光)和N-聚糖(綠焚光)。另外， 使用4, 6 - 二胺基-2 -苯基叼l哚(DAPI,藍(lán)瑩光)對細(xì)菌 DNA染色使細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)胞石年片之間有明顯的區(qū)別。當(dāng)表達(dá)野
生型OmpHl的細(xì)胞被染色時(shí)，檢測對蛋白質(zhì)和N-聚糖有特異 性的免疫熒光(圖4A)。當(dāng)缺失重要的天門冬氨酸N 139S的突 變體^皮抗-Myc-和N-聚糖-特異性免疫血清染色時(shí)，只獲 得蛋白質(zhì)而不是聚糖特異性信號(4B組)，這表明N-聚糖-特 異性免疫血清的特異性。在非蛋白特異性的C20S突變體中，當(dāng) 蛋白質(zhì)被保持在周質(zhì)中時(shí)可以;險(xiǎn)測到紅色免疫熒光，這i兌明抗體 不能再細(xì)胞中擴(kuò)散，并且有足夠能力纟全測任意表面表現(xiàn)型(組 4C)。接下來，表達(dá)糖基化位點(diǎn)不同的多重OmpHl變體的細(xì)胞 進(jìn)行如下染色OmpHl kgn—隨'hfgdd—ds證(組4 D), OmpH 1
rgd—，t,腦dd—dsn1t (組4 ￡),J kgn_nit'rgd—nit (組4 f),
OmpHlV83T KGN4NT (組4 G)和OmpHl kgn—mt,rgd—nit hfgdd一'dsn汀(組4H)。所有的OmpHl變體都是雙鏈的，表示細(xì)菌 表面糖基化蛋白的存在。圖4用灰色模式表示，第一欄是同行其
他圖的結(jié)合圖。
權(quán)利要求
1.一種重組N-糖基化蛋白質(zhì)，包括一種或一種以上的如下N-糖基化的優(yōu)化氨基酸共有序列D/E-X-N-Z-S/T其中，X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸，且其中所述N-糖基化優(yōu)化氨基酸共有序列的其中之一被引入。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白質(zhì)，包括至少2個(gè)，優(yōu)選至 少3個(gè)，更優(yōu)選至少5個(gè)所述的N-凈唐基化優(yōu)4匕氨基酸共有，歹'j 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)包括一 種或一種以上N-聚糖，所述N-聚糖選自彎曲桿菌N-聚 糖，優(yōu)選空腸彎曲桿菌N -聚糖，書f生自轉(zhuǎn)移到O抗原在 革蘭氏陰性細(xì)菌中形成O聚糖的寡4唐和聚沖唐的N -聚糖或 衍生自革蘭氏陽性[MW5]細(xì)菌，優(yōu)選綠膿桿菌09、 011,大 腸桿菌07, 09, 016, 0157和志賀氏痢疾桿菌01的N -聚糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中任意一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中該 蛋白質(zhì)包4舌兩種或兩種以上的不同的N-聚4唐。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任意一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中該 y妄白質(zhì)衍生自哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)、病毒蛋白質(zhì)、 細(xì)菌蛋白質(zhì)或才直物蛋白質(zhì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中該 蛋白質(zhì)和/或N-聚4唐具有治療和/或預(yù)防活性。
7. 才艮據(jù)權(quán)利要求1到6中4壬意一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中該 蛋白和/或N-聚糖具有免疫活性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1到7中任意一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，進(jìn)一步 包括至少 一 種多肽序列，所述多肽序列能夠輩巴向所述重*且蛋 白到革蘭氏陰性細(xì)菌的外"萣上。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述輩巴向多肽序列 選自n型信號肽或外膜蛋白，優(yōu)選來自空腸彎曲桿菌OmpHl 的全長蛋白或信號肽、來自空腸彎曲4干菌的JIpA、來自大腸 才干菌， <尤選OmpS, OmpC, OmpA, OprF, PhoE, LamB， Lpp的 外膜蛋白、OmpA和來自綠膿桿菌的Inp蛋白。
