專利名稱：豬圓環(huán)病毒和螺桿菌組合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及組合疫苗。更具體而言，本發(fā)明涉及從患 有胃食管潰瘍的豬中分離的新型豬螺桿菌物種的分離和表征，其疫苗 以及針對(duì)螺桿菌(^//co^3"er)物種和豬圓環(huán)病毒毒株的組合疫苗。
背景技術(shù)：
斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(multisystemic wastingsyndrome ) (PMWS)是新出現(xiàn)的豬疾病。PMWS看起來(lái)破壞宿主的免疫系統(tǒng)并在斷 奶仔豬中引起高死亡率。這種疾病具有長(zhǎng)潛伏期， 一般為3-8周，并 影響受感染豬的多種器官。在加拿大、美國(guó)和法國(guó)檢測(cè)到的PMWS綜合 征的臨床特征為體重逐步減輕以及表現(xiàn)為例如呼吸急促、呼吸困難和 黃疰。從病理學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，其表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞或肉芽腫浸潤(rùn)，淋巴結(jié) 病以及較罕見的肝炎和淋巴細(xì)胞或肉芽腫性腎炎(Clark， Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499—501; La Semaine Veterinaire No. 26， supplement to La Semaine Veterinaire 1996 ( 834 ) ; La Semaine Veterinaire 1997 ( 857 ) : 54; Gupi P. S. Nayar等人，Can. Vet. J,第38巻，1997; 385-387 )。受PMWS侵襲的仔豬通常死于呼吸衰 竭和伴隨組織細(xì)胞浸潤(rùn)的間質(zhì)性肺炎。
豬圓環(huán)病毒(PCV)引起世界性的豬感染并且是高度傳染性的。PCV
最初檢測(cè)為豬腎(PK15)細(xì)胞系的非細(xì)胞病變性污染物。PCV已分類 為新病毒科圓環(huán)病毒科。這些病毒是具有單鏈環(huán)狀DNA基因組的小型 無(wú)包膜因子。
各種圓環(huán)病毒已在一系列動(dòng)物物種中鑒定，包括PCV，雞貧血病 毒(CAV)，鸚鷸科鳥類的味羽病病毒(beak and feather disease virus) (BFDV)，植物病毒包括地三葉草矮化病毒(SCSV )、椰子葉 腐爛病毒(CFDV)和香蕉束頂病毒(BBTV)?？雌饋?lái)在目前識(shí)別的圓 環(huán)病毒中沒有DNA序列同源性或共同抗原決定簇。Todd等人，(1991 ) Jrc力.r/ro/. HI: 129-135。
圓環(huán)病毒科中的成員已顯示引起貧血、免疫缺陷相關(guān)疾病并在體 外感染巨噬細(xì)胞。PCV僅在最近被認(rèn)為涉及PMWS。參見，例如，Ellis 等人，(1998 ) /.旦44-51和Gopi等人，(1997 )
化f. /. 385-386。然而，由于PCV在豬群體中的普遍存在，PCV 與PMWS的病原學(xué)聯(lián)系已受到懷疑。另外，用來(lái)源于受污染的PK15細(xì) 胞培養(yǎng)物的PCV接種物實(shí)驗(yàn)性感染豬未能產(chǎn)生臨床疾病。參見，例如 Tischer等人，(1986 )Jrc力.P7ro/. 91: 271-276。
豬的傳染因子特別是病毒不僅深刻影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，由于對(duì)豬器官 用于人中的異種移植的興趣增加，還對(duì)人造成潛在的公共衛(wèi)生危險(xiǎn)。 以前的PMWS疾病診斷基于組織病理學(xué)檢查。因此，需要診斷PMWS相 關(guān)病原體存在，以及預(yù)防PMWS疾病的改進(jìn)方法。
在美國(guó)，每年加工59,000，000只豬，并且由于胃食管潰瘍的直接 死亡損失估計(jì)為至少2. 0%且可能高達(dá)5%。經(jīng)濟(jì)損失為每年至少 $147， 000， 000。由于不健康以及其次由于咬尾而尸體報(bào)廢的亞臨床損 失未知但可能是巨大的，多達(dá)每年$750， 000, 000。豬中的胃食管潰瘍 疾病一般發(fā)生在5-90%的3-6個(gè)月大的豬中，而每年的死亡損失為 1-5%。通常癥狀為猝死或貧血、厭食、嘔吐和具有黑糞癥的不健康、 咬尾癥和尸體報(bào)廢。已知影響GEU流行的因素包括高碳水化合物飲食、 飼料顆粒大小、it會(huì)應(yīng)激和胃孩i生物。"Many of the techniques used to increase feed efficiency and reduce feeding costs are
associated with an increased prevalence of stomach lesions-Economics dictate that a compromise between feed eficeincy and losses due to ulcers must be reached. ，，R. Friendship in "Diseases of Swine" ， 8th ed. ， ISU Press, Ames, IA。
在人中，與幽門螺桿菌(^e7/co^"er;^/or/)感染相關(guān)的細(xì)菌 性胃炎現(xiàn)在識(shí)別為與胃癌和MALT淋巴瘤相關(guān)的B型胃炎的病因。這是 最常見的細(xì)菌性傳染病，盡管在發(fā)達(dá)國(guó)家中頻率減少。抗微生物藥是 有效的治療但"正常"胃細(xì)菌群體的失衡可能導(dǎo)致胃十二指腸潰瘍和 與腺癌相關(guān)的胃反流病。人和豬之間的解剖學(xué)和生理學(xué)相似性提示可 能存在關(guān)于豬中的胃食管潰瘍的細(xì)菌起源。然而，由于抗微生物藥造 成的微生物菌群的紊亂也將是不希望有的。因此需要針對(duì)豬胃菌群， 且特別是與胃食管病癥原因相關(guān)的那些細(xì)菌例如螺桿菌物種的疫苗。
的現(xiàn)有技術(shù)。
。、 土 、 5 ， ， p ,
發(fā)明概述
本發(fā)明基于從受PMWS侵襲仔豬的勻漿組織中分離、本文命名為
"pcv ii型"或"pvcn"的新病毒的發(fā)現(xiàn)。該病毒的表征顯示它與
從持續(xù)感染的PK15細(xì)胞中獲得的、本文命名為"PCV I型，，或"PCVI" 的非病原性豬圓環(huán)病毒具有共同特征。新型PCV變異體PCVII 412以 及幾種另外的PCVII分離林的完整DNA基因組已克隆和測(cè)序。這些DNA
序列的部分用作探針以診斷臨床樣品中病毒的存在，并分離病毒的其
他天然存在的變異體。PCVII的基因組序列的了解還使得可獲得在病
毒基因組的可讀框內(nèi)編碼的各種蛋白質(zhì)的多肽序列，并允許生產(chǎn)這些 肽或其部分，其用作診斷測(cè)試中的標(biāo)準(zhǔn)或反應(yīng)物或用作疫苗組分。保 護(hù)性抗體還可由蛋白質(zhì)引起并且可以以多克隆或單克隆形式產(chǎn)生。
完整PCVII序列的可用性因此允許設(shè)計(jì)和構(gòu)建多肽，其可以充當(dāng) 疫苗或診斷反應(yīng)物，或充當(dāng)在針對(duì)PMWS的被動(dòng)免疫療法中有用的單克 隆抗體(Mab)制劑生產(chǎn)中的中間產(chǎn)物，或充當(dāng)用作診斷反應(yīng)物的抗體 生產(chǎn)中的中間產(chǎn)物。
本發(fā)明進(jìn)一步基于新型細(xì)菌物種，特別是與豬中的胃食管潰瘍有
關(guān)的新型螺桿菌屬物種的發(fā)現(xiàn)。特別地，新型物種A cei7/o已用作用 于開發(fā)治療胃食管病癥的疫苗的抗原來(lái)源。本發(fā)明提供了用于通過減 毒或化學(xué)滅活從A cer^ 及其相關(guān)物種獲得免疫原性組合物的方法。 最有利地，新型螺桿菌和豬圓環(huán)病毒用于提供組合疫苗，由此來(lái) 源于2種病原體類型的免疫原可以共同遞送至靶動(dòng)物以刺激保護(hù)性抗 體和免疫性的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供了用于治療豬中的胃食管潰瘍 和PMWS的疫苗。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及來(lái)源于PCVII基因組的用于生產(chǎn) PCVII診斷劑和疫苗的多核苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，多核苷酸 能夠與PCVII核苷酸序列選擇性雜交并包含至少約8個(gè)連續(xù)核苷酸， 所述連續(xù)核苷酸來(lái)源于PCVII毒林412、9741和B9、 1010、 1011-48121、 1011-48285、 999、 1103和1121的序列(SEQ ID N0S: 1、 11、 12和 24-30 )，或與之互補(bǔ)。在另一實(shí)施方案中，多核苷酸編碼與多肽具有 至少約85。/。同一性的免疫原性PCVI1多肽，所述前者多肽選自來(lái)源于 可讀框0RFs l-6的多肽，以及包含至少約5個(gè)氨基酸的0RFs 1-6的 免疫原性片段。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，多核苷酸編碼ORF 6的多 肽或其免疫原性片段。本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用這些多核苷酸序列或其 部分作為寡聚探針，用于生產(chǎn)可以充當(dāng)診斷反應(yīng)物或疫苗抗原的肽， 涉及肽自身、以及在疾病診斷和治療中有用的多克隆和單克隆抗體。
本發(fā)明的其他方面包括能夠?qū)崿F(xiàn)所需蛋白質(zhì)生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)，所 述蛋白質(zhì)由來(lái)源于完整PCVII基因組的序列編碼，包含此類系統(tǒng)或其
部分的重組載體，用此類載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞，由轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn) 的蛋白質(zhì)，以及由此類蛋白質(zhì)制備的疫苗。另外，本發(fā)明涉及由基因 組編碼的具有表位的肽序列，并涉及與標(biāo)記或載體蛋白共價(jià)連接的此 類序列。本發(fā)明還包含了 PCVII基因組的各個(gè)0RFs，以及由這些0RFs 編碼的蛋白質(zhì)，及其部分。
本發(fā)明還涉及制備多肽組合物、例如疫苗和免疫診斷組合物、以 及免疫球蛋白的方法，還涉及免疫測(cè)定法和用于測(cè)定法的包含引物、 探針、多肽和/或免疫球蛋白的試劑盒。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)
明涉及檢測(cè)生物樣品中的PCVII抗體的方法，其包括(a)提供生物樣 品；(b)在允許生物樣品中存在的PCVII抗體結(jié)合PCVII多肽以形成
抗體/抗原復(fù)合物的條件下，使生物樣品與如上所述的免疫原性pcvn
多肽反應(yīng)；和(c)檢測(cè)復(fù)合物的存在或缺乏，由此檢測(cè)樣品中PCVII
抗體的存在或缺乏。
在本發(fā)明的組合免疫接種或疫苗接種程序中，還可以組合針對(duì)豬 圓環(huán)病毒的免疫接種或疫苗接種與針對(duì)豬螺桿菌的那種，并可以進(jìn)一
步包括針對(duì)其他豬病原體，特別是可能與PMWS綜合征相關(guān)的那些的免 疫接種或疫苗接種。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗因此可以包 含對(duì)應(yīng)另一種豬病原體的另一種效價(jià)(valency)，所述另一種病原體 例如但不限于，PRRS (豬繁殖與呼吸綜合征)和/或豬肺炎枝原體 (妙co; /ss則力7/ o/7/7e咖o/zise)， 和/或大腸桿菌，和/或萎縮性鼻 炎，和/或偽狂犬病(假狂犬病)病毒和/或豬流行性感冒和/或胸膜肺 炎放線桿菌(y4c"./2o6a"7/"s /7/ewo;7/ze咖ar7/ae)和/或豬霍亂，及 其組合。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的免疫接種或疫苗接種程序和疫苗將組 合針對(duì)圓環(huán)病毒和螺桿菌產(chǎn)生的胃食管潰瘍，以及PRRS和/或豬流行 性感冒的免疫接種或疫苗接種。因此可以使用任何合適形式的免疫原 性組合物或疫苗，特別是任何可用的商品化疫苗，以便將其與如本文 所述的針對(duì)豬圓環(huán)病毒和豬螺桿菌的免疫原性組合物或疫苗組合。
本發(fā)明的主題因此還包含多價(jià)免疫原性組合物和疫苗、多疫苗試 劑盒、以及免疫接種或疫苗接種組合方法，其使得能夠使用此類組合 免疫接種或疫苗接種程序。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面包含了用于誘發(fā)針對(duì)螺桿菌物種和豬圓 環(huán)病毒的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，其包含至少一種螺桿菌抗原和 至少 一種豬圓環(huán)病毒抗原，以及獸醫(yī)學(xué)可接受的媒介物或賦形劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物，豬圓環(huán)病毒抗原 可以包含至少一種豬圓環(huán)病毒II型抗原。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案 中，螺桿菌抗原可以是但不限于，《e7/co6a"er ce油、i^/co6a"er
