專利名稱：用于產(chǎn)生寡核苷酸的方法
用于產(chǎn)生寡核苷酸的方法 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一般而言核酸，特別是RM的局域化(localised)檢 測(cè)，其通過(guò)采用或不釆用核酸內(nèi)切酶活性，使用環(huán)狀探針、或能夠形 成環(huán)的探針進(jìn)行滾環(huán)核酸合成來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些方面，探針包含用于改 善其在滾環(huán)核酸合成之前的雜交/連接事件中的性能的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)，并 且在某些方面，探針包含能夠切割靶核酸的切割元件。本發(fā)明涉及這 些探針及其使用方法。發(fā)明背景滾環(huán)復(fù)制利用了環(huán)狀核酸分子的復(fù)制本質(zhì)上是產(chǎn)生重復(fù)拷貝的環(huán) 的無(wú)盡過(guò)程這一 事實(shí)一 一 這就是原核生物基因組在自然界中進(jìn)行復(fù)制 的方式。該反應(yīng)的研究變化形式利用線性寡核苷酸，其一般通過(guò)在兩個(gè)末 端經(jīng)過(guò)與連接模板雜交而被置于鄰近位置后將它們連接在一起而成形 為環(huán)。隨后，可以在滾環(huán)復(fù)制中拷貝這些環(huán)。這個(gè)反應(yīng)通常通過(guò)向閉 合環(huán)中加入引物來(lái)啟動(dòng)，但如W0 97/20948中指出的，它同樣可以從 連接才莫板(最初的雜交靶)來(lái)良好地啟動(dòng)。該研究背景中的反應(yīng)通常稱為滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，盡管嚴(yán)格來(lái)說(shuō)這 應(yīng)當(dāng)被保留用于其中滾環(huán)產(chǎn)物通過(guò)高分枝(hyperbranch )或DNA級(jí)聯(lián) 反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增的情況(W0 97/19193和W0 97/20948 )。滾環(huán)產(chǎn)物可以保持一連串環(huán)的串聯(lián)重復(fù)拷貝，或可以通過(guò)用限制 性酶或核酶消化而還原成單體。這個(gè)基本過(guò)程在專利文獻(xiàn)(例如W098/38300 )和科學(xué)論文(Dahl F等人，Proc Natl Acad Sci USA. 101 (13) ， 4548-53 ( 2004 ))中描述。在細(xì)胞和組織樣品中通過(guò)雜交來(lái)檢測(cè)特定核酸對(duì)于研究和診斷目 的具有重要意義。最初，這通過(guò)經(jīng)標(biāo)記的DM或RNA探針與樣品雜交 (原位雜交)來(lái)完成。然而，這種方法的分子分辨率(檢測(cè)雜交靶中 的變異的能力)和靈敏度對(duì)于許多目的來(lái)說(shuō)是不夠的。因此引進(jìn)了修改方法，其中使用未標(biāo)記的、線性的、短的(寡核 苷酸)探針來(lái)誘導(dǎo)雜交位點(diǎn)處的經(jīng)標(biāo)記的DNA的合成。這種所謂的引物 原位雜交(PRimed IN Situ)技術(shù)(PRINS， Koch等人，1989，以及 許多后續(xù)出版物)通過(guò)用短探針獲得的在靶序列中的更佳區(qū)分，以及 來(lái)自位點(diǎn)特異性DNA合成的信號(hào)擴(kuò)增而提供了改善的分辨率和靈敏度， 但只對(duì)某些雜交靶起作用。因此，在W0 97/20948中提出了改善該技術(shù)的性能的策略。根據(jù)這 種策略，用環(huán)狀寡核苷酸探針代替線性探針，并且使用環(huán)形探針作為 DNA合成的模板從雜交靶引發(fā)位點(diǎn)特異性DNA合成，由此雜交耙變得以 具有所述DM環(huán)的互補(bǔ)序列的眾多串聯(lián)重復(fù)拷貝這樣的方式進(jìn)行延伸。 這些拷貝隨后可以通過(guò)在DNA合成過(guò)程中摻入經(jīng)標(biāo)記的核香酸，或通過(guò) 與串聯(lián)重復(fù)序列的后續(xù)雜交來(lái)檢測(cè)。這種通過(guò)滾環(huán)復(fù)制來(lái)進(jìn)行的可識(shí) 別的DNA的局域化產(chǎn)生在這節(jié)的下列部分中稱為滾環(huán)PRINS。通過(guò)滾環(huán)PRINS進(jìn)行的核酸分子的局域化檢測(cè)要求合成反應(yīng)有效 地保持在這些分子最初所存在的位點(diǎn)處。這可以通過(guò)使用靼核酸分子 的游離3'-末端作為用于DNA聚合酶的引物，使其能夠起始環(huán)形探針的 滾環(huán)復(fù)制來(lái)獲得。在DNA中，此類末端已可以作為在體內(nèi)斷裂DNA的生 物過(guò)程的結(jié)果而獲得(Andersen CL.等人，C力r咖o;yo頂e 10 (4)， 305-12 ( 2002 ))或作為人工制備物而獲得。此類"天然存在的"3'-末端在WO 97/20948中使用。備選地，如果用核酸內(nèi)切酶在靼位點(diǎn)的3' 消化靶DNA，那么可以使用核酸酶來(lái)產(chǎn)生適當(dāng)放置的3'-末端以制備用 于反應(yīng)的靶DNA。如果所得到的末端并非正好緊鄰環(huán)進(jìn)行雜交的地方， 那么用核酸外切酶或具有核酸外切酶活性的聚合酶消化耙DNA，以使3'-末端凹陷(recess )直至它可以引發(fā)滾環(huán)過(guò)程的點(diǎn)。如W0 99/49079 和Larsson C.等人，#""re 1， 227-32 ( 2004 )中所述，這些步驟可以在環(huán)與靶DM雜交之前、期間或之后進(jìn)行。W0 02/50310提 及，不僅DNA，而且RNA都可以通過(guò)滾環(huán)DNA合成來(lái)檢測(cè)(在溶液中、在 載玻片上和在石蠟切片中，p. 11， 1.6)。然而，沒(méi)有給出關(guān)于制備用 于滾環(huán)過(guò)程的耙RNA的指示，并且為DNA檢測(cè)所準(zhǔn)備的工具(限制性消 化)不能應(yīng)用于RNA靶。另外，用于DM檢測(cè)的過(guò)程要求添加分開(kāi)的滾 環(huán)引物，并且因?yàn)闆](méi)有強(qiáng)調(diào)差異，所以這必須同樣應(yīng)用于RNA檢測(cè)。因此，總之，既沒(méi)有在W0 97/20948中提供，也沒(méi)有在W0 02/50310 中提及對(duì)于RNA單巴的乾引發(fā)檢須'j ( target primed detection)特異的 基于滾環(huán)DNA合成的方法。RM的滾環(huán)檢測(cè)也在WO 99/49079和WO 01/77383中提議。這些 專利申請(qǐng)?jiān)敿?xì)說(shuō)明了下列內(nèi)容的基本概念，即通過(guò)提供對(duì)于經(jīng)由在 RNA模板上進(jìn)行連接來(lái)形成環(huán)形探針來(lái)說(shuō)優(yōu)化的反應(yīng)條件來(lái)進(jìn)行RNA 耙的滾環(huán)檢測(cè)，并提出乾分子的斷裂可以用RM酶H或RM酶A來(lái)獲 得。然而，盡管優(yōu)化了關(guān)于探針形成的條件，但在該優(yōu)化條件下DNA 環(huán)的產(chǎn)率仍顯著低于當(dāng)在DM模板上形成環(huán)時(shí)所獲得的產(chǎn)率。至于用 RNA酶A進(jìn)行消化，它提供了 RNA耙的隨機(jī)切割，而不是所想要的定 向切割。定向切割可以通過(guò)用RM酶H消化RNA來(lái)獲得，所述RM酶 特異性地切割DNA/RNA雜交物中的RNA組分，導(dǎo)致只在環(huán)形探針?biāo)?于的位點(diǎn)處發(fā)生RNA降解。不幸的是，這種降解導(dǎo)致探針脫離其雜交 革巴，從而使得它不再報(bào)告那種靶的定位(Koch，未公布的觀察結(jié)果)。 因此仍未公布先前關(guān)于DNA檢測(cè)而描述的靶引發(fā)滾環(huán)PRINS的有效 RM檢測(cè)版本。US2003/0087241公開(kāi)了用于合成寡核苷酸(優(yōu)選RM寡核苷酸) 的小單鏈環(huán)狀寡核苷酸模板。環(huán)狀寡核苷酸進(jìn)一步包含用于將合成的 多聚體轉(zhuǎn)變成單體的手段；此類手段可以是例如自切割核酶。公開(kāi)的 方法的目的是有效、低成本且大規(guī)模地合成寡核苷酸。沒(méi)有設(shè)想檢測(cè) 方法。因此，盡管滾環(huán)技術(shù)中存在近期進(jìn)展，但仍需要技術(shù)改進(jìn)，特別是提供包含適當(dāng)定位的限制性位點(diǎn)的、除雙鏈DM序列之外的核酸序 列的檢測(cè)。特別地，需要該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，使得可能進(jìn)行單鏈核 酸序列(包括RNA和單鏈DNA )的位點(diǎn)特異性切割，以便允許通過(guò)耙 引發(fā)滾環(huán)PRINS來(lái)檢測(cè)此類序列。發(fā)明概述本發(fā)明旨在改善用于檢測(cè)核酸分子的滾環(huán)技術(shù)。這涉及將公開(kāi)的 環(huán)形探針數(shù)目從2擴(kuò)大到6(

圖1)，這部分地通過(guò)補(bǔ)充已知的預(yù)先形 成的環(huán)(圖1A)和具有第三種設(shè)計(jì)的掛鎖探針(圖1C)、本文公開(kāi)的 自我模板式(龜形)探針，和部分地通過(guò)引入可以加入至所有3種探 針設(shè)計(jì)中的新元件——切割子(slicer)(圖1E-H)來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于 某些應(yīng)用，它可能足以在靶核酸分子的3'-末端處或附近放置合適的 探針，并且在必要時(shí)使那個(gè)末端凹陷至其中滾環(huán)復(fù)制可以開(kāi)始的點(diǎn)。 對(duì)于其他應(yīng)用，可能需要切割靶分子以產(chǎn)生適當(dāng)定位的3'-末端。切 割子基本上是切割元件，它包含構(gòu)建到探針內(nèi)的核酸內(nèi)切酶活性，這 使其能夠產(chǎn)生適當(dāng)定位的3'-末端。這些新型探針設(shè)計(jì)使得能夠獲得 改善的基于靶引發(fā)滾環(huán)復(fù)制的檢測(cè)方法，其同樣在本文公開(kāi)。在第一個(gè)方面，本發(fā)明通過(guò)向已知探針即預(yù)先形成的環(huán)形探針和 掛鎖探針添加龜形探針來(lái)擴(kuò)大環(huán)形探針的跨度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方案中，這種龜形探針(圖1D)是環(huán)狀核酸探針，其包含i) 包含至少75%互補(bǔ)的核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分ii) 包含由所述第一個(gè)部分或所述笫三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 第二個(gè)核酸部分，進(jìn)一步包含與靶核酸序列至少75%互補(bǔ)的第四個(gè)核酸部分以及 限定所述特定探針的一個(gè)或多個(gè)元件。由于經(jīng)由在其序列內(nèi)所包含的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和兩個(gè)互補(bǔ)序列而介導(dǎo)的 分子內(nèi)雜交，龜形探針可以使用自我模板式連接來(lái)進(jìn)行連接。當(dāng)這些互補(bǔ)序列雜交時(shí)，探針的5'-末端和3'-末端變得接近，這使得探針能 夠進(jìn)行連接而形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)在靶核酸分子上的連接效率很低 時(shí)(例如在包含由于降解、制備或固定而產(chǎn)生的修飾的RNA靶或DNA 靶上，例如，向核酸堿基添加單羥甲基(-CH20H)，導(dǎo)致通過(guò)亞甲基 橋接而產(chǎn)生腺噪呤基團(tuán)的二聚化)，此類自我模板式連接可能是優(yōu)選 的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以被描述為總長(zhǎng)度為30 - 200 個(gè)核苷酸的環(huán)狀核酸探針，其包含i) 包含核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分，所述核酸序列互相 至少75 %互補(bǔ)并且各具有3-100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度ii) 包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 第二個(gè)核酸部分，并且其中所述第二個(gè)部分具有9 - 50個(gè)核苷酸的長(zhǎng) 度iii) 包含與靶核酸序列至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序列的第四個(gè) 部分，并且其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸。在第二個(gè)方面，本發(fā)明通過(guò)引入切割子來(lái)擴(kuò)大環(huán)形探針的跨度， 所述切割子是可以摻入至下列三種探針中任何一種之內(nèi)的切割元件 龜形探針、預(yù)先形成的環(huán)形探針和掛鎖探針(圖1E-1H)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，環(huán)形探針是含有一個(gè)或多個(gè)插 入的切割元件的龜形探針，稱為切割子-龜形探針。因此，根據(jù)第一個(gè) 方面，切割子-龜是環(huán)狀核酸探針，其中所述探針包含具有核酸內(nèi)切酶 活性的一個(gè)或多個(gè)元件(圖1H)。備選地，可以將一個(gè)或多個(gè)切割元件摻入環(huán)形探針內(nèi)，所述環(huán)形 探針是預(yù)先形成的環(huán)形探針或掛鎖探針，從而使得所述探針包含具有 核酸內(nèi)切酶活性的一個(gè)或多個(gè)元件。此類預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探 針、或切割子-掛鎖探針除了所述一個(gè)或多個(gè)切割元件(圖1E-F和 1G)以外還包含包含核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分，所述核酸序列互相至 少75%互補(bǔ)并且各具有3 - 100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二個(gè)核酸部分，并且其中所述第二個(gè)部分具有9-50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度； 包含與靶核酸序列至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序列的第四個(gè)部分， 并且其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸。如果備選的環(huán)形探針是預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針，那么它優(yōu)選 通過(guò)在雜交前連接該切割子-龜形探針來(lái)獲得(圖1F)。備選地，它 可以通過(guò)使用外部連接模板在雜交前連接該切割子-掛鎖探針來(lái)獲得 (圖1E)。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶DNA分子的方法，所述方 法包括使環(huán)狀核酸探針與靶DNA序列在該靶DNA分子的3'-末端處或 附近雜交，所述環(huán)狀核酸探針為龜形探針；進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾 環(huán)產(chǎn)物。備選地，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶RM分子的方法，所述方法包括 使環(huán)狀核酸探針與靶RNA序列在該靶RNA分子的3'-末端處或附近雜 交，所述環(huán)狀核酸探針是龜形探針、預(yù)先形成的環(huán)形探針或掛鎖探針； 進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。這種方法包括i) 獲得包含所述靶RM分子的制劑，和ii) 提供所述環(huán)狀核酸探針，和i i i )使所述探針與所述靶RNA分子在所述靶RNA分子的3'-末端 處或附近進(jìn)行雜交，和iv)用所述探針作為模板來(lái)實(shí)施滾環(huán)復(fù)制，應(yīng)當(dāng)理解，在環(huán)形探針以開(kāi)放環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在的任何時(shí)候，它進(jìn)一 步需要在滾環(huán)復(fù)制前連接成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。并通過(guò)使?jié)L環(huán)產(chǎn)物可視化來(lái)檢測(cè)所述靶RNA分子。 在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶核酸分子的方法，所述方 法包括使環(huán)形探針與所述靶核酸分子雜交，所述環(huán)形探針是切割子-龜形探針、預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針、或切割子-掛鎖探針；用具 有核酸內(nèi)切酶活性的元件切割所述靶核酸分子，以在所述耙核酸分子內(nèi)產(chǎn)生3'-末端；從所述新的3'-末端開(kāi)始進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán) 產(chǎn)物(圖2)。這種方法包括 )獲得包含所述靶核酸分子的制劑，和i) 提供所述環(huán)狀核酸探針，和ii) 使所述探針與所述靶核酸分子雜交，和iv)用具有核酸內(nèi)切酶活性的元件切割所述靶核酸分子，在所述 靶核酸分子內(nèi)產(chǎn)生新的3'-和5'-末端，和v )用所述探針作為模板從在所述靶核酸分子內(nèi)的所述新的3' -末 端開(kāi)始實(shí)施滾環(huán)復(fù)制，并通過(guò)使?jié)L環(huán)產(chǎn)物可視化來(lái)檢測(cè)所述耙核酸分子。應(yīng)當(dāng)理解，在環(huán)形探針以開(kāi)放環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在的任何時(shí)候，它進(jìn)一 步需要在滾環(huán)復(fù)制前連接成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在笫一個(gè)應(yīng)用方面，本發(fā)明涉及用于原位即在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞學(xué)或組織 學(xué)制備物中檢測(cè)靶核酸序列的方法。環(huán)形探針被設(shè)計(jì)為識(shí)別在位于細(xì) 胞或組織中的靶核酸分子之中的靶區(qū)域，并且使用適合于所選探針和 靶的程序。在第二個(gè)應(yīng)用方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)固定在固體支持物上的 耙核酸分子的方法，所述方法包括使所述耙核酸與任何所述探針雜交； 用所述探針作為模板來(lái)進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。該方法還包括一些除了關(guān)于原位應(yīng)用所提及的那些以外的步驟。 因此，本發(fā)明例如涉及進(jìn)一步包括下列步驟的方法i) 提供附著至固體支持物的捕獲寡核苷酸，和ii) 使所述捕獲寡核苷酸與所述靶核酸分子雜交，從而將所述耙 核酸分子附著至所述固體支持物。(kit一of—parts )。定義乂-,f:在真核生物mRM的5'-末端中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，其包含末端 甲基鳥(niǎo)苷殘基。"W裙雜f "Wz7邁e入可以充當(dāng)序列特異性核酸內(nèi)切酶的DNA序列。M-^r/MM核雜由下列序列組成的DM核酶5'-NNMNNn-(A/G)GGCTAGCTACAACGA-NNNNNNn-( N是包括經(jīng)修飾的核苷酸的任何 天然或人工核苷酸，和n表示核苷酸的隨機(jī)數(shù)目)?！?J7家族由下列序列組成的DNA核酶5'-NNNNNNn-TNalNa2Na3AGCNblNb2Nb3WCGAA-NNNMNn-3、 N是包括經(jīng)修飾的核苷酸的任 何天然或人工核苷酸，n表示核苷酸的隨機(jī)數(shù)目，W表示A或T，并且Na,與^互補(bǔ)，N"與Nb2互補(bǔ)，和Na3與Nb3互補(bǔ)。ZMC4 #雜來(lái)自8-17家族且由下列序列組成的DNA核酶 5'-NNNNNNn-TCCGAGCCGGTCGAA-NNNNNNn-3' (N是包括經(jīng)修飾的核苷酸 的任何天然或人工核苷酸，和n表示核苷酸的隨機(jī)數(shù)目)。勿萄尤伴具有核酸內(nèi)切酶活性的元件，所述核酸內(nèi)切酶活性使 其能夠切割核酸分子。切割元件的例子包括DNA核酶和化學(xué)基團(tuán)例如 鑭系元素(III)絡(luò)合物。矛放環(huán)炎潛神處于環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸序列，其通過(guò)外部連接模板 自我模板來(lái)輔助，含有至少一個(gè)5'-末端和一個(gè)3'-末端。這種開(kāi)放環(huán) 狀結(jié)構(gòu)隨后可以通過(guò)連接而變成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。坊合環(huán)炎潛種具有無(wú)終止的主鏈的核酸序列，所述主鏈為例如 但不限于DM和RNA中的糖-磷酸，或PNA中通過(guò)肽鍵連接的N-(2-氨 基乙基)-甘氨酸單位。兩個(gè)互補(bǔ)核酸序列之間的堿基配對(duì)。探奸由天然或人工的、修飾或未修飾的核苷酸組成的核酸序列， 其具有例如6 - 200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。豕承探# fc/"/e pro6e^ f氹#為環(huán)狀探#,:用于形成具有 無(wú)終止主鏈的探針的核酸序列，因此它可以為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)或開(kāi)放環(huán)狀結(jié)構(gòu)形式。它能夠與靶核酸序列雜交。因此關(guān)于環(huán)形探針?biāo)懻摰?結(jié)二或二者。5、 P、、、， ； ， 、… 、…Gwr〃e ; ro6eJ :包含具有游離3'-末端和游離5'-末端的核酸序列的一類環(huán)形探針。龜形探針能夠與靶序列雜交，并且 提供分子內(nèi)結(jié)構(gòu)例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)形式的其自身連接模板。這種自我提供 的連接模板允許連接所述探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。包含具有游離3'-末端和游離5'-末端的核酸序列的一 類環(huán)形探針，它在與其靶雜交后將這樣折疊，即使得3'-末端和5'-末端位于互相緊鄰的位置，從而使得能夠進(jìn)行連接以形成閉合環(huán)狀結(jié) 構(gòu)。遽接^^我同一個(gè)或第二個(gè)核苷酸序列的5'-末端和3'-末端可以 與之雜交并且以使得該兩個(gè)末端能夠連接以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的方式 進(jìn)行排列的核酸序列。斧命遽凝^"我第二個(gè)核苷酸序列的5'-末端和3'-末端可以與之 雜交并且以使得該第二個(gè)核苷酸能夠連接以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的方式 進(jìn)行排列的核酸序列?！?4^"我4'遽凝"<5//*-^歷;7/^^///^〃0/2入使用為所述核酸 序列的一部分的連接模板來(lái)連接核酸序列的5'-末端和3'-末端。豫A移4時(shí)豕^探奸(^re/or邁ecT c/rc/e pro6e,: —類環(huán)形探 針，其在它與其靶序列雜交之前具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并包含能夠與耙 序列雜交的核酸序列。優(yōu)選地，可以使用外部連接模板，通過(guò)連接來(lái) 自龜形探針類別的探針，或者備選地通過(guò)連接來(lái)自掛鎖探針類別的探 針連接來(lái)獲得這類環(huán)形探針。為、f^潛神分子中的一個(gè)或多個(gè)核酸序列部分與同一個(gè)分子的 一個(gè)或多個(gè)核酸序列部分雜交。犮關(guān)在其自身上雜交從而形成單鏈核酸環(huán)和雙鏈核酸區(qū)域的單 鏈核酸序列部分。鎖定核酸。肽核酸。夭^VJ"^:核苷酸G、 C、 A、 T、 U和I。入工裙凝這是在自然界中未發(fā)現(xiàn)的兩種核酸，例如但不限于 PNA、 LNA、異-dCTP或異-dGTP,以及任何經(jīng)修飾的核苷酸，例如但不 限于偶聯(lián)有生物素的核苷酸、偶聯(lián)有熒光團(tuán)的核苷酸或放射性核苷酸。慕裙夯虔它在本文中定義為單鏈核酸序列，其長(zhǎng)度為例如IO-200個(gè)核苷酸。 #灰慕#芬凝.'直接或間接附著至固體支持物并能夠經(jīng)由雜交來(lái) 捕獲耙RM分子的核酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，捕獲寡核苷酸可以在附著至 固體支持物之前或之后與靶核酸雜交，而且它可以包含任何天然或人 工核酸。^e伴識(shí)別特定抗原并選擇性地與之結(jié)合的免疫球蛋白家族的蛋白質(zhì)。這還包括抗體片段，例如但不限于FAB片段。