專利名稱：產(chǎn)生l-蘇氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于發(fā)酵工業(yè)中的技術(shù)。更具體而言，本發(fā)明涉及通過使用
埃希氏菌屬C&c/zer/c/^)細(xì)菌的發(fā)酵有效產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法。L-蘇氨酸是必
需氨基酸之一，并且作為用于醫(yī)學(xué)目的的營養(yǎng)混合物中的成分是有用的。還 將其以多種方式使用作為動物飼料添加劑，和作為制藥工業(yè)和化學(xué)工業(yè)中的
反應(yīng)劑。
背景技術(shù)：
L-氨基酸例如L-蘇氨酸和L-異亮氨酸是通過使用產(chǎn)生氨基酸的細(xì)菌的發(fā) 酵以工業(yè)方法產(chǎn)生的，所述細(xì)菌例如具有產(chǎn)生這些L-氨基酸的能力的棒狀桿 菌型細(xì)菌(coryneform bacteria)或埃希氏菌屬細(xì)菌。作為這些產(chǎn)生氨基酸的細(xì) 菌，使用從自然界分離的細(xì)菌菌林或這些細(xì)菌菌抹的人工突變體。使用細(xì)菌 菌株的重組體以改進(jìn)生產(chǎn)力(productivity)，所述重組體中通過基因重組等增強(qiáng) 了 L-氨基酸生物合成酶。
具體而言，產(chǎn)生L-蘇氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌的突變菌抹是已知的，例如 6-二甲基氨基噪呤(6-dimethylaminopurine)抗性菌才朱(Japanese Patent Laid-open (Kokai) No. 5-304969)和疏螺旋體素(borrelidin)抗性菌抹(國際專利公開 WO98/04715)。使用重組埃希氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法是已知的，具 體而言在使用的菌抹中通過使用質(zhì)粒來擴(kuò)增蘇氨酸操縱子(US5,175,107),或 在使用的菌株中通過使用質(zhì)粒來擴(kuò)增磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸 酶基因(美國專利申請?zhí)?002/0110876)。
作為大腸桿菌中涉及L-蘇氨酸生物合成的酶的編碼基因，已知天冬氨酸 激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(aspartate semialdehyde dehydrogenase gene) (asd)、天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶基因(thrA)、高絲 氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)等。thrA、 thrB和thrC (thrABC) 構(gòu)成蘇氨酸操縱子。蘇氨酸操縱子形成弱化子結(jié)構(gòu)(attenuatorstructure),并且 其在培養(yǎng)基中的表達(dá)受異亮氨酸和蘇氨酸抑制。已知將此弱化區(qū)的前導(dǎo)序列
或弱化子從蘇氨酸操縱子去除時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)率得到改進(jìn)(美國專利號5,538,873, Biotechnology Letters, Vol. 24, No. 21, November 2002,和國際專利公開 WO05/049808)。
迄今為止，已經(jīng)開發(fā)的用于產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法包括使用分批培養(yǎng)， 其使用初始含有所有營養(yǎng)物的發(fā)酵罐；補(bǔ)料分批培養(yǎng)，其使用初始含有預(yù)定 營養(yǎng)物并且用一種或多種額外營養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料的發(fā)酵罐(美國專利號 5,538,873和歐洲專利號593792);和調(diào)節(jié)糖濃度的方法，從而使糖濃度保持 在預(yù)定水平或更低(國際專利公開WO05/014840和國際專利公開 WO05/014843)。此外，已開發(fā)的產(chǎn)生L-蘇氨酸的其它方法是對培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ) 料的方法，或向培養(yǎng)基添加營養(yǎng)物的方法，從而將磷酸和碳源作為生長限制 因子(美國專利號5,763,230)。
疏是細(xì)菌細(xì)胞生長的必需因子，并且通常以硫酸銨的形式包含在用于L-蘇氨酸發(fā)酵的培養(yǎng)基中。然而，就L-蘇氨酸的發(fā)酵產(chǎn)生而言，在發(fā)酵培養(yǎng)基 中調(diào)節(jié);s危濃度和降低辟"農(nóng)度的作用是未知的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供通過使用具有產(chǎn)生L-蘇氨酸的能力的埃希氏菌屬細(xì) 菌有效產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了勤勉地研究從而達(dá)到了前述目的。