力e/'/邁a/32'/'或幽門:^^軒菌抗^^ 。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，豬圓環(huán)病毒II型抗原包含了保藏于 ECACC的選自下列的至少一種豬圓環(huán)病毒II型抗原豬圓環(huán)病毒II 型登記號(hào)V97100219、豬圓環(huán)病毒II型登記號(hào)V97100218、豬圓環(huán)病 毒II型登記號(hào)V97100217、豬圓環(huán)病毒II型登記號(hào)V98011608和豬 圓環(huán)病毒II型登記號(hào)V98011609。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，豬圓 環(huán)病毒II型抗原是減毒的豬圓環(huán)病毒II型病毒或滅活的豬圓環(huán)病毒 II型，或可以包含由豬圓環(huán)病毒II型可讀框(ORF)編碼的抗原，所 述ORF選自O(shè)RFs 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12和13。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案進(jìn)一步包含獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑和非必需 的凍干穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，螺桿菌抗原可以是 cciT/o抗原。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，豬圓環(huán)病毒II型抗原可以包含含 有且在體內(nèi)表達(dá)由豬圓環(huán)病毒II型可讀框(ORF)編碼的抗原的載體， 所述ORF選自O(shè)RFs 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12和13。 在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，載體選自DNA質(zhì)粒、線性DNA分子和重 組病毒。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，重組病毒可以選自豬皰疹病毒、 豬腺病毒和痘病毒。
重組病毒可以選自但不限于，Aujesky病病毒、痘苗病毒、禽痘 病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒。
本發(fā)明的螺桿菌抗原可以選自但不限于，減毒的螺桿菌菌林、滅
活的螺桿菌菌林、螺桿菌菌林亞單位，并且其中豬圓環(huán)病毒抗原選自
減毒的豬圓環(huán)病毒、滅活的豬圓環(huán)病毒、豬圓環(huán)病毒亞單位，和包含
且在體內(nèi)表達(dá)編碼豬圓環(huán)病毒抗原的核酸分子且選自DNA質(zhì)粒、線性
DNA分子和重組病毒的載體；以及非必需的其它豬病原體的抗原。本
發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)一步包含其它豬病原體的其它抗原。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其它豬病原體的其它抗原選自PRRS
病毒抗原、豬肺炎枝原體抗原、胸膜肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗
原、萎縮性鼻炎抗原、豬Ot皰疹病毒I型抗原、豬霍亂抗原、豬流行 性感冒抗原及其組合。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，豬圓環(huán)病毒抗原 包含多種豬圓環(huán)病毒抗原。
本發(fā)明的另 一方面是用于誘導(dǎo)針對(duì)螺桿菌菌株和豬圓環(huán)病毒的免 疫應(yīng)答的方法，其包括給豬施用免疫原性組合物。
本發(fā)明的再一方面是用于制備包含至少一種螺桿菌抗原和至少一
種豬圓環(huán)病毒抗原的免疫原性組合物的試劑盒，其中(i)和(ii)分 開包裝。在本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，豬圓環(huán)病毒抗原包 含至少一種豬圓環(huán)病毒II型抗原。
當(dāng)結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的下列詳細(xì)描述時(shí)可以更充分地理解本發(fā) 明的這些以及其他方面和特征。
應(yīng)當(dāng)注意在本公開內(nèi)容中以及特別在權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語(yǔ) 例如"包含"可以具有在美國(guó)專利法中對(duì)其認(rèn)定的含義；例如它們可 以意指"包括，，；并且此類術(shù)語(yǔ)如"基本上由……組成"具有在美國(guó) 專利法中歸于其的含義，例如它們涵蓋未明確敘述的元件，但排除在 現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)或影響本發(fā)明的基本或新穎特征的元件。
附圖簡(jiǎn)述
作為例子給出，但不希望將本發(fā)明限制于描述的具體實(shí)施方案的 下列詳細(xì)描述，可以與引入本文作為參考的附圖結(jié)合理解，其中


圖1顯示了 PCVII 412的圖示，顯示了可讀框的位置。
圖2A-2C顯示了 PCVII 412基因組的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )。 顯示了有義和反義鏈。對(duì)應(yīng)各個(gè)ORF的翻譯產(chǎn)物的氛基酸序列同樣顯 示如下ORF 1 (SEQ ID NO: 3) ; ORF 2 ( SEQ ID NO: 9) ; ORF 3 (SEQ ID NO: 7) ; ORF 4 (SEQ ID NO: 20) ; ORF 5 (SEQ ID NO: 21 );和ORF 6 (SEQ ID NO: 5)。
圖3A- 3D顯示了來(lái)自PCVII 412的可讀框與從PK15細(xì)胞分離的 PCVI的可讀框的氨基酸序列比較。圖3A顯示了與來(lái)自PCVI的相應(yīng)ORF (底部行，SEQ ID NO: 4)比較的PCVII 412的ORF 1 (頂部行，SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列。圖3B顯示了與來(lái)自PCVI的相應(yīng)ORF (底部行，SEQIDNO: 6 )比較的PCVII 412的ORF 6 (頂部行，SEQ ID NO: 5)的氨基酸序列。圖3C顯示了與來(lái)自PCVI的相應(yīng)ORF(底部行，SEQ ID NO: 8)比較的PCVII 412的ORF 3 (頂部行，SEQ ID NO: 7)的 氨基酸序列。圖3D顯示了與來(lái)自PCVI的相應(yīng)ORF(底部行，SEQ IDNO: 10)比較的PCVII 412的ORF 2 (頂部行，SEQ ID NO: 9)的氨基酸 序列。
圖4A-4B顯示了各種PCV分離林的核苷酸序列比較來(lái)自PK15 細(xì)胞的PCVI (SEQ ID NO: 2) 、 PCVII 412 (SEQ ID NO: 1) 、 PCVII 9741 (SEQ ID NO: 11)和PCVII B9 (SEQ ID NO: 12)。
圖5顯示了用于檢測(cè)PCV感染的多重PCR結(jié)果。該測(cè)定法鑒定PCV 感染并區(qū)分PCVI和PCVII的存在。泳道l是分子量標(biāo)記。泳道2-4 是按照PCVII、 PCVI和陰性順序的對(duì)照。泳道5-13是從來(lái)自受PMWS
侵襲獸群的仔豬收集的血液樣品。
圖6顯示了對(duì)來(lái)自受PMWS侵襲仔豬的各種組織樣品進(jìn)行的多重 PCR結(jié)果。兩行中的泳道1是分子量標(biāo)記。頂部行中的泳道2是陽(yáng)性 PCVII對(duì)照，而泳道3是陰性對(duì)照。其余泳道是從受PMWS侵襲仔豬收 集的各種組織樣品。
種未鑒定的螺桿菌物種比較的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。
圖8顯示了豬圓環(huán)病毒毒林PCVI1 1010的核苷酸序列(SEQ IDNO:
24)
圖9顯示了豬圓環(huán)病毒毒林PCVII 999的核苷酸序列(SEQ IDNO: 28 )。
圖IO顯示了豬圓環(huán)病毒毒林PCVII 999的優(yōu)化核苷酸序列(SEQ ID NO: 27)。
圖11顯示了豬圓環(huán)病毒毒株P(guān)CVII 1011-48121的核苷酸序列 (SEQ ID NO: 25 )。
圖12顯示了豬圓環(huán)病毒毒林PCVII 1011-48285的核苷酸序列 (SEQ ID NO: 26)。
圖13顯示了豬圓環(huán)病毒毒林PCVI1 1103的核苷酸序列(SEQ ID NO: 29)。
圖14顯示了豬圓環(huán)病毒毒林PCVII 1121的核苷酸序列(SEQ ID NO: 30)。
發(fā)明詳述
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用在本領(lǐng)域范圍內(nèi)的分子生物 學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn) 中充分說(shuō)明。參見，例如，Sambrook， Fritsch & Maniatis， #o/ecw/ar "由r"orr他廁/,第I、 II和III巻，第二版(1989 ); 細(xì)67膨'/7g，第I和II巻(D. N. Glover ed. 1985 ); 0//g歸c7eo"Ve 5y/2t力es/s (M. J. Gait ed. 1984 ) ; Jc/d ^r6r/f/2'zaf/an
(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984 ) ; 1r72'腳/ Cw"wre ".K. Freshney ed. 1986 ) ; i/ffiZ7c^///ze"e//"/7""z//z7es ( IRL press, 1986 ); Perbal， B.，」尸rac〃ca/67// e &船/eci/hr 67o/2/"g 廣1984 ); y^力ofl^f"z/邁o/o^r ( S. Colowick and N. Kaplan eds.， Academic Press ， Inc.) 系歹'J ; 和 ^a/7t/6o0ir o/* ^^er/邊e/^a/ //ZM7Mo/o^r，第I-IV巻(D. M. Weir和C. C. Blackwel 1 eds. ， 1986， Blackwell Scientific Publications)。
在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于具體DNA、多肽 序列或方法參數(shù)，因?yàn)檫@樣的事物當(dāng)然可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解本文使 用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的目的，并不希望是限制 性的。
本文自始至終使用下列氨基酸縮寫丙氨酸Ala (A);精氨酸 Arg (R);天冬酰胺Asn (N);天冬氨酸Asp (D);半胱氨酸 Cys (C);谷氨酰胺Gin (Q);谷氨酸Glu (E);甘氨酸Gly (G);組氨酸His(H);異亮氨酸lie (I);亮氨酸Leu (L); 賴氨酸Lys (K);甲硫氨酸Met (M);苯丙氨酸Phe ( F);脯 氨酸Pro (P);絲氨酸Ser ( S);蘇氨酸Thr (T);色氨酸 Trp (W);酪氨酸Tyr (Y);和纈氨酸Val (V)。
除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所 屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本文描述的那些相 似或等價(jià)的許多方法和材料可以在本發(fā)明實(shí)踐中使用，本文還是描述 了優(yōu)選材料和方法。
在本發(fā)明的描述中，將釆用下列術(shù)語(yǔ)并預(yù)期如下文指出的進(jìn)行定義。
術(shù)語(yǔ)"PCVII蛋白質(zhì)"、"PMWS蛋白質(zhì)"或編碼其的核苷酸序列 分別意指衍生于如本文描述的新型PCVII分離林的蛋白質(zhì)或核苷酸序 列。幾種PCVII分離林的核苷酸序列顯示于圖4A-4B中并且與6種鑒 定的PCVII ORF對(duì)應(yīng)的氨基酸序列顯示于圖2A-2C中。然而，如本文 定義的PCVII或PMWS蛋白質(zhì)，或編碼其的基因不限于描述的序列。
此外，如本文使用的，"衍生于"PCVII基因組的核苷酸序列或 其互補(bǔ)物指為了預(yù)期目的保留舉例說(shuō)明的多核苷酸的基本特性的序 列，表示它所來(lái)自的完整序列的一部分。此類衍生的具體而非限制性 例子為編碼相同或基本上相同的氨基酸序列，但由于密碼子簡(jiǎn)并采用 不同的特定密碼子的序列；另一個(gè)例子是與病毒DNA互補(bǔ)的序列。在 診斷測(cè)試中有用的探針或寡核苷酸需要保留所示序列的互補(bǔ)性但可以 比完整序列更短或可以省略其部分。然而，對(duì)于在處理或表達(dá)中的使 用，核苷酸變化通常是希望的，以制備或刪除限制性位點(diǎn)、提供加工 位點(diǎn)、或以不會(huì)不利地影響功能的方式改變編碼的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ) "核苷酸序列"和"多核苷酸"指核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸序列， 且包括基因組鏈及其互補(bǔ)序列。
"衍生于"包含PCVII分離林基因組的核苷酸序列的序列因此指 包含對(duì)應(yīng)基因組核苷酸序列(或其互補(bǔ)物)區(qū)域或以本領(lǐng)域已知方式 修飾與其預(yù)期用途一致的那種序列的區(qū)域組合的序列的序列。當(dāng)然這
些序列無(wú)需在物理上來(lái)源于基因的核苷酸序列，還指基于多核苷酸所 來(lái)自的區(qū)域中的堿基序列提供的信息、以不管怎樣的方式產(chǎn)生的多核 苷酸。例如， 一般DNA序列所來(lái)自的區(qū)域包括編碼特定表位的區(qū)域。 類似地，"衍生于"PCVII ORF的肽指基本上等同于這些多肽或其部分、具有與那種部分相同的生物學(xué)特性的氨基酸序列。
此外，衍生的蛋白質(zhì)或核苷酸序列無(wú)需在物理上衍生于上文描述 的基因，還可以以任何方式產(chǎn)生，包括例如，基于本文提供的信息的
化學(xué)合成、分離(例如，從PCVII分離林中)或通過重組生產(chǎn)。另外，
該術(shù)語(yǔ)意指具有與該基因編碼的連續(xù)氨基酸序列基本上同源(如下文 定義的)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其顯示免疫學(xué)活性。
因此，該術(shù)語(yǔ)意指全長(zhǎng)以及免疫原性、截短的和部分序列，以及 蛋白質(zhì)的活性類似物和前體形式。該術(shù)語(yǔ)還包括特定基因的核苷酸片
段，其包括基因的至少約8個(gè)連續(xù)堿基對(duì)、更優(yōu)選至少約10-20個(gè)連 續(xù)堿基對(duì)，且甚至至少約25 - 50個(gè)或75個(gè)或更多個(gè)連續(xù)堿基對(duì)。如 下文更充分討論的，此類片段在診斷方法中用作探針，和用于蛋白質(zhì) 的重組生產(chǎn)。
該術(shù)語(yǔ)還包括中性形式或堿或酸加成鹽形式的蛋白質(zhì)，取決于制 備方式。此類酸加成鹽可以涉及游離氨基并且堿性鹽可以由游離羧基 形成。藥學(xué)可接受的堿和酸加成鹽在下文進(jìn)一步討論。另外，蛋白質(zhì) 可以通過與其他生物材料例如脂質(zhì)和糖類組合，或通過側(cè)鏈修飾例如 氨基的乙酰化，羥基側(cè)鏈的磷酸化，巰基的氧化，氨基酸殘基的糖基 化，以及編碼的一級(jí)序列的其他修飾進(jìn)行修飾。