^琳和標(biāo)記參分f:能夠1 )互相選擇性地結(jié)合和2 )附著至固體表面或生物分子的分子對(duì)，例如生物素/鏈霉抗生物素蛋白。附著可以是直接的或間接的，例如經(jīng)由A蛋白。/^謬^持參寡核苷酸或者受體/標(biāo)記物對(duì)可以與其附著或在其上合成的任何固體表面，例如但不限于，顯微鏡載玻片、ELISA平板、微芯片或珠。^^^#子RNA分子，將探針設(shè)計(jì)為與之雜交。 爽凝^》f:核酸分子，將探針設(shè)計(jì)為與之雜交。 為^/i/:探針可以與之雜交的在靶核酸分子中的序列。 偶聯(lián)li浙,^,^茅凝具有與其3'-末端、末端或在寡核苷酸內(nèi)某處結(jié)合的生物素的寡核苷酸。遂i^模炎人工或天然核苷酸的閉合環(huán)狀序列，在滾環(huán)復(fù)制過(guò)程中聚合酶將其用作模板。淡i5^復(fù)浙使用環(huán)狀單鏈寡核苷酸作為滾環(huán)模板和使用靶RM分子或靶DNA分子作為引物的DNA合成。加入DNA聚合酶和dNTPs開(kāi)始了聚合。因?yàn)闈L環(huán)模板是無(wú)末端的，所以產(chǎn)物將是由與滾環(huán)模板互補(bǔ)的串聯(lián)重復(fù)序列組成的長(zhǎng)的單鏈DNA鏈。人工以及天然核酸殘基可以 充當(dāng)用于滾環(huán)復(fù)制的底物。勿口切口應(yīng)當(dāng)被理解為由于缺失磷酸二酯鍵而引起的在雙鏈核 酸的一條鏈中的裂口，這留下游離的3'-羥基和5'-磷酸基。與切口鄰 近的堿基將仍與相反鏈上的堿基雜交。切口例如是通過(guò)切刻核酸內(nèi)切 酵(nicking endonuclease)進(jìn)4亍消4匕的結(jié)果。4刀口還可以是下歹'J過(guò) 程的結(jié)果使兩個(gè)序列在連接模板上進(jìn)行雜交，從而使得一個(gè)序列的 5'-末端鄰近于另一個(gè)序列的3'-末端。切口可以通過(guò)連接酶的作用而 進(jìn)行連接。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新型環(huán)形探針設(shè)計(jì)及其用于通過(guò)滾環(huán)復(fù)制來(lái)檢測(cè)單鏈 核酸分子的方法。下文提及的方法和探針可以用于體外檢定和檢定試 劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及新型環(huán)形探針設(shè)計(jì)，即龜形探針 環(huán)狀核酸探針，其進(jìn)一步包含i) 包含至少75%互補(bǔ)的核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分；ii) 包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 第二個(gè)核酸部分。例如但不限于總長(zhǎng)度為30 - 200個(gè)核苷酸的的環(huán)狀核酸探針，其 包含i) 包含核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分，所述核酸序列互相 至少75 %互補(bǔ)并且各具有3 - 100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；ii) 包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 第二個(gè)核酸部分，并且其中所述第二個(gè)部分具有9 一 50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；iii) 包含與靶核酸序列至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序列的第四個(gè) 部分，并且其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還可以被描述為環(huán)狀核酸探針，其中3'-末端和5-末端通過(guò)所述探針中的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)而變得接近，從而使 得3'-末端和5-末端由切口分隔開(kāi)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針可以是單鏈的。并且在一個(gè)特別 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針是DNA探針。龜形探針的特征在于，在探針序列中包含其自身連接模板，這允 許所述探針通過(guò)自我模板式連接來(lái)進(jìn)行連接以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而 無(wú)需添加外部連接模板。龜形探針的目的和特征在下文中詳細(xì)闡述?；パa(bǔ)性由于經(jīng)由包含在其序列內(nèi)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和2個(gè)互補(bǔ)序列所介導(dǎo)的龜 形探針的分子內(nèi)雜交，自我模板式連接是可能的。當(dāng)這些互補(bǔ)序列在 發(fā)夾附近雜交時(shí)，探針的5'-末端和3'-末端變得接近，這使得能夠連 接探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及 環(huán)狀核酸探針，其包含包含至少75%互補(bǔ)的核酸序列的第一個(gè)部分 和第三個(gè)部分，以及包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二個(gè)核酸部分，例如75 - 100 %互補(bǔ)，或例如80-100 %互補(bǔ)，或例如85 - 100 %互補(bǔ)，或例如90 - 100 %互補(bǔ)，或例如95 -100%互補(bǔ)，或例如100%互補(bǔ)。應(yīng)當(dāng)理解，互補(bǔ)部分能夠互相雜交。當(dāng)在靶核酸分子上的連接效率很低時(shí)(例如在包含由于降解、制 備或固定而產(chǎn)生的修飾的RNA靶或DM靶上，例如，向核酸堿基添加 單羥甲基(-CH20H)，導(dǎo)致通過(guò)亞甲基橋接而產(chǎn)生腺嘌呤基團(tuán)的二聚 化)，此類自我模板式連接可能是優(yōu)選的。回復(fù)此類堿基修飾的操作 程序已公開(kāi)(Masuda N.等人，Nucleic Acids Res. 15; 27( 22 )4436-43 (1999 ))，但它們只減少損害，因?yàn)樗行揎椀耐耆コ遣豢赡?的。龜形探針的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是自我包含的連接模板是一段棵露的DNA, 其與使用例如染色質(zhì)DNA的外部模板式連接相比較，應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致更高的 連接效率。因此，在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及核酸探針，其進(jìn)一步包含含有核酸殘基序列的第四個(gè)部分，所述核酸殘基序列與靶核酸序列至少75%互補(bǔ)，例如75 - 100 %互補(bǔ)，或例如80 - 100 %互補(bǔ)， 或例如85 - 100 %互補(bǔ)，90 - 100 %互補(bǔ)，或例如95 - 100 %互補(bǔ)，或 例如100%互補(bǔ)。龜形探針可以檢測(cè)單個(gè)非多腺苷酸化的RNA，s，例如但不限于， 來(lái)自EB病毒的EBER1和EBER2、腺病毒編碼的小RNA，s VA1和VA2、 核糖體RNA，s、端粒酶復(fù)合物(hTERC)的RNA部分、小干擾RNA，s (siRM，s)和微小RNA，s (miRNA，s)。關(guān)于RNA靶，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及包含第四個(gè)部分的 核酸殘基的環(huán)狀核酸探針，其中所述第四個(gè)部分包含核酸殘基序列， 所述核酸殘基序列與靶RNA序列至少75 %互補(bǔ)，例如75 - 100%互補(bǔ)， 或例如80 - 100 %互補(bǔ)，或例如85 - 100 %互補(bǔ)，90 - 100 %互補(bǔ)，或 例如95 - 100%互補(bǔ)，或例如100%互補(bǔ)。包含與靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的龜形探針的第四個(gè)部分可以具有6-100的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及環(huán)狀 核酸探針，其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸，例如20 -100個(gè)核苷酸，或例如20 - 80個(gè)核苷酸，或例如20 - 60個(gè)核苷酸， 或例如20 - 40個(gè)核苷酸，或例如20 - 30個(gè)核苷酸。龜形探針的第一個(gè)和第三個(gè)部分包含在互相雜交后能夠(連同第 二個(gè)部分一起)將探針折疊成開(kāi)放環(huán)狀結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)序列，所述開(kāi)放環(huán) 狀結(jié)構(gòu)可以連接成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1D)。這些部分的長(zhǎng)度必需具有 允許在反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交的大小。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及環(huán)狀核酸探針，其中所述第一個(gè)部分和第三個(gè)部分的長(zhǎng)度各為 3-1GG個(gè)核苷酸，例如3-5G個(gè)核苷酸，或例如3-4Q個(gè)核苷酸，或 例如3-30個(gè)核苷酸，或例如3-20個(gè)核苷酸，或例如3-10個(gè)核苷 酸。包含發(fā)夾的龜形探針的笫二個(gè)部分對(duì)于在分子內(nèi)雜交后使探針變 成開(kāi)環(huán)是重要的。這個(gè)部分的長(zhǎng)度必需具有允許在反應(yīng)條件下進(jìn)行雜 交的大小。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及環(huán)狀核酸探針，其中所述第二個(gè)部分的長(zhǎng)度為9-50個(gè)核苷酸，例如15-50個(gè)核苷酸， 或例如15-40個(gè)核苷酸，或例如15-30個(gè)核苷酸，或例如10-20 個(gè)核普酸，或例如15-IO個(gè)核苷酸。為了標(biāo)示龜形探針或者區(qū)分不同的龜形探針(如果反應(yīng)中存在超 過(guò)一種的龜形探針)，那么需要限定特定龜形探針的元件一一標(biāo)示物 (identifier)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及環(huán)狀核酸探 針，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)限定該特定探針的元件。在一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及總長(zhǎng)度為30 - 200個(gè) 核苷酸的環(huán)狀核酸探針，其包含1. 包含核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分，所述核酸序列互相 至少75%互補(bǔ)并且各具有3 - IOO個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；2. 包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 第二個(gè)核酸部分，并且其中所述第二個(gè)部分具有9-50個(gè)核苷酸的長(zhǎng) 度；3. 包含與靶核酸序列至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序列的第四個(gè)部 分，并且其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸?？梢允褂貌煌椒▉?lái)標(biāo)示特定特定龜形探針，并且標(biāo)示物元件將 依據(jù)所選擇的方法而不同。如果通過(guò)經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸與標(biāo)示物無(wú)件雜交來(lái)獲得檢測(cè)，那么 標(biāo)示物需要具有一定長(zhǎng)度，以對(duì)于靶序列來(lái)說(shuō)特異，并允許在反應(yīng)條 件下雜交。理論上，標(biāo)示物可以匹配探針的總長(zhǎng)度，但在大多數(shù)情況 下較短的標(biāo)示物元件將是優(yōu)選的。較短的標(biāo)示物將具有較快的雜交動(dòng) 力學(xué)，且將使得探針能夠包含超過(guò)一種的標(biāo)示物。因此，在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及限定該特定探針的元件，其是6 - 200個(gè)核苷酸的 核苷酸序列，例如6-150個(gè)核苷酸，或例如6-100個(gè)核苷酸，或例 如6 - 80個(gè)核苷酸，或例如6 - 60個(gè)核苷酸，或例如6 - 50個(gè)核苷酸， 或例如10-40個(gè)核苷酸，或例如10-30個(gè)核苷酸，或例如15-30 個(gè)核苷酸。然而，因?yàn)樗鳊斝翁结樤跐L環(huán)復(fù)制中用作模板，所以檢測(cè)還可以通過(guò)合成來(lái)獲得。此類通過(guò)合成的檢測(cè)可以以類似于已建立的線性PRINS反應(yīng)的方式來(lái)進(jìn)行。盡管經(jīng)標(biāo)記的(例如熒光團(tuán))A、 T、 G、 C 或U的摻入是顯而易見(jiàn)的方法，但它將引起背景染色，因?yàn)檫@些核苷 酸不僅可以摻入滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物中，而且還可以摻入樣品中的其他地方。 因此，可能優(yōu)選的是，在復(fù)制時(shí)將一種或多種人工核苷酸例如isoC 或isoG摻入探針序列中，并提供互補(bǔ)核苷酸作為經(jīng)標(biāo)記的核苷酸(例 如熒光團(tuán))。因?yàn)榇祟惾斯ず塑账嵩谧匀唤缰形窗l(fā)現(xiàn)，所以異-dCTP 和異-dGTP不會(huì)摻入樣品中的其他地方，從而最小化了背景反應(yīng)。這 個(gè)方面使得利用偶聯(lián)有熒光團(tuán)的異-dCTP核苷酸或異-dGTP核苷酸是 優(yōu)選的。如果檢測(cè)通過(guò)合成來(lái)獲得，那么限定該特定探針的標(biāo)示物元 件因此優(yōu)選地可以是一種或多種人工核苷酸。因此，在另一實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及限定該特定探針的元件，其由一個(gè)或多個(gè)人工核苷酸 組成，例如1 - 20個(gè)人工核苷酸，或例如1 - 10個(gè)人工核苷酸，或例 如1 - 5個(gè)人工核苷酸，或例如4個(gè)人工核苷酸，或例如3個(gè)人工核苷 酸，或例如2個(gè)人工核苷酸，或例如l個(gè)人工核苷酸。龜形探針的總長(zhǎng)度可以依上文限定的每種元件的具體長(zhǎng)度而變。 此外，目前化學(xué)合成的寡核苷酸的長(zhǎng)度限制為大約150 - 200個(gè)核苷 酸。還可以是有利的是，使用盡可能短的探針(無(wú)需明顯地對(duì)雜交事 件和滾環(huán)效率進(jìn)行折衷)，因?yàn)閳A環(huán)越短，每單位長(zhǎng)度的合成的DNA 中標(biāo)示物元件將拷貝越多次，從而增加反應(yīng)結(jié)束時(shí)的檢測(cè)信號(hào)。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及環(huán)狀核酸探針，其中探針總長(zhǎng)度為30 - 200個(gè)核苷酸，例如30 - 150個(gè)核苷酸，或例如50 - 150個(gè)核苦酸， 或例如70 - 150個(gè)核苷酸，或例如90 - 150個(gè)核苷酸，或例如70-130 個(gè)核苷酸，或例如70-110個(gè)核苷酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDNO: 1)的龜形探針5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAAAACATGCGGACCACC- * AGCTGGTACTTGACCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3'， 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDN0:2) 的龜形探針5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAAAAATAGCGGACAAGCCGAATA-CCCTTCTCCCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3'， 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQ IDN0:3) 的龜形探針5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAAAACATGCGGACCACCAGC-TGGTACTTGACCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3', 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQ IDN0:4) 的龜形探針5' -P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAAAAATAGCGGACAAGCC-GAATACCCTTCTCCCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3'， 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDN0:5) 的龜形探針5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACGCATGTGTGAGCCGAGTCC-TGGGTGCACGTCCCACAGCTCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3', 其中P是5'-磷酸。當(dāng)使用靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制用于檢測(cè)靶核酸分子時(shí)，3'-末端必須存 在于接近探針進(jìn)行雜交的位置處，以充當(dāng)滾環(huán)復(fù)制的引物。當(dāng)檢測(cè)DNA 時(shí)，這個(gè)3'-末端可以由于生物過(guò)程或人工制備而存在(WO 97/20948 )， 或者它可以例如使用限制性酶來(lái)隨后產(chǎn)生(WO 99/49079和Larsson C. 等人，Nature Methods 1， 227-32 ( 2004 ))。然而，如果靶分子是RM，那么不能使用限制性酶，因?yàn)槿斯ぶ?備物在制備物之間將非常不同，3'-末端的更特異的產(chǎn)生將是優(yōu)選的。 某些RNA分子具有接近于探針進(jìn)行雜交的區(qū)域的可用的3'-末端，并 且在這種情況下可以使用不含切割元件的探針。然而，對(duì)于3'-末端的這種要求限制了探針位置位于RNA分子的3'-末端附近。這個(gè)問(wèn)題通過(guò)引入切割子探針來(lái)解決，所述切割子探針是含有摻 入的切割元件的環(huán)狀探針。這種切割元件使得切割子探針能夠切割靶 核酸，從而在其雜交之處產(chǎn)生新的3'-末端。因此，可以耙向任何核 酸分子的任何可接近區(qū)域，使得能夠檢測(cè)例如在3'-末端處多腺苷酸 化的真核生物信使RNA。RNA剪接是受嚴(yán)格調(diào)節(jié)的過(guò)程，其中前mRNA (前信使RNA )被去 除了內(nèi)含子從而產(chǎn)生隨后翻譯成蛋白質(zhì)的外顯子序列，所述前niRNA 是包含交替的外顯子和內(nèi)含子的基因的編碼序列的精確拷貝。還可以 在剪接過(guò)程中從最終mRNA中省略外顯子。這是稱為可變剪接的常見(jiàn)現(xiàn) 象，這允許一個(gè)基因產(chǎn)生幾種不同的mRNA，s，并由此產(chǎn)生幾種不同的 蛋白質(zhì)。它提供了調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性或由同一基因產(chǎn)生具有不同活性的 蛋白質(zhì)的方法。然而，如果可變剪接沒(méi)有被正確調(diào)節(jié)，那么它可以具 有嚴(yán)重后果，并且可變剪接已被發(fā)現(xiàn)在許多人類疾病例如癌癥的發(fā)展 中起重要作用。真核生物信使RNA例如剪接變體的檢測(cè)可以通過(guò)如下來(lái)進(jìn)行將 切割元件定位在切割子探針的耙互補(bǔ)部分內(nèi)，從而將耙互補(bǔ)部分分成 兩個(gè)部分。如果這兩個(gè)部分被設(shè)計(jì)為識(shí)別兩個(gè)鄰近外顯子(例如分別 為外顯子2和1 )的部分，那么切割子探針在外顯子1 - 2接頭處雜交。 然后，信號(hào)將只在存在外顯子l-2接頭從而允許切割子探針雜交并切 割靶RNA時(shí)出現(xiàn)。如果存在不含外顯子2但含外顯子1 - 3接頭的剪接 變體，那么它可以通過(guò)加入其中兩個(gè)靶互補(bǔ)部分識(shí)別外顯子1- 3接 頭的不同切割子探針來(lái)同時(shí)檢測(cè)。因此，不同的剪接變體可以使用本 發(fā)明的切割子探針來(lái)檢測(cè)。類似地，外顯子-內(nèi)含子接頭可以用包含跨 越外顯子-內(nèi)含子接頭的靶互補(bǔ)部分的切割子探針來(lái)檢測(cè)。因?yàn)楦骶哂?其自身標(biāo)示物的多個(gè)探針可以共雜交，所以幾種剪接變體的篩選可以 同時(shí)完成。顯示出可以通過(guò)切割子探針來(lái)檢測(cè)的可變剪接的癌癥相關(guān)基因的 例子包括但不限于，CD44、 WT1、 BRCA1、 BRCA2、 MDM2、 FGFR l-4、kallinkrin家族成員、NRSF、 NF1、 SVH、 SRF、 FYN、胱天蛋白酶-8、 PASG、 MUC1、胰島素受體、Racl、 KAI1/CD82、 WISP1、腸泌素受體、 胃泌素受體、DNMT3b4、 SVH、 C-CAM、 VEGF、輔肌動(dòng)蛋白-4、 SHBG、整 聯(lián)蛋白-lC、 AIB1、雄激素受體、雌激素受體、Syk、 uPAR、 FGFR1、 Crk、 NF1、 TSGIOI、生腱蛋白-C、纖連蛋白、Ikaros、 RET、 HE4/WFDC2、 Bradeion、 SSCA/SERPINB3、TADG-12/TMPRSS3、Testisin、PSCA、Bin-l、 Bim/BCL2L11、 Fas抗原/CD95、聚集蛋白聚糖、TACC、 RSU-1、酪氨酸 羥化酶、R0N、生腱蛋白、纖蛋白-1、 hSlo、甲狀腺激素受體、FGF-8、 CEACAMl/CD66a/BGP、和WW0X ( Brinkman BM、 ClinBiochem. 37(7)， 584-94 ( 2004 );和Venables JP、 Cancer Res. 64 ( 21) ， 7647-54 (2004 ))、骨橋蛋白、存活蛋白、hTERT(端粒酶)、細(xì)胞周期蛋白 Dl、或胰島素受體。幾種核酸酶已在文獻(xiàn)中被描述為能夠切割核酸序列。這些核酸酶 可以是脫氧核酶和核酶，并且這兩種類型都能夠提供切割元件所要求 的活性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子探針，其中所 述具有核酸內(nèi)切酶活性的元件是核酸序列。然而，因?yàn)镈NA比RNA更 穩(wěn)定，并所使用的優(yōu)選聚合酶是DNA聚合酶，所以脫氧核酶作為切割 元件是優(yōu)選的。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子探針， 其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的元件是DNA序列。近年來(lái)已通過(guò)體外 選擇策略產(chǎn)生了完全由DNA組成的許多不同的催化核酸，并且已命名 為脫氧核酶(DNA核酶)。包含核酸內(nèi)切酶活性的DM核酶介導(dǎo)序列 特異性切割，因此作為切割元件是理想的。因此，在另一實(shí)施方案中， 本發(fā)明涉及切割子探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的元件是DM 核酶。所描述的大多數(shù)DM核酶顯示出核糖核酸酶活性，并且目前最感 興趣的用于切割RNA的DNA核酶是10-23、 8-17、 17E ( 8-17酶的衍生 物)和16. 2-11。因?yàn)樗求w外選擇的笫IO個(gè)循環(huán)的第23個(gè)克隆，所以如此將其 稱為10-23 DNA核酶，其包含由15個(gè)核苦酸組成的二價(jià)金屬離子依賴性催化結(jié)構(gòu)域，側(cè)翼是通過(guò)沃森-克里克堿基配對(duì)而結(jié)合靶RNA的2 個(gè)底物識(shí)別臂。已報(bào)道，10-23 DNA核酶用幾種不同的二價(jià)金屬離子 作為輔因子來(lái)發(fā)揮作用。10-23 DNA核酶切割未配對(duì)的嘌呤A/G和配 對(duì)的嘧咬U(/C)之間的特定磷酸二酯鍵，產(chǎn)生2、3'-環(huán)狀磷酸末端， 和5'-羥基末端(Santoro SW和Joyce GF Proc Natl Acad Sci USA. 29; 94 ( 9 ) : 4262-6. ( 1997 ))。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及切割子探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的元件是10-23 DNA核酵。