結(jié)果，本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的硫濃度能夠影響發(fā)酵結(jié)果，并且能夠通過調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基 中的硫濃度以使其保持在預(yù)定水平或更低來改進(jìn)發(fā)酵期間L-蘇氨酸的產(chǎn)率， 并且由此完成本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法，其包括在含有碳源、氮源 和硫源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生L-蘇氨酸的能力、屬于埃希氏菌屬的微 生物；和從培養(yǎng)物中收集L-蘇氨酸，其中調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的硫濃度以使其 處于預(yù)定水平或更低。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中調(diào)節(jié)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中 的硫濃度從而卩吏其為0.35 g/L或更低。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中對所述微生物中的L-蘇 氨酸生物合成酶進(jìn)行修飾，從而使該酶不受到L-蘇氨酸的反饋抑制。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述L-蘇氨酸生物合成
酶選自下組天冬氨酸激酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶和它們的組合。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述硫源選自下組硫
酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽和它們的組合。 本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述培養(yǎng)方法選自下組
分批培養(yǎng)方法、補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法和連續(xù)培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述培養(yǎng)方法是補(bǔ)料分 批培養(yǎng)方法或連續(xù)培養(yǎng)方法，其中將含有硫源的補(bǔ)料培養(yǎng)基添加至發(fā)酵罐中 的培養(yǎng)物。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)一步 含有碳源和具有生長促進(jìn)作用的營養(yǎng)物，并且其中將所述補(bǔ)料培養(yǎng)基連續(xù)地 或間歇地添加至發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物，從而使培養(yǎng)物中的碳源濃度在微生物的 對數(shù)生長結(jié)束之后保持在30 g/L或更低。
本發(fā)明的又一 目的是提供以發(fā)酵液為基礎(chǔ)產(chǎn)生動物飼料添加劑的方法， 其包括
A) 在包含碳源、氮源和硫源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生L-蘇氨酸的 能力、屬于埃希氏菌屬的微生物，
B) 進(jìn)行發(fā)酵，其中調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的硫濃度從而使其處于預(yù)定水平或 更低，
C) 將粗發(fā)酵液千燥至按重量計(jì)10%或更少的水含量。 附圖簡述


圖1顯示最初添加至培養(yǎng)基的硫的量和L-蘇氨酸產(chǎn)率之間的關(guān)系。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述 <1>本發(fā)明的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的方法是產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法，通過在含有碳源、氮源和^5克源的 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生L-蘇氨酸的能力、屬于埃希氏菌屬的微生物，從 而在培養(yǎng)基中將L-蘇氨酸產(chǎn)生，其中調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基中的硫濃度從而使其保 持在預(yù)定水平或更低。在本發(fā)明中，術(shù)語"硫濃度"的意思是依據(jù)硫原子濃 度的硫源濃度。
用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是任何培養(yǎng)基，只要其是含有碳源、氮源和硫 源作為營養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基，除了調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)基使其硫濃度保持在預(yù)定水 平或更低之外，對培養(yǎng)基不進(jìn)行具體限定。硫源可以是任何含硫來源。硫酸 的鹽，例如硫酸鹽、硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽，以及含硫氨基酸例如半胱氨酸、 胱氨酸和谷胱甘肽是理想的。在這些之中，硫酸銨是特別優(yōu)選的。不對鹽進(jìn) 行具體限定，并且可使用銨鹽、鈣鹽、鈉鹽、磷鹽、鎂鹽、錳鹽和鐵鹽。此 外，所述培養(yǎng)基可包含僅一類、或兩類或更多類的這些物質(zhì)。短語"預(yù)定水 平或更低"所表示的濃度可以是任何濃度，在該濃度L-蘇氨酸產(chǎn)率與在含有 大量硫的培養(yǎng)基中或常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)率相比得到改進(jìn)。具體而言，發(fā)