該術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步涉及序列的缺失、添加和置換，只要多肽起作用以 產(chǎn)生如本文定義的免疫應(yīng)答。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選的置換一般將是在 性質(zhì)上保守的，即，在氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些置換。例如，氨基酸 一般分成4個(gè)家族(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2 )堿性-賴 氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電的極 性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪 氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)分類為芳香族氨基酸?？珊侠?地預(yù)言用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)替換亮氨酸，或反之亦然；用谷氨酸 單獨(dú)替換天冬氨酸，或反之亦然；用絲氨酸單獨(dú)替換蘇氨酸，或反之 亦然；或使用結(jié)構(gòu)上相關(guān)氨基酸的類似氨基酸保守替換，對(duì)生物活性將沒有較大的影響。具有與參考分子基本上相同的氨基酸序列但具有 基本上不影響蛋白質(zhì)免疫原性的較小氨基酸置換的蛋白質(zhì)因此在參考 多肽的定義內(nèi)。
"可讀框"或"ORF"是編碼多肽的多核苷酸序列的區(qū)域。 "斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征"或"PMWS"指脊推動(dòng)物特別是豬 的疾病，其臨床特征在于體重逐步減輕、呼吸急促、呼吸困難和黃疰。 一致的病理學(xué)變化包括淋巴細(xì)胞至肉芽腫間質(zhì)性肺炎，淋巴結(jié)病以及 較罕見的淋巴細(xì)胞至肉芽腫性肝炎和腎炎。參見，例如，Clark， E. G. 戶roc. 」ssoc. ^^//2e戶rscL 1997: 499—501;和Harding, J.戶/"oc. 無(wú) J^oc 5W"e ra". 1997: 503。
"分離的"核酸分子是從完整生物分開且離散的核酸分子，其中 該核酸分子在自然界中存在于該生物中；或完全或部分地缺乏在自然 界中通常與其結(jié)合的序列的核酸分子；或在自然界中存在但具有與其 結(jié)合的異源序列(如下文定義的)的序列。
術(shù)語(yǔ)"疫苗組合物"意指包含抗原的任何藥物組合物，所述組合 物可以用于預(yù)防或治療受試者中的疾病或病狀。該術(shù)語(yǔ)因此涵蓋了如 下文所述的亞單位疫苗，以及包含完整的被殺死、減毒、或滅活微生 物的纟且合物。
"亞單位疫苗組合物"指包含至少一種免疫原性多肽但不是全部 抗原的組合物，所述多肽和抗原來(lái)源于來(lái)自目的病原體的抗原或與其 同源。此類組合物基本上不含完整的病原體細(xì)胞或顆粒，或此類細(xì)胞 或顆粒的裂解物。因此，"亞單位疫苗組合物，，由來(lái)自病原體的至少 部分純化的(優(yōu)選基本上純化的)免疫原性多肽，或其重組類似物制
多肽的亞單位抗原或目的抗原。
本發(fā)明的組合物可以包括本領(lǐng)域已知的任何藥學(xué)可接受的載體。 術(shù)語(yǔ)"表位"指抗原或半抗原上特異性B細(xì)胞和/或T細(xì)胞對(duì)其應(yīng) 答的位點(diǎn)。該術(shù)語(yǔ)還可與"抗原決定簇"或"抗原決定簇位點(diǎn)"互換 使用。識(shí)別相同表位的抗體可以在顯示一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原結(jié)合的能力的簡(jiǎn)單免疫測(cè)定法中鑒定。
針對(duì)組合物或疫苗的"免疫應(yīng)答"是在宿主中針對(duì)目的組合物或 疫苗產(chǎn)生的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常地，"免疫應(yīng)答"包
括但不限于下列效應(yīng)中的一種或多種特異性針對(duì)目的組合物或疫苗 中包括的一種或多種抗原產(chǎn)生的抗體、B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、抑制 性T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或y 5 T細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主將顯 示治療或保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而使得增強(qiáng)對(duì)于新感染的抵抗力和/或減 少疾病的臨床嚴(yán)重度。此類保護(hù)將通過受感染宿主通常顯示的癥狀的 減少或缺乏，更快的恢復(fù)時(shí)間和/或受感染宿主中病毒滴度的降低來(lái)證 明。
術(shù)語(yǔ)"免疫原性"蛋白質(zhì)或多肽指誘發(fā)如上所述的免疫應(yīng)答的氨 基酸序列。如本文使用的，"免疫原性"蛋白質(zhì)或多肽包括蛋白質(zhì)的 全長(zhǎng)序列、其類似物、或其免疫原性片段。"免疫原性片段"指包括 一種或多種表位并因此誘發(fā)如上所述的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)片段。此類 片段可以使用本領(lǐng)域眾所周知的任何數(shù)目的表位作圖技術(shù)進(jìn)行鑒定。 參見,例如,f/7"o/7e他j7/7/'/7g尸rofoco7s in Methods in Molecular Biology,第66巻(Glenn E. Morris, Ed. ， 1996 ) H畫na Press, Totowa， N. J。例如，線性表位可以通過例如在固體載體上同時(shí)合成對(duì) 應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的部分的大量肽，并當(dāng)肽仍附著至載體的時(shí)候使肽與 抗體反應(yīng)來(lái)測(cè)定。此類技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且在例如全部整體引入 本文作為參考的美國(guó)專利號(hào)4， 708， 871; Geysen等人，(1984 )/Voc.
JcaA ^S^^l: 3998—4002; Geysen等人，(1986 )#o7ec. T/z7邁u/70人11: 709-715中描述。類似地，構(gòu)象表位通過測(cè)定氨基酸的 立體構(gòu)象容易地鑒定，例如通過X射線晶體學(xué)和二維核磁共振。參見， 例如Epitope Mapping Protocols, 同上。
合成抗原也包括在該定義內(nèi)，例如，多表位、側(cè)翼表位(flanking epitopes),以及其他重組或合成來(lái)源的抗原。參見，例如，Bergmann 等人，(1993 ) ^/幾/. T/z7邁Mf /. 11: 2777—2781; Bergmann等人， (1996 )/. //zm 〃"oA 1^2: 3242-3249; Suhrbier， A. ( 1997 )/邁7z7z;/70厶 s/2"e//脅A 21: 402-408; Gardner等人，(1998 ) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3， 1998。
用于本發(fā)明目的的免疫原性片段通常將包括分子的至少約3個(gè)氨 基酸，優(yōu)選至少約5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少約10-15個(gè)氨基酸，且最 優(yōu)選25或更多個(gè)氨基酸。對(duì)于片段的長(zhǎng)度沒有臨界上限，它可以包含 幾乎全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)序列，或甚至包含蛋白質(zhì)的2個(gè)或更多個(gè)表位的融 合蛋白。
上述免疫原性蛋白質(zhì)、免疫原性多肽、合成抗原、或免疫原性片 段中的任何一種可以用于在宿主中產(chǎn)生抗體。
"天然"蛋白質(zhì)或多肽指從蛋白質(zhì)天然存在的來(lái)源分離的蛋白質(zhì) 或多肽。"重組"多肽指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生；即從由編碼所需多 肽的外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。"合成"多肽是通過化 學(xué)合成制備的那些。
"載體"是另一種DNA區(qū)段可以與其附著的復(fù)制子，例如質(zhì)粒、 噬菌體、或粘粒，以便產(chǎn)生附著區(qū)段的復(fù)制。
DNA "編碼序列"或"編碼特定蛋白質(zhì)的核苷酸序列，，是在合適的 調(diào)節(jié)元件控制下在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的DNA序列。編碼序 列的邊界由5'(氨基)末端上的起始密碼子和3'(羧基)末端上的翻 譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括但不限于，原核序列、來(lái)自真 核mRNA的cDNA、來(lái)自真核(例如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列， 和甚至是合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常將位于編碼序列的3'。
DNA "控制元件"總的來(lái)說(shuō)指啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸 化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、增強(qiáng)子等，其共同使編碼 序列在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。并非所有這些控制序列必須始終存在 于重組載體中，只要所需基因能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯。
"可操作地連接，，指其中這樣描述的組分被配置以便執(zhí)行其通常 功能的元件排列。因此，與編碼序列可操作地連接的控制元件能夠?qū)?現(xiàn)編碼序列的表達(dá)?？刂圃槐嘏c編碼序列鄰接，只要它們起作用 以指導(dǎo)其表達(dá)。因此，例如，插入的不翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列可以存在于
啟動(dòng)子和編碼序列之間并且啟動(dòng)子仍可視為與編碼序列"可操作地連 接，，。
控制元件例如啟動(dòng)子，"指導(dǎo)編碼序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄"，當(dāng)RNA 聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子并將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí)，所述mRNA隨后翻譯 成由編碼序列編碼的多肽。
"宿主細(xì)胞"是已由外源核酸分子轉(zhuǎn)化或能夠由外源核酸分子轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞。
當(dāng)外源DNA已引入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，細(xì)胞已由此類外源DNA "轉(zhuǎn)化"。 外源DNA可以整合(共價(jià)連接)或不整合到構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體 DNA內(nèi)。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以維持在游離元件 例如質(zhì)粒上。就真核細(xì)胞而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是其中外源DNA已整 合到染色體內(nèi)從而使得它通過染色體復(fù)制由子細(xì)胞遺傳的細(xì)胞。這種 穩(wěn)定性通過真核細(xì)胞建立包含含有外源DNA的子細(xì)胞群體的細(xì)胞系或 克隆的能力證實(shí)。
"同源性"指2種多核苷酸或2種多肽之間的同一性百分比。當(dāng) 序列在限定的分子長(zhǎng)度上顯示至少約80% - 85% ,優(yōu)選至少約90% , 且最優(yōu)選至少約95% -98%的序列同一性時(shí)，2種DNA或2種多肽序 列互相是"基本上同源的"。如本文使用的，基本上同源還指顯示與 特定DM或多肽序列具有完全同一性的序列。同一性百分比可以通過 直接比較2個(gè)分子之間的序列信息來(lái)測(cè)定，即通過序列比對(duì)，計(jì)數(shù)2 個(gè)比對(duì)序列之間的確切匹配數(shù)目，除以較短序列的長(zhǎng)度，并將結(jié)果乘 以100。容易獲得的計(jì)算機(jī)程序可以用于幫助分析，例如ALIGN, Dayhoff ， M. 0. in爿〃as o/*戶rofe/i7 5^we"ce a/ d 57rw"i/re M. 0. Dayhoff ed. ， 5 Suppl. 353-358， National biomedical Research Foundation, Washington, D. C.，其修改了用于肽分析的Smith和 Waterman (1981) M 場(chǎng)/.淑力.482-489的局部同源 性算法。用于測(cè)定核苷酸序列同一性的程序在Wisconsin Sequence Analysis Package, 版本8 (從Genetics Computer Group, Madison, Wis.可獲得)中可獲得，例如BESTFIT、 FASTA和GAP程序，其同樣依賴于Smith和Waterman的算法。這些程序可由制造商推薦以及上文提 及的Wisconsin Sequence Analysis Package中描述的缺省參數(shù)而容 易地使用。