因?yàn)樗莵?lái)自體外選擇的第8輪的第17個(gè)克隆，所以如此將其稱 為8-17 DNA核酶，其包含由13個(gè)核苷酸組成的二價(jià)金屬離子依賴性 催化結(jié)構(gòu)域，側(cè)翼是通過(guò)沃森-克里克堿基配對(duì)而結(jié)合靶RNA的2個(gè)底 物識(shí)別臂(Santoro SW和Joyce GF Proc Natl Acad Sci USA. 29; 94 ( 9 ) : 4262-6. ( 1997 ))。如同10-23 DNA核酶一樣，已才艮道，8-17 DNA核酶用幾種不同的 二價(jià)金屬離子作為輔因子來(lái)發(fā)揮作用。8-17 DNA核酶切割在與隨后為 任何核糖核苷酸(A、 C、 G或U )的G擺動(dòng)配對(duì)的T之間的特定磷酸二 酯鍵，產(chǎn)生2、 3'-環(huán)狀磷酸末端，和5'-羥基末端。因此，在另一實(shí) 施方案中，本發(fā)明涉及切割子探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的 元件是來(lái)自8-17家族的DM核酶。一般地，切割RNA的DNA核酶作為切割元件是理想的，因?yàn)樗鼈?容易摻入探針序列內(nèi)，從而產(chǎn)生切割子探針。然而，當(dāng)使用此類設(shè)計(jì) 時(shí)，切割子探針在切割靶RNA分子后將產(chǎn)生5'-羥基末端和2、 3'-環(huán) 狀磷酸末端，其中所述2'， 3'-環(huán)狀磷酸末端具有對(duì)于切割子探針的一 個(gè)核苷酸突出端。通常， 一個(gè)堿基核苷酸突出端在滾環(huán)復(fù)制開(kāi)始前通 過(guò)包含核酸外切酶活性的聚合酶容易去除。然而，因?yàn)?'，3'-環(huán)狀磷 酸有效地抑制至少一些DM聚合酶(例如Phi29 DNA聚合酶)的核酸 外切酶和聚合酶活性，所以需要修飾/去除此類2'，3'-環(huán)狀磷酸以允 許該3'-末端引發(fā)滾環(huán)反應(yīng)。2'， 3'-環(huán)狀磷酸的去除可以使用T4多核 苷酸激酶來(lái)酶促完成，這產(chǎn)生引發(fā)滾環(huán)反應(yīng)所需的3'-羥基末端。已對(duì)8-17 DNA核酶實(shí)施了體外選擇的另外輪回，這已導(dǎo)致產(chǎn)生這種DNA 核酶的新變體。在這些新變體中，17E DNA核酶是最感興趣的，因?yàn)?已報(bào)道它包含兩步機(jī)制，其中通常由DNA核酶切割而產(chǎn)生的2、 3'-環(huán) 狀磷酸被水解。2、 3'-環(huán)狀磷酸的這種水解僅在將Pb"用作二價(jià)金屬 輔因子時(shí)發(fā)生。然而，如果17E DNA核酶用作切割元件，而Pb"作為 輔因子，那么切割產(chǎn)物是3'-(或2'-)單磷酸末端和5'-羥基末端(Brown AK等人，Biochemistry 17; 42 ( 23 ) : 7152-61 ( 2003 ))。 如果使用包含核酸外切酶活性的DNA聚合酶，那么這可以允許該新的 3'-末端充當(dāng)滾環(huán)復(fù)制的引物而不要求修飾/去除。因此，在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及切割子探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的元 件是17E DNA核酶。包含脫氧核糖核酸酶活性的DNA核酶也已得到描述，但由于DNA 的更大的穩(wěn)定性，所以此類DNA核酶很可能必須包含更復(fù)雜的活性位 點(diǎn)。包含脫氧核糖核酸酶活性的有效DNA核酶因此一定比包含核糖核 酸酶活性的DNA核酶更罕見(jiàn)。已將包含脫氧核糖核酸酶活性的DM核 酶分成兩類需要Cu^和抗壞血酸鹽以促進(jìn)DM切割的類型I，和只需 要Cu"的類型II (Carmi N.等人，Proc Natl Acad Sci USA. 3; 95(5 ): 2233-7 ( 1998 ))。目前，DM核酶對(duì)于DM切割比對(duì)于RNA 切割具有更低的效率，但將來(lái)將極有可能開(kāi)發(fā)出對(duì)DNA具有更高切割 效率的DM核酶。一些脫氧核酶包含分子內(nèi)的堿基配對(duì)，例如8-17 DNA核酶。此類 結(jié)構(gòu)可以通過(guò)摻入已知改善雜交效率的人工核苷酸例如PNA或LNA可 以而得到強(qiáng)化，這可以改善切割效率。在文獻(xiàn)中，已報(bào)道與寡核苷酸偶聯(lián)的不同反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)能夠誘 導(dǎo)核酸分子的序列特異性切割。類似于DNA核酶，這些化學(xué)基團(tuán)中的 許多使用二價(jià)金屬離子作為輔因子。與化學(xué)絡(luò)合物偶聯(lián)的寡核苷酸與 靶核酸分子中的序列雜交，從而通過(guò)其序列確定切割位點(diǎn)。如果這種 偶聯(lián)的寡核苷酸是切割子探針的一部分，那么切割子探針通過(guò)探針與 靶核酸分子的雜交而提供靶特異性，并且化學(xué)基團(tuán)切割靶核酸分子，從而產(chǎn)生用作滾環(huán)反應(yīng)引物的3'-末端。在化學(xué)絡(luò)合物抑制滾環(huán)復(fù)制 的情況下，如果化學(xué)基團(tuán)通過(guò)切割連接體例如但不限于二硫橋而與探 針偶聯(lián)，那么絡(luò)合物可以在滾環(huán)復(fù)制前從切割子探針上釋放。因此， 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子探針，其中所述具有核酸內(nèi)切 酶活性的元件是反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。如使用DNA核酶一樣，已描述了包含核糖核酸酶活性的反應(yīng)性化 學(xué)基團(tuán)，并且這些基團(tuán)中的一些已與寡核苷酸相偶聯(lián)以提供序列特異 性，例如但不限于，三聯(lián)吡咬-Cu(II) ( Terpyridine-Cu(II))(Sakamoto S.等人，Nucleic Acids Res. 1; 31( 5 ): 1416-25( 2003 ))、 5-氨基-2， 9-二曱基菲咯啉-Zn (II) ( Astrom H.等人，Org Biomol Chem. 7; 1 ( 9 ): 1461-5 ( 2003 ))、四氮雜大環(huán)-Eu(III) (Huang L.等 人，J Biol InorgChem. 5 ( 1 ): 85-92 ( 2000 ))和新亞銅試劑-Zn (II)(Whitney A.等人，Chem Commun ( Camb ) .7; ( 1 ) : 36-7 ( 2003 ))， 已報(bào)道所有這些誘導(dǎo)由偶聯(lián)的寡核苷酸所指導(dǎo)的序列特異性切割。在 新亞銅試劑-Zn(II)的情況下，寡核苷酸包含PNA形式的人工核苷酸， 所述人工核苷酸因?yàn)樵黾拥陌杏H和性、序列特異性和生物化學(xué)穩(wěn)定性 而被使用。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子探針，其中 所述具有核酸內(nèi)切酶活性的元件選自下列三聯(lián)吡淀-Cu(II)、 5-氨基 -2，9-二甲基菲咯啉-Zn(II)、四氮雜大環(huán)-Eu(III)和新亞銅試劑 -Zn(II)。盡管DNA與RNA相比具有更大的穩(wěn)定性，但也已報(bào)道了包含脫氧 核糖核酸酶活性的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)，例如但不限于，用012+作為輔因 子的環(huán)丙沙星(HCp)。在抗壞血酸鹽/過(guò)氧化氫激活后，HCp可以使 用Cu2+作為輔因子而充當(dāng)有效的化學(xué)核酸酶(Jimenez-Garrido N等 人，J Inorg Biochem. 99 ( 3 ) : 677-89 ( 2005 ))。如使用DNA核 酶一樣，反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)目前對(duì)于DNA切割比對(duì)于RNA切割具有更低 的效率，但將來(lái)將極有可能開(kāi)發(fā)出對(duì)DNA具有更高切割效率的反應(yīng)性 化學(xué)基團(tuán)。反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)已被報(bào)道為偶聯(lián)至與靶核酸分子雜交的寡核苷酸的一個(gè)末端，和為偶聯(lián)至在雜交區(qū)域內(nèi)的核酸分子，而DNA核酶必須位于雜交區(qū)域內(nèi)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子探針， 其中所述一個(gè)或多個(gè)具有核酸內(nèi)切酶活性的元件位于靶互補(bǔ)序列內(nèi)部，從而將其分成兩個(gè)或更多個(gè)部分，并且在另一實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及切割子探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的元件是位于靶互 補(bǔ)區(qū)域的一個(gè)末端中的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。為了標(biāo)示切割子探針或者區(qū)分不同的切割子探針(如果反應(yīng)中存 在超過(guò)一種的切割子探針)，那么需要一個(gè)或多個(gè)限定特定切割子探 針的元件一一標(biāo)示物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及環(huán)狀核 酸探針，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)限定該特定探針的元件?？梢允褂貌煌椒▉?lái)標(biāo)示特定切割子探針，并且標(biāo)示物元件將依 據(jù)所選擇的方法而不同。如果通過(guò)經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸與標(biāo)示物元件雜交來(lái)獲得檢測(cè)，那么 標(biāo)示物需要具有一定長(zhǎng)度，以對(duì)于靶序列來(lái)說(shuō)特異，并允許在反應(yīng)條 件下雜交。理論上，標(biāo)示物可以匹配探針的總長(zhǎng)度，但在大多數(shù)情況 下較短的標(biāo)示物元件將是優(yōu)選的。較短的標(biāo)示物將具有較快的雜交動(dòng) 力學(xué)，且將使得探針能夠包含超過(guò)一種的標(biāo)示物。因此，在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及限定該特定探針的元件，其是6 - 200個(gè)核苷酸的 核苷酸序列，例如6-150個(gè)核苷酸，或例如6-IOO個(gè)核苷酸，或例 如6 - 80個(gè)核苷酸，或例如6 — 60個(gè)核苷酸，或例如6 - 50個(gè)核苷酸， 或例如10-40個(gè)核苷酸，或例如10-30個(gè)核苷酸，或例如15-30 個(gè)核苷酸。然而，因?yàn)樗銮懈钭?龜形探針在滾環(huán)復(fù)制中用作模板，所以檢 測(cè)還可以通過(guò)合成來(lái)獲得。此類通過(guò)合成的檢測(cè)可以以類似于已建立 的線性PRINS反應(yīng)的方式來(lái)進(jìn)行。盡管經(jīng)標(biāo)記的(例如熒光團(tuán))A、 T、 G、 C或U的摻入是顯而易見(jiàn)的方法，但它將引起背景染色，因?yàn)檫@些 核苷酸不僅可以摻入滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物中，而且還可以摻入樣品中的其他 地方。因此，可能優(yōu)選的是，在復(fù)制時(shí)將一種或多種人工核苷酸例如 isoC或isoG摻入探針序列中，并提供互補(bǔ)核苷酸作為經(jīng)標(biāo)記的核苷酸(例如熒光團(tuán))。因?yàn)榇祟惾斯ず塑账嵩谧匀唤缰形窗l(fā)現(xiàn)，所以它 們不會(huì)以任何大的程度摻入樣品中的其他地方，從而最小化了背景反應(yīng)。這個(gè)方面使得利用偶聯(lián)有熒光團(tuán)的異-dCTP核苷酸或異-dGTP核苷 酸是優(yōu)選的。如果檢測(cè)通過(guò)合成來(lái)獲得，那么限定該特定探針的標(biāo)示 物元件因此優(yōu)選地可以是一種或多種人工核苷酸。因此，在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及限定該特定探針的元件，其由一個(gè)或多個(gè)人工核 苷酸組成，例如1 - 2G個(gè)人工核苷酸，或例如1 - 10個(gè)人工核苷酸， 或例如1 — 5個(gè)人工核苷酸，或例如4個(gè)人工核苷酸，或例如3個(gè)人工 核苷酸，或例如2個(gè)人工核苷酸，或例如1個(gè)人工核苷酸。切割子-龜形探針的總長(zhǎng)度可以依上文限定的每種元件的具體長(zhǎng) 度而變。此外，當(dāng)前化學(xué)合成的寡核苷酸的長(zhǎng)度限制為大約150 - 200 個(gè)核苷酸。還可以是有利的是，使用盡可能短的探針(無(wú)需明顯地對(duì) 雜交事件和滾環(huán)效率進(jìn)行折衷)，因?yàn)閳A環(huán)越短，每單位長(zhǎng)度的合成 的DNA中標(biāo)示物元件將拷貝越多次，從而增加反應(yīng)結(jié)束時(shí)的檢測(cè)信號(hào)。 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及環(huán)狀核酸探針，其中探針總 長(zhǎng)度為30 - 200個(gè)核苷酸，例如30 - 150個(gè)核苷酸，或例如50-150 個(gè)核苷酸，或例如70-150個(gè)核苷酸，或例如90-150個(gè)核苷酸，或 例如70 - 130個(gè)核苷酸，或例如70 - 110個(gè)核苷酸。優(yōu)選的切割子探針設(shè)計(jì)是切割子-龜，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)自我模板式 連接來(lái)連接，特別地，當(dāng)在靶核酸分子上的連接效率很低時(shí)(例如在 包含由于制備或固定而產(chǎn)生的修飾的RNA靶或DM靶上，例如，向核 酸堿基添加單羥曱基(-CH2OH)，導(dǎo)致通過(guò)亞曱基橋接而產(chǎn)生腺嘌呤 基團(tuán)的二聚化)，所述自我模板式連接可能是優(yōu)選的。因此，在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子-龜形探針類型的環(huán)狀核酸探針， 其中所述探針包含一個(gè)或多個(gè)具有核酸內(nèi)切酶活性的元件。切割子-龜形探針的特征在于包含一個(gè)或多個(gè)切割元件，并且在探 針序列中包含其自身連接模板，允許連接探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)， 而無(wú)需添加外部連接模板。因此，在一種優(yōu)選設(shè)計(jì)中，切割子-龜形探針包括(圖6H):環(huán)狀核酸探針，其包含I. 包含核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分，所述核酸序列互相 至少75%互補(bǔ)并且各具有3-100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；II. 包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 第二個(gè)核酸部分，并且其中所述第二個(gè)部分具有9 — 50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；III. 包含與靼核酸序列至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序列的第四個(gè) 部分，并且其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸。IV. 切割元件。由于經(jīng)由包含在其序列內(nèi)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和2個(gè)互補(bǔ)序列所介導(dǎo)的切 割子-龜形探針的分子內(nèi)雜交，自我模板式連接是可能的。當(dāng)這些互補(bǔ) 序列雜交時(shí)，切割子-龜形探針的5'-末端和3'-末端變得接近，這使 得能夠連接探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明涉及核酸探針，其包含包含至少75%互補(bǔ)的核酸序列的第一個(gè) 部分和第三個(gè)部分，和包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二個(gè)核酸部分，以及切割元件，例如75 - 100 %互補(bǔ)， 或例如80 - 100 %互補(bǔ)，或例如85 - 100 %互補(bǔ)，90 - 100 %互補(bǔ)，或 例如95 - 100 %互補(bǔ)，或例如100%互補(bǔ)。應(yīng)當(dāng)理解，互補(bǔ)部分能夠互相雜交。切割子-龜形探針可以包含一個(gè)或多個(gè)切割元件，并且切割元件可 以位于雜交區(qū)域內(nèi)或雜交區(qū)域的一個(gè)末端中(如果切割元件是反應(yīng)性 化學(xué)基團(tuán))。因此，與靶核酸分子雜交的切割子-龜形探針的這一部分 可以分成兩個(gè)或更多個(gè)雜交部分。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明 涉及切割子-龜形探針，其中所述一個(gè)或多個(gè)具有核酸內(nèi)切酶活性的元 件位于靶互補(bǔ)序列內(nèi)部，從而將其分成兩個(gè)或更多個(gè)部分，并且在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子-龜形探針，其中所述具有核酸內(nèi)切 酶活性的元件是位于靶互補(bǔ)區(qū)域的一個(gè)末端中的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。然而，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用一個(gè)切割元件，所述切割元 件位于雜交部分內(nèi)，從而將其分成兩個(gè)部分。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子-龜類型的核酸探針，其進(jìn)一步包含第四個(gè)和第 五個(gè)部分，它們各包含核酸殘基序列，所述核酸殘基序列與靶核酸序列至少75%互補(bǔ)，例如75 - 100 %互補(bǔ)，或例如80 - 100 %互補(bǔ)，或 例如85 - 100 %互補(bǔ)，或例如90 - 100 %互補(bǔ)，或例如95 - 100 %互補(bǔ)， 或例如100%互補(bǔ)。關(guān)于RNA，本發(fā)明的這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及切割子 -龜類型的環(huán)狀核酸探針，其包含核酸殘基的第四個(gè)和第五個(gè)部分，其 中所述第四個(gè)和第五個(gè)部分各包含與靶RNA序列至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序列。切割子-龜?shù)牡谒膫€(gè)和第五個(gè)部分可以具有相同或不同的長(zhǎng)度，只 要它們均能夠在反應(yīng)條件下與靶核酸分子雜交。包含與靶核酸序列互 補(bǔ)的核酸序列的切割子-龜形探針的第四個(gè)部分可以具有6-100個(gè)核 苷酸的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子-龜類 型的環(huán)狀核酸探針，其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸， 例如10-100個(gè)核苷酸，或例如10-80個(gè)核苷酸，或例如10-60個(gè) 核苷酸，或例如10-40個(gè)核苷酸，或例如10-30個(gè)核普酸。包含與 靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的切割子-龜形探針的第五個(gè)部分可以具 有6-100的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子 -龜類型的環(huán)狀核酸探針，其中所述第五個(gè)部分的長(zhǎng)度是6 - 100個(gè)核 苷酸，例如10-100個(gè)核苷酸，或例如10-80個(gè)核苷酸，或例如10 -60個(gè)核苷酸，或例如10-40個(gè)核苷酸，或例如10-30個(gè)核普酸。切割子-龜形探針的第一個(gè)和第三個(gè)部分包含在互相雜交后能夠 (連同第二個(gè)部分一起)將探針折疊成開(kāi)放環(huán)狀結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)序列，所 述開(kāi)放環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以連接成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1H)。這些部分的長(zhǎng)度 必需具有允許在反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交的大小。因此，在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及切割子-龜類型的環(huán)狀核酸探針，其中所述第一個(gè)部分 和第三個(gè)部分的長(zhǎng)度各為3 — 100個(gè)核苷酸，例如3 — 50個(gè)核苷酸，或 例如3-40個(gè)核苷酸，3-3Q個(gè)核苷酸，或例如3-20個(gè)核苷酸，或 例如3-10個(gè)核苷酸。切割子-龜形探針的第二個(gè)部分包含發(fā)夾，所述發(fā)夾對(duì)于在分子內(nèi)雜交后使探針變成開(kāi)放環(huán)狀結(jié)構(gòu)是重要的。這個(gè)部分的長(zhǎng)度必需具有 允許在反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交的大小。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及切割子-龜類型的環(huán)狀核酸探針，其中所述第二個(gè)部分的長(zhǎng)度為9-5Q個(gè)核苷酸，例如15-50個(gè)核苷酸，或例如15-40個(gè)核苷酸， 15 - 30個(gè)核苷酸，或例如10 - 20個(gè)核苷酸，或例如15 — 10個(gè)核苷酸。 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQ ID N0:6) 的切割子-龜5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACGCTACAGCCACACAGGCTAGCTACAAC GAGTCTCCTCCCTAGCAAAACCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3,, 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDN0:7) 的切割子-龜5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCACATGTTTGGCTCCTCGGTAGCACCGCAGGCTAGCTACAAC GATGAGCGTTGGCGGTGTGTCCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3', 其中P是5'-磷酸。掛鎖探針和預(yù)先形成的環(huán)形探針均同樣可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)切 割元件引入環(huán)形探針中而變成切割子探針(分別為切割子-掛鎖和預(yù)先 形成的切割子-環(huán))。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及環(huán)狀核酸 探針，其為預(yù)先形成的環(huán)形探針或掛鎖探針，其中所述探針包含一個(gè) 或多個(gè)具有核酸內(nèi)切酶活性的元件。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子探針，其為環(huán)狀核 酸探針，包含i) 一個(gè)或多個(gè)部分，每個(gè)部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少75 %互補(bǔ)的核酸殘基序列，和ii) 限定該特定探針的元件。在這個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以進(jìn)一步涉及切割子探針，其中與 靶核酸序列的區(qū)域具有至少75 %互補(bǔ)性的所述一個(gè)或多個(gè)部分的總 長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸。預(yù)先形成的切割子-環(huán)的特征在于包含一個(gè)或多個(gè)靶識(shí)別部分、一個(gè)或多個(gè)切割元件(一般而言與切割子探針一樣)，并且在其用作雜 交探針前是閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些類型的切割子探針優(yōu)選可以通過(guò)在使 用前連接切割子-龜來(lái)獲得。切割子-龜形探針對(duì)于制備預(yù)先形成的切 割子-環(huán)形探針是理想的，因?yàn)樗鼈兪亲晕夷０迨降模虼丝梢赃M(jìn)行連 接以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)而無(wú)需外部連接模板。外部連接模板將必須在 雜交前從預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針中去除，以確保外部連接模板不 會(huì)用作滾環(huán)引物而產(chǎn)生假信號(hào)。因?yàn)榍懈钭?