10. —種核酸，該核酸編碼4又利要求1到9中任《可一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
11. 包括權(quán)利要求10所述核酸的載體。
12. 包括權(quán)利要求10所述核酸和權(quán)利要求11所述載體的宿主細(xì)胞。
13. 才艮據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì) 胞或原核細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞選自細(xì)菌 所組成的組，所述細(xì)菌選自由埃希氏桿菌屬、彎曲桿菌屬細(xì) 菌、沙門氏菌、志賀氏菌屬、幽門螺桿菌、假單胞菌屬、桿 菌屬、優(yōu)選大腸桿菌、更優(yōu)選大腸桿菌Topl0株、W3110抹、 CLM24才朱、BL21才朱、SCM6才朱和SCM7才朱、和腸道沙門菌 SL.3261林、SL3749抹和SL326iAwaaL抹所組成的組。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12-14中任意一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中所述 宿主細(xì)月包是一種重組革蘭氏陰性細(xì)菌，所述細(xì)菌包^舌i)一 種基因型包括編碼a)至少一種天然的或重組特異性凈唐基4匕 轉(zhuǎn)移酶，用于在脂質(zhì)載體上組裝寡糖，b)至少一種來自彎 曲^干菌，優(yōu)選空腸彎曲^干菌的天然的或重組寡糖轉(zhuǎn)移酶 (OTase) ， c)至少一種牙又利要求1到9中^f壬意一項(xiàng)戶斤述的 重組蛋白，優(yōu)選權(quán)利要求8或9所述的重組蛋白的核酸序列， 和ii) 一種表現(xiàn)型，包括一種4又利要求1到9中4壬意一項(xiàng)所 述的重組的N-糖基化蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)位于革蘭氏陰性細(xì) 菌的外膜內(nèi)和/或外膜上。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，選自埃希氏桿菌屬、彎 曲桿菌屬細(xì)菌、志賀氏菌屬、幽門螺桿菌和假單^^菌屬、沙 門氏菌、優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸一干菌ToplO才朱、W3110 抹、CXM24株、BL21株、SCM6抹和SCM7株、和腸道沙 門菌SL3261林，SL3749抹和SL326iAwaaL林。
17. 權(quán)利要求1到9中任意一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)在制備藥物中 的應(yīng)用。
18. 權(quán)利要求10所述核酸和/或權(quán)利要求11所述的載體在制備藥 物中的應(yīng)用。
19. ^又利要求15或16所述的宿主細(xì)胞在制備藥物中的應(yīng)用。
20. 權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)在制備用于治療或預(yù)防需要的患 者的疫苗中的應(yīng)用。
21. 核酸和/或權(quán)利要求18所述的載體在制備用于治療或預(yù)防需 要的患者的疫苗中的應(yīng)用。
22. 纟又利要求15或16所述的宿主細(xì)力包在制備用于治療或預(yù)防需 要的患者的疫苗中的應(yīng)用。
23. 權(quán)利要求19或22所述的宿主細(xì)胞用于在動(dòng)物，^尤選哺乳動(dòng) 物，更優(yōu)選嚙齒動(dòng)物、羊、馬、犬、牛或人體內(nèi)i秀導(dǎo)IgA 4元 體的應(yīng)用。
24. —種藥物組合物，包括至少一種權(quán)利要求1到9中任意一項(xiàng) 所述的蛋白質(zhì)。
25. —種藥物組合物，包括至少一種權(quán)利要求10所述的核酸和/ 或一又利要求11所述的載體。
26. —種藥物組合物，包4舌至少一種權(quán)利要求16或17所述的宿 主細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24到26中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，進(jìn)一 步包括一種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或助劑。