可替代地，同源性可以通過多核苷酸在形成同源區(qū)之間的穩(wěn)定雙 鏈體的條件下雜交，隨后用單鏈特異性核酸酶消化，以及消化片段的 大小測(cè)定來(lái)測(cè)定。基本上同源的DNA序列可以在DNA雜交實(shí)驗(yàn)中在例 如對(duì)于那種特定系統(tǒng)定義的嚴(yán)格條件下鑒定。合適雜交條件的確定在 本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。參見，例如，Sambrook等人，同上；DNA Cloning,同 上；Nucleic Acid Hybridization, 同上。
2種核酸片段視為可與多核苷酸"選擇性雜交"，如果在下列條 件下它們能夠與核酸或其變體(例如，與PCVII核酸雜交但不與來(lái)自 圓環(huán)病毒科的其他成員的多核苷酸雜交的探針)特異性雜交或特異性 啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(i )在如Sambrook等人，同上和Nucleic Acid Hybridization,同上，中所述的一般雜交和洗滌條件下，(ii)使用 允許最多約25 - 30 %堿基對(duì)錯(cuò)配的降低的嚴(yán)格性洗滌條件，例如2x SSC， 0. 1%SDS,室溫2次，每次30分鐘；隨后2x SSC， 0.1%SDS, 37°C1次，30分鐘；隨后2 x SSC室溫2次，每次10分鐘，或(iii ) 選擇在標(biāo)準(zhǔn)條件下用于在一般聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR )中使用的引物(例 如在Saiki，等人，(1988 ) 5^/e/ ce l旦487-491中描述)，這導(dǎo) 致PCVII或其變體序列的特異性擴(kuò)增。
術(shù)語(yǔ)"功能性等價(jià)"意指蛋白質(zhì)的氨基酸序列是與參考氨基酸序 列或其免疫原性部分誘發(fā)的應(yīng)答比較，將誘發(fā)基本上等價(jià)或增強(qiáng)的如 上文定義的免疫應(yīng)答的序列。
DNA構(gòu)建體的"異源"區(qū)是在另一種DNA分子內(nèi)或與另一種DNA 分子附著的DNA可鑒別區(qū)段，所述區(qū)段在自然條件下不與該另 一種DNA 分子結(jié)合。因此，當(dāng)異源區(qū)編碼病毒基因時(shí)，基因通常將位于在來(lái)源 病毒基因組中不位于病毒基因側(cè)面的DNA側(cè)面。異源編碼序列的另一 個(gè)例子是其中編碼序列自身在自然界中未發(fā)現(xiàn)(例如，具有不同于天 然基因的密碼子的合成序列)的構(gòu)建體。等位基因變異或天然存在的
突變事件不產(chǎn)生如本文使用的DNA異源區(qū)。
術(shù)語(yǔ)"治療"如本文使用的指(i)防止感染或再感染(預(yù)防)， 或(ii )減少或消除目的疾病的癥狀(治療)。
如本文使用的，"生物樣品，，指從受試者中分離的組織或流體樣 品，包括但不限于，例如，血液，血漿，血清，糞便物，尿，骨髓， 膽汁，脊髓液，淋巴組織和淋巴液，皮膚樣品，皮膚、呼吸器官、腸 和生殖泌尿道的外分泌物，眼淚，唾液，乳汁，血細(xì)胞，器官，組織 活檢樣品，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)成分的樣品，包括但不限于，由培養(yǎng)基 中的細(xì)胞和組織生長(zhǎng)產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基，例如，重組細(xì)胞和細(xì)胞組分。
如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"和"可檢測(cè)標(biāo)記"指能夠檢測(cè)的分 子，包括但不限于，放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光物、酶、酶底 物、酶輔助因子、酶抑制劑、發(fā)色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、 配體(例如生物素或半抗原)等。術(shù)語(yǔ)"熒光劑，，指能夠顯示在可檢
測(cè)范圍內(nèi)的熒光的物質(zhì)或其部分?？梢栽诒景l(fā)明中使用的標(biāo)記的具體 例子包括熒光素、羅丹明、丹?；?、傘形酮、得克薩斯紅、魯米諾、 NADPH和a - p -半乳糖苷酶。
"脊推動(dòng)物受試者，，指脊索動(dòng)物(cordata )亞門的任何成員，包 括但不限于，哺乳動(dòng)物例如牛、綿羊、豬、山羊、馬和人；馴養(yǎng)動(dòng)物 例如狗和貓；以及鳥類，包括馴養(yǎng)、野生和獵鳥，例如公雞和母雞包 括小雞、火雞及其他鵓雞類鳥。該術(shù)語(yǔ)不指明特定年齡。因此，預(yù)期 包含成年和新生動(dòng)物，以及胚胎。
本發(fā)明的一個(gè)方面是從受PMWS侵襲的豬中分離的、本文中稱為 "PCVir，的新圓環(huán)病毒的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的有用材料和方法經(jīng)由核苷酸 序列家族的發(fā)現(xiàn)而變得可能，所述核苷酸序列各自包含新型PCVII病 毒的完整基因組。這種多核苷酸家族的可用性首先允許分離由于小異 質(zhì)性而不同的基因組家族的其他成員。其次，它允許構(gòu)建在診斷中有 用的DNA片段和蛋白質(zhì)。例如，至少約8-10個(gè)核苷酸或更多的寡聚 物，優(yōu)選包含至少約15 - 20個(gè)核苷酸的寡聚物在疾病診斷中用作雜交 探針。此類探針可以用于檢測(cè)例如懷疑含有病毒的受試者血清中病毒基因組的存在。類似地，編碼蛋白質(zhì)的基因可以進(jìn)行克隆并用于設(shè)計(jì) 探針以檢測(cè)和分離其他病毒分離抹中的同源基因。
pcvii序列還允許設(shè)計(jì)和生產(chǎn)pcvii特異性多肽，該多肽用作關(guān)
于針對(duì)血清或血液中的pcvn產(chǎn)生的抗體存在的診斷反應(yīng)物。針對(duì)這 些多肽的抗體還用作診斷劑。因?yàn)閹追N可讀框可以在完整基因組的背 景下譯解，所以可以推導(dǎo)出pcvn相關(guān)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。最后，基 因序列的了解還使得能夠設(shè)計(jì)和生產(chǎn)有效對(duì)抗pcvii的疫苗并因此用 于預(yù)防pmws以及用于產(chǎn)生保護(hù)性抗體。
從基因組可獲得的測(cè)序信息允許推導(dǎo)由病毒基因組編碼的各種多
肽的氨基酸序列并鑒定合適的表位。由pcvii基因組中鑒定的幾個(gè)orf
的片段產(chǎn)生，從而使用重組技術(shù)提供所需多肽。原核和真核宿主都可 用于此類表達(dá)。短多肽片段還可以是化學(xué)合成的并連接至載體蛋白用 于作為疫苗使用。此外，可以生產(chǎn)與賦予免疫原性的蛋白質(zhì)連接的表 位。因此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)其自身可以用作疫苗，或者可以用于在宿主中
誘導(dǎo)免疫活性b細(xì)胞，所述b細(xì)胞隨后可以用于生產(chǎn)分泌在被動(dòng)免疫
治療中有用的抗體的雜交瘤。
更具體而言，圖4a-4b中顯示了關(guān)于pcvii的3種分離林-pcvii 412 (seq id no: 1) 、 pcvii 9741 ( seq id no: 11)和pcvii b9
(seqidn0: 12)的完整遺傳序列。各種pcvii分離林中的核苷酸序 列同源性百分比超過99%同一性。新近發(fā)現(xiàn)的病毒基因組與從受感染 pk15細(xì)胞中分離的pcv (本文中稱為"pcvr )在核苷酸水平上分享 大約76%的同一性。如實(shí)施例中進(jìn)一步描述的，核苷酸插入和缺失
(indels)已在3個(gè)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)。
如圖1中所示，新病毒包含編碼包含超過50個(gè)氨基酸殘基的蛋白 質(zhì)的至少6個(gè)可能的可讀框(0rf)，而從pk15獲得的pcvi具有7 個(gè)可能的0rf。代表性pcvii分離林的orf存在于下列核苷酸位置上
(使用圖4a-4b中所示的pcvii分離林的編號(hào))0rf 1， 51 - 992; 0rf 2, 671 - 360; 0rf 3， 565 - 389; 0rf4， 553 - 729; 0rf5, 1016
-1174;和0RF6， 1735 - 1037。圖2A - 2C中顯示了由6個(gè)ORF編碼 的多肽。
ORF可以相對(duì)于Impl010毒林進(jìn)行限定。本發(fā)明還包含了在任何 其他PCVII毒林，以及如本文或本文引用的文件中定義的任何PCVII 毒林中的相應(yīng)0RF的用途。因此，使用標(biāo)準(zhǔn)軟件例如MacVector⑧由基 因組核苷酸序列確定ORF是常規(guī)技術(shù)。同樣地，與1010毒林的基因組另一種毒林(例如，WO-A-99 18214中公開的那些，例如Imp 1008、 Imp 1011-48121、 Imp 1011-48285、 Imp 999，以及新毒林1103和1121 ) 的基因組上的0RF。使用軟件或進(jìn)行比對(duì)不需要過度的實(shí)驗(yàn)法并且直 接提供等價(jià)0RF。
在本發(fā)明實(shí)踐中同樣等價(jià)和有用的是不會(huì)改變考慮的基因的功能 性和毒林特異性(例如2型毒林)或這種基因編碼的多肽的那些核苷
酸序列。由于密碼簡(jiǎn)并而不同的序列當(dāng)然包括在本發(fā)明實(shí)踐中。
PCVII的主要細(xì)胞乾是外周血中的單核細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞，盡 管該病毒同樣在受感染動(dòng)物的各種組織和器官中發(fā)現(xiàn)。受感染的巨噬 細(xì)胞失去其正常功能，引起宿主免疫系統(tǒng)的損害，導(dǎo)致死亡。
新型圓環(huán)病毒的克隆和測(cè)序已提供了關(guān)于PMWS的致病因子的信 息。如上文說(shuō)明的，測(cè)序信息以及克隆及其基因產(chǎn)物對(duì)于診斷和疫苗 開發(fā)有用。特別地，PCR和基于抗體的診斷方法在疾病的診斷中有用 并且在本文中用于特異性鑒定和區(qū)分這種新型PCVII病毒與來(lái)源于持 續(xù)感染的PK15細(xì)胞的PCVI。測(cè)序信息還在特異性引物設(shè)計(jì)中有用， 以表達(dá)病毒特異性基因產(chǎn)物、研究病毒結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生特異性抗體和鑒定 豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病中的毒性基因。
PCVII的新病毒基因組由從受PMWS侵襲豬的組織中分離的病毒獲 得。病毒DNA從各種來(lái)源提取，包括受感染的Dulac和Vero細(xì)胞團(tuán)塊， 外周血棕黃層細(xì)胞，來(lái)自受感染動(dòng)物的組織和血清。使用實(shí)施例中更 充分討論的技術(shù)從樣品中提取DNA。
通過比較圓環(huán)病毒科的已知病毒中的序列和結(jié)構(gòu)相似性，利用保 守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)獨(dú)特引物。隨后進(jìn)行單引物PCR并克隆 產(chǎn)物。以不同方向插入質(zhì)粒栽體內(nèi)的2種全長(zhǎng)病毒基因組在2個(gè)方向 上完全測(cè)序。制備并測(cè)序另外的PCR產(chǎn)物以確保引物/莖環(huán)區(qū)的保真 度。
使用類似引物，獲得其他PCVII分離林，包括PCVII 9741和PCVII B9。所得到的序列在本文中提供，并且完整序列或其任何部分同樣可 以使用合成方法、或通過包含部分序列檢索的合成方法組合使用類似 于本文描述的那些的方法來(lái)制備。
PCVII基因組序列的可用性允許構(gòu)建編碼來(lái)源于PCVII基因組的 病毒多肽及其抗原活性區(qū)域的表達(dá)栽體。編碼所需蛋白質(zhì)的片段可以 使用常規(guī)限制性消化由cDNA克隆獲得、或通過合成方法獲得，并且連 接到例如包含融合序列例如p-半乳糖苷酶部分的載體內(nèi)。包含可讀框 的PCVII基因組的任何所需部分可以作為重組蛋白質(zhì)例如成熟或融合 蛋白獲得，或可以由化學(xué)合成或一般重組方法提供。
顯而易見的是由上述DNA序列編碼的PCVII蛋白質(zhì)、來(lái)源于其的 活性片段、類似物和嵌合蛋白質(zhì)可以通過各種方法產(chǎn)生。重組產(chǎn)物可 以采取部分蛋白質(zhì)序列、全長(zhǎng)序列的形式，包括信號(hào)序列的前體形式， 不含信號(hào)的成熟形式，或甚至是融合蛋白(例如，包含對(duì)于重組宿主 合適的前導(dǎo)序列，或包含關(guān)于其它病原體的其它亞單位抗原序列)。
可以構(gòu)建基因文庫(kù)并將所得到的克隆用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。 集落可以合并且使用針對(duì)PCVII蛋白質(zhì)的多克隆血清或單克隆抗體進(jìn) 行篩選。
可替代地， 一旦測(cè)定氨基酸序列，就可以制備包含編碼所測(cè)定氨 基酸序列部分的密碼子的寡核苷酸探針并用于在基因組或cDNA文庫(kù) 中篩選編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因。用于制備寡核苷酸探針和DNA文庫(kù)， 及其通過核酸雜交的篩選的基本策略是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知 的。參見，例如，DNA Cloning:第I巻，同上；Nucleic Acid Hybridization,同上；Oligonucleotide Synthesis,同上；Sambrook 等人，同上。 一旦來(lái)自篩選文庫(kù)的克隆已通過陽(yáng)性雜交鑒定，就可以
通過限制性酶分析和DNA測(cè)序證實(shí)特定文庫(kù)插入物包含PCVII蛋白質(zhì) 基因或其同系物?；螂S后可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)一步分離，并且適當(dāng) 時(shí)，使用PCR方法或限制性內(nèi)切酶刪除全長(zhǎng)序列的部分。
類似地，基因可以使用已知技術(shù)例如苯酚提取直接從病毒中分離， 并且序列進(jìn)一步處理以產(chǎn)生任何所需改變。關(guān)于用于獲得和分離病毒 DNA的技術(shù)描述，參見例如，本文的實(shí)施例以及Hamel等人，(1998 ) /, P7ro/. 21: 5262-5267。