探針提供單分子檢測(cè)，所 以這種去除將必須絕對(duì)完全，這在實(shí)踐中可能難以達(dá)到。因此，在一種優(yōu)選設(shè)計(jì)中，預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針包含i) 一個(gè)或多個(gè)部分，每個(gè)部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少75 %互補(bǔ)的核酸殘基序列，和ii) 限定該特定探針的元件，和 iii ) 一個(gè)或多個(gè)切割元件，和iv)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即無(wú)終止的主鏈。預(yù)先形成的切割子-環(huán)可以包含一個(gè)或多個(gè)切割元件，并且切割元 件可以位于雜交區(qū)域內(nèi)或雜交區(qū)域的一個(gè)末端中(如果切割元件是反 應(yīng)性化學(xué)基團(tuán))。因此，與靶核酸分子雜交的預(yù)先形成的切割子-環(huán)的 這一部分可以分成兩個(gè)或更多個(gè)雜交部分。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明涉及預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針，其中所述一個(gè)或多個(gè)具有核 酸內(nèi)切酶活性的元件位于靶互補(bǔ)序列內(nèi)部，從而將其分成兩個(gè)或更多 個(gè)部分，或其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的元件是位于靶互補(bǔ)區(qū)域的一個(gè)末端中的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用一個(gè)切割元件，所述切割元件位于 雜交部分內(nèi)，從而將其分成兩個(gè)部分。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明涉及預(yù)先形成的切割子-環(huán)類型的核酸探針，其進(jìn)一步包含第一個(gè) 和第二個(gè)部分，它們各包含核酸殘基序列，所述核酸殘基序列與靶核 酸序列至少75%互補(bǔ)，例如80 - 100 %互補(bǔ)，或例如85 - 100 %互補(bǔ)， 90 - 100 %互補(bǔ)，或例如95 - 100 %互補(bǔ)，或例如100%互補(bǔ)。關(guān)于RNA 靶，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及預(yù)先形成的切割子-環(huán)，其中所述第一個(gè)和第二個(gè)部分各包含與靶RNA序列至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序 列。預(yù)先形成的切割子-環(huán)的第一個(gè)和第二個(gè)部分可以具有相同或不 同的長(zhǎng)度，只要它們均能夠在反應(yīng)條件下與靶核酸分子雜交。包含與 靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的預(yù)先形成的切割子-環(huán)的第一個(gè)部分可 以具有6-100的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù) 先形成的切割子-環(huán)類型的環(huán)狀核酸探針，其中所述第一個(gè)部分的長(zhǎng)度 為6-100個(gè)核苷酸，例如10-100個(gè)核苷酸，或例如10-80個(gè)核普 酸，或例如10-60個(gè)核苷酸，或例如10-40個(gè)核苷酸，或例如10-30個(gè)核苷酸。包含與耙核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的預(yù)先形成的切割子 -環(huán)形探針的第二個(gè)部分可以具有6-100的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè) 實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及環(huán)狀核酸探針即預(yù)先形成的切割子-環(huán)，其中 所述第二個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸，例如IO-IOO個(gè)核苷酸， 或例如10-80個(gè)核苷酸，10-60個(gè)核苷酸，或例如10 - 40個(gè)核普酸， 或例如10- 3G個(gè)核香酸。切割子-掛鎖探針的特征在于包含兩個(gè)或更多個(gè)耙識(shí)別部分以及 一個(gè)或多個(gè)切割元件(一般而言與切割子探針一樣)。切割子-掛鎖探 針(圖1G)具有兩個(gè)或更多個(gè)部分，所述部分各包含與靶核酸序列的 區(qū)域至少75%互補(bǔ)的核酸殘基序列，從而使得能夠使用靼核酸作為連 接模板來(lái)進(jìn)行外部模板式連接。因此，在一種優(yōu)選設(shè)計(jì)中，切割子-掛鎖探針包含(圖1G):i)兩個(gè)或更多個(gè)部分，每個(gè)部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少 75%互補(bǔ)的核酸殘基序列，和U)限定該特定探針的元件，和iii ) 一個(gè)或多個(gè)切割元件。應(yīng)當(dāng)理解，切割子-掛鎖的環(huán)化/連接以及切割元件的結(jié)合都需要 靶識(shí)別，并且環(huán)化/連接和切割元件可能識(shí)別相同或不同的靶(圖1G)。通過(guò)使用置于掛鎖探針的環(huán)化/連接元件內(nèi)的切割元件，環(huán)化和切 割官能團(tuán)識(shí)別相同的靶分子和那種靶分子的相同部分。如果切割元件置于負(fù)責(zé)掛鎖探針環(huán)化的所述一個(gè)或多個(gè)靶識(shí)別部分外，那么該切割 子 -探針可以識(shí)別兩種或更多種耙分子，或相同靶分子的兩個(gè)或更多個(gè) 部分。在后面一種情況下，該切割子-探針將報(bào)告兩種或更多種粑的共 定位。切割子-掛鎖可以包含一個(gè)或多個(gè)切割元件，并且切割元件可以位 于與靶雜交的游離核酸部分內(nèi)，或當(dāng)切割元件是反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)時(shí)，位于在最接近靶核酸分子3'-末端處進(jìn)行雜交的游離核酸末端部分的 一個(gè)末端中。因此，與靶核酸分子雜交的切割子-掛鎖的部分可以分成 三個(gè)或更多個(gè)雜交部分。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割 子-掛鎖探針，其中所述一個(gè)或多個(gè)具有核酸內(nèi)切酶活性的元件位于靼 互補(bǔ)序列內(nèi)，從而將其分成三個(gè)或更多個(gè)部分，或者其中所述切割元 件是位于雜交區(qū)域的一個(gè)末端中的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用位于雜交部分之一內(nèi)的一個(gè)切割元 件，從而將切割子-掛鎖的靶識(shí)別部分分成三個(gè)部分(圖1G)。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及切割子-掛鎖類型的核酸探針，其進(jìn)一 步包含第一個(gè)、第二個(gè)部分和第三個(gè)部分，它們各包含核酸殘基序列， 所述核酸殘基序列與耙核酸序列至少75%互補(bǔ)，例如75 - 100%互補(bǔ)， 例如80 - 100 %互補(bǔ)，或例如85 - 100%互補(bǔ)，90 - 100 %互補(bǔ)，或例 如95 - 100 %互補(bǔ)，或例如100%互補(bǔ)。關(guān)于RNA靶，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及環(huán)狀核酸探針即 切割子-掛鎖，其包含第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)部分的核酸殘基，其中 所述第一個(gè)、第二個(gè)和笫三個(gè)部分各包含與乾RNA序列至少75%互補(bǔ) 的核酸殘基序列。切割子-掛鎖的第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)部分可以具有相同或不同 的長(zhǎng)度，只要它們都能夠在反應(yīng)條件下與靶核酸分子雜交。包含與靶 核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針的第一個(gè)部 分可以具有6-100的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉 及切割子-掛鎖類型的環(huán)狀核酸探針，其中所述第一個(gè)部分的長(zhǎng)度為6 -IOO個(gè)核苷酸，例如6-1GG個(gè)核苷酸，或例如6-80個(gè)核苷酸，或例如6 - 60個(gè)核苷酸，或例如8 - 40個(gè)核苷酸，或例如1Q - 30個(gè)核苷 酸。包含與靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的切割子-掛鎖探針的第二個(gè)部 分可以具有6-100的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉 及切割子-桂鎖類型的環(huán)狀核酸探針，其中所述第二個(gè)部分的長(zhǎng)度為6 -100個(gè)核苷酸，例如6-10Q個(gè)核苷酸，或例如6-80個(gè)核苷酸，6 -60個(gè)核苦酸，或例如8-40個(gè)核普酸，或例如10-30個(gè)核苷酸。 包含與靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的切割子-掛鎖探針的第三個(gè)部分 可以具有6-100的線性長(zhǎng)度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及 環(huán)狀核酸探針即切割子-掛鎖，其中所述第三個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100 個(gè)核苷酸，例如6-100個(gè)核苷酸，或例如6-80個(gè)核苷酸，6-60個(gè) 核苷酸，或例如8-40個(gè)核苷酸，或例如10-30個(gè)核苷酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDNO:8) 的切割子-掛鎖 5'-P-CATCGGGAGAAGCTCATAGATTTATTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTT ACTTGGATGTCTGACAGTCTAGGCTAGCTACAACGATGGTTTGCAGAGACCCAGTGGC-3,, 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDNO:9) 的切割子-掛鎖 5'-P-CCATGTCAAAATCACTCCCATTTATTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTT-ACTTGGATGTCTGTAAAGAGAGGCTAGCTACAACGAGATGGCACCTGGCACCC-3', 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDNO:10) 的切割子-掛鎖 5'-P-TACTTCATCGCATCTTTGTGTTTATTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTT-ACTTGGATGTCTAGGGAAAAGGCTAGCTACAACGATAAGAAATTCGATGCTGC-3', 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQ IDN0:11) 的切割子-掛鎖 5'-P-TAATTACTGATTGTGTATCTTTTATTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTT-ACTTGGATGTCTAGAACGTAGGCTAGCTACAACGAAAATAGTAGTCATTTGC-3'， 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDN0:12) 的切割子-掛鎖 5'-P-CTAGCAAAACCTCTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTTACTTTACAGCCAGG-CTAGCTACAACGAACACGTCTCCTCC-3'， 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDN0:13) 的切割子-掛鎖 5'-P-CGCACTGAGCGTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTTACTTGGACTTGAGG-CTAGCTACAACGACTCGGGTCGGTAGCAC-3,, 其中P是5'-磷酸。上文描述的不同探針可以用于在溶液中、原位和在如下文詳細(xì)描 述的基于陣列的測(cè)定法中檢測(cè)核酸。通過(guò)靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制來(lái)檢測(cè)核酸分子具有由于反應(yīng)的靶引發(fā)特 征而引起的強(qiáng)信號(hào)擴(kuò)增和局域化信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，靶引發(fā)的滾環(huán)反應(yīng)從核酸分子的天然3'-末端開(kāi)始引發(fā)。因?yàn)檫@種方法需要在RM中探針進(jìn)行雜交的區(qū)域處或 附近存在3'-末端，所以靶RNA優(yōu)選可以是非多腺苷酸化的RNA，例如 但不限于，來(lái)自EB病毒的EBER1和EBER2、腺病毒編碼的小RNA，s VA1 和VA2、核糖體RNA，s、端粒酶復(fù)合物(hTERC)的RM部分、小干擾 RNA，s (siRNA，s)和微小RNA，s (miRNA，s)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶RNA分子的方法，所述方法包括使環(huán)狀核酸探針與把RNA序列在所述靶RM分子的-末端處或附近進(jìn)行雜交， 所述環(huán)狀核酸探針是預(yù)先形成的環(huán)形探針、掛鎖探針、或龜類型的環(huán) 狀核酸探針；進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。
因此，在這個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以涉及包括下列步驟的方法
i) 獲得包含所述靶RNA分子的制劑，和
ii) 提供所述環(huán)狀核酸探針，和
iii )使所述探針與所述靶RM分子在所述靶RNA分子的-末端 處或附近進(jìn)行雜交，和
iv) 用所述探針作為模板來(lái)實(shí)施滾環(huán)復(fù)制， 并通過(guò)使?jié)L環(huán)產(chǎn)物可視化來(lái)檢測(cè)所述靼RM分子。
備選地，本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)靶核酸分子的方法，所述方法包 括使環(huán)狀核酸探針與靶核酸序列在所述靶核酸分子的3'-末端處或附 近進(jìn)行雜交，所述環(huán)狀核酸探針是預(yù)先形成的環(huán)形探針、掛鎖探針或 根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀核酸探針；進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物，其中 所述靶核酸是RNA分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括
i) 獲得包含所述靶RM分子的制劑，和
ii) 提供所述環(huán)狀核酸探針，和
i i i )使所述探針與靶RNA分子在所述靶RNA分子的3'-末端處或 附近進(jìn)行雜交，和
iv )使用所述靶核酸分子作為連接模板或使用對(duì)于所述環(huán)狀核酸 探針來(lái)說(shuō)內(nèi)在的連接模板，來(lái)連接環(huán)狀探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，
v) 用所述探針作為模板來(lái)實(shí)施滾環(huán)復(fù)制，
vi) 通過(guò)使?jié)L環(huán)產(chǎn)物可視化來(lái)檢測(cè)所述粑RNA分子， 其中步驟iv)也可以在步驟iii )之前進(jìn)行。
如果所使用的探針是龜形探針或掛鎖探針，那么在實(shí)施滾環(huán)復(fù)制 前需要連接步驟。因此，在這個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以進(jìn)一步涉及 這樣的方法，其中所述探針是掛鎖探針或龜類型的環(huán)狀核酸探針，其 中所述方法進(jìn)一步包括連接所述探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的步驟(圖5和7)(實(shí)施例3和5)。
然而，如果耙DM是染色質(zhì)DM或包含修飾的DM，所述修飾為 例如由于降解、制備或固定而產(chǎn)生的修飾，例如向核酸堿基添加單羥 甲基(-CH20H)，導(dǎo)致通過(guò)亞曱基橋接而產(chǎn)生腺嘌呤基團(tuán)的二聚化， 那么通過(guò)使用龜形探針獲得的自我模板式連接可能是優(yōu)選的。因此， 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)耙DNA分子的方法，所述方 法包括使龜類型的環(huán)狀核酸探針與靶DNA序列在所述耙DNA分子的 3'-末端處或附近進(jìn)行雜交；進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。
通過(guò)靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制來(lái)檢測(cè)核酸分子還可以原位進(jìn)行，這具有 下列幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)它提供關(guān)于某些RM分子的表達(dá)的信息；它揭示出所 述RNA在哪種細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)；并且它提供關(guān)于在該細(xì)胞中所述RNA 存在于何處的信息，例如存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。由于集中在基于 陣列的技術(shù)，通常低估了單細(xì)胞檢測(cè)的重要性以及RNA種類在細(xì)胞內(nèi) 的定位。然而，因?yàn)椴徽_定位的RNA可以對(duì)細(xì)胞具有有害后果，例 如如果信使RNA或核糖體RNA保留在細(xì)胞核中，那么RNA在細(xì)胞內(nèi)的 定位不能被忽視。同樣，大多數(shù)其他技術(shù)(例如基于PCR和基于陣列 的)使用從幾種細(xì)胞中提取的RNA，并因此在不同類型的細(xì)胞上求平 均值，所述不同類型的細(xì)胞各取決于細(xì)胞類型和來(lái)自周圍細(xì)胞的調(diào)節(jié) 而具有不同表達(dá)譜。因此，表達(dá)譜將通常代表在一組細(xì)胞上的平均值。 因此，如果例如一半的細(xì)胞不表達(dá)某種RNA,而另一半以高于正常的 量表達(dá)這種RNA，那么結(jié)論可以是所有細(xì)胞都以正常量表達(dá)該RNA。因 此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中所述耙RNA分子的檢測(cè)原位 發(fā)生的方法(圖5-7)(實(shí)施例3-5)。
在實(shí)踐中，這個(gè)實(shí)施方案可以例如采取下列形式
取決于靶RNA分子是作為組織還是作為細(xì)胞提供，可能需要不同 的預(yù)處理，例如以石蠟包埋組織的脫蠟形式，或如果細(xì)胞是例如植物 或酵母，以細(xì)胞壁降解的形式。然而，預(yù)處理后的操作程序?qū)τ诓煌?細(xì)胞或組織是類似的，取決于所使用的環(huán)形探針類型而對(duì)操作程序有 小改變(例如如果使用預(yù)先形成的環(huán)，那么省略連接步驟)。探針在雜交混合物中混合至0. 001 - 100 jiM，優(yōu)選0.01-10 ja M的終濃度。所使用的雜交混合物包含20%甲酰胺、2xSSC、 5%甘 油、1 jug/Ml載體DNA。這種雜交混合物還可以包含載體RNA，并且 載體DNA、載體RNA、甲酰胺和甘油的量可以改變以適合特殊需要。將 雜交混合物加入至包含靶核酸的制劑中并于95。C孵育0. 5-60分鐘， 優(yōu)選2- IO分鐘，隨后冷卻至37'C并孵育5- 30分鐘(延伸的雜交可 以于37'C進(jìn)行過(guò)夜)。備選地，雜交可以于37'C進(jìn)行而無(wú)需加熱至 95°C。應(yīng)當(dāng)理解，雜交溫度可以例如依據(jù)所使用的探針的解鏈溫度而 不同。
探針雜交后，可以使用T4DNA連接酶來(lái)進(jìn)行連接。取決于所使用 的環(huán)形探針的類型，對(duì)于連接需要不同的條件，并且如果所述環(huán)形探 針是預(yù)先形成的環(huán)，那么省略連接步驟。
優(yōu)選地，所使用的環(huán)形探針是龜形探針，因?yàn)辇斝翁结槹渥?身的連接模板。這允許連接反應(yīng)能夠用幾種不同的DNA連接酶來(lái)進(jìn)行， 例如但不限于下列連接酶中的任何一種T4DNA連接酶、Tsc連接酶、 Tth連接酶、Pfu連接酶、Taq連接酶、Arap連接酶(Ampl igase )或大 腸桿菌DNA連接酶。優(yōu)選地，T4 DNA連接酶(Fermentas)以0. 05-0. 15 U/y 1的濃度使用，備選地可以使用0. 001-0. 7U/ul。可以加 入RNA酶抑制劑，例如但不限于Ribolock RNA酶抑制劑(Fermentas )。 使用0.01-2 U/jj1,優(yōu)選O. 5-1.5 U/pl Ribolock (Fermentas) 的終濃度。如果連接反應(yīng)在細(xì)胞或組織中發(fā)生，那么添加BSA至O. 05 -O. 5 |ig/pl，備選地0.01-1 |ig/pl的終濃度可以改善酶促反 應(yīng)。在適合于所選連接酶的溫度下使用2分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選5分鐘 -5小時(shí)的孵育時(shí)間。
備選地，環(huán)形探針可以是使用靶RNA作為模板來(lái)進(jìn)行連接的掛鎖 探針。這種連接反應(yīng)比使用龜形探針獲得的連接反應(yīng)具有更低的效率， 并且在緩沖液中使用T4 DNA連接酶最有效地進(jìn)行(根據(jù)Niisson M. 等人，Nat Biotechnol. 18 ( 7 ) : 791-3. ( 2000 ))，所述緩沖液 包含10 mMTris-HCL (在25。C下pH7. 5 ) 、 10mMMgCl2、 10 |i M ATP和0. 1 U/|al T4 DNA連接酶(Fermentas)。如果連接反應(yīng)在細(xì)胞或 組織中發(fā)生，那么添加bsa至0. 05-0. 5 mg/yl，備選地0.01-1 m g/M 1的終濃度可以改善酶促反應(yīng)。在37X:下使用5分鐘-24小時(shí)， 優(yōu)選15分鐘-5小時(shí)的孵育時(shí)間。備選地，可以使用T4 RNA連接酶 或Amp連接酶。
如果探針不是正好在靶核酸的3'-末端處雜交，那么可以4吏用包 含3'-"'核酸外切酶活性的酶以使靼核酸分子的3'-末端凹陷至滾環(huán) 復(fù)制可以開(kāi)始的點(diǎn)。優(yōu)選地，這種酶是包含3'-〉5'核酸外切酶活性并 能夠進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制的DNA聚合酶，例如但不限于，Phi29DM聚合酶。 然而，如果所使用的聚合酶不能提供所需的3'-〉5'核酸外切酶活性， 那么可以使用包含3'->5'核酸外切酶活性的核酸外切酶或包含 3'-〉5'核酸外切酶活性的另一種聚合酶。
滾環(huán)反應(yīng)使用靶RNA的3'-末端作為滾環(huán)復(fù)制的引物來(lái)進(jìn)行。優(yōu) 選地，所使用的聚合酶是Phi29DNA聚合酶，因?yàn)樗?'->5'核酸 外切酶活性、強(qiáng)的鏈置換活性和強(qiáng)的持續(xù)>^成能力(processivUy)。 使用的終濃度為0. 001 - 2 U/ iu 1,優(yōu)選0. 05 - 1. 5 U/ u 1的Phi29聚 合酶(Fe腦ntas )。使用0. 001 - 2 mM，優(yōu)選0. 05 - 1 mM的最終dNTP 濃度。備選地，可以使用其他聚合酶，例如T7 DNA聚合酶或Sequenase Version 2.0 T7 DNA聚合酶。在對(duì)于所選聚合酶的最佳溫度上，使用 10分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選20分鐘-4小時(shí)的孵育時(shí)間?？梢约尤隦NA 酶抑制劑，例如但不限于Ribolock RNA酶抑制劑(Fermentas)。如 果反應(yīng)在細(xì)胞或組織中發(fā)生，那么添加BSA至0. 05 - 0. 5 yg/jal， 備選地0.01-1 jag/ja 1的終濃度可以改善酶促反應(yīng)。對(duì)于某些聚合 酶，單鏈結(jié)合蛋白(SSB)的添加強(qiáng)烈增加了滾環(huán)復(fù)制的效率。因?yàn)?Phi29 DM聚合酶不被SSB增強(qiáng)，所以優(yōu)選使用0 p g/ja 1 SSB的濃 度。備選地，可以使用0.001-0.2 Mg/Ul的濃度。應(yīng)當(dāng)理解，滾環(huán) 反應(yīng)的不同變化形式例如但不限于高分枝反應(yīng)也可用于信號(hào)擴(kuò)增。