酵培養(yǎng)基中的硫濃度優(yōu)選為0.35 g/L或更低，更優(yōu)選0.25 g/L或更低，特別 優(yōu)選O.IO g/L或更低。本發(fā)明的特征之一是調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度。對 于本發(fā)明的方法，可使用分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和/或連續(xù)培養(yǎng)，并且可在 初始培養(yǎng)基中將培養(yǎng)基中的硫濃度調(diào)節(jié)至預(yù)定水平或更低，或可通過控制補(bǔ) 料培養(yǎng)基中的硫濃度或通過組合使用這些技術(shù)將培養(yǎng)基中的硫濃度限定在預(yù) 定水平或更低。對于初始培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基可使用相同的硫源，或補(bǔ)料培 養(yǎng)基中的硫源可不同于初始培養(yǎng)基中所使用的硫源。
在本發(fā)明中，補(bǔ)料分批培養(yǎng)指下述培養(yǎng)方法其中在培養(yǎng)期間將培養(yǎng)基 連續(xù)地或間歇地添加至容器中，并且在培養(yǎng)完成之前不從容器中取出 (w他draw)培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)指下述培養(yǎng)方法在培養(yǎng)期間連續(xù)地或間歇地將 培養(yǎng)基添加至容器中，并且從容器中提取培養(yǎng)基(通常而言，以等同于培養(yǎng)基 補(bǔ)料的量)。術(shù)語"初始培養(yǎng)基"的意思是在補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中，添 加補(bǔ)料培養(yǎng)基之前用于分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基；術(shù)語"補(bǔ)料培養(yǎng)基"的意思是在
進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，將提供至發(fā)酵罐的培養(yǎng)基。補(bǔ)料培養(yǎng)基可 包含微生物生長所必需的全部或部分成分。在本發(fā)明中，術(shù)語"發(fā)酵培養(yǎng)基" 的意思是包含在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基，并且從此發(fā)酵培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸。 此外，在本發(fā)明中，術(shù)語"發(fā)酵罐(fermenter)"的意思是在其中進(jìn)行L-蘇氨 酸發(fā)酵的容器，并且不限定其形狀?？墒褂冒l(fā)酵罐(fermentation tank)或小型 發(fā)酵罐(jar fermenter)。此外，只要能夠產(chǎn)生和收集L-蘇氨酸，不限定發(fā)酵罐 的容積。
雖然優(yōu)選在全部發(fā)酵過程中始終將硫濃度限定于預(yù)定水平或更低，但也 可僅在部分過程中對其進(jìn)行限定。例如，當(dāng)本發(fā)明的方法包括細(xì)胞增殖階段
(生長期)和L-蘇氨酸產(chǎn)生階段(L-蘇氨酸產(chǎn)生期)時(shí)，在L-蘇氨酸產(chǎn)生期將硫濃 度限定于預(yù)定水平或更低是足夠的。在生長期(細(xì)胞增殖期間)，硫可以以多于 預(yù)定的量存在于培養(yǎng)基中，或可將硫濃度限定于預(yù)定水平或更低。此外，在
產(chǎn)生L-蘇氨酸的階段中，硫含量無需在此階段的全部時(shí)間內(nèi)始終在前述范圍
內(nèi)，硫含量在該階段的早期可以在前述水平或更高，并且可隨著培養(yǎng)時(shí)間而
降低。此外，在硫不足(runshort)時(shí)，可將其間歇地添加。術(shù)語"生長期，，用 于本發(fā)明中的意思是自開始培養(yǎng)起3小時(shí)，優(yōu)選6小時(shí)，特別優(yōu)選10小時(shí)之 內(nèi)的時(shí)期，在這段時(shí)期中主要消耗碳源用于細(xì)菌細(xì)胞生長，即，細(xì)胞以對數(shù) 增殖。術(shù)語"L-蘇氨酸產(chǎn)生期"用于本發(fā)明中的意思是自開始培養(yǎng)起在最初3 小時(shí)，優(yōu)選6小時(shí)，特別優(yōu)選10小時(shí)之后的時(shí)期，在這段時(shí)期主要消耗碳源 用于L-蘇氨酸產(chǎn)生。
發(fā)酵培養(yǎng)基包含微生物生長所需的最小量的硫是足夠的；然而，疏的量 可能暫時(shí)不足。短語"不足，，的意思是與培養(yǎng)中較早的點(diǎn)相比，硫濃度降低， 并且甚至可能成為"0"。術(shù)語"暫時(shí)"的意思是，例如，^琉可能在相當(dāng)于全部 發(fā)酵時(shí)間的大約20%、大約40%或至多大約60%的時(shí)間內(nèi)不足。在^L不足的 時(shí)期內(nèi)，雖然濃度可以暫時(shí)為O,但是期望的是硫以1 (ig/L或更多、10嗎/L 或更多或100嗎/L或更多的濃度存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。因此，即使硫濃度暫 時(shí)成為O,對于任何時(shí)期的含硫培養(yǎng)基的培養(yǎng)均包含在以下表述之內(nèi)"在包 含碳源、氮源和硫源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于埃希氏菌屬的微生物"。培養(yǎng)基 中的硫濃度能夠通過離子層析方法和熱瓶方法(hot flask method)測量。