可替代地，DNA序列可以合成制備而不是克隆。如果序列將在蛋 白質(zhì)生產(chǎn)中使用，那么可以設(shè)計(jì)具有對(duì)于特定氨基酸序列合適的密碼 子的DNA序列。 一般而言，如果序列將用于表達(dá)，那么將選擇預(yù)期宿 主的偏愛密碼子。全序列由通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備并裝配成完整編碼序列 的重疊寡核苷酸裝配。參見，例如，Edge ( 1981 ) Nature 292: 756; Nambair等人，(1984 ) 5We腳223: 1299; Jay等人,(1984 )/. 腸7. C力e瓜，6311。
一旦所需蛋白質(zhì)的編碼序列已制備或分離，它們就可以克隆到任 何合適的載體或復(fù)制子內(nèi)。眾多克隆栽體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的， 并且合適的克隆載體的選擇僅是挑選的問題。用于克隆的重組DNA載 體以及它們可以轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的例子包括噬菌體(大腸桿菌)、 pBR322 (大腸桿菌)、pACYC177 (大腸桿菌)、pKT230 (革蘭氏陰性 菌)、pGV1106 (革蘭氏陰性菌)、pLAFRl (革蘭氏陰性菌)、pME290 (非大腸桿菌的革蘭氏陰性菌)、PHV14 (大腸桿菌和枯草芽孢桿菌 (&c//7^ w6〃7/s) ) 、 pBD9 (芽孢桿菌(Sac/'7/ws) ) 、 pIJ61 (鏈霉菌(S"e;^o邁7ces) ) 、 pUC6 (鏈霉菌)、YIp5 (糖酵母 (^2"力ar0yz77ces) ) 、 YCpl9 (糖酵母)和牛乳頭瘤病毒(哺乳動(dòng)物 細(xì)胞)。參見，Sambrook等人，同上；C7o/2/"g，同上；B. Perbal， 同上。
基因可以置于啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(對(duì)于細(xì)菌表達(dá))和任選 地操縱子(本文統(tǒng)稱為"控制"元件)的控制下，從而使得編碼所需 蛋白質(zhì)的DNA序列在通過包含這種表達(dá)構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞
中轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼序列可以含有或不含信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。如果包 括信號(hào)序列，那么它可以是天然的同源序列、或異源序列。前導(dǎo)序列 可以通過宿主在翻譯后加工中去除。參見，例如，美國(guó)專利號(hào) 4,431,739; 4,425,437; 4， 338， 397。
其他調(diào)節(jié)序列也可能是希望的，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 蛋白質(zhì)序列的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且例子包 括響應(yīng)化學(xué)或物理刺激(包括在調(diào)節(jié)化合物的存在下)，導(dǎo)致基因表 達(dá)開啟或關(guān)閉的那些。其他類型的調(diào)節(jié)元件也可以存在于載體中，例 如增強(qiáng)子序列。
控制序列和其他調(diào)節(jié)序列可以在插入到載體例如上文所述的克隆 載體之前與編碼序列連接?？商娲兀幋a序列可以直接克隆到已包
含控制序列和合適的限制性位點(diǎn)的表達(dá)栽體內(nèi)。
在某些情況下可能必須修飾編碼序列，從而使得它可以以合適方 向連接至控制序列；即，以維持正確可讀框。還可能希望生產(chǎn)所需 PCVII蛋白質(zhì)的突變體或類似物。突變體或類似物可以通過下列制備 刪除編碼蛋白質(zhì)的序列的部分，插入序列，和/或置換序列內(nèi)的一個(gè)或 多個(gè)核苷酸。用于修飾核苷酸序列的技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變，在例如 Sambrook等人，同上；"W "o"http://7g ，同上；A^"eic」"V
好^T2V/z"/加，同上，中描述。
表達(dá)載體隨后用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是
本領(lǐng)域已知的且包括從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)可獲得的永 生細(xì)胞系，例如但不限于，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、 幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如Hep G2) 、 Mandin-Darby牛腎("MDBK，，)細(xì)胞、以及其他。類似地，細(xì) 菌宿主例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌屬將在本表達(dá)構(gòu)建體中 發(fā)現(xiàn)用途。在本發(fā)明中有用的酵母宿主包括釀酒酵母(^cc力ar^z^ces ce，/s/ae)、白色念珠菌(Ca/^ a "Wc謹(jǐn))、麥芽糖假絲酵母 (Ca刀^2Va歷a"c^a)、 多形漢遜酵母(〃a/7se/2"7a ; o/jB/ar/7力a )、 脆壁克魯維酵母(/7z/7^ r咖/ces /Vap7")、乳酸克魯維酵母
(i7w/Fero/z yces /ac〃s)、季氏畢赤酵母(？/cA/a ^////eW邁and//)、 巴斯德畢赤酵母(？/c力/a w〃or")、 粟酒裂殖酵母
(5^力/zo《acc力aro/z yces / o/z 6e ) 和解月旨耶氏酵母(尸srro『/a h> 77〃ca)。用于與桿狀病毒表達(dá)載體一起使用的昆蟲細(xì)胞包括埃 及伊蚊(ae^7/7〃)、苜蓿銀紋夜蛾(J"o^Tfl/^ ￡\9//尸0,/7/"<2)、 家香(/z7or/)、，繁、腹果錄(ProsopA/Za /zze/a/70《asfer)、草 地貪夜域(S/7C^o/^era )和粉紋夜械(7r/c力o/7/z;s/a刀/)。
取決于選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)通過在能表達(dá)目
蛋白質(zhì)隨后從宿主細(xì)胞中分離并純化。如果表達(dá)系統(tǒng)將蛋白質(zhì)分泌到 生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)，那么蛋白質(zhì)可以直接從培養(yǎng)基中純化。如果蛋白質(zhì)不 是分泌的，那么它從細(xì)胞裂解物中分離。合適的生長(zhǎng)條件和回收方法 的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以通過化學(xué)合成例如固相肽合成使用已知的 氨基酸序列或來(lái)源于目的基因的DNA序列的氨基酸序列來(lái)生產(chǎn)。此類 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。關(guān)于固相肽合成技術(shù)參見例如，J. M. Stewart和J. D. Young, 5W/d戶力ase戶e/^油5^/^力eWs， 2nd Ed.， Pierce Chemical Co. , Rockford, IL. ( 1984 )以及G. Barany和R. B. Merrifield， f力e戶e;^/des.' 1na/j^/s, 5y"f力es/s，》/o/c^7， editors E. Gross和J. Meienhofer, 第2巻，Academic Press, New York, ( 1980 ),第3-254頁(yè)；關(guān)于傳統(tǒng)溶液合成參見M. Bodansky, /V//2c/;77es of尸e; f/de 5y"^ es2's, Springer—Verlag， Berlin( 1984 ) 以及E. Gross和J. Meienhofer, Eds. ， 77 e尸ep〃des.' Ans/ys/s， Sy/^Aes/^ 同上，第1巻。如果所述抗原的小片段能夠在目
的受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，那么肽的化學(xué)合成可能是優(yōu)選的。
基因組分析顯示存在至少6個(gè)可讀框，其中至少一個(gè)編碼假定的 DM復(fù)制酶基因。
肽的抗原區(qū)一般相對(duì)較小，長(zhǎng)度一般為IO個(gè)氨基酸或更小。少至 5個(gè)氨基酸的片段一般可以表征抗原區(qū)。因此，使用PCVII的基因組作為基礎(chǔ)，來(lái)源于PCVII各個(gè)ORF中的任何一個(gè)，例如0RF1-6,且 特別是0RF 6，并且編碼多肽的短區(qū)段的DNA可以重組表達(dá)為融合蛋 白或分離的肽。另外，短氨基酸序列可以化學(xué)合成。在其中合成的肽 適當(dāng)構(gòu)建以便提供正確表位但又太小而不能是免疫原的情況下，肽可 以連接至合適栽體。
用于獲得此類鍵的許多技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括使用從Pierce Company, Rockford, IL獲得的N-琥珀酸亞胺基-3-( 2-吡咬基-石危代) 丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亞胺基4- (N-馬來(lái)酰亞胺基-甲基)環(huán)己烷 -l-羧酸酯(SMCC)形成二硫鍵。(如果肽缺少巰基，那么這可以通過 添加半胱氨酸殘基來(lái)提供。)這些反應(yīng)物在其自身和一種蛋白質(zhì)上的 肽半胱氨酸殘基之間產(chǎn)生二硫鍵，并通過另 一種蛋白質(zhì)中的賴氨酸上 的e-氨基，或其他游離氨基產(chǎn)生酰胺鍵。各種此類二硫化物/酰胺形 成劑是已知的。參見，例如，WeK. ( 1982 ) 185。其他雙 功能偶聯(lián)劑形成硫醚而不是二硫鍵。這些硫醚形成劑中的許多是商購(gòu) 可得的并且包括6-馬來(lái)酰亞胺基己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-馬來(lái)酰亞胺基-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸等的活性酯類。羧基可以通過將 其與琥珀酰亞胺或l-羥基-2-硝基-4-磺酸，鈉鹽組合來(lái)活化。前述名 單并不意味著是窮舉性的，并且無(wú)疑可以使用指定化合物的變體。
可以使用其自身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)宿主有害的抗體的任何載體，例如 各種血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
當(dāng)綴合物注射到合適受試者內(nèi)時(shí)將導(dǎo)致產(chǎn)生包含免疫球蛋白的抗 血清，所述免疫球蛋白不僅特定反應(yīng)性針對(duì)綴合物，還針對(duì)攜帶序列 的類似部分的融合蛋白，并針對(duì)整個(gè)PCVII內(nèi)的合適決定簇。
由本發(fā)明的新型病毒編碼的蛋白質(zhì)或其片段可以用于生產(chǎn)多克隆 和單克隆抗體。如果多克隆抗體是需要的，那么選擇的哺乳動(dòng)物(例 如，小鼠、兔、山羊、馬等)用本發(fā)明的抗原、或其片段、或突變抗 原免疫。收集來(lái)自免疫動(dòng)物的血清并根據(jù)已知操作處理。參見，例如， Jurgens等人，(1985 ) /. C力r咖.，363-370。如果使用包含多 克隆抗體的血清，那么多克隆抗體可以通過免疫親和層析使用已知操
作進(jìn)行純化。
針對(duì)蛋白質(zhì)及其片段的單克隆抗體同樣可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容 易地生產(chǎn)。通過使用雜交瘤技術(shù)用于制備單克隆抗體的一般方法是眾 所周知的。永生的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系可以通過細(xì)胞融合，以及通過其他
技術(shù)例如用致癌性DNA直接轉(zhuǎn)化、或用EB病毒轉(zhuǎn)染B淋巴細(xì)胞進(jìn)行制 備。參見，命J:i口， M. Schreier等人，^/6r/^ 邁a rec力力/^/es ( 1980 ); Hammerling等人，#o/20c/c>/7<3 7 Afl〃60d2'es a/ d 炒&r2V0/^
(1981); Ke腸tt等人，M 羅/麵"/7〃6ocT/es ( 1980 );還參見 美國(guó)專利號(hào)4， 341， 761; 4， 399， 121 ; 4, 427, 783 ; 4,444,887 ; 4,452,570; 4,466, 917; 4， 472，500， 4,491,632;和4， 493， 890?？?以篩選針對(duì)所需蛋白質(zhì)或其片段產(chǎn)生的單克隆抗體組的各種特性；即， 同種型、表位、親和力等。使用免疫親和技術(shù)，單克隆抗體在它們針 對(duì)的相應(yīng)抗原的純化中有用。多克隆和單克隆抗體也可以用于被動(dòng)免 疫接種或可以與亞單位疫苗制劑組合以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。多克隆和單克 隆抗體同樣對(duì)于診斷目的是有用的。
本發(fā)明的新型病毒蛋白質(zhì)可以單獨(dú)或與其他抗原組合配制到疫苗 組合物中用于在如下所述的受試者免疫中使用。制備此類制劑的方法 在例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edition, 1990中描述。 一般 地，本發(fā)明的疫苗制備為可注射的，作為液體溶液或懸浮液。還可以 制備在注射之前適合于制成液體媒介物中的溶液或懸浮液的固體形 式。制劑還可以是乳化的或活性成分可以包裝在脂質(zhì)體媒介物中。活 性免疫原性成分一般與相容的藥學(xué)媒介物例如水、鹽水、葡萄糖、甘 油、乙醇等及其組合混合。另外，需要時(shí)，媒介物可以包含較小量的 輔助物質(zhì)例如濕潤(rùn)或乳化劑和pH緩沖劑。
增強(qiáng)疫苗功效的佐劑也可以加入制劑中。此類佐劑包括但不限于， 由鋁鹽(鋁)形成的佐劑，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；水包 油和油包水型乳劑制劑，例如完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑
(IFA)、阿夫立定和二甲基雙十八烷基渙化銨(DDA);由細(xì)菌細(xì)胞壁組分形成的佐劑，例如佐劑包括單磷酰脂質(zhì)A (MPL) (Imoto等人， (1985 ) 7W. Ze". li: 1545-1548 )、海藻糖二霉菌酸酯(TDM) 和細(xì)胞壁骨架(CWS);來(lái)源于ADP-核糖基化的細(xì)菌毒素的佐劑，例 如來(lái)源于白喉毒素(例如，CRM197，無(wú)毒的白喉毒素突變體(參見，例 :i口Bixler等人，(1989fjrp. 251: 175;和Constant ino