延伸的速度和持續(xù)時(shí)間可以通過(guò)改變dNTP、聚合酶、環(huán)、引物和 SSB的濃度來(lái)控制。此外，溫度和緩沖條件是可調(diào)整的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)物使用與滾環(huán)產(chǎn)物的一部分互補(bǔ)的經(jīng) 標(biāo)記的寡核苷酸(例如用熒光團(tuán)標(biāo)記的)來(lái)檢測(cè)。此類寡核苷酸加入
至0.001-10 juM，優(yōu)選0.01-0.5 jaM的終濃度。如果是多重的 (multiplexd)，那么這些濃度間隔應(yīng)用于每種寡核苷酸。在37^C下 使用5分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選10分鐘-2小時(shí)的孵育時(shí)間。在洗滌緩沖 液中洗滌栽玻片以去除任何未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸，并通過(guò)70 %、 85%和99%的系列乙醇來(lái)脫水。備選地，滾環(huán)產(chǎn)物可以通過(guò)如上 所述在滾環(huán)復(fù)制過(guò)程中摻入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸(天然或人工核苷酸)來(lái) 檢測(cè)。風(fēng)干栽玻片，力口入包含DAPI的封固溶液(mounting solution) (例如VectorShield+DAPI),并分析載玻片。
對(duì)于純化的RNA，例如從組織或細(xì)胞中提取的RNA,可以使用包括 類似于在組織和細(xì)胞中的檢測(cè)的步驟的操作程序。這可以通過(guò)將耙 RNA固定在固體支持物(例如，顯微鏡載玻片、ELISA平板、芯片、珠 等)上以陣列形式來(lái)進(jìn)行。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其 中所述靶RM固定在固體支持物上的方法。原則上，RNA可以非特異 性地附著，例如經(jīng)由抗體，或特異性地附著，例如經(jīng)由捕獲寡核苷酸。 如果RM的附著是非特異性的，那么探針需要提供把特異性。然而， 如果靶RNA是特異性地附著，例如經(jīng)由捕獲寡核苷酸，那么特異性可 以由捕獲寡核苷酸專門(mén)提供。識(shí)別個(gè)體外顯子的捕獲寡核苷酸可以例 如位于陣列中，并且可以使用包含聚-T靼互補(bǔ)區(qū)域的龜形探針以顯示 哪個(gè)外顯子作為多腺苷酸化的RNA而存在。如果耙RNA是非腺苷酸化 的，那么環(huán)狀探針例如龜形探針可以被設(shè)計(jì)為在耙RNA分子的3'-末 端處或附近進(jìn)行雜交，并由此提供區(qū)分特定RNA，s所需的特異性。因 此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及進(jìn)一步包括下列步驟的方法
i) 提供附著至固體支持物的捕獲寡核苷酸，和
ii) 使所述捕獲寡核普酸與所述靼核酸分子雜交，從而將所述乾 核酸分子附著至所述固體支持物。
下列步驟舉例說(shuō)明了可以如何進(jìn)行靶RNA分子的基于陣列的檢 測(cè)，使用經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的載玻片作為固體支持物，與用生物素標(biāo)記的捕獲寡核苷酸以及龜形-探針相組合。在實(shí)踐中，這個(gè)實(shí)施方案可以例如采取下列形式a) 使捕獲寡核苷酸附著至經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的載玻片，和b) 使靶RNA與捕獲-寡核苷酸雜交，和c) 使龜形-探針與靶RNA雜交，和d) 連接龜形-探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，和e) 可選地，修飾/凹陷3'-末端至滾環(huán)復(fù)制可以開(kāi)始的點(diǎn)，和 f )滾環(huán)復(fù)制，和g)檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。將與靶RNA中的區(qū)域互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸附著至經(jīng)鏈霉抗生物素 蛋白包被的載玻片，使用濃度為0. Olpmol-lnmol的捕獲寡核苷酸， 優(yōu)選使用0.1-100 pmol的偶聯(lián)有生物素的寡核苷酸。優(yōu)選地，使用 包含0. 1 M Tris-HCl (在25。C下pH7. 5 ) 、 0. 15 M NaCl和0. 05 %吐 溫-20的緩沖液。備選地，雜交可以在pH為5-8的廣泛范圍的其他 緩沖液中進(jìn)行。在洗滌緩沖液中洗滌載玻片以去除任何未結(jié)合的捕獲 寡核苷酸。為了使靶RNA固定在固體支持物上；向包含附著的捕獲寡核苷酸 的栽玻片力口入0. 01-10 pmol RM，備選地0. 001 pmol - 1 iamolMA， 優(yōu)選地在包含O.l M Tris-HCl (在25'C下pH7. 5 ) 、 0. 15 M NaCl和 0. 05%吐溫-20的緩沖液中進(jìn)行。備選地，雜交可以在pH為5-8的 廣泛范圍的其他緩沖液中進(jìn)行。在洗滌緩沖液中洗滌載玻片以去除任 何未結(jié)合的捕獲寡核苦酸。龜形-探針與靶RNA的雜交通過(guò)向栽玻片加入龜形-探針來(lái)進(jìn)行， 所述載玻片包含通過(guò)捕獲寡核苷酸而附著至載玻片的耙RNA，龜形探 針的濃度為0.1-100 pmol，備選地0.002 pmol - 2 jamol,在包含 0. 1 M Tris-HCl (在25匸下pH7. 5 ) 、 0. 15 M NaCl和0. 05%吐溫-20 的緩沖液中進(jìn)行。備選地，雜交可以在pH為5-8的廣泛范圍的其他 緩沖液中進(jìn)行。在洗滌緩沖液中洗滌載玻片以去除未結(jié)合的捕獲寡核 苷酸?？梢允褂?但不限于)下列連接酶中的任何一種來(lái)連接龜形-探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)T4DM連接酶、Tsc連接酶、Tth連接酶、Pfu 連接酶、Taq連接酶、Amp連接酶或大腸桿菌DM連接酶。優(yōu)選地，T4 DNA連接酶(Fermentas )以0. 1 - 1 U/ ji 1的濃度使用，備選地可以 使用0.0001 - 2 U/jal?？梢约尤隦NA酶抑制劑，例如但不限于 Ribolock RNA酶抑制劑(Fermentas)，終濃度為0.01-2 U/jal, 優(yōu)選0. 5 - 1. 5 U/ /a 1 Ribolock ( Fermentas)。在適合于所選連接酶 的溫度下使用2分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選10分鐘-60分鐘的孵育時(shí)間。 在洗滌緩沖液中洗滌載玻片以去除所述酶。滾環(huán)反應(yīng)使用靶RNA的3'-末端作為滾環(huán)復(fù)制的引物來(lái)進(jìn)行。優(yōu) 選地，所使用的聚合酶是Phi29DNA聚合酶，因?yàn)樗?'-〉5'核酸 外切酶活性、強(qiáng)的鏈置換活性和強(qiáng)的持續(xù)合成能力(processivity)。 使用的終濃度為0. 001 - 2 U/m 1，優(yōu)選0. 05 - 1. 5 U/u 1的Phi29聚 合酶(Fermentas)。使用0. 001 - 2 mM，優(yōu)選0. 05 - 1 mM的最終dNTP 濃度。備選地，可以使用其他聚合酶，例如T7 DNA聚合酶或Sequenase Version 2.0 T7 DNA聚合酶。在對(duì)于所選聚合酶的最佳溫度上，使用 10分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選20分鐘-4小時(shí)的孵育時(shí)間?？梢约尤隦NA 酶抑制劑，例如但不限于Ribolock RNA酶抑制劑(Fermentas)。如 果反應(yīng)在細(xì)胞或組織中發(fā)生，那么添加BSA至0. 05-0. 5 jag/jLil， 備選地0.01-1 Mg/H 1的終濃度可以改善酶促反應(yīng)。對(duì)于某些聚合 酶，單鏈結(jié)合蛋白(SSB)的添加強(qiáng)烈增加了滾環(huán)復(fù)制的效率。因?yàn)?Phi29 DNA聚合酶不被SSB增強(qiáng)，所以優(yōu)選使用0 n g/ja 1 SSB的濃 度。備選地，可以使用0. 001-0.2 jjg/jul的濃度。應(yīng)當(dāng)理解，滾環(huán) 反應(yīng)的不同變化形式例如但不限于高分枝反應(yīng)也可用于信號(hào)擴(kuò)增。延伸的速度和持續(xù)時(shí)間可以通過(guò)改變dNTP、聚合酶、環(huán)、引物和 SSB的濃度來(lái)控制。此外，溫度和緩沖條件是可調(diào)整的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)物使用與滾環(huán)產(chǎn)物的一部分互補(bǔ)的經(jīng) 標(biāo)記的寡核苷酸(例如用熒光團(tuán)標(biāo)記的)來(lái)檢測(cè)。此類寡核苷酸加入 至0.001-10 mM，優(yōu)選o. 01-0. 5 pM的終濃度。如果是多重的，那么這些濃度間隔應(yīng)用于每種寡核苷酸。在37。C下使用5分鐘-24 小時(shí)，優(yōu)選IO分鐘-2小時(shí)的孵育時(shí)間。在洗滌緩沖液中洗滌載玻片 以去除任何未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸，并通過(guò)70%、 85%和99%的 系列乙醇來(lái)脫水。備選地，滾環(huán)產(chǎn)物可以通過(guò)如上所述在滾環(huán)復(fù)制過(guò) 程中摻入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸(天然或人工核苷酸)來(lái)檢測(cè)。風(fēng)干載玻片， 加入包含DAPI的封固溶液(例如VectorShield+DAPI)，并分析載玻片。備選地，可以組合某些步驟，例如步驟b-d),導(dǎo)致產(chǎn)生更簡(jiǎn)單 的方案，其包括a) 使捕獲寡核苷酸附著至經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的栽玻片，和b) 使靶RNA與捕獲寡核苷酸雜交，使龜形-探針與靶RNA雜交， 和連接龜形-探針，和c) 滾環(huán)復(fù)制，和d) 檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。將與靶RM的一部分互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸附著至經(jīng)鏈霉抗生物素 蛋白包被的載玻片，使用濃度為0. 01 pmol - 1 nmol的捕獲寡核苷酸。 優(yōu)選地，使用0.1-100 pmol的偶聯(lián)有生物素的寡核苷酸。優(yōu)選地， 使用包含0. 1 M Tris-HCl (在25。C下pH7. 5 ) 、 0. 15 M NaCl和0. 05 %吐溫-20的緩沖液。備選地，雜交可以在pH為5-8的廣泛范圍的 其他緩沖液中進(jìn)行。在洗滌緩沖液中洗滌載玻片以去除未結(jié)合的捕獲 寡核苷酸。為了在一個(gè)步驟中使靶RNA固定在固體支持物上、使龜形探針與 靶RNA雜交以及連接龜形探針；向包含附著的捕獲寡核苷酸的載玻片 同時(shí)加入靶RNA、探針和連接酶，在適合于所選連接酶的連接緩沖液 中進(jìn)行。濃度可以類似于上文所述的更復(fù)雜的操作程序；例如在lxT4 DNA連接酶緩沖液中混合的0. 01 - 10 pmol RNA，備選地0. 001 pmol -l nmol謹(jǐn)，0. 1 - 100 pmol龜形探針，備選地0. 002 pmol - 2 m mol，以及0. 1 - 1 U/ |i 1 T4 DNA連接酶，備選地0. 001 - 2 U/ |j 1。 可以將RNA酶抑制劑加入至該混合物中，例如但不限于RibolockRM酶抑制劑(Fermentas)，終濃度為0. 01-2U/pl，優(yōu)選O. 5-1.5 U/ ju 1 Ribolock ( Fermentas )。在適合于所選連接酶的溫度下使用2 分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選10分鐘-60分鐘的孵育時(shí)間。在洗滌緩沖液中 洗載玻片滌以去除未結(jié)合的RNA和探針，并去除所述酶。滾環(huán)反應(yīng)使用靶RNA的3'-末端作為滾環(huán)復(fù)制的引物來(lái)進(jìn)行。優(yōu) 選地，所使用的聚合酶是Phi29 DNA聚合酶，因?yàn)樗?'-〉5'核酸 外切酶活性、強(qiáng)的鏈置換活性和強(qiáng)的持續(xù)合成能力(processivity)。 使用的終濃度為0. 001 - 2 U/ju 1，優(yōu)選0. 05 - 1. 5 U/y 1的Phi29聚 合酶(Fermentas )。使用0. 001 - 2 mM，優(yōu)選0. 05 - 1 mM的最終dNTP 濃度。備選地，可以使用其他聚合酶，例如T7 DNA聚合酶或Sequenase Version 2. 0 T7 DM聚合酶。在對(duì)于所選聚合酶的最佳溫度上，使用 10分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選20分鐘-4小時(shí)的孵育時(shí)間?？梢约尤隦NA 酶抑制劑，例如但不限于Ribolock RNA酶抑制劑(Fermentas)。如 果反應(yīng)在細(xì)胞或組織中發(fā)生，那么添加BSA至0. 05 - 0. 5 jug/jul， 備選地O. 01-1 jag/ja 1的終濃度可以改善酶促反應(yīng)。對(duì)于某些聚合 酶，單鏈結(jié)合蛋白(SSB)的添加強(qiáng)烈增加了滾環(huán)復(fù)制的效率。因?yàn)?Phi29 DNA聚合酶不被SSB增強(qiáng)，所以優(yōu)選使用0 y g/m 1 SSB的濃 度。備選地，可以使用0.001-0.2 jag/jal的濃度。應(yīng)當(dāng)理解，滾環(huán) 反應(yīng)的不同變化形式例如但不限于高分枝反應(yīng)也可用于信號(hào)擴(kuò)增。延伸的速度和持續(xù)時(shí)間可以通過(guò)改變dNTP、聚合酶、環(huán)、引物和 SSB的濃度來(lái)控制。此外，溫度和緩沖條件是可調(diào)整的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)物使用與滾環(huán)產(chǎn)物的一部分互補(bǔ)的經(jīng) 標(biāo)記的寡核苷酸(例如用熒光團(tuán)標(biāo)記的)來(lái)檢測(cè)。此類寡核苷酸加入 至0.001-10 "M，優(yōu)選0.01-0.5 mM的終濃度。如果是多重的， 那么這些濃度間隔應(yīng)用于每種寡核苷酸。在37。C下使用5分鐘-24 小時(shí)，優(yōu)選10分鐘-2小時(shí)的孵育時(shí)間。在洗滌緩沖液中洗滌載玻片 以去除任何未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸，并通過(guò)70%、 85%和99%的 系列乙醇來(lái)脫水。備選地，滾環(huán)產(chǎn)物可以通過(guò)如上所述在滾環(huán)復(fù)制過(guò) 程中摻入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸(天然或人工核苷酸)來(lái)檢測(cè)。風(fēng)干栽玻片，加入包含DAPI的封固溶液(例如VectorShield+DAPI)，并分析載玻 片。此外，如果捕獲寡核苷酸在固體支持物上合成，那么步驟a)可 以省略，從而將方案減少至a )使靶RNA與捕獲寡核苷酸雜交，使龜形-探針與靶RNA雜交， 和連接龜形-探針，和b) 滾環(huán)復(fù)制，和c) 檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。如果使用預(yù)先形成的環(huán)形探針，那么在該復(fù)雜方案中可以省略連 接步驟。在該簡(jiǎn)化方案中，可以省略連接酶，并且靶RNA在固體支持 物上的固定和龜形探針與耙RN A的雜交可以優(yōu)選地使用洗滌緩沖液代 替連接酶緩沖液來(lái)進(jìn)行。如前所述，將靶RNA附著至固體支持物上的捕獲寡核苷酸可以優(yōu) 選地在該固體支持物上合成。這可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法來(lái)完成，例如P-氰乙基亞磷酰胺化學(xué)。備選地，捕獲寡核苷酸可以在合成后通過(guò)例 如但不限于鏈霉抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物而附著至固體支持物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中捕獲寡核苷酸直接在載體上 合成的方法，和在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中捕 獲寡核苷酸用標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，并且通過(guò)所述標(biāo)記物與固定在固體支 持物上的受體分子的結(jié)合而附著至固體支持物。如前所述，探針可以在靶核酸分子的3'-末端處或附近雜交，無(wú) 論所述探針是龜形探針、預(yù)先形成的環(huán)形探針，還是掛鎖探針。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中所述環(huán)狀核酸探針 與來(lái)自所述靶核酸分子3'-末端的25個(gè)或更少的核苷酸雜交，例如0 -25個(gè)核苷酸，或例如0-20個(gè)核苷酸，或例如0-15個(gè)核苷酸，或 例如0-10個(gè)核苷酸，或例如O-5個(gè)核苷酸，或例如4個(gè)核苷酸，或 例如3個(gè)核苷酸，或例如2個(gè)核普酸，或例如1個(gè)核苷酸，或例如0 個(gè)核苷酸。如果探針不是正好在緊鄰靶核酸的3'-末端處雜交，那么可以使用包含3'-W核酸外切酶活性的酶以使靶核酸分子的3'-末端凹陷至 滾環(huán)復(fù)制可以開(kāi)始的點(diǎn)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣 的方法，其進(jìn)一步包括用包含3'-〉5'核酸外切酶活性的酶來(lái)使靶核酸 分子的3'-末端凹陷。所述包含3'-〉5'核酸外切酶活性的酶可以是例 如包含3'-〉5'核酸外切酶的聚合酶或核酸外切酶。因此，在另外一個(gè) 實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中所述包含3'-〉5'核酸外切 酶活性的酶選自具有3'->5'核酸外切酶活性的聚合酶和具有3'-〉5' 核酸外切酶活性的核酸外切酶。優(yōu)選地，這種酶是包含3'->5'核酸外 切酶活性并能夠進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制的DNA聚合酶，例如但不限于，Ph i 2 9 DNA 聚合酶。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中所 述包含3'-〉5'核酸外切酶活性的酶是包含3'->5'核酸外切酶活性的 DNA聚合酶。然而，如果所使用的聚合酶不能夠提供所需的3'->5'核 酸外切酶活性，那么可以使用包含3'-〉5'核酸外切酶活性并能夠使耙 核酸的3'-末端凹陷的核酸外切酶。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及這樣的方法，其中所述包含3'-W核酸外切酶活性的酶是包含 3'-〉5'核酸外切酶活性的核酸外切酶。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用切割子探針來(lái)檢測(cè)乾核酸分子的方法，所述切割子探針在與靶核酸分子雜交時(shí)能夠產(chǎn)生其自己的3'-末端。切割子探針可以是切割子-龜形探針(圖1H)、預(yù)先形成的切 割子-環(huán)形探針(圖1E-F)或切割子-掛鎖探針(圖1G)。因此，在下 列部分中，應(yīng)當(dāng)理解所有提及的探針包含切割子元件，除非另有說(shuō)明。 因?yàn)榍懈钭犹结樤陔s交后產(chǎn)生其自己的3'-末端，所以本發(fā)明的 方法能夠?qū)Π械娜魏巫畲箝L(zhǎng)度起作用。然而，應(yīng)當(dāng)存在足夠的核酸殘 基以確保在反應(yīng)條件下靶核酸和切割子探針之間的雜交。如果探針和 其靶之間的雜交例如通過(guò)摻入增加解鏈溫度的核酸殘基例如PNA或 LNA來(lái)增強(qiáng)，那么可以擴(kuò)展確保雜交所需的核苷酸下限。因此，在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶核酸分子的方法，所述方法包 括使探針與靶核酸分子雜交，所述探針是龜形探針類型的環(huán)狀核酸探 針、預(yù)先形成的環(huán)形探針或掛鎖探針；用具有核酸內(nèi)切酶活性的元件切割所述革巴核酸分子，以在靶核酸分子內(nèi)產(chǎn)生3'-末端；由所述新的 3'-末端進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括下列步驟的方法i) 獲得包含所述靶核酸分子的制劑，和ii) 提供所述環(huán)狀核酸探針，和iii) 使所述探針與所述靶核酸分子雜交，和iv) 用具有核酸內(nèi)切酶活性的元件切割所述靶核酸分子，在所述 靶核酸分子內(nèi)產(chǎn)生新的3'-和5'-末端，和v )用所述探針作為模板從在所述靶核酸分子內(nèi)的所述新的3' -末 端開(kāi)始實(shí)施滾環(huán)復(fù)制，并通過(guò)使?jié)L環(huán)產(chǎn)物可視化來(lái)檢測(cè)所述靶核酸分子。 由切割子探針?biāo)那懈钤沟迷撎结樐軌蚯懈畎泻怂幔瑥?而在它進(jìn)行雜交之處產(chǎn)生新的3'-末端(圖3b)。因此，它可以靶向 任何核酸分子的任何區(qū)域，使得能夠檢測(cè)例如在3'-末端處多腺苷酸 化的真核生物信使RM。切割子探針因此對(duì)于檢測(cè)信使RNA，或其中不 存在用于探針-雜交的合適3'-末端的其他RNA種類是理想的。因此， 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中所述靶核酸分子是RNA分子的方 法。所述用于檢測(cè)靶核酸分子的方法可以使用任何切割子探針。優(yōu)選 使用切割子-龜，且備選地可以使用預(yù)先形成的切割子-環(huán)或切割子-掛鎖。如果使用的切割子探針是切割子-龜或切割子-掛鎖，那么在滾 環(huán)復(fù)制步驟前需要連接該探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的步驟。因此，在 另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中所述探針是切割子-龜類型的環(huán)狀核 酸探針、或切割子-掛鎖探針的方法，并且所述方法包括連接所述探針 以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步步驟。如前所述，通過(guò)靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制來(lái)檢測(cè)核酸分子還可以原位進(jìn) 行，這具有下列幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)它提供關(guān)于某些RNA分子的表達(dá)的信息； 它揭示出所述RNA在哪種細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)；并且它提供關(guān)于在該細(xì)胞 中所述RNA存在于何處的信息，例如存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。由于集中在基于陣列的技術(shù)，通常低估了單細(xì)胞檢測(cè)的重要性以及RNA種 類在細(xì)胞內(nèi)的定位。然而，因?yàn)椴徽_定位的RNA可以對(duì)細(xì)胞具有有 害后果，例如如果信使RNA或核糖體RNA保留在細(xì)胞核中，那么在細(xì) 胞內(nèi)的定位不能被忽視。同樣，大多數(shù)其他技術(shù)(例如基于PCR和基 于陣列的)使用從幾種細(xì)胞中提取的RNA，并因此在不同類型的細(xì)胞 上求平均值，所述不同類型的細(xì)胞各取決于細(xì)胞類型和來(lái)自周圍細(xì)胞 的調(diào)節(jié)而具有不同表達(dá)譜。因此，表達(dá)譜將通常代表在一組細(xì)胞上的 平均值。因此，如果例如一半的細(xì)胞不表達(dá)某種RNA,而另一半以高 于正常的量表達(dá)這種RM，那么結(jié)論可以是所有細(xì)胞都以正常量表達(dá) 該RNA。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中原位檢測(cè)所述靼 核酸分子的方法，并且所述方法進(jìn)一步包括將包含靶核酸分子的細(xì)胞 或組織固定在表面上(標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)制備物)(圖8)(實(shí)施 例6 )。切割子探針可以以基于陣列的方式使用，類似于使用龜形-探針 (不含切割子元件)的基于陣列的方法。然而，盡管使用龜形探針(不 含切割子元件)的基于陣列的方法受到在靶核酸中的探針結(jié)合區(qū)域處 或附近需要合適的3'-末端這一要求的限制，但使用切割子探針的基 于陣列的方法可以檢測(cè)任何核酸，因?yàn)樗陔s交后產(chǎn)生新的3'-末端。此類基于陣列的檢測(cè)通過(guò)將靶核酸固定在固體支持物(例如顯微 鏡載玻片、ELISA平板、芯片、珠等)上來(lái)進(jìn)行。因此，在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及其中所述靶核酸分子固定在固體支持物上的方法。 如果核酸分子的滾環(huán)檢測(cè)以基于陣列的形式進(jìn)行，那么除了關(guān)于使用 切割子探針的核酸檢測(cè)已提及的步驟之外該方法還將包括一些另外步 驟。