28. 用于生產(chǎn)N -連接的糖基化蛋白質(zhì)的方法，包括a)提供 一種重組生物體，優(yōu)選原核生物體，該生物體包括一種核酸， 所述核酸用于編碼i) 一種來自彎曲沖干菌，優(yōu)選空腸彎曲詳干 菌的功能性pgl」燥作子，和ii)至少一個(gè)重組革巴向蛋白質(zhì)， 該蛋白質(zhì)包4舌一種或一種以上如下所述N -凈唐基^M尤4匕氨 基酸共有序列D/E-X-N-Z-S/T,其中X和Z可以是除 了脯氨酸的任意天然氨基酸，且其中引入至少一種所述N -糖基化優(yōu)化氨基酸共有序列，和b)以適于〗吏輩巴向蛋白質(zhì)產(chǎn) 生N - 4唐基^:作用的方式培養(yǎng)重《且生物體。
29. 才艮據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中輩巴向蛋白質(zhì)是一種如斗又 利要求1到9任意一個(gè)所述的重組蛋白質(zhì)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的方法，其中來自彎曲桿菌，優(yōu) 選空腸彎曲桿菌的功能性pgl操作子包括一種核酸，所述核 酸編碼i)來自彎曲桿菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的重組OTase; 和ii)來自彎曲桿菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的重組和/或天然特 異性糖基化轉(zhuǎn)移酶；和/或iii)來自除了彎曲桿菌之外的菌種 的重組的和/或天然的特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶，用于在脂質(zhì)載體 上組裝一種寡糖，所述轉(zhuǎn)移酶,皮OTase轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白上。
31. —種用于制備權(quán)利要求15或16所述宿主細(xì)胞的方法，包括-以下步驟i) -提供一種革蘭氏陰性細(xì)菌，ii)向所述細(xì)菌中 引入至少一個(gè)一亥香序列，該4亥苷序列用于編石馬a)至少一 種重組特異性糖基化轉(zhuǎn)移酶用于在脂質(zhì)載體上組裝寡糖，和 /或b)至少一種來自彎曲桿菌，優(yōu)選空腸彎曲桿菌的重組寡 糖轉(zhuǎn)移酶(OTase),和/或c)至少一種重組蛋白質(zhì)，包括 一種或一種以上以下N -糖基化優(yōu)化氨基酸共有序列D/E -X - N - Z - S/T,其中X和Z可以是除了脯氨酸的任意天然氨 基酸，且其中引入至少一種所述N - #唐基化優(yōu)化氨基酸共有 序列，和iii) i咅養(yǎng)所述細(xì)月包，直到至少一種c)所述4亥普序 列編碼的重組N -糖基化蛋白,皮力文置在革蘭氏陰性細(xì)菌的 外膜上和/或外膜中。
32. 4艮據(jù)權(quán)利要求28到31中任意一項(xiàng)所述的方法，其中重組原 核生物體或宿主細(xì)l包選自細(xì)菌所組成的組，其中所述細(xì)菌選 自由埃希氏桿菌屬、彎曲桿菌屬細(xì)菌、沙門氏菌、志賀氏菌 屬、幽門螺桿菌、假單胞菌屬、桿菌屬、優(yōu)選大腸埃希氏桿 菌、更^f尤選大腸才干菌Topl04朱、W3110^朱、CLM24才朱、BL21 抹、SCM6株和SCM7抹、和腸道沙門菌SL3261抹、SL3749 才朱和S:L326iAwaaL林所組成的組。
33. 用于生產(chǎn)、分離和/或純化4又利要求1到9中任意一項(xiàng)所述的 重組蛋白的方法，包括如下步驟a)培養(yǎng)權(quán)利要求15或16 所述的宿主細(xì)力包，b)除去所述革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜，和c) 復(fù)原所述重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組的N-糖基化蛋白，包括一種或一種以上引入的N-糖基化優(yōu)化氨基酸序列、編碼這些蛋白的核酸和相應(yīng)的載體和宿主細(xì)胞。另外，本發(fā)明介紹了所述蛋白、核酸、載體和宿主細(xì)胞在制備藥物過程中的應(yīng)用。而且，本發(fā)明提供了制備所述蛋白的方法。
文檔編號C12P21/00GK101360831SQ200680020861
公開日2009年2月4日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者烏梅西·艾胡杰, 邁克爾·科沃瑞克, 馬克斯·艾伊比 申請人:Eth蘇黎世公司