等人，(1992 ) Vaccine )、百日咳毒素(PT )、霍亂毒素(CT )、大 腸桿菌熱敏毒素(LT1和LT2)、假單胞菌(i^eWozz70/7^)內(nèi)毒素A、 肉毒梭菌(C. 6^"http:///2咖)C2和C3毒素，以及來(lái)自產(chǎn)氣莢膜桿菌(C. j er/V//^ei^) 、 C. ^7/r/尸or鵬和難辨梭菌(C. ^ 7Y7c//e)的毒素； 皂戒佐劑，例如Quil A (美國(guó)專利號(hào)5, 057, 540 )，或由皂甙產(chǎn)生的 顆粒例如ISC0Ms (免疫刺激復(fù)合物)；細(xì)胞因子，例如白介素(例如， IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-12等)，千擾素(例如， Y干擾素)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF) 等；胞壁酰肽例如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺 (thr-MDP) 、 N-乙酰-去胞壁酰(normuramyl ) -L-丙氨酰-D-異谷氨 酰胺(nor-MDP) 、 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨 酸-2- ( r -2' _二棕櫚酰-^2~甘油-3羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE ) 等；來(lái)源于CpG分子家族、CpG二核苷酸和包含CpG基序的合成寡核 苷酸(參見，例如，Krieg等人，Aa( 1995 ) Hi: 546和Davis 等人，/. J歷邁M0/, ( 1998 ) i^: 870-876 )的佐劑；以及合成佐劑， 例如PCPP(聚二(羧基苯氧基)磷腈)(Payne等人,「縱/腳(1998 ) i^: 92-98 )。此類佐劑是從許多經(jīng)銷商例如Accurate Chemicals; Ribi Immunechemicals， Hamilton, MT; GIBC0; Sigma, St. Louis， M0商購(gòu)可得的。
如上文說(shuō)明的，蛋白質(zhì)可以連接至載體以便增加其免疫原性。合 適的栽體包括大的代謝緩慢的大分子例如蛋白質(zhì)，包括血清白蛋白、 鑰孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白以及本領(lǐng) 域技術(shù)人員眾所周知的其他蛋白質(zhì)；多糖，例如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、 纖維素、纖維素珠等；聚氨基酸例如聚谷氨酸、聚賴氨酸等；氨基酸共聚物；和滅活的病毒顆粒。
蛋白質(zhì)可以以其天然形式使用，或者其官能團(tuán)內(nèi)含物可以通過例 如賴氨酸殘基的琥珀?；蚺cCys-硫內(nèi)酯反應(yīng)進(jìn)行修飾。巰基也可以 通過例如氨基官能團(tuán)與2-亞氨基塞吩(iminothiolane)或3- ( 4-二 硫代吡啶基)丙酸鹽的N-幾基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)摻入載體(或抗原) 內(nèi)。合適的載體也可以進(jìn)行修飾以摻入間隔臂(例如環(huán)己二胺或類似 大小的其他雙功能分子)用于附著肽。
關(guān)于本發(fā)明蛋白質(zhì)的其他合適載體包括如引入本文作為參考的美 國(guó)專利號(hào)5,071,651中公開的輪狀病毒的VP6多肽，或其功能片段。 還有用的是通過美國(guó)專利號(hào)4, 722,840中公開的方法制備的目的免疫 原和病毒蛋白質(zhì)的融合產(chǎn)物。再其他合適的載體包括細(xì)胞，例如淋巴 細(xì)胞，因?yàn)橐赃@種形式呈遞模擬受試者中引起免疫狀態(tài)的天然呈遞方 式?？商娲?，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以偶聯(lián)至紅細(xì)胞，優(yōu)選受試者自己 的紅細(xì)胞。將肽與蛋白質(zhì)或細(xì)胞偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
此外，蛋白質(zhì)可以以中性或鹽形式配制到疫苗組合物內(nèi)。藥學(xué)可 接受的鹽包括酸加成鹽(由活性多肽的游離氨基形成)以及由無(wú)機(jī)酸 例如鹽酸或磷酸，或此類有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形 成的。由游離羧基形成的鹽還可以來(lái)源于無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、鉀、 銨、鈣或鐵，以及此類有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組 氨酸、普魯卡因等。
疫苗制劑將包含"治療有效量"的活性成分，即，能夠在組合物 將施用的受試者中誘發(fā)免疫應(yīng)答的量。此類應(yīng)答將通過受感染宿主通 常顯示的癥狀的減少或缺乏和/或更快的恢復(fù)時(shí)間來(lái)證明。
確切量由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試容易地確定。蛋白質(zhì)濃度 一般將為組合物的1% -約95% (w/w),或適當(dāng)時(shí)再更高或更低。
為了免疫受試者，疫苗一般腸胃外通常通過肌內(nèi)注射施用。然而， 其他施用方式例如皮下、腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)注射也是可接受的。待施用 的量取決于待治療的動(dòng)物、動(dòng)物免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、以及所需 的保護(hù)程度。有效劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過確定劑量應(yīng)答
曲線的常規(guī)試驗(yàn)容易地確定。受試者通過施用至少1次劑量，且優(yōu)選
2次劑量的疫苗來(lái)免疫。此外，動(dòng)物可以施用維持針對(duì)感染的免疫狀 態(tài)所需的多次劑量。
適合于其他施用方式的另外的疫苗制劑包括栓劑，以及在某些情 況下的氣溶膠、鼻內(nèi)、口服制劑、和緩釋制劑。對(duì)于栓劑，媒介物組 合物將包括傳統(tǒng)的結(jié)合劑和載體，例如聚堿性乙二醇(polyalkaline glycol )或甘油三酸酯。此類松劑可以由包含約0. 5% -約10%(w/w)， 優(yōu)選約1% -約2%的活性成分的混合物形成?？诜浇槲锇ù祟愅?常使用的賦形劑如藥物級(jí)別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維 素糖精鈉、碳酸鎂等。這些口服疫苗組合物可以釆取溶液、懸浮液、 片劑、丸劑、膠嚢、緩釋制劑、或粉劑的形式，并且包含約10%-約 95%的活性成分，優(yōu)選約25% -約70o/o。
鼻內(nèi)制劑將通常包括既不會(huì)對(duì)鼻粘膜造成刺激也不會(huì)明顯干擾纖 毛功能的媒介物。稀釋劑例如水、鹽水或其他已知物質(zhì)可以由本發(fā)明 使用。鼻制劑還可以包含防腐劑例如但不限于，氯丁醇和苯扎氯銨。 可以存在表面活性劑以增強(qiáng)目的蛋白質(zhì)被鼻粘膜的吸收。
受控或緩釋制劑通過將蛋白質(zhì)摻入載體或媒介物內(nèi)來(lái)制備，所述 載體或媒介物為例如脂質(zhì)體、不可再吸收的不透性聚合物例如乙烯乙 酸乙烯酯共聚物和Hytrel⑧共聚物，可膨脹的聚合物例如水凝膠，或 可再吸收的聚合物例如膠原和某些多元酸或聚酯，例如用于制備可再 吸收的縫線的那些。蛋白質(zhì)還可以使用本領(lǐng)域眾所周知的植入的微型 泵遞送。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以經(jīng)由表達(dá)其的載體病毒施用。與本發(fā)明一 起使用的載體病毒包括但不限于痘苗及其他痘病毒、腺病毒和皰疹病 毒。例如，表達(dá)新型蛋白質(zhì)的重組痘苗病毒可以如下構(gòu)建。編碼特定 蛋白質(zhì)的DNA首先插入合適的載體內(nèi)，從而使得它鄰近痘苗啟動(dòng)子并 位于痘苗DNA序列側(cè)翼，例如編碼胸苷激酶(TK)的序列側(cè)翼。這種 載體隨后用于轉(zhuǎn)染同時(shí)感染痘苗的細(xì)胞。同源重組用于將痘苗啟動(dòng)子 和編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因插入病毒基因組內(nèi)。在5-溴脫氧尿苷的存
在下培養(yǎng)細(xì)胞并挑選對(duì)其有抗性的病毒斑可以選擇所得到的TK重組 體。
可替代的施用途徑涉及基因治療或核酸免疫接種。因此，編碼目 的蛋白質(zhì)的核苷酸序列(和伴隨的調(diào)節(jié)元件)可以直接施用于受試者 用于其體內(nèi)翻譯?？商娲?，離體轉(zhuǎn)染受試者細(xì)胞或組織并將轉(zhuǎn)化的 材料再引入宿主內(nèi)可以完成基因轉(zhuǎn)移。DNA可以直接引入宿主生物內(nèi)， 即，通過注射(參見美國(guó)專利號(hào)5, 580,859和5,589,466;國(guó)際乂>開 號(hào)WO 90/11092;以及Wolff等人，(1990 ) 5We腳247: 1465-1468 )。 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移還可以使用已知方法完成。參見，例如，美國(guó)
專利號(hào)5， 703， 055; Hazinski等人，(1991)」邁./. Ce/7淑. "y。厶丄206-209; Brigham等人，(1989 ) J瓜/. Sc/.，
278-281; Canonico等人，(1991) 67// . 1^: 219A;和Nabel
等人，(1990 ) Sc/e/2ce M: 1285-1288。靶向試劑例如針對(duì)特定細(xì) 胞類型上表達(dá)的表面抗原的抗體可以與脂質(zhì)體表面共價(jià)綴合，從而使 得核酸可以遞送至對(duì)感染敏感的特定組織和細(xì)胞。
如上文說(shuō)明的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以用作診斷劑以檢測(cè)生物樣 品中PCVII反應(yīng)性抗體的存在，以便確定PCVII感染的存在。例如， 與蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的存在可以使用標(biāo)準(zhǔn)電泳和免疫診斷技術(shù)進(jìn)行檢 測(cè)，包括免疫測(cè)定法例如竟?fàn)?、直接反?yīng)、或夾層型測(cè)定法。此類測(cè) 定法包括但不限于，蛋白質(zhì)印跡法；凝集測(cè)試；酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫 測(cè)定法，例如ELISAs;生物素/抗生物素蛋白型測(cè)定法；放射性免疫 測(cè)定法；免疫電泳法；免疫沉淀等。反應(yīng)一般包括顯示標(biāo)記例如熒光、 化學(xué)發(fā)光、放射性、酶標(biāo)記或染料分子，或用于檢測(cè)抗原以及與其反 應(yīng)的一種或多種抗體之間的復(fù)合物形成的其他方法。
上述測(cè)定法一般涉及液相中未結(jié)合的抗體與抗原-抗體復(fù)合物與 其結(jié)合的固相栽體的分離?？梢栽诒景l(fā)明實(shí)踐中使用的固體栽體包括 基質(zhì)例如硝酸纖維素(例如，以膜或微量滴定孔的形式)；聚氯乙稀 (例如，片或微量滴定孔)；聚苯乙烯膠乳(例如，珠或微量滴定板)； 聚偏氟乙烯；重氮化紙；尼龍膜；活化珠、磁性反應(yīng)珠等。
一般地，固體載體首先在合適的結(jié)合條件下與固相組分(例如，
一種或多種PCVII蛋白質(zhì))反應(yīng)，從而使得組分充分固定于載體。首
先將抗原與具有較佳結(jié)合特性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)有時(shí)可以增強(qiáng)抗原與載體 的固定。合適的偶聯(lián)蛋白包括但不限于，大分子例如血清白蛋白包括
牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋 白、卵白蛋白以及本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他蛋白質(zhì)。可以用于 使抗原結(jié)合載體的其他分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、 氨基酸共聚物等。此類分子以及將此類分子與抗原偶聯(lián)的方法是本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員眾所周知的。參見，例如，Brinkley， M. A. 5/oca yi^"e C力e瓜(1992 )上2-13; Hashida等人，/.A/oc力e瓜 (1984 )互56-63;以及Anjaneyulu和Staros， /"ter"a〃ona7/. o尸 尸e;^ide i^c^ej'/ ( 1987 ) 117—124。
固體栽體與固相組分反應(yīng)后，通過洗滌從載體中去除任何未固定
的固相組分，并且隨后在合適的結(jié)合條件下使載體結(jié)合組分與懷疑包 含配體部分(例如，針對(duì)固定抗原的抗體)的生物樣品接觸。洗滌以 去除任何未結(jié)合配體后，在合適的結(jié)合條件下加入次級(jí)結(jié)合劑部分， 其中所述次級(jí)結(jié)合劑能夠與結(jié)合配體選擇性結(jié)合。次級(jí)結(jié)合劑的存在 隨后可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
更具體而言，可以使用其中微量滴定板孔用所需蛋白質(zhì)包被的 ELISA法。隨后向包被孔中加入含有或懷疑含有抗蛋白質(zhì)免疫球蛋白 分子的生物樣品。足以允許抗體結(jié)合固定的抗原的孵育期后，可以洗 滌板以去除未結(jié)合部分并加入可檢測(cè)地標(biāo)記的次級(jí)結(jié)合分子。允許次 級(jí)結(jié)合分子與任何捕獲的樣品抗體反應(yīng)，洗滌板并使用本領(lǐng)域眾所周 知的方法檢測(cè)次級(jí)結(jié)合分子的存在。