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及進(jìn)一步包括下列步驟的方 法i) 提供附著至固體支持物的捕獲寡核苷酸，和ii) 使所述捕獲寡核苷酸與所述靶核酸分子雜交，從而將所述乾 核酸分子附著至所述固體支持物。使用切割子探針的此類方法看起來(lái)特別有希望用于RNA檢測(cè)，因?yàn)榍懈钭犹结樋梢杂糜跈z測(cè)不同的剪接變體或不同的RNA種類。因此， 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中所述靶核酸分子是RM的方法(圖 4)(實(shí)施例2)。將乾RNA附著至固體支持物的捕獲寡核苷酸可以優(yōu)選在固體支持 物上合成。這可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法來(lái)完成，例如0-氰乙基亞磷酰胺 化學(xué)，備選地，捕獲寡核苷酸可以在合成后通過(guò)例如但不限于鏈霉抗 生物素蛋白/生物素復(fù)合物或共價(jià)連接(例如來(lái)自Amersham Boisciences的Codelink活化的載玻片)而附著至固體支持物。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中捕獲寡核苷酸直接在載體上合成 的方法，和在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中捕獲寡 核苷酸用標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，并且通過(guò)所述標(biāo)記物與固定在固體支持物 上的受體分子的結(jié)合而附著至固體支持物。此外，當(dāng)使用切割子探針時(shí)，核酸分子可以非特異性地結(jié)合至固 體支持物，例如經(jīng)由抗體，并且切割子探針隨后可以用于選擇單個(gè)特 異性靶核酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中靶核酸分子 經(jīng)由抗體附著至固體支持物的方法。此類抗體可以例如針對(duì)多腺苷酸 化的信使RNA的5'-帽。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣 的方法，其中靶RNA分子通過(guò)靶向所述核酸分子的5'-帽的抗體而附 著至固體支持物，這是直接或間接的，例如經(jīng)由CAP結(jié)合蛋白。當(dāng)使用切割子探針用于切割靶核酸時(shí)，結(jié)果所得的對(duì)于引發(fā)滾環(huán) 復(fù)制來(lái)說(shuō)所需的新的3'-末端可能需要進(jìn)行修飾以便聚合酶或核酸外 切酶識(shí)別該3'-末端。通常，該3'-末端將包含羥基，但如果由切割子 探針?biāo)那懈钤抢?0-23或8-17 DNA核酶，那么產(chǎn)生的 3'-末端將是包含2 3'-環(huán)狀磷酸的一個(gè)堿基突出端(圖3A)。此類 2'， 3'-環(huán)狀磷酸將抑制至少某些聚合酶，例如優(yōu)選的聚合酶(Phi29 DNA聚合酶)，因此可能需要修飾步驟(圖4E)。因此，在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中修飾所述靶核酸分子的所述新 的3'-末端以獲得游離的羥基。由大多數(shù)DNA核酶產(chǎn)生的2、3'-環(huán)狀磷酸的去除可以使用T4多核苷酸激酶來(lái)完成，所述T4多核苷酸激酶包含激酶和磷酸酶活性(比 較圖4D和4E)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法， 其中所述靶核酸分子的所述新的3'-末端被T4多核苷酸激酶修飾。備 選地，如果DM核酶是例如17E DM核酶，所述17E DM核酶已報(bào)道 產(chǎn)生3'-磷酸(或2'-磷酸)而不是2/， V-環(huán)狀磷酸(Brown AK等人， Biochemistry 17; 42 ( 23 ) : 7152-61 ( 2003 ))，那么包含磷酸酶 活性的任何酶可以用于修飾該3'-末端，例如但不限于牛小腸堿性磷 酸酶(CIAP)、細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)和奸堿性磷酸酶(SAP)。如果切割元件是例如10-23 DM核酶、8-17 DNA核酶或17E DNA 核酶，那么在耙核酸的新的3'-末端產(chǎn)生一個(gè)堿基突出端。這種一個(gè) 堿基突出端可能需要被去除以便該3'-末端引發(fā)滾環(huán)復(fù)制。包含 3'-W核酸外切酶活性的酶可以用于去除該一個(gè)堿基突出端。因此， 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中所述靶核酸分子的 所述新的3'-末端被包含3'-〉5'核酸外切酶活性的酶修飾。所述包含 3'-〉5'核酸外切酶活性的酶可以是例如包含3'-〉5'核酸外切酶的聚 合酶或核酸外切酶。因此，在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中 所述耙核酸分子的所述新的3'-末端被酶修飾的方法，所述酶選自具 有3'->5'核酸外切酶活性的聚合酶和具有3'->5'核酸外切酶活性的 核酸外切酶。優(yōu)選地，所述包含3'-〉5'核酸外切酶活性的酶是包含 3'-〉5'核酸外切酶活性并能夠進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制的DNA聚合酶，例如但不 限于，Phi29 DM聚合酶。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉 及這樣的方法，其中所述包含3'->5'核酸外切酶活性的酶是包含 3'-〉5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶，例如Phi29 DNA聚合酶、或例 如T4 DNA聚合酶、或例如T7 DNA聚合酶、或例如Deep Vent DNA聚 合酶、或例如DNA聚合酶I、或例如Klenow片段、或例如Vent DNA 聚合酶、或例如9。N^DM聚合酶、或例如等溫BstDNA聚合酶。然而， 如果使用的聚合酶不能提供所需3'-〉5'核酸外切酶活性，那么可以另 外使用包含3'->5'核酸外切酶活性并能夠使靶核酸的該3'-末端凹陷 的核酸外切酶。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中所述包含3'->5'核酸外切酶活性的酶是包含3'-〉5'核酸外切酶活性的核酸外切酶，例如核酸外切酶T、或例如CCR4、或例如Rrp6p、或例如外來(lái)體復(fù)合物核酸外切酶RRP41。在某些操作程序中，雙酶系統(tǒng)因此可能是優(yōu)選的，它可以是例如與包含3'->5'核酸外切酶活性的核酸外切酶或包含3'-〉5'核酸外切酶的另一種聚合酶相組合的不含3'-〉5'核酸外切酶活性的聚合酶。另 一種其中在這種情況下包含兩種聚合酶的雙酶系統(tǒng)可能是優(yōu)選的情形是，當(dāng)用于滾環(huán)復(fù)制的聚合酶不能摻入某些核苷酸，例如人工或修飾 的核苷酸時(shí)。這種無(wú)能隨后可以通過(guò)添加能夠摻入此類核苷酸的第二 種聚合酶來(lái)補(bǔ)償，例如Klenow片段、或例如Taq聚合酶、或例如9°Nm DNA聚合酶、或例如Therminator DM聚合酶、或例如Pwo DNA聚合 酶、或例如Pfu DNA聚合酶、或例如DNA聚合酶I、或例如Vent DNA 聚合酶、或例如Tth DNA聚合酶、或例如等溫Bst DNA聚合酶。在不同方法中提及的靶核酸可以從細(xì)胞或從組織中獲得。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中包含靶核酸分子的制備物從細(xì)胞 中提供的方法，所述細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、爬行動(dòng)物、兩 棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類和植物細(xì)胞，和在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中包 含靶核酸分子的制備物從組織中提供的方法，所述組織選自哺乳動(dòng)物、 爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類和植物組織。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明 涉及其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及其中所述組織是哺乳動(dòng)物組織的方法。在另一實(shí)施方案中，本 發(fā)明涉及其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明 涉及其中所述組織是人組織的方法。也可以通過(guò)上文提及的方法來(lái)檢測(cè)來(lái)源于病毒的核酸。然而，因 為病毒具有在宿主細(xì)胞內(nèi)和在宿主細(xì)胞外的階段，所以來(lái)源于病毒的 核酸也可從體液或排泄物中檢測(cè)，所述體液或排泄物例如但不限于脊 髓液、或例如尿、或例如糞便、或例如唾液、或例如血液。因此，在 另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中包含靶核酸分子的制備物從病毒中 提供的方法。因?yàn)榘幸l(fā)的滾環(huán)復(fù)制檢測(cè)單個(gè)分子，所以一個(gè)信號(hào)等于一個(gè)靶 核酸分子。因此，通過(guò)計(jì)數(shù)信號(hào)的數(shù)目，并可能地將其與參照相比較， 可以獲得靶核酸分子總量的測(cè)量結(jié)果。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明涉及其中靶核酸分子的量通過(guò)計(jì)數(shù)滾環(huán)復(fù)制信號(hào)的數(shù)目來(lái)定量測(cè) 量的方法。備選地，耙核酸分子總量的測(cè)量結(jié)果可以通過(guò)測(cè)量來(lái)自滾 環(huán)復(fù)制的熒光信號(hào)的量來(lái)獲得。此外，這可能需要包括內(nèi)部或外部參 照。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的方法，其中基于測(cè) 量來(lái)自滾環(huán)復(fù)制的焚光信號(hào)的量來(lái)定量測(cè)量靶核酸分子的量。所述方法和探針可以在檢定試劑盒中使用。因此，在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明涉及包含環(huán)狀核酸探針以及選自下列的至少 一種組分的試劑盒緩沖液、反應(yīng)物、抗體、 一種或多種靼核酸的對(duì)照制劑。所述方法或探針中的任何可以用于體外檢定。因此，在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及應(yīng)用所述方法中的任何一種的檢定方法，和在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括使環(huán)狀核酸探針與靶核酸分子雜交的 檢定方法，其中所述環(huán)狀核酸探針選自龜形探針、預(yù)先形成的環(huán)形探 針、掛鎖探針、切割子-龜形探針、預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針或切 割子-桂鎖探針。優(yōu)選地，所述體外檢定對(duì)RNA進(jìn)行，例如但不限于，檢測(cè)經(jīng)剪接 的RM、經(jīng)可變剪接的信使RM、來(lái)自EB病毒的EBER1和EBER2、腺 病毒編碼的小RM，s VA1和VA2、核糖體RNA，s、端粒酶復(fù)合物(hTERC ) 的RM部分、小干擾RM，s (siRNA，s)和微小RNA，s (miRNA，s)。因 此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中所述靶核酸分子是RNA的檢 定方法。與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求于2005年4月12日提交的DK PA 2005 00522的優(yōu)先權(quán)。在本文中引用的這些申請(qǐng)、專利中的每一個(gè)和每個(gè)文件，以及在 這些申請(qǐng)、專利和文件("申請(qǐng)所引用的文件")中的每一個(gè)中引用的每個(gè)文件，以及(在申請(qǐng)及其專利的文本中或在其申請(qǐng)過(guò)程中)申 請(qǐng)所引用的文件中參考或引用的每個(gè)文件，以及在其申請(qǐng)過(guò)程中提出 的支持可專利性的所有論點(diǎn)，在此引入本文作為參考。另外，單數(shù)參考不排除復(fù)數(shù)。因此，提及"a" 、 "an"、"笫一 個(gè)(種)，，、"第二個(gè)(種)"等時(shí)，并不排除復(fù)數(shù)。在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"包含"，或變化形式"包括"或"含 有，，，應(yīng)當(dāng)理解為意味著包括所述的元素、整數(shù)或步驟，或者元素、 整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟，或者元素、 整數(shù)或步驟的組。如將是顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特點(diǎn)可以應(yīng) 用于本發(fā)明的其他方面。等價(jià)形式本發(fā)明還可以其他具體形式體現(xiàn)而不背離其精神或基本特征。因 此，前述實(shí)施方案在所有方面應(yīng)被視為對(duì)于本文描述的發(fā)明是舉例說(shuō) 明性的而不是限制性的。因此，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)而不 是由前述描述指明，并且希望通過(guò)其中的參考而包括在權(quán)利要求書(shū)的 等價(jià)性的含義和范圍內(nèi)的所有變化。在下文中，本發(fā)明將借助于下列非限制性附圖和實(shí)施例來(lái)進(jìn)行描述。圖例圖1用于在滾環(huán)復(fù)制中使用的不同環(huán)形探針設(shè)計(jì)。如在發(fā)明概迷中提及的，最初存在用于在滾環(huán)復(fù)制中使用的兩種環(huán)形探針設(shè)計(jì)；這個(gè)數(shù)目已增至6。不僅使得能夠從靶分子的天然3'-末端開(kāi)始滾環(huán)復(fù)制，還使得能夠在靶分子中的所需點(diǎn)處序列特異性地 產(chǎn)生新的3'-末端。A)預(yù)先形成的環(huán)形探針。B)由龜形探針形成的 預(yù)先形成的環(huán)形探針，所述龜形探針不需要外部模板用于連接；因此 不存在含模板的環(huán)形探針的污染，所述模板可以充當(dāng)滾環(huán)引物從而產(chǎn) 生假產(chǎn)物。C)桂鎖探針。D)龜形探針。E)預(yù)先形成的切割子-環(huán)形 探針。F)預(yù)先形成的切割子-環(huán)形探針，其由切割子-龜形探針形成。 G)切割子-掛鎖探針。H)切割子-龜形探針。當(dāng)它們?cè)跈?quán)利要求書(shū)和 詳細(xì)描述中出現(xiàn)時(shí)，編號(hào)圖解說(shuō)明了探針的不同核酸部分，l指元件或 部分之間的邊界，CE指切割元件，和Id指標(biāo)示物元件。在切割子-掛鎖(圖1G)中，為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，在其中環(huán)化官能團(tuán) 和切割官能團(tuán)識(shí)別相同靶分子和那種靶分子的相同部分的情況下，已 將切割元件置于用于環(huán)化/連接所述探針的靶識(shí)別部分內(nèi)。如果切割元 件置于靼識(shí)別部分外，那么該探針識(shí)別兩種靶分子，或同一分子的兩 個(gè)分開(kāi)的部分。在后面一種情況下，該探針將報(bào)告兩種靶的共定位。圖2使用切割子-探針的滾環(huán)復(fù)制操作程序的圖解說(shuō)明。用切割子-龜舉例說(shuō)明的滾環(huán)操作分成下列步驟-其中步驟A) 提供切割子-探針和靶RM;步驟B)使所述切割子-龜與所述靶RNA 雜交；步驟C)連接所述切割子-龜以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，和切割所述 耙RM;步驟D)和步驟E)滾環(huán)復(fù)制；和步驟F )通過(guò)加入熒光偶聯(lián) 的檢測(cè)寡核苷酸來(lái)檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。必要時(shí)切割也可以在雜交過(guò)程中進(jìn) 行，并且切割產(chǎn)生的3'-末端的修飾可以在步驟C)和D)之間進(jìn)行。圖3乾RM的DNA核酶水解。DNA核酶是包含酶促活性的核酸序列。這些通常通過(guò)體外選擇實(shí) 驗(yàn)來(lái)制備，并且對(duì)于活性一般需要二價(jià)金屬離子。A)顯示了由10-23 DNA核酶、17EDM核酶和幾種其他DNA核酶催化的乾RNA的水解。B) 使用含10-23 MA核酶作為切割元件的、體外轉(zhuǎn)錄的RM和切割子-掛鎖探針來(lái)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其舉例說(shuō)明了新的3'-末端的序列特異性形 成(實(shí)施例1)。泳道1是低范圍RM梯(Low Range RNA Ladder ) (Fennentas);泳道2是體外轉(zhuǎn)錄的乾K混，不含切割子-掛鎖；泳 道3是切割子-掛鎖，不含MA;泳道4是未與T4 FNA連接酶一起孵 育的切割子-掛鎖和靶RNA;泳道5是與T4 FNA連接酶一起孵育的切 割子-掛鎖和靶RM，導(dǎo)致切割子-桂鎖環(huán)化；泳道6是含有T4 FNA連 接酶的切割子-掛鎖和外部連接模板(DM)。圖4使用切割子探針的基于固體支持物/陣列的RM檢測(cè)。如實(shí)施例2中所述，該實(shí)驗(yàn)使用切割子-桂鎖探針、體外轉(zhuǎn)錄的 RM、偶聯(lián)有生物素的捕獲寡核苷酸以及作為固體支持物的經(jīng)鏈霉抗生 物素蛋白包被的顯微鏡載玻片來(lái)進(jìn)行。A)陰性對(duì)照，其中捕獲寡核苷 酸和耙RM都被省略。B)陰性對(duì)照，其中靶MA被省略。C)陰性對(duì) 照，其中捕獲寡核苷酸被省略。D)包含所有反應(yīng)物和步驟的完整反應(yīng) (實(shí)施例2) 。 E)陰性對(duì)照，其中T4多核苷酸激酶被省略。F)陰性 對(duì)照，其中使用掛鎖探針代替切割子-掛鎖，這兩種探針均識(shí)別靶RNA 中完全相同的核酸序列。圖5使用龜形探針的原位檢測(cè)。在EBV陽(yáng)性人扁桃體組織中原位檢測(cè)非多腺苷酸化的EB病毒(EBV) RNA即EBERl,所述扁桃體組織在福爾馬林中固定并在石蠟中 包埋。因?yàn)镋BERl RNA是非多腺苷酸化的，所以可以使用在EBERl RNA 的3'-末端中雜交的不含切割元件的探針，在這種情況下所述探針是 龜形探針。A)如實(shí)施例3中所述處理的扁桃體組織切片，其中箭頭指出滾環(huán) 產(chǎn)物，即EBERl RNA陽(yáng)性細(xì)胞。B)在實(shí)施例3中使用的龜形探針的設(shè) 計(jì)。圖6使用預(yù)先形成的環(huán)的原位檢測(cè)。在EBV陽(yáng)性人扁桃體組織中原位檢測(cè)非多腺苷酸化的EB病毒 (EBV) RNA即EBER1，所述扁桃體組織在福爾馬林中固定并在石蠟中 包埋。因?yàn)镋BERl RNA是非多腺苷酸化的，所以可以使用在EBERl RNA 的3'-末端中雜交的不含切割元件的探針，在這種情況下所述探針是 在雜交前通過(guò)連接龜形探針而形成的預(yù)先形成的環(huán)形探針。使用龜形 探針代替掛鎖探針來(lái)制備預(yù)先形成的環(huán)形探針的原因是，龜形探針包 含其自身的連接模板，并且不需要外部添加連接模板。因此，不存在 含寡核苷酸的預(yù)先形成的環(huán)的污染，所述寡核苷酸可以充當(dāng)引物而導(dǎo) 致假滾環(huán)信號(hào)。A)如實(shí)施例4中所述處理的扁桃體組織切片，其中箭頭指出滾環(huán) 產(chǎn)物，即EBERl RNA陽(yáng)性細(xì)胞。B )顯示了在實(shí)施例4中使用的環(huán)形探 針的設(shè)計(jì)。圖7使用掛鎖探針的原位檢測(cè)。在EBV陽(yáng)性人扁桃體組織中原位檢測(cè)非多腺苷酸化的EB病毒 (EBV) RNA即EBERl,所述扁桃體組織在福爾馬林中固定并在石蠟中 包埋。因?yàn)镋BERl RNA是非多腺苷酸化的，所以可以使用在EBERl RNA 的3'-末端中雜交的不含切割元件的探針，在這種情況下所述探針是掛鎖探針。A)如實(shí)施例5中所述處理的扁桃體組織切片，其中箭頭指出滾環(huán) 產(chǎn)物，即EBERl RM陽(yáng)性細(xì)胞。B)在實(shí)施例5中使用的桂鎖探針的設(shè)計(jì)。 圖8使用切割子-龜形探針的原位檢測(cè)。在EBV陽(yáng)性人扁桃體組織中原位檢測(cè)非多腺普酸化的EB病毒 (EBV) RNA即EBER1，所述扁桃體組織在福爾馬林中固定并在石蠟中 包埋。切割子-龜形探針被設(shè)計(jì)為與定位在來(lái)自3'-末端的112個(gè)核香 酸的EBER1 RNA區(qū)域雜交。識(shí)別相同區(qū)域的龜形探針不產(chǎn)生信號(hào)(數(shù) 據(jù)未顯示)，這表明在這種情況下需要切割元件。A)如實(shí)施例6中所述處理的扁桃體組織切片，其中箭頭指出滾環(huán) 產(chǎn)物，即EBERl RNA陽(yáng)性細(xì)胞。B)在實(shí)施例6中使用的切割子-龜形 探針的設(shè)計(jì)。圖9使用兩種不同龜形探針的平行原位檢測(cè)(多路技術(shù)(multiplexing))。 在EBV陽(yáng)性人何杰金氏淋巴瘤組織中原位檢測(cè)非多腺苷酸化的EB 病毒(EBV) RM即EBER1和非多腺苷酸化的hTR (人端粒酶RNA亞單 位)，所述組織在福爾馬林中固定并在石蠟中包埋。因?yàn)镋BERl RNA 和hTR RNA都是非多腺苷酸化的，所以可以使用在靶RM的3'-末端 中雜交的不含切割元件的探針，在這種情況下所述探針是龜形探針。A) 如實(shí)施例7中所述處理的何杰金氏組織切片，其中紅色通道已 被去除，從而使得只能看見(jiàn)來(lái)自EBER1探針的綠色信號(hào)和細(xì)胞核的藍(lán) 色染色。B) 如實(shí)施例7中所述處理的何杰金氏組織切片，其中綠色通道已 被去除，從而使得只能看見(jiàn)來(lái)自hTR探針的紅色信號(hào)和細(xì)胞核的藍(lán)色 染色。實(shí)施例實(shí)施例1使用含10-2 3 DM核酶作為切割元件的切割子探針來(lái)切割RM連接切割子-掛鎖以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及切割MA在一個(gè)步驟 中完成。所使用的RNA是體外轉(zhuǎn)錄的酵母SSA4 RNA的3'-UTR的片段，所 述轉(zhuǎn)錄使用T7 RM聚合酶和作為轉(zhuǎn)錄模板的Pucl8載體來(lái)進(jìn)行，所述 Pucl8載體含有DNA片段，該DNA片段包含插入的酵母SSA4的3'-UTR 的部分。SSA4 RNA的切割在包含10 mM Tris-HCL (在25。C下pH7. 5 )、 10 mM MgCh和10 mM ATP的緩沖液中進(jìn)行，因?yàn)檫@些條件對(duì)于在溶 液中在RNA模板上連接DNA是優(yōu)化的(根據(jù)Nilsson M.等人，Nat Biotechnol. 18 ( 7 ): 791-3. ( 2000 ))。因?yàn)檫@種緩沖液包含Mg2+， 所以靶RNA的切割可以與探針的連接同時(shí)進(jìn)行。SSA4 RNA和SSA4-切 割子-掛鎖探針的終濃度分別為0.5 mM和1 |iM。反應(yīng)體系于37°C 孵育90分鐘，并加載到5%聚丙烯酰胺凝膠上。體外轉(zhuǎn)錄的靶<formula>formula see original document page 61</formula>其中實(shí)施例2使用切割子-掛鎖探針的基于陣列的RNA檢測(cè)基于陣列的RM檢測(cè)，其使用經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的顯微鏡 載玻片作為固體支持物和使用體外轉(zhuǎn)錄的SSA4 RNA (類似于實(shí)施例1 中使用的RM)作為靶RNA (圖4)。體外轉(zhuǎn)錄的SSA4 RNA使用T7 RNA聚合酶和作為轉(zhuǎn)錄模板的Pucl8 栽體來(lái)產(chǎn)生，所述Pucl8載體含有DNA片段，所述DM片段包含作為 轉(zhuǎn)錄模板插入的SSA4序列。捕獲寡核苷酸的雜交在這個(gè)測(cè)定法中使用的捕獲寡核苷酸是與體外轉(zhuǎn)錄的靶RM分子 5'-末端互補(bǔ)的偶聯(lián)有3'-生物素的寡核苷酸，并且以經(jīng)鏈霉抗生物素 蛋白包被的顯微鏡栽玻片形式提供固體支持物。將包含直徑為大約6 mm的孔的塑料蓋附著至載玻片，以便分開(kāi)不同反應(yīng)體系。將終濃度為 1 jaM的捕獲寡核苷酸在緩沖液中附著至經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的 載玻片，所述緩沖液包含lOmMTris-HCL (在25。C下pH7. 5 )和10mM MgCl2。取決于固體支持物的規(guī)模，更大或更小量的捕獲寡核苷酸可能 是優(yōu)選的。在雜交后，于37TC用洗滌緩沖液(0. 1 M Tris-HCl、 0.15 M NaCl和O. 05%吐溫-20)洗滌栽玻片。雜交、連接和切割靼RNA分子與捕獲寡核苷酸的雜交、SSA4-切割子-掛鎖探針的連 接以及耙RNA的切割在一個(gè)步驟中進(jìn)行。這通過(guò)在混合物中將靶RM 和探針加至栽玻片，并將載玻片于37iC孵育30分鐘來(lái)完成，所迷混 合物包含10nM耙RM、 120 nM探針、10 mM Tris-HCL (在25匸下 pH7.5) 、 10 mM MgCl2、 10 ATP、 5 mM DTT、 1 U/ja 1 Ribolock(Fermentas)和0. 1 U/y 1 T4 DM連接酶(Fermentas)。這些連 接條件對(duì)于在溶液中在RNA模板上連接DNA是優(yōu)化的(根據(jù)Nils son M. 