此外，根據(jù)本發(fā)明，在能夠使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)，可調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基中 的硫濃度從而將其限定于預(yù)定水平或更低。例如，通過使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)限 定硫濃度時(shí)，優(yōu)選將發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度控制在0.35 g/L或更低，理想的 是0.25g/L或更低，更理想的是0.10g/L或更低。
本發(fā)明中使用的碳源的實(shí)例包括糖，例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、 麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜(molasses)。葡萄糖和蔗糖是特 別優(yōu)選的。此外，有機(jī)酸例如乙酸和檸檬酸，和醇例如乙醇，也能夠單獨(dú)使 用或與其它碳源組合使用。此外，碳源的原料可以是蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高 級糖蜜(high test molasses)和柑橘類糖蜜(citrus molasses)，和天然原料如纖維 素、淀粉、玉米、谷物和木薯淀粉(tapioca)的水解物。此外，溶解在培養(yǎng)基中 的二氧化碳也能夠用作碳源。這些碳源能夠用在初始培養(yǎng)基中和/或補(bǔ)料培養(yǎng)
基中。培養(yǎng)基可包含這些碳源的一種或多種類型。此外，可將相同的碳源用 于初始培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基，或補(bǔ)料培養(yǎng)基的碳源可不同于初始培養(yǎng)基的碳 源。例如，可將葡萄糖用在初始培養(yǎng)基中，而將蔗糖用在補(bǔ)料培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明中使用的氮源的實(shí)例包括氨、銨鹽例如硫S臾銨、碳酸銨、氯化 銨、磷酸銨、乙酸銨和尿素、硝酸鹽等。用于調(diào)節(jié)pH的氨氣和氨水也能夠
用作氮源。此外，也能夠使用蛋白胨、酵母提取物、肉膏(meat extract)、麥芽 提取物(malt extract)、玉米漿(corn steep liquor)、大豆水解物等。培養(yǎng)基可包 含這些氮源的一種或多種類型。這些氮源也能夠用在初始培養(yǎng)基中和/或補(bǔ)料 培養(yǎng)基中。此外，可將相同的氮源用于初始培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基二者，并且 補(bǔ)料培養(yǎng)基的氮源可不同于初始培養(yǎng)基的氮源。
此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基除碳源、氮源和硫之外優(yōu)選還包含磷酸源。作為 磷酸源，能夠使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和磷酸聚合物例如焦磷酸。
此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基除碳源、氮源和硫之外可包含生長促進(jìn)因子(具有 生長促進(jìn)作用的營養(yǎng)物)。能夠使用的生長促進(jìn)因子包括痕量金屬、氨基酸、 維生素、脂肪酸、核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白 水解物。
痕量金屬的實(shí)例包括鐵、錳、鎂、鈣、鉀、鈉等。維生素的實(shí)例包括維 生素B,、維生素Bs、維生素B6、煙酸、煙酰胺、維生素B,2等?？蓪⑦@些生 長促進(jìn)因子包含在初始培養(yǎng)基中或補(bǔ)料培養(yǎng)基中。
此外，在使用其生長需要氨基酸等的營養(yǎng)缺陷突變體(auxotrophic mutant) 時(shí)，優(yōu)選將所需營養(yǎng)物添加至培養(yǎng)基。具體而言，因?yàn)樵谌缦滤瞿軌蛴糜?本發(fā)明的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌中，L-蘇氨酸生物合成途徑通常是增強(qiáng)的并且 L-蘇氨酸降解能力通常是減弱的，所以優(yōu)選添加L-賴氨酸、L-高絲氨酸、L-異亮氨酸、L-曱硫氨酸或它們的組合。
初始培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基可具有相同或不同的組成。此外，初始培養(yǎng)基 和補(bǔ)料培養(yǎng)基可具有相同或不同的硫濃度。此外，當(dāng)在多個(gè)階段添加補(bǔ)料培
養(yǎng)基時(shí)，在各個(gè)階段所添加的補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成可以是相同或不同的。
培養(yǎng)優(yōu)選在通氣條件下進(jìn)行，發(fā)酵溫度優(yōu)選在20至45°C，特別優(yōu)選在 33至42。C。優(yōu)選將氧濃度調(diào)節(jié)到5至50%,更優(yōu)選調(diào)節(jié)至大約10%。此外， 進(jìn)行通氣時(shí)優(yōu)選將pH調(diào)節(jié)到5至9。如果在培養(yǎng)期間pH降低，例如，可添 加碳酸4丐或堿例如氨氣和氨水以中和培養(yǎng)物。在這些條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)