因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，來(lái)自生物樣品的結(jié)合的抗-抗原配 體的存在可以使用包含針對(duì)抗體配體的抗體的次級(jí)結(jié)合劑容易地檢 測(cè)。許多抗豬免疫球蛋白(Ig)分子是本領(lǐng)域已知的，其可以使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法容易地綴合至可檢測(cè)的酶標(biāo)記，例如辣根過 氧化物酶、堿性磷酸酶或脲酶。合適的酶底物隨后用于產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。在其他相關(guān)實(shí)施方案中，竟?fàn)幮虴LISA技術(shù)可以使用本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的方法實(shí)行。
測(cè)定法還可以在溶液中進(jìn)行，從而使得蛋白質(zhì)和對(duì)那些蛋白質(zhì)特 異的抗體在導(dǎo)致沉淀的條件下形成復(fù)合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中， 蛋白質(zhì)可以使用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)技術(shù)，例如通過直接化學(xué)或間接偶 聯(lián)，附著至固相顆粒(例如，瓊脂糖珠等)?？乖坏念w粒隨后在 合適的結(jié)合條件下與懷疑含有針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體的生物樣品接觸。結(jié) 合抗體之間的交聯(lián)導(dǎo)致形成顆粒-抗原-抗體復(fù)合物聚集物，這可以沉 淀并使用洗滌和/或離心與樣品分開?？梢允褂帽姸鄻?biāo)準(zhǔn)方法中的任何 一種例如上文描述的那些免疫診斷方法分析反應(yīng)混合物，以確定抗體-抗原復(fù)合物的存在或缺乏
在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以提供免疫親和性基質(zhì)，其中來(lái)自 懷疑含有針對(duì)目的蛋白質(zhì)的抗體的生物樣品的多克隆抗體群體與基質(zhì) 固定。在這點(diǎn)上，可以使用固定抗原進(jìn)行樣品的最初親和純化。所得 到的樣品制劑因此將只包含抗PCVII部分，避免親和力載體中可能的 非特異性結(jié)合特性。以高產(chǎn)量和良好保留抗原結(jié)合活性的固定免疫球 蛋白(完整的或特異性片段)的眾多方法是本領(lǐng)域已知的。不受任何 具體方法的限制，固定的A蛋白或G蛋白可以用于固定免疫球蛋白。
因此， 一旦免疫球蛋白分子已固定以提供免疫親和性基質(zhì)，標(biāo)記 的蛋白質(zhì)就可以在合適的結(jié)合條件下與結(jié)合抗體接觸。任何非特異性 結(jié)合抗原已從免疫親和性載體洗涂后，結(jié)合抗原的存在可以通過使用 本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定標(biāo)記來(lái)確定。
另外，針對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體而不是蛋白質(zhì)本身可以在上述測(cè)定 法中使用，以便檢測(cè)給定樣品中針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體的存在。這些測(cè)定 法基本上如上所述進(jìn)行且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
此外，還可以進(jìn)行基于核酸的測(cè)定法。在這點(diǎn)上，使用公開的 PCVII核酸序列作為基礎(chǔ)，可以制備寡聚物用作雜交探針或PCR引物 以檢測(cè)例如來(lái)自懷疑含有病毒的受試者的生物樣品中病毒基因組的存 在。用于在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中使用的寡聚物長(zhǎng)度為大約8個(gè)核 苷酸或更多，優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約10 - 12個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度為至少 約15-20個(gè)核苷酸，且長(zhǎng)度至多50個(gè)或更多個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，寡 聚物來(lái)源于缺乏異質(zhì)性的病毒基因組區(qū)域。
寡聚物通過從基因組中切除，或重組或合成制備。例如，寡聚物 可以使用常規(guī)方法例如寡核苷酸自動(dòng)化合成法制備。
寡聚物可以在診斷測(cè)定法中用作探針。在代表性測(cè)定法中，處理 待分析的生物樣品以提取其中包含的核酸?？梢詫?duì)從樣品中獲得的核 酸實(shí)施凝膠電泳或其他大小分離技術(shù)。可替代地，核酸樣品可以無(wú)需 大小分離即可進(jìn)行點(diǎn)印跡。探針隨后用報(bào)道分子部分標(biāo)記。合適的標(biāo) 記以及用于標(biāo)記探針的方法是本領(lǐng)域已知的，且包括例如通過切口翻 譯或激酶作用(kinasing)摻入的放射性標(biāo)記、生物素、熒光探針和 化學(xué)發(fā)光探針。從樣品中提取的核酸隨后在合適嚴(yán)格性的雜交條件下 用標(biāo)記探針處理。
可以制備與靶向的PCVII基因序列完全互補(bǔ)的探針。然而，當(dāng)在 診斷測(cè)定法中使用較長(zhǎng)的探針時(shí)，互補(bǔ)性的程度可以較少。 一般地， 在測(cè)定方法中使用高嚴(yán)格性條件，特別是當(dāng)探針完全或高度互補(bǔ)時(shí)。 然而，當(dāng)靶向異質(zhì)性區(qū)域時(shí)應(yīng)當(dāng)使用嚴(yán)格性較低的條件。調(diào)整嚴(yán)格性 的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。此類調(diào)整在雜交和洗滌操作過程中進(jìn)行 并且包括溫度、離子強(qiáng)度、甲酰胺濃度和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)度的調(diào)整。這些 因素在例如Sambrook等人，同上，中概述。
在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，上述方法包括使用PCVII核酸特異 性探針，其中2種探針(引物)限定PCVII基因組的內(nèi)部區(qū)域。在這 個(gè)實(shí)施方案中，每種探針具有包含PCVII核酸內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的3'末端的 一條鏈。核酸/探針雜交復(fù)合物隨后通過引物延伸反應(yīng)轉(zhuǎn)換成包含雙鏈 探針的片段。包含探針的片段通過接連重復(fù)下列步驟來(lái)擴(kuò)增(i)使 雙鏈雙鏈探針的片段變性以產(chǎn)生單鏈片段，(ii )使單鏈與探針雜交 以形成鏈/探針復(fù)合物，(iii )在DNA聚合酶以及所有4種脫氧核糖 核苷酸的存在下由鏈/探針復(fù)合物產(chǎn)生雙鏈片段，和(iv)重復(fù)步驟(i ) 到(iii)直至已達(dá)到所需擴(kuò)增程度。擴(kuò)增產(chǎn)物隨后根據(jù)已建立的操作
鑒定。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括能夠與上述內(nèi)部區(qū)域但不與用于 擴(kuò)增的特異性探針/引物序列選擇性雜交的第三種多核苷酸探針。
PCR技術(shù)例如上述的那些是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，戶^W 戶rotoco/s.. J 6Wde to^"力o^1 fl/7d^/7//ca〃o力s( Academic Press ); /O"rac〃ca"/7/7roac力(IRL press ) ; Saiki等人，(1986 )淑yre 324: 163。
其他擴(kuò)增方法也可以在基于核酸的測(cè)定法中使用，例如連接酶鏈 反應(yīng)(LCR) 、 PCR、 Q-P復(fù)制酶等。
用于在本文中使用的其他測(cè)定法包括"Bio-Bridge"系統(tǒng)，其使 用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給核酸探針添加未修飾的3'-聚-dT-尾 (Enzo Biochem. Corp.)。帶聚dt-尾的探針與靶核苷酸序列雜交， 并隨后與生物素修飾的多聚A雜交。另外，EP 124221描述了 DNA雜 交測(cè)定法，其中分析物退火至與酶標(biāo)記的寡核苷酸互補(bǔ)的單鏈DNA探 針，并且所得到的加尾雙鏈體與酶標(biāo)記的寡核苷酸雜交。EP 204510 描述了 DNA雜交測(cè)定法，其中分析物DNA與具有尾例如聚-dT-尾的探 針接觸，具有與探針尾雜交的序列例如多聚A序列的擴(kuò)增鏈，并且其 能夠結(jié)合多條標(biāo)記鏈。該技術(shù)首先可以涉及血清中的靶PCVII序列如 上所述擴(kuò)增至大約1()6序列/ml。擴(kuò)增的序列隨后可以使用本領(lǐng)域已知 的雜交測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)。
此外，來(lái)源于PCVII病毒基因組的核酸序列還可以用于原位雜交 測(cè)定法。 一般地，此類測(cè)定法使用福爾馬林固定的細(xì)胞培養(yǎng)制劑或組 織，例如淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體、肝、肺、心臟、腎、胰腺、鼻曱、 大腸和小腸等。關(guān)于合適的原位雜交測(cè)定法的描述參見，例如， Sirinar認(rèn)itr等人，(1996 )/. P7ro厶淑力.149-160。
上述測(cè)定法的反應(yīng)物，包括蛋白質(zhì)、針對(duì)其的抗體或寡聚物可以 與合適的說(shuō)明書和其他必需的反應(yīng)物一起在試劑盒中提供，以便進(jìn)行 如上所述的免疫測(cè)定法。取決于使用的特定免疫測(cè)定法，試劑盒還可 以包含合適的標(biāo)記以及其他包裝的反應(yīng)物和材料(即，洗滌緩沖液等)。 標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定法，例如上文描述的那些，可以使用這些試劑盒進(jìn)行。
申請(qǐng)人已從位于加拿大、美國(guó)(California)和法國(guó)(Brittany) 的農(nóng)場(chǎng)獲得的肺或神經(jīng)節(jié)樣品中成功地分離了 5種PCV新毒林。這些 病毒已在具有PMWS綜合征的豬的病灶中檢測(cè)到，但在健康豬中則沒 有。另外，新型螺桿菌屬細(xì)菌物種已鑒定并發(fā)現(xiàn)位于患有胃食管潰瘍 的豬的胃和食管的粘膜表面之中和之上。 一種新型螺桿菌物種是A cer^ ，其與幽門螺桿菌緊密相關(guān)但不相同。
另外，申請(qǐng)人已測(cè)序了 PCV新毒林中4種的基因組，即從加拿大 和美國(guó)獲得的毒林以及2種法國(guó)毒林。毒林在核苷酸水平上互相顯示 出非常強(qiáng)的同源性，超過96%，并且與PK15毒林的同源性弱得多， 約76%。新毒林因此可以視為新類型豬圓環(huán)病毒(本文中稱為ii型) 的代表，i型由PK15代表。
5種毒林的純化制劑根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1997年10月2日星期 四以保藏號(hào)V97100219 (本文中稱為Imp. 1008PCV) ; V97100218 (本 文中稱為Imp.l010PCV) ; V97100217 (本文中稱為Imp. 999PCV); 并且于1998年1月16日星期五以保藏號(hào)V98011608 (本文中稱為 Imp. 1011-48285 );和V98011609 (本文中稱為Imp. 1011-48121 )保 藏于ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Culture ),應(yīng)用微生物和研究中心(Centre for Applied microbiology & Research) , PortonDown， Salisbury, Wi 1 tshire SP4 0JG, United Kingdom)。
PCVII毒林還從經(jīng)歷晚期流產(chǎn)和死產(chǎn)的農(nóng)場(chǎng)的一窩流產(chǎn)小豬中分 離。重癥彌漫性心肌炎存在于伴隨廣泛的PCVII抗原免疫組織化學(xué)染
色的i只小豬中。不同量的pcvii抗原還存在于多個(gè)胚胎的肝、肺和
腎中。與胎兒損傷和豬流產(chǎn)有關(guān)的其他因素包括豬細(xì)小病毒、豬繁殖 與呼吸綜合征病毒、腦心肌炎病毒和腸道病毒的存在無(wú)法確定。
從超過4周歲的30個(gè)高度健康的獸群獲得并在常規(guī)流產(chǎn)或繁殖失 敗的情況下測(cè)試的組織，在涉及幾只死產(chǎn)小豬和不能存活的新生兒的 2次提交物中對(duì)于PCVII是陽(yáng)性的，所述小豬呈現(xiàn)重癥彌漫性心肌炎、 心臟肥大和慢性被動(dòng)性充血的證據(jù)。2次陽(yáng)性提交物來(lái)自同一農(nóng)場(chǎng)，
但在2次不同的時(shí)間發(fā)生。受侵襲小豬的心臟及其他組織中的PCVII 通過免疫組織化學(xué)和病毒分離證實(shí)。在1999年前地方性傳染區(qū)域中繁 殖失敗的情況下無(wú)法檢測(cè)到豬圓環(huán)病毒支持了生殖疾病是PCVII感染
的新臨床表現(xiàn)的觀點(diǎn)，并進(jìn)一步暗示性傳播方式以及垂直傳播方式負(fù) 責(zé)豬群中的病毒散播。
因此，在如上所述的免疫接種程序表中用包括至少一種PCVII免 疫原(例如，來(lái)自在毒林Impl008、 Impl010、 Imp999、 Impl011-48285、 Impl011-48121、 1103和1121中選擇的至少一種毒林)的組合物(所 述組合物還可以包括來(lái)自至少一種其他豬病原體例如至少一種豬細(xì)小 病毒的至少一種免疫原，其中當(dāng)使用栽體時(shí)，載體可以共表達(dá)PCVII 免疫原和至少一種其他豬病原體例如螺桿菌物種的至少一種免疫原或
ppv免疫原)接種豬例如母豬，例如大母豬或小母豬，可以預(yù)防與pcvii 相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或子宮內(nèi)感染，以及斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭 綜合征和其他與pcvn相關(guān)的病理后遺癥。