等人，Nat Biotechnol. 18 ( 7 ) : 791-3. ( 2000 ))。在37T孵育 后，于37'C用洗滌緩沖液(0. 1 M Tris-HCl、 0. 15 M NaCl和0. 05%吐溫-20)洗涂栽玻片。3'-末端修飾因?yàn)樵谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)中的切割子探針是包含10-23 DNA核酶作為切割 元件的切割子-掛鎖(圖8B)，所以切割在3'-末端處產(chǎn)生環(huán)狀磷酸而 不是常規(guī)的羥基。RNA的新的3'-末端因此需要進(jìn)行修飾以使得Phi29 DNA聚合酶能夠開(kāi)始滾環(huán)復(fù)制。這通過(guò)下列方式來(lái)完成使用T4多核 苷酸激酶來(lái)去除環(huán)狀磷酸，從而在靶RNA的3'-末端處產(chǎn)生常規(guī)的羥 基。這個(gè)反應(yīng)通過(guò)下列方式來(lái)進(jìn)行加入在補(bǔ)充有0. 3 M NaCl、 4 mM ATP和1 U/ y 1 Ribolock ( Fermentas )的lx交換緩沖液(Fer謎tas ) 中的1 U/ul T4多核苷酸激酶(Fermentas)，并將載玻片于37X:孵 育30分鐘。在37匸孵育后，于37。C用洗滌緩沖液(0. lMTris-HCl、 0. 15 M NaCl和0. 05%吐溫-20)洗滌栽玻片。滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制使用所述探針作為滾環(huán)復(fù)制模板并從靶RNA的新的3'-末端開(kāi)始，使之成為靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制。滾環(huán)復(fù)制于37'C在包含下列 成分的混合物中進(jìn)行30分鐘lx Phi29反應(yīng)緩沖液(Fermentas)、 0. 25 mM dNTP、 1 U/ jli 1 Ribolock ( Fermentas )和0. 25 U/ ju 1 Phi29 DNA聚合酶(Fermentas)。在滾環(huán)復(fù)制后，通過(guò)于37'C將其輕柔地浸 入洗滌緩沖液中2分鐘來(lái)洗滌栽玻片，以避免破壞滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物。滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)通過(guò)下列方式來(lái)進(jìn)行加入包含10 mM Tris-HCl(在25。C下pH 7. 5 )和10 mMMgCl2、 5 mM DTT、 1 U/n 1 Ribolock (Fermentas)以及0.25 )iM熒光探針A和0. 25 nM熒光探針B的 混合物，并將栽玻片于37TC孵育30分鐘。為了能夠區(qū)分假信號(hào)和真信號(hào)，加入兩種熒光探針(探針A和探 針B)，盡管只有一種與滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物退火。真信號(hào)在探針A的光譜 中可見(jiàn)，而假信號(hào)(如果存在)則將在探針A和探針B的光譜中可檢 測(cè)到。在37'C孵育后，通過(guò)于37X:將其輕柔地浸入洗滌緩沖液中2分鐘 來(lái)洗滌載玻片以避免破壞滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物，脫水，用包含DAPI的VectorShield進(jìn)行封固(mount)，并在焚光顯微鏡下可視化。體外轉(zhuǎn)錄的耙RM (SEQ ID NO: l4): 5'-GGGAUAAAUACAAAGAUGCGAUGAAGUAGCAGCAUCGAAUUUCUUAGmiUUCCCUCUUAA CAACUUUUUAUAAGUAUA,AUAAGAUACACAAUCAGUAAUUAGCAAAUGACUACUAUUUGU ACGUUCUCAUCGUCAUAAGCCAGAGUUUAAUUAAGUGCCUCAACCGGGAUGCGAUUUCGCGUU CAUAUACAAAGCCGAAAUGACAAUAAGAAAGUCAUCGCCAAACAACACGACCCUUUAGUGAGG G醒AUUG-3',經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的栽玻片購(gòu)自Xenopore。捕獲寡核苷酸(SEQ ID NO: 15): 5'-AGAGGGAAAACTAAGAAATTCGATGCTGCTACTTC-z-3'，其中z是生物素。SSA4-切割子-掛鎖探針(SEQ ID NO: 11): 5'-P-TAATTACTGATTGTGTATCTTTTATTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATT TACTTGGATGTCTAGAACGTAGGCTAGCTACAACGAAAATAGTAGTCATTTGC-3'，其中P是5'-磷酸。焚光探針A (SEQ ID NO: 16): 5'-x-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC-3,,其中x是熒光團(tuán)TAMRA (羅丹明)。 熒光探針B (SEQ ID NO: 17): 5'-y-CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC-3',其中y是熒光團(tuán)FAM (FITC)。 所有探針購(gòu)自DNA Technology A/S。實(shí)施例3使用龜形探針來(lái)原位檢測(cè)MA在石蠟包埋、福爾馬林固定、感染了 EB病毒(EBV)的人扁桃體 組織中原位檢測(cè)EBER1 (EB早期區(qū)域)RNA (參見(jiàn)圖5)。預(yù)處理福爾馬林固定、石蠟包埋的組織用二甲苯脫蠟2x10分鐘， 并隨后在99%、 85%、 70%的系列乙醇中洗滌以去除殘留的二甲苯。 然后，將該組織在室溫下脫水并風(fēng)干。將該組織用溶解在0.1 M HC1 中的0. 05%胃蛋白酶(Sigma)于37'C處理15分鐘。胃蛋白酶處理通 過(guò)將載玻片浸入洗滌緩沖液(0.1 M Tris-HCl、 0.15 M NaCl和0. 05 %吐溫-20)中來(lái)終止。將該組織在處于lx PBS中的0. 4%低聚甲醛 中再固定20分鐘，和于37'C在洗滌緩沖液中洗滌5分鐘，并在室溫 下脫水和風(fēng)干。探針雜交將包含O. 1 juMEBl-龜形探針、20%甲酰胺、2x SSC、 0.2 jLig/ylBSA、 5%甘油和0.2 Mg/M 1栽體DNA的雜交混合物加 至載玻片，并用蓋玻片覆蓋。用耐熱膠將蓋玻片密封至載玻片。栽玻 片于95。C加熱2分鐘，冷卻至37。C并在那個(gè)溫度下孵育30分鐘。在 雜交后，將載玻片在含0. 05%吐溫-20的2x SSC中于37C洗滌5分 鐘，在洗滌緩沖液中于37'C洗滌5分鐘，并最后在室溫下脫水和風(fēng)干。 雜交可以于37'C進(jìn)行而無(wú)需首先加熱至95'C，但已發(fā)現(xiàn)加熱至95°C 可增加信號(hào)數(shù)目。載體DNA或RNA可能不一定需要，但通常似乎可增 加信號(hào)數(shù)目。探針連接使用龜形探針的優(yōu)點(diǎn)是，這種探針包含其自身的連接 模板，從而使得探針-連接在這種自身包含的DNA模板上來(lái)進(jìn)行而不是 使用乾RNA作為模板來(lái)進(jìn)行。這種探針設(shè)計(jì)在大多數(shù)情況下將是優(yōu)選 的，因?yàn)槭褂肦M模板的DNA連接比使用DNA模板的DNA連接具有低 得多的效率(比較圖5和7)。探針的連接在包含lx T4 DM連接酶緩沖液(Fermentas ) 、 0. 2 ja g/p 1 BSA和0. 1 U/p 1 T4 DNA連接酶(Fermentas)的混合物中于 371C進(jìn)行30分鐘。在與連接酶混合物一起孵育后，載玻片在洗滌緩沖 液中于371C洗滌5分鐘。滾環(huán)復(fù)制該滾環(huán)復(fù)制使用所述探針作為滾環(huán)復(fù)制模板并從耙RNA的天然3'-末端開(kāi)始，使之成為靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制。這個(gè)操作程序 不僅檢測(cè)耙分子的存在，而且還檢測(cè)其在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的定位。滾環(huán)復(fù) 制于37。C在包含下列成分的混合物中進(jìn)行30分鐘lx Phi29反應(yīng)緩 沖液(Fermentas) 、 0. 25mMdNTP、 0. 2 jj g/p 1 bsa、 5。/。甘油和1U/ jal Phi29 DNA聚合酶(Fermentas)。在滾環(huán)復(fù)制后，載玻片在洗滌 緩沖液中于37'c洗滌5分鐘。滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)通過(guò)下列來(lái)進(jìn)行:加 入包含20%曱酰胺、2x SSC、5。/q甘油以及0. 25 juM熒光探針A和0. 25 juM熒光探針B的雜交混合物，并將栽玻片于37'C孵育30分鐘 為了區(qū)分假信號(hào)和真信號(hào)，加入兩種熒光探針(探針A和探針B )， 盡管只有一種與滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物退火。真信號(hào)在探針A的光鐠中可見(jiàn)， 而假信號(hào)(如果存在)則將在探針A和探針B的光諳中可檢測(cè)到。將載玻片在洗滌緩沖液中洗滌，脫水，用包含DAPI的 VectorShield封固，并在熒光顯樣史鏡下可^L化。EB1-龜形探針(SEQ ID NO: 3): 5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAAAACATGCGGACCACCAGCTGGTACT TGACCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3',其中P是5'-磷酸。熒光探針A (SEQ ID NO: 16): -x-cctcaatgctgctgctgtactac-3/， 其中x是熒光團(tuán)TAMRA (羅丹明)。 熒光探針B (SEQ ID NO: 17): 5'-y-CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC-3', 其中y是熒光團(tuán)FAM (FITC)。 所有探針購(gòu)自DNA Technology A/S。實(shí)施例4:使用預(yù)先形成的環(huán)形探針來(lái)原位檢測(cè)RNA在石蠟包埋、福爾馬林固定、感染了 EB病毒(EBV)的人扁桃體 組織中原位檢測(cè)EBER1 (EB早期區(qū)域)RM (參見(jiàn)圖6)。在其用作雜交探針前通過(guò)連接EBl-龜形探針(圖5)(實(shí)施例3) 來(lái)制備預(yù)先形成的環(huán)。預(yù)先形成的環(huán)的制備向所述混合物中加入使用lx連接T4 DNA連接緩沖液 (Fer麵tas ) 、 0. 1 U/ p 1 T4腿連接酶(Fermentas )進(jìn)行連接的 EB卜龜形探針，并將連接混合物于37'C孵育30分鐘。預(yù)處理福爾馬林固定、石蠟包埋的組織用二甲苯脫蠟2x10分鐘， 并隨后在99%、 85%、 70%的系列乙醇中洗滌以去除殘留的二甲苯。 然后，將該組織在室溫下脫水并風(fēng)干。將該組織用溶解在0.1 M HC1 中的0. 05%胃蛋白酶(Sigma)于37。C處理15分鐘。胃蛋白酶處理通 過(guò)將載玻片浸入洗滌緩沖液(0. 1 M Tris-HCl、 0. 15 M NaCl和0. 05 %吐溫-20)中來(lái)終止。將該組織在處于lx PBS中的0. 4%低聚甲醛 中再固定20分鐘，和于37"C在洗滌緩沖液中洗滌5分鐘，并在室溫 下脫水和風(fēng)干。探針雜交將包含0.1 jaM preEBl-龜形探針、20%曱酰胺、2x SSC、 0.2 jig/ml BSA、 5%甘油和0. 2 p g/)i 1載體DM的雜交混 合物加至載玻片，并用蓋玻片覆蓋。用耐熱膠將蓋玻片密封至載玻片。 載玻片于95C加熱2分鐘，冷卻至37。C并在那個(gè)溫度下孵育30分鐘。 在雜交后，將載玻片在含0. 05%吐溫-20的2x SSC中于37t:洗滌5 分鐘，在洗滌緩沖液中于37'C洗滌5分鐘，并最后在室溫下脫水和風(fēng) 干。雜交可以于37'C進(jìn)行而無(wú)需首先加熱至95t:，但已發(fā)現(xiàn)加熱至 "1C可增加信號(hào)數(shù)目。載體DM或RNA可能不一定需要，但通常似乎 可增加信號(hào)數(shù)目。滾環(huán)復(fù)制該滾環(huán)復(fù)制使用所述探針作為滾環(huán)復(fù)制模板并從耙 RNA的天然3'-末端開(kāi)始，使之成為靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制。這個(gè)操作程序因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQ IDN0:11) 的切割子-掛鎖 5'-P-TAATTACTGATTGTGTATCTTTTATTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTT-ACTTGGATGTCTAGAACGTAGGCTAGCTACAACGAAAATAGTAGTCATTTGC-3'， 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDN0:12) 的切割子-掛鎖 5'-P-CTAGCAAAACCTCTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTTACTTTACAGCCAGG-CTAGCTACAACGAACACGTCTCCTCC-3'， 其中P是5'-磷酸。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下列序列(SEQIDN0:13) 的切割子-掛鎖 5'-P-CGCACTGAGCGTTCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTTACTTGGACTTGAGG-CTAGCTACAACGACTCGGGTCGGTAGCAC-3,, 其中P是5'-磷酸。上文描述的不同探針可以用于在溶液中、原位和在如下文詳細(xì)描 述的基于陣列的測(cè)定法中檢測(cè)核酸。通過(guò)靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制來(lái)檢測(cè)核酸分子具有由于反應(yīng)的靶引發(fā)特 征而引起的強(qiáng)信號(hào)擴(kuò)增和局域化信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，靶引發(fā)的滾環(huán)反應(yīng)從核酸分子的天然3'-末端開(kāi)始引發(fā)。因?yàn)檫@種方法需要在RM中探針進(jìn)行雜交的區(qū)域處或 附近存在3'-末端，所以靶RNA優(yōu)選可以是非多腺苷酸化的RNA，例如 但不限于，來(lái)自EB病毒的EBER1和EBER2、腺病毒編碼的小RNA，s VA1 和VA2、核糖體RNA，s、端粒酶復(fù)合物(hTERC)的RM部分、小干擾 RNA，s (siRNA，s)和微小RNA，s (miRNA，s)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶RNA分子的方法，所述方法包括使環(huán)狀核使用掛鎖探針來(lái)原位檢測(cè)RNA在石蠟包埋、福爾馬林固定、感染了 EB病毒(EBV)的人扁桃體 組織中原位檢測(cè)EBER1 (EB早期區(qū)域)RNA (圖7)。預(yù)處理福爾馬林固定、石蠟包埋的組織用二甲苯脫蠟2x10分鐘， 并隨后在99%、 85%、 70%的系列乙醇中洗滌以去除殘留的二甲苯。 然后，將該組織在室溫下脫水并風(fēng)干。將該組織用溶解在0.1 M HC1 中的0. 05%胃蛋白酶(Sigma)于37C處理15分鐘。胃蛋白酶處理通 過(guò)將載玻片浸入洗滌緩沖液(0. 1 M Tris-HCl、 0. 15 M NaCl和0. 05 %吐溫-20)中來(lái)終止。將該組織在處于lx PBS中的0. 4%低聚甲醛 中再固定20分鐘，和于37C在洗滌緩沖液中洗滌5分鐘，并在室溫 下脫水和風(fēng)干。探針雜交將包含0. 1 MMEBl-掛鎖探針、20%甲酰胺、2x SSC、 0.2 ing/jalBSA、 5%甘油和0.2 lig/ul載體DNA的雜交混合物加 至載玻片，并用蓋玻片覆蓋。用耐熱膠將蓋玻片密封至載玻片。載玻 片于95C加熱2分鐘，冷卻至37。C并在那個(gè)溫度下孵育30分鐘。在 雜交后，將載玻片在含0. 05%吐溫-20的2x SSC中于37。C洗滌5分 鐘，在洗滌緩沖液中于37。C洗滌5分鐘，并最后在室溫下脫水和風(fēng)干。 雜交可以于37。C進(jìn)行而無(wú)需首先加熱至95'C,但已發(fā)現(xiàn)加熱至95匸 可增加信號(hào)數(shù)目。載體DNA或RNA可能不一定需要，但通常似乎可增 加信號(hào)數(shù)目。探針連接探針的連接在包含10mMTris-HCL(在25'C下pH7. 5 )、 10 mM MgCl2、 10 jaM ATP、 5 mM DTT、 0. 2 p g/ ja 1 BSA和0. 1 U/ y 1 T4 DM連接酶(Fermentas )的混合物中于37'C進(jìn)行30分鐘。在 與連接酶混合物一起孵育后，將載玻片在洗滌緩沖液中于37C洗滌5 分鐘。這些連接條件對(duì)于在溶液中在RNA模板上連接DNA是優(yōu)化的(根 據(jù)Nilsson M.等人，Nat Biotechnol. 18 ( 7 ): 791-3. ( 2000 ))。滾環(huán)復(fù)制該滾環(huán)復(fù)制使用所述探針作為滾環(huán)復(fù)制模板并從靶 RNA的天然3'-末端開(kāi)始，使之成為靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制。這個(gè)操作程序 不僅檢測(cè)耙分子的存在，而且還檢測(cè)其在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的定位。滾環(huán)復(fù)制于37t:在包含下列成分的混合物中進(jìn)行30分鐘lx Phi29反應(yīng)緩 沖液(Fermentas) 、 0. 25 mM dNTP、 0. 2 jj g/p 1 BSA、 5。/。甘油和1U/ Ul PM29 DNA聚合酶(Fermentas)。在滾環(huán)復(fù)制后，載玻片在洗滌 緩沖液中于37'C洗滌5分鐘。滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)通過(guò)下列來(lái)進(jìn)行:加 入包含20 %甲酰胺、2x SSC、 5 %甘油以及0. 25 ja M熒光探針A和0. 25 juM熒光探針B的雜交混合物，并將載玻片于37t:孵育30分鐘。為了區(qū)分假信號(hào)和真信號(hào)，加入兩種熒光探針(探針A和探針B ), 盡管只有一種與滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物退火。真信號(hào)在探針A的光i普中可見(jiàn)， 而假信號(hào)(如果存在)則將在探針A和探針B的光i瞽中可檢測(cè)到。將載玻片在洗滌緩沖液中洗滌，脫水，用包含DAPI的 VectorShield封固，并在焚光顯微鏡下可視化。EBl-掛鎖探針(SEQ ID NO: 18): 5'-P-CAGCTGGTACTTGACCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTAGTGATTTACTTAAAACA 丁GCGGACCAC-3'其中 ，熒光探針A (SEQ ID NO: 16): -x-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAd ， 其中x是熒光團(tuán)TAMRA (羅丹明)。 熒光探針B (SEQ ID NO: 17): 5'-y-CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC-3'， 其中y是熒光團(tuán)FAM (FITC)。 所有探針購(gòu)自DM Technology A/S。實(shí)施例6使用切割子-龜形探針來(lái)原位檢測(cè)RNA使用切割子-龜形探針在石蠟包埋、福爾馬林固定、感染了EB病 毒(EBV)的人扁桃體組織中原位檢測(cè)EBER1 (EB早期區(qū)域)RNA (圖 8)。預(yù)處理福爾馬林固定、石蠟包埋的組織用二曱苯脫蠟2x10分鐘， 并隨后在99%、 85%、 70%的系列乙醇中洗滌以去除殘留的二甲苯。 然后，將該組織在室溫下脫水并風(fēng)干。將該組織用溶解在0.1 M HC1 中的0. 05%胃蛋白酶(Sigma)于37X:處理15分鐘。胃蛋白酶處理通 過(guò)將載玻片浸入洗滌緩沖液(0. 1 M Tris-HCl、 0. 15 M NaCl和0. 05 %吐溫-20)中來(lái)終止。將該組織在處于lx PBS中的0. 4%低聚甲醛 中再固定20分鐘，和于37。C在洗滌緩沖液中洗滌5分鐘，并在室溫 下脫水和風(fēng)干。探針雜交將包含O. 1 yMEBl-切割子-龜形探針、20%曱酰胺、 2x SSC、 0.2 Mg/plBSA、 5%甘油和0. 2 ja g/ju 1栽體DNA的雜交 混合物加至載玻片，并用蓋玻片覆蓋。用耐熱膠將蓋玻片密封至載玻 片。載玻片于95。C加熱2分鐘，冷卻至37X:并在那個(gè)溫度下孵育30 分鐘。在雜交后，將載玻片在含0. 05%吐溫-20的2x SSC中于37X: 洗滌5分鐘，在洗滌緩沖液中于37'C洗滌5分鐘，并最后在室溫下脫 水和風(fēng)干。雜交可以于37。C進(jìn)行而無(wú)需首先加熱至95°C,但已發(fā)現(xiàn)加 熱至95'C可增加信號(hào)數(shù)目。載體DNA或RNA可能不一定需要，但通常 似乎可增加信號(hào)數(shù)目。探針連接使用自我模板式探針的優(yōu)點(diǎn)是，這種探針包含其自身 的連接模板，從而使得探針-連接在這種自身包含的DNA模板上來(lái)進(jìn)行 而不是使用靶RNA作為模板來(lái)進(jìn)行。這種探針設(shè)計(jì)在大多數(shù)情況下將 是優(yōu)選的，因?yàn)槭褂肦NA模板的DNA連接比使用DM模板的DNA連接 具有低得多的效率(比較圖5和7 )。探針的連接在包含lxT4DM連接酶緩沖液(Fermentas)、 0.2 jli g/li 1 BSA和0. 1 U/jn 1 T4 DNA連接酶(Fermentas)的混合物中于 37'C進(jìn)行30分鐘。在與連接酶混合物一起孵育后，載玻片在洗滌緩沖 液中于37X:洗滌5分鐘，并最后在室溫下脫水和風(fēng)干。這種切割子的切割元件是10-23 DNA核酶，所述10-23 DNA核酶 對(duì)于活性來(lái)說(shuō)嚴(yán)格依賴于二價(jià)金屬離子的存在，例如Mg2+、 Mn2+、 Ca2+ 或Pb2+。因?yàn)閘x T4 DNA連接酶緩沖液包含Mg2+，所以耙RM的切割 與連接平行發(fā)生。靶RNA的切割也可以在雜交過(guò)程中進(jìn)行，或作為分 開(kāi)的步驟進(jìn)行，只要存在二價(jià)金屬離子。3'-末端修飾因?yàn)?0-23 DNA核酶當(dāng)切割RNA時(shí)在3'-末端處產(chǎn) 生環(huán)狀磷酸而不是常規(guī)的羥基，所以Phi29 DNA聚合酶不能從所產(chǎn)生 的3'-末端開(kāi)始引發(fā)(圖4E)。因此，RNA的新的3'-末端需要進(jìn)行修 飾以允許Phi29 DNA聚合酶能夠開(kāi)始滾環(huán)復(fù)制。這通過(guò)下列方式來(lái)完 成使用T4多核苷酸激酶來(lái)去除環(huán)狀磷酸，以在3'-末端處產(chǎn)生常規(guī) 的羥基。通過(guò)使用在補(bǔ)充有0. 3MNaCl、 4mMATP和0. 2 m g/'y i BSA 的lx交換緩沖液(Fermentas )中的1 U/jj 1 t4多核苷酸激酶 (Fermentas)，這個(gè)反應(yīng)于37。C進(jìn)行30分鐘。在孵育后，載玻片在 洗滌緩沖液中于37。C洗滌5分鐘。滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制使用所述探針作為滾環(huán)模板并從靶RNA的新 的3'-末端開(kāi)始，使之成為靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制。這個(gè)操作程序不僅檢 測(cè)乾分子的存在，而且還檢測(cè)其在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的定位。滾環(huán)復(fù)制于37 。C在包含下列成分的混合物中進(jìn)行30分鐘lx Phi29反應(yīng)緩沖液 (Fermentas) 、 0. 25 mM dNTP、 0. 2 p g/p 1 BSA、 5%甘油和1 U/ pl Phi29 DNA聚合酶(Fermentas)。在滾環(huán)復(fù)制后，載玻片在洗滌 緩沖液中于37'C洗滌5分鐘。滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)通過(guò)下列來(lái)進(jìn)行:加 入包含20%甲酰胺、2x SSC、5。/。甘油以及0. 25 uM熒光探針A和0. 25 juM熒光探針B的雜交混合物，并將載玻片于37匸孵育30分鐘。為了區(qū)分假信號(hào)和真信號(hào)，加入兩種熒光探針(探針A和探針B), 盡管只有一種與滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物退火。真信號(hào)在探針A的光譜中可見(jiàn)， 而假信號(hào)(如果存在)則將在探針A和探針B的光鐠中可檢測(cè)到。將載玻片在洗滌緩沖液中洗滌，脫水，用包含DAPI的 VectorShield封固，并在熒光顯微鏡下可視化。EBl-切割子-龜形探針(SEQ ID NO: 19): 5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACCCAAAACGATCCCTCCTCTGGGCTAGC TACAACGAACACACCGACATCGGGATCGACTCGGAATAACCGA-3',其中P是5'-磷酸。熒光探針A (SEQ ID NO: 16): -x-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAd , 其中x是熒光團(tuán)TAMRA (羅丹明)。 熒光探針B (SEQ ID NO: 17): 5' -y-CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC-3/， 其中y是熒光團(tuán)FAM (FITC)。 所有探針購(gòu)自腿Technology A/S。實(shí)施例7使用兩種不同的龜形探針來(lái)平行地原位檢測(cè)RM (多路技術(shù))。在石蠟包埋、福爾馬林固定、EB病毒(EBV)陽(yáng)性的人何杰金氏淋巴瘤組織中原位檢測(cè)EBERl (EB早期區(qū)域)RNA和hTR (人端粒酶RM亞單位)(參見(jiàn)圖5 )。預(yù)處理福爾馬林固定、石蠟包埋的組織用二曱苯脫蠟2x10分鐘，隨后在99%、 85%、 99%的系列乙醇中洗滌以去除殘留的二曱苯，并在室溫下風(fēng)干。將該組織用溶解在0.1 M HC1中的0. 05%胃蛋白酶 (Sigma)于37'C處理15分鐘。胃蛋白酶處理通過(guò)將栽玻片浸入洗滌緩沖液(0. 1 M Tris-HCl、 0.15 M NaCl和0. 05%吐溫-20)中來(lái)終止。將載玻片在室溫下脫水和風(fēng)干。探針雜交將包含0. 1 uMEBl-龜形探針、0.1 jaMhTR-龜形探針、20%曱酰胺、2x SSC、 0.2 pg/nl BSA、 5%甘油和1 u g/n 1載體RNA的雜交混合物加至栽玻片，并用蓋玻片覆蓋。用耐熱膠將蓋玻片密封至載玻片。載玻片于95匸加熱2分鐘，冷卻至37。C并在那個(gè) 溫度下孵育30分鐘。在雜交后，將栽玻片在含0. 05 %吐溫-20的2x SSC 中于37。C洗滌5分鐘，在洗滌緩沖液中于37'C洗滌5分鐘，并最后在 室溫下脫水和風(fēng)干。雜交可以于37t:進(jìn)行而無(wú)需首先加熱至95°C，但 已發(fā)現(xiàn)加熱至95"C可增加信號(hào)數(shù)目。載體DNA或RNA可能不一定需要， 但通常似乎可增加信號(hào)數(shù)目。探針連接使用龜形探針的優(yōu)點(diǎn)是，這種探針包含其自身的連接 模板，從而使得探針-連接在這種自身包含的dm模板上來(lái)進(jìn)行，而不 是使用靶rna作為模板來(lái)進(jìn)行(比較圖5和7)。探針的連接在包含lxT4DNA連接酶緩沖液(Fermentas)、 0.2 n g/ m 1 BSA和0. 1 U/ m 1 T4 DNA連接酶(Fermentas )的混合物中于 37n進(jìn)行30分鐘。在與連接酶混合物一起孵育后，栽玻片在洗滌緩沖 液中于37'C洗滌5分鐘。為了使該混合物容易經(jīng)過(guò)組織進(jìn)行擴(kuò)散，可 以向該混合物加入0. 05%吐溫-20和0. 05% NP40。滾環(huán)復(fù)制該滾環(huán)復(fù)制使用所述探針作為滾環(huán)復(fù)制模板并從靶 rna的天然3'-末端開(kāi)始，使之成為靶引發(fā)的滾環(huán)復(fù)制。這個(gè)操作程序 不僅檢測(cè)耙分子的存在，而且還檢測(cè)其在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的定位。滾環(huán)復(fù) 制于37。C在包含下列成分的混合物中進(jìn)行30分鐘lx Phi29反應(yīng)緩 沖液(Fermentas ) 、 0. 25mMdNTP、 0. 2 p g/ja 1 BSA、 5%甘油和111/ jj1 Phi29 dna聚合酶(Fermentas)。在滾環(huán)復(fù)制后，載玻片在洗滌 緩沖液中于37'C洗滌5分鐘。滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的檢測(cè)通過(guò)下列來(lái)進(jìn)行:加 入包含20%甲酰胺、2x SSC、5。/。甘油以及0. 25 yM熒光探針A和0. 25 juM熒光探針B的雜交混合物，并將載玻片于37匸孵育30分鐘。將載玻片在洗滌緩沖液中洗滌，脫水，用包含DAPI的 VectorShield封固，并在熒光顯微鏡下可視化。EB1-龜形探針(SEQ ID NO: 3): 5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAAAACATGCGGACCACCAGCTGGTACT TGACCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3',其中 、hTR-龜形探針(SEQ ID NO: 5): 5'-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGGTGCA CGTCCCACAGCTCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3',其中P是5'-磷酸。熒光探針A (SEQ ID NO: 16): 5' -x-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC-3', 其中x是熒光團(tuán)TAMRA (羅丹明)。 焚光探針B (SEQ ID NO: 17): 5' -y-CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC-3'， 其中y是熒光團(tuán)FAM (FITC)。 所有探針購(gòu)自DNA Technology A/S。參考文獻(xiàn)WO 97/19193 WO 97/20948 WO 98/38300 WO 99/49079 WO 01/77383 WO 02/50310 US2003/0087241Andersen CL.等人，O r麵廳e紋10 (4) ， 305-12 ( 2002 ) Astrom H，等人，Org Biomol Chem. 7; 1 ( 9 ): 1461-5 ( 2003 ) Brown AK等人，Biochemistry 17; 42 ( 23 ) : 7152-61 ( 2003 ) Carmi N.等人，Proc Natl Acad Sci USA. 3; 95 ( 5 ) : 2233-7 (1998 )Dahl F等人，Proc Natl Acad Sci USA. 101 (13) ， 4548-53 (2004 )Huang L.等人，J Biol Inorg Chem. 5 ( 1 ): 85-92 ( 2000 ) Jimenez-Garrido N等人，J Inorg Biochem. 99 ( 3 ) : 677-89 (2005 )Koch J. Chromosoma 98: 259 ( 1989 ). Larsson C.等人，Nature Methods 1， 227-32 ( 2004 )) MasudaN.等人，Nucleic Acids Res. 15; 27 ( 22 )4436-43 ( 1999 ) Nilsson M.等人，Nat Biotechnol. 18 ( 7 ) : 791-3. ( 2000 ) Sakamoto S.等人，Nucleic Acids Res. 1; 31 ( 5 ) : 1416-25 (2003)Santoro SW和Joyce GF Proc Natl Acad Sci USA. 29; 94 ( 9 ): 4262-6. ( 1997 )Whitney A.等人，Chem Commun ( Camb ) . 7; ( 1 ): 36-7 ( 2003 ).
權(quán)利要求
1.總長(zhǎng)度為30-200個(gè)核苷酸的環(huán)狀核酸探針，其包含I.包含核酸序列的第一個(gè)部分和第三個(gè)部分，所述核酸序列互相至少75％互補(bǔ)并且各具有3-100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；II.包含由所述第一個(gè)部分或所述第三個(gè)部分延伸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二個(gè)核酸部分，并且其中所述第二個(gè)部分具有9-50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；III.包含與靶核酸序列至少75％互補(bǔ)的核酸殘基序列的第四個(gè)部分，并且其中所述第四個(gè)部分的長(zhǎng)度為6-100個(gè)核苷酸。
2. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其中所述第四個(gè) 部分包含與靶RNA序列至少7 5 %互補(bǔ)的核酸殘基序列。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其進(jìn)一步包含限 定所述特定探針的一個(gè)或多個(gè)元件。
4. 限定根據(jù)權(quán)利要求3的特定探針的元件，其是6 - 150個(gè)核苷酸 的核苷酸序列。
5. 限定根據(jù)權(quán)利要求3的特定探針的元件，其由一個(gè)或多個(gè)人工 核苷酸組成。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其中所述探針包 含具有核酸內(nèi)切酶活性的一個(gè)或多個(gè)元件。
7. 環(huán)狀核酸探針，其是預(yù)先形成的環(huán)形探針或掛鎖探針，其中所 述探針包含具有核酸內(nèi)切酶活性的一個(gè)或多個(gè)元件。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的環(huán)狀核酸探針，其包含i) 一個(gè)或多個(gè)部分，每個(gè)部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少75% 互補(bǔ)的核酸殘基序列，和ii) 限定根據(jù)權(quán)利要求3-4中任一項(xiàng)的特定探針的元件。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的環(huán)狀核酸探針，其中與耙核酸序列的區(qū) 域具有至少75%互補(bǔ)性的所述一個(gè)或多個(gè)部分的總長(zhǎng)度為6-100個(gè)核 苷酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6- 9中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶活性的一個(gè)或多個(gè)元件位于所述靶互補(bǔ)序列內(nèi)，將其分成兩 個(gè)或更多個(gè)部分。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7- 10中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其中所述探針 的總長(zhǎng)度為30 - 200個(gè)核苷酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6- 11中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有 核酸內(nèi)切酶活性的元件是核酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶 活性的元件是DNA序列。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶 活性的元件是DNA核酶。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶 活性的元件是10-23 DNA核酶。
16. 根椐權(quán)利要求14的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶 活性的元件是來(lái)自8-17家族的DNA核酶。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶 活性的元件是17E DNA核酶。
18. 根據(jù)權(quán)利要求6- 11中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有 核酸內(nèi)切酶活性的元件是反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的環(huán)狀核酸探針，其中所述具有核酸內(nèi)切酶 活性的元件是位于所述靶互補(bǔ)序列的一個(gè)末端中的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，其中所述具 有核酸內(nèi)切酶活性的元件選自三聯(lián)吡啶-Cu(II)、 5-氨基-2，9-二甲基 菲咯啉-Zn (11)、四氮雜大環(huán)-Eu (111)和新亞銅試劑-Zn (11)。
21. 用于檢測(cè)靶DNA分子的方法，所述方法包括使根據(jù)權(quán)利要求1 -5中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針與耙DNA序列在所述靼DNA分子的3'-末 端處或附近進(jìn)行雜交；進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。
22. 用于檢測(cè)靶RNA分子的方法，所述方法包括使環(huán)狀核酸探針與 耙RNA序列在所述耙RNA分子的3'-末端處或附近進(jìn)行雜交，所述環(huán)狀 核酸探針是預(yù)先形成的環(huán)形探針、掛鎖探針或根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針；進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其包括I. 獲得包含所述靶RNA分子的制劑，和II. 提供所述環(huán)狀核酸探針，和III. 使所述探針與所述靶RNA分子在所述靶RNA分子的3'-末端 處或附近進(jìn)行雜交，和IV. 用所述探針作為模板來(lái)實(shí)施滾環(huán)復(fù)制， 并通過(guò)使?jié)L環(huán)產(chǎn)物可視化來(lái)檢測(cè)所述靶RNA分子。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中所述探針是掛鎖探針或根 據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針，并且所述方法進(jìn)一步包括 連接所述探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的步驟。
25. 根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中所述耙RNA分子的檢測(cè)在 細(xì)胞或組織中原位發(fā)生。
26. 根據(jù)權(quán)利要求22 - 24中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶RNA固定在固體支持物上。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟i) 提供附著至固體支持物的捕獲寡核苷酸，和ii) 使所述捕獲寡核苷酸與所述耙核酸分子雜交，從而將所述靶核 酸分子附著至所述固體支持物。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述捕獲寡核苷酸在所述支持物上直接合成。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述捕獲寡核苷酸用標(biāo)記物進(jìn) 行標(biāo)記，并且通過(guò)所述標(biāo)記物與固定在固體支持物上的受體分子的結(jié)合 而附著至固體支持物。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述靶核酸分子通過(guò)抗體而附 著至固體支持物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述靶RNA分子通過(guò)靶向所述 核酸分子的5'-帽的抗體而附著至固體支持物。
32. 根據(jù)權(quán)利要求21-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述環(huán)狀核酸探針與來(lái)自所述靶核酸分子的3'-末端的25個(gè)或更少的核苷酸雜交。
33. 根據(jù)權(quán)利要求21 - 32中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括用包含 3'-〉5'核酸外切酶活性的酶來(lái)使所述耙核酸分子的3'-末端凹陷。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述包含3'->5'核酸外切酶活 性的酶選自具有3'-〉5'核酸外切酶活性的聚合酶和具有3'->5'核酸外 切酶活性的核酸外切酶。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述包含3'-〉5'核酸外切酶活 性的酶是包含3'-〉5'核酸外切酶活性的核酸外切酶。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述包含3'-〉5'核酸外切酶活 性的酶是包含3'-〉5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
37. 用于檢測(cè)乾核酸分子的方法，所述方法包括使探針與所述乾核 酸分子雜交，所述探針是根據(jù)權(quán)利要求6或10-20中任一項(xiàng)的環(huán)狀核 酸探針、根據(jù)權(quán)利要求7-20中任一項(xiàng)的預(yù)先形成的環(huán)形探針、或根據(jù) 權(quán)利要求7- 20的掛鎖探針；用具有核酸內(nèi)切酶活性的元件切割所述靶 核酸分子，以在所述靶核酸分子內(nèi)產(chǎn)生3'-末端；從所述新的3'-末端 開(kāi)始進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制；和檢測(cè)滾環(huán)產(chǎn)物。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述靶核酸分子是RM分子。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，所述方法包括i) 獲得包含所述靶核酸分子的制劑，和ii) 提供所述環(huán)狀核酸探針，和iii) 使所述探針與所述靶核酸分子雜交，和iv) 用具有核酸內(nèi)切酶活性的元件切割所述靶核酸分子，在所述靶 核酸分子內(nèi)產(chǎn)生新的3'-和5'-末端，和v )用所述探針作為模板從在所述靶核酸分子內(nèi)的所述新的3'-末端 開(kāi)始實(shí)施滾環(huán)復(fù)制，并通過(guò)使?jié)L環(huán)產(chǎn)物可視化來(lái)檢測(cè)所述靶核酸分子。
40. 根據(jù)權(quán)利要求36 - 38中任一項(xiàng)的方法，其中所述探針是根據(jù) 權(quán)利要求6或10-20中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針或根據(jù)權(quán)利要求7-20 的掛鎖探針，并且所述方法包括連接所述探針以形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步步驟。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37 - 39中任一項(xiàng)的方法，其中在細(xì)胞或組織中 原位檢測(cè)所述耙核酸分子。
42. 根據(jù)權(quán)利要求37 - 40中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶核酸分子 固定在固體支持物上。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述耙核酸分子是RNA。
44. 根據(jù)權(quán)利要求42或43的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟 i)提供附著至固體支持物的捕獲寡核苷酸，和ii )使所述捕獲寡核苷酸與所述靶核酸分子雜交，從而將所述耙核 酸分子附著至所述固體支持物。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述捕獲寡核苷酸在所述支持 物上直接合成。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述捕獲寡核苷酸用標(biāo)記物進(jìn) 行標(biāo)記，并且通過(guò)所述標(biāo)記物與固定在固體支持物上的受體分子的結(jié)合 而附著至固體支持物。
47. 根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述靶核酸分子通過(guò)抗體而附 著至固體支持物。
48. 根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述靶RNA分子通過(guò)耙向所述 核酸分子的5'-帽的抗體而附著至固體支持物。
49. 根據(jù)權(quán)利要求37 - 48中任一項(xiàng)的方法，其中所述靼核酸分子 的所述新的3'-末端被修飾從而獲得游離的羥基。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述靶核酸分子的所述新的3'-末端通過(guò)T4多核苷酸激酶進(jìn)行修飾。
51. 根據(jù)權(quán)利要求37 - 48中任一項(xiàng)的方法，其中所述耙核酸分子 的所述新的3'-末端通過(guò)包含3'-〉5'核酸外切酶活性的酶進(jìn)行修飾。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述靶核酸分子的所述新的3'-末端通過(guò)選自具有->5'核酸外切酶活性的聚合酶和具有->5'核酸 外切酶活性的核酸外切酶的酶進(jìn)行修飾。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述包含3'-〉5'核酸外切酶活性的酶是包含3'-〉5'核酸外切酶活性的核酸外切酶。
54. 根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述包含3'-〉5'核酸外切酶活 性的酶是包含3'-〉5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
55. 根據(jù)權(quán)利要求21-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含耙核酸分子的制劑從選自哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類 和植物細(xì)胞的細(xì)胞中提供。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
58. 根據(jù)權(quán)利要求21-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含耙核酸 分子的制劑從選自哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類和植物組織的 組織中提供。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中所述組織是哺乳動(dòng)物組織。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述組織是人組織。
61. 根據(jù)權(quán)利要求21-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含靶核酸 分子的制劑從病毒中提供。
62. 根據(jù)權(quán)利要求21-61中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)計(jì)數(shù)滾環(huán)復(fù) 制信號(hào)的數(shù)目來(lái)定量測(cè)量靶核酸分子的量。
63. 根據(jù)權(quán)利要求21-61中任一項(xiàng)的方法，其中基于測(cè)量來(lái)自滾 環(huán)復(fù)制的熒光信號(hào)的量來(lái)定量測(cè)量靶核酸分子的量。
64. 試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1 一 20中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸探針 以及選自下列的至少一種組分緩沖液、反應(yīng)物、抗體、 一種或多種靶 核酸的對(duì)照制劑。
65. 檢定方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求l-20中任一項(xiàng)的環(huán)狀核酸 探針與靶核酸分子雜交。
66. 根據(jù)權(quán)利要求65的檢定方法，其中所述耙核酸分子是RNA。
67. 檢定方法，其應(yīng)用權(quán)利要求21-66中任一項(xiàng)所述的任何方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于使用滾環(huán)復(fù)制來(lái)有效地檢測(cè)靶核酸的寡核苷酸和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明的寡核苷酸的特征在于它們可以無(wú)需外部連接模板而環(huán)化。在另一方面，本發(fā)明的寡核苷酸的特征在于它們可以產(chǎn)生對(duì)于滾環(huán)復(fù)制所需的靶核酸的游離3′-末端。本發(fā)明的寡核苷酸和檢測(cè)方法可用作例如研究工具和用于檢定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101238221SQ200680020917
公開(kāi)日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2006年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者J·S·羅曼, J·克啻, M·斯托加德 申請(qǐng)人:現(xiàn)場(chǎng)Rcp公司