因此，本發(fā)明包含了使用PCVII免疫原的方法和組合物，用于預(yù) 防與豬圓環(huán)病毒-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或子宮內(nèi)感染，以及與 PCVII相關(guān)的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征和其他病理后遺癥，以及對(duì) 抗其他感染例如螺桿菌物種。來(lái)自毒抹1103和/或毒林1121的免疫原
可以對(duì)使用pcvii免疫原的方法和組合物有用，用于預(yù)防與豬圓環(huán)病
毒-2相關(guān)的心肌炎和/或流產(chǎn)和/或子宮內(nèi)感染，并且可以根據(jù)本發(fā)明 與來(lái)源于螺桿菌物種優(yōu)選A cen/o的一種或多種免疫原組合。
pcvn免疫原可以是任何pcvii免疫原，包括任何表達(dá)pcvii的
包括下列中的任何一個(gè)或全部于1999年7月1日提交的美國(guó)申請(qǐng)序 列號(hào)09/347， 594，于1998年7月6日提交的法國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8 08777; 于1998年9月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)09/161， 092;于1998年5 月21日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)09/082,558;分別于1997年10月3 日、1998年1月22日和1998年3月20日提交的法國(guó)申請(qǐng)?zhí)?7 12382、98 00873和98 03707; W0-A-99 18214; Audonnet等人，和Bublot 等人的美國(guó)申請(qǐng)，于1999年6月10日提交的序列號(hào)分別為60/138， 352 和60/138, 478，以及分別于2000年5月31日和6月1日提交的序列 號(hào)09/586， 535和09/583， 545(分別為"DNA VACCINE-PCV"，和"PORCINE CIRCOVIRUS RECOMBINANT POXVIRUS VACCINE");以及W099/29717
考)。因此，包含PCVII免疫原的組合物，包括表達(dá)PCVII免疫原的 載體可以如本文引用的文件所述制備。
來(lái)自至少一種其他豬病原體的至少一種免疫原可以如上述或本文 引用的專利或文獻(xiàn)出版物(或其中引用的文件)中的任何一個(gè)中描述 的，或如已知豬疫苗或免疫原性組合物中使用的，或如1997年7月 15日提交的PCT/FR97/01313，于1998年1月29日/>開的WO 98/03658; 或于1996年7月19日提交的法國(guó)申請(qǐng)96 09338;或于1999年1月 15日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)09/232, 468 ( "POLYNUCLEOTIDE VACCINE FORMULA AGAINST PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY PATHOLOGIES")中所述。
本發(fā)明中使用的組合物中PCVII免疫原的量可以如上述或本文引 用的專利或文獻(xiàn)出版物(或其中引用的文件)中的任何一個(gè)中描述的。 并且，來(lái)自至少一種其他豬病原體的至少一種免疫原的量可以如上述 或本文引用的專利或文獻(xiàn)出版物(或其中引用的文件)中的任何一個(gè) 中描述的，或如已知豬疫苗或免疫原性組合物中使用的。
用于在本發(fā)明中使用的組合物可以依照獸醫(yī)學(xué)或藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù) 人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。此類組合物可以考慮到此類因素如豬 的年齡、性別、重量、狀況和具體治療以及施用途徑以獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的 技術(shù)人員眾所周知的劑量和技術(shù)施用。組合物可以單獨(dú)施用，或可以 與本發(fā)明的其他組合物(例如包含PCVII免疫原的其他組合物)或與 其他預(yù)防或治療組合物(例如，其他豬免疫原性或疫苗組合物) 一起 共施用或順次施用。因此，本發(fā)明還提供了多價(jià)或"混合(cocktail )" 或組合組合物，以及使用它們的方法。在這點(diǎn)上，可以參考美國(guó)專利號(hào)5, 843,456，所述專利引入本文作為參考且涉及狂犬病組合物和組 合組合物及其用途。
本發(fā)明的組合物可以用于腸胃外或粘膜施用，優(yōu)選通過皮內(nèi)或肌 內(nèi)途徑。特別對(duì)于皮內(nèi)途徑，注射可以使用無(wú)針注射器完成。當(dāng)使用 粘膜施用時(shí)，可以使用口、鼻或眼途徑。
在此類組合物中，免疫原可以與合適的載體、稀釋劑或賦形劑例 如無(wú)菌水、生理鹽水、葡萄糖等和/或優(yōu)選與佐劑混合。組合物還可以 是凍干或冷凍的。取決于施用途徑和所需制劑，組合物可以包含輔助 物質(zhì)例如pH緩沖劑、佐劑、防腐劑、用于粘膜途徑的聚合物賦形劑等。
可以使用由M. Powell和M. Newman, Plenum Press, 1995編輯 的 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"第147 頁(yè)上描述的SPT乳劑，以及同一本書的第183頁(yè)上描述的乳劑MF59。 例如包含佐劑的疫苗以下列方式制備包含免疫原的670/。v/v水相借 助于乳化葉輪式混合器在2. 3。/。w/v甘露醇酐油酸酯、2.6。/。w/v用11 EO(環(huán)氧乙烷)乙氧基化的油酸和28. l%v/v輕液體石蠟油(歐洲藥 典型)中乳化。
用于制備乳劑的可替代方法包括使混合物通過高壓勻漿器進(jìn)行乳 化，所述混合物包括5%w/v角鯊?fù)椤?. 5%w/vPluronic L121、 0.2 。/ow/v用20 E0乙氧基化的油酸和脫水山梨糖醇的酯、包含免疫原的 92. 3%v/v水相。
進(jìn)一步的佐劑例子是選自丙烯酸或曱基丙烯酸聚合物以及馬來(lái)酸 酐和烯基衍生物共聚物的化合物。有利的佐劑化合物是特別與糖或多 元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。這些化合物稱為 卡波姆(Phameuropa第8巻，No. 2， June 1996 )。本領(lǐng)域技術(shù)人員 還可以參考美國(guó)專利號(hào)2, 909,462 (引入本文作為參考)，其描述了 與含有至少3個(gè)羥基，優(yōu)選不超過8個(gè)的多羥基化合物交聯(lián)的此類丙 烯酸聚合物，其中至少3個(gè)羥基的氫原子由含有至少2個(gè)碳原子的不 飽和脂肪族基團(tuán)取代。優(yōu)選的基團(tuán)是含有2-4個(gè)碳原子的那些，例如 乙烯基、烯丙基和其他烯鍵型不飽和基團(tuán)。不飽和基團(tuán)其自身可以含
有其他取代基，例如甲基。以名稱Carbopol (BF—Goodrich, Ohio,
USA)出售的產(chǎn)品是特別合適的。它們是與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊
四醇交聯(lián)的。在它們中可以提及的是Carbopo1⑧974P、 934P和971P。
在馬來(lái)酸酐和烯基衍生物共聚物中，共聚物EMA ( Monsanto )是優(yōu)選
的，它是馬來(lái)酸酐和乙烯共聚物，線性或交聯(lián)的，例如與乙烯醚交聯(lián)
的?？梢詤⒖家氡疚淖鳛閰⒖嫉腏. Fields等人，Nature, 186:
778-780， 4 June 1960。
從其結(jié)構(gòu)觀點(diǎn)來(lái)看，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物以及共聚物EMA
優(yōu)選由下式的基本單位形成
<formula>complex formula see original document page 42</formula>
其中，R!和R2是相同或不同的，表示H或CH3; x == 0或1，優(yōu)選x =1;和y = 1或2，而x + y = 2。對(duì)于共聚物EMA ， x = 0和y = 2。對(duì)于卡波姆，x = y =1。
這些聚合物溶解于水中導(dǎo)致將優(yōu)選中和至生理學(xué)pH的酸性溶液， 以便產(chǎn)生免疫原性、免疫或疫苗組合物自身將摻入其中的佐劑溶液。 聚合物的羧基隨后部分為CO(T形式。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的佐劑特別是卡波姆的溶液在蒸餾水中優(yōu)選 在氯化鈉的存在下制備，獲得的溶液為酸性pH。這種貯存液通過將其 加入所需量(用于獲得所需最終濃度)或其基本部分的含有NaCl的水 中稀釋，優(yōu)選生理鹽水(NaCL 9 g/1)， 一次或分為幾個(gè)部分加入， 伴隨同時(shí)或隨后中和(pH 7.3-7.4)，優(yōu)選用Na0H。當(dāng)其用于與疫 苗混合時(shí)，將使用這種生理學(xué)pH的溶液，這可以特別以凍干、液體或 冷凍的形式貯存。
最終疫苗組合物中的聚合物濃度可以是0.01%-2%w/v，例如 0. 06 —l%w/v,例如0. 1 — 0. 6%w/v。
根據(jù)本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域的知識(shí)，無(wú)需過度實(shí)驗(yàn)，技術(shù)人員即可
選擇合適的佐劑(需要時(shí))以及其在根據(jù)本發(fā)明的免疫、免疫原性或
疫苗組合物中使用的量。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物可以與表達(dá)來(lái)自至少一種另 外豬病原體的至少一種免疫原或目的表位的至少一種活的減毒、滅活、
或亞單位疫苗，或重組疫苗(例如，作為載體或DNA質(zhì)粒的痘病毒) 組合。
本發(fā)明設(shè)想了用于各種施用途徑形式的組合物。并且再一次，有 效劑量和施用途徑通過已知因素例如年齡、性別、重量以及已知且不 需要過度實(shí)驗(yàn)的其他篩選操作確定。每種活性劑的劑量可以如本文引 用的文件所述的和/或可以為1或數(shù)微克-數(shù)百或數(shù)千微克，例如對(duì)于 亞單位免疫原性或疫苗組合物為1 fig-1 mg;和對(duì)于滅活的(滅活前 滴度)免疫原性或疫苗組合物為104-l(T TCID5。，有利地106-108 TCID5。。對(duì)于活的減毒免疫原性或疫苗組合物，劑量可以為1(T-108, 有利地1 03 - 1 06 TCIDs。。
重組體或栽體可以以合適的量施用，以獲得對(duì)應(yīng)本文和/或本文引 用的文件中所述劑量的體內(nèi)表達(dá)。例如，關(guān)于病毒懸浮液的合適范圍 可以以經(jīng)驗(yàn)確定。本發(fā)明中的病毒載體或重組體可以以每次劑量(例 如約2ral )約至少103 pfu的量施用于豬或感染或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)；更優(yōu) 選約104 pfu-約IO1。 pfu，例如約105 pfu-約109 pfu,例如約106 pfu -約10Spfu。并且，如果超過一種的基因產(chǎn)物由超過一種的重組體表 達(dá)，那么每種重組體可以以這些量施用；或者，每種重組體可以這樣 施用，使得組合地存在包含這些量的重組體的總和。
在本發(fā)明中使用的質(zhì)粒組合物中，劑量可以如本文引用文件中描 述或如本文描述的。例如，質(zhì)粒組合物中每種質(zhì)粒DNA的合適量可以 是l pg-2 nig,優(yōu)選50 jug-l fflg。技術(shù)人員可以參考關(guān)于DNA質(zhì)粒 載體的本文引用的文件以無(wú)需過度實(shí)驗(yàn)而確定用于本發(fā)明的DNA質(zhì)粒 載體組合物的其他合適劑量。
然而，誘發(fā)合適的免疫原應(yīng)答的組合物劑量、其中的組分濃度和施用組合物的時(shí)間選擇可以通過方法來(lái)確定，所述方法例如為血清抗
體滴定，例如ELISA和/或血清中和測(cè)定法分析和/或豬中的疫苗接種 攻擊評(píng)估。根據(jù)技術(shù)人員的知識(shí)、本公開內(nèi)容和本文引用的文件，此 類確定并不需要過度實(shí)驗(yàn)。并且，用于順次施用的時(shí)間可以類似地用 根據(jù)本公開內(nèi)容以及本領(lǐng)域知識(shí)可確定的方法無(wú)需過度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確 定。
PCVII免疫原可以由PCVII獲得、或可以由PCVII基因或其部分 或表位的體外重組表達(dá)獲得。螺桿菌免疫原可以由螺桿菌獲得、或可 以由螺桿菌基因或其部分或表位的體外重組表達(dá)獲得。用于制備和/ 或使用栽體(或重組體)進(jìn)行表達(dá)的方法可以通過下列中公開的方法 或類似方法完成美國(guó)專利號(hào)4,603,112、 4,769,330、 5, 174, 993、 5, 505, 941 、 5,338,683 、 5， 494， 807 、 4， 722， 848 、 5, 942, 235 、 5,364,773 、 5,762, 938 、 5, 770, 212 、 5, 942, 235 、 5,756,103 、 5,766,599 、 6, 004, 777 、 5,990,091 、 6, 033,904 、 5, 869, 312 、 5, 382, 425、 PCT/^開號(hào)W0 94/16716、 W0 96/39491、 W0 95/30018, Paoletti， Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1996 ) 93: 11341-11348， Smith等人，美國(guó)專利號(hào)4, 745, 051 (重組桿狀病毒),Richardson, C. D. (Editor) ， Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" ( 1995 Humana Press Inc. ) , Smith等人， (1983 ) Mol. Cell. Biol. ， 3: 2156-2165; Pennock等人，(1984 )， Mol. Cell. Biol. 4: 399—406; EPA 0 370 573,于1986年10月16 日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)920, 197， EP專利
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