選進(jìn)行大約10至120小時(shí)，可觀量的L-蘇氨酸積累于培養(yǎng)基中。只要能夠?qū)?L-蘇氨酸從培養(yǎng)基分離和收集，則對積累的L-蘇氨酸的濃度不進(jìn)行限定，并 且L-蘇氨酸的濃度為50 g/L或更高，理想的是75 g/L或更高，更理想的是 100g/L或更高。
在本發(fā)明中，微生物的培養(yǎng)可以通過種子培養(yǎng)(seed culture)和/或主培養(yǎng) (main culture)來進(jìn)行，以誘導(dǎo)高于一定水平的L-蘇氨酸積累。種子培養(yǎng)可通 過使用搖瓶等的搖動或通過分批培養(yǎng)來進(jìn)行。主培養(yǎng)可作為補(bǔ)料分批培養(yǎng)或 連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行?；蛘?，種子培養(yǎng)和主培養(yǎng)均可作為分批培養(yǎng)進(jìn)行。
在這些培養(yǎng)方法中，當(dāng)L-蘇氨酸濃度達(dá)到預(yù)定水平時(shí)，可取出一些發(fā)酵 液，并且可添加新鮮培養(yǎng)基以重復(fù)培養(yǎng)。作為新鮮培養(yǎng)基，包含碳源和具有 生長促進(jìn)作用的營養(yǎng)物(生長促進(jìn)因子)的培養(yǎng)基是優(yōu)選的，并且其優(yōu)選包含預(yù) 定濃度或更低的硫。表述"預(yù)定濃度或更低，，的意思是調(diào)節(jié)待添加的培養(yǎng)基 從而使發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度成為0.35 g/L或更低，理想的是0.25 g/L或更 低，更理想的是0.10g/L或更低。作為碳源，葡萄糖、蔗糖和果糖是優(yōu)選的。 作為生長促進(jìn)因子，氮源、磷酸、氨基酸等是優(yōu)選的。作為氮源，能夠使用 氨、銨鹽例如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷S交銨、乙酸銨和尿素、硝酸鹽等。 此外，作為磷酸源，能夠使用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。至于氨基酸，在使 用營養(yǎng)缺陷突變菌抹時(shí)，優(yōu)選補(bǔ)充以所需的氨基酸。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，可將補(bǔ)料培養(yǎng)基的添加 間歇暫停，從而將糖或營養(yǎng)物的供給暫停。優(yōu)選將補(bǔ)料培養(yǎng)基的添加暫停補(bǔ) 料時(shí)間(feeding time)的至多30%,理想的是20%，特別理想的是10%。所述 "補(bǔ)料時(shí)間，，的意思是從初次添加#卜料培養(yǎng)基開始到最后 一次添加補(bǔ)料培養(yǎng) 基結(jié)束的時(shí)期。補(bǔ)料培養(yǎng)基添加的暫?？缮儆?0%,并且最優(yōu)選少于10%。 當(dāng)間歇添加補(bǔ)料培養(yǎng)基時(shí)，起初可在預(yù)定的時(shí)間添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，并且可控 制第二次和之后的添加以使其在計(jì)算機(jī)檢測到pH或溶氧濃度增加時(shí)開始。 這種檢測發(fā)現(xiàn)通常發(fā)生在某個(gè)添加時(shí)期前的添加/暫停時(shí)期內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基中 的碳源耗盡后，并且因此培養(yǎng)罐(culture tank)中的底物濃度應(yīng)該自動并且始終 如一地(consistently)保持在低水平(美國專利號5，912，11"。
用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)的補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)選是包含碳源和具有生長促進(jìn)作用的 營養(yǎng)物(生長促進(jìn)因子)的培養(yǎng)基，并且可以包含硫以使發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度 保持在預(yù)定濃度或更低。表述"預(yù)定濃度或更低"用于本文的意思是調(diào)節(jié)添
加的培養(yǎng)基從而使發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度保持在0.35 g/L或更低，理想的是 0.25g/L或更低，更理想的是0.10g/L或更低的濃度。盡管補(bǔ)料培養(yǎng)基自身的 硫濃度可以在前述濃度范圍之內(nèi)或之外，優(yōu)選其在前述濃度范圍之內(nèi)。
作為碳源，葡萄糖、蔗糖和果糖是優(yōu)選的。作為生長促進(jìn)因子，氮源、 磷酸、氨基酸等是優(yōu)選的。作為氮源，能夠使用氨、銨鹽例如硫酸銨、碳酸 銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨和尿素、硝酸鹽等。此外，作為磷酸源，能夠 使用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。至于氨基酸，在使用營養(yǎng)缺陷突變菌抹時(shí)， 優(yōu)選補(bǔ)充以所需的氨基酸。此外，補(bǔ)料培養(yǎng)基可以是一種類型的培養(yǎng)基，或 兩種或多種類型的培養(yǎng)基的混合物。在使用兩種或兩種類型的補(bǔ)料培養(yǎng)基時(shí)， 可將培養(yǎng)基混合并且通過使用一種補(bǔ)料罐(feed can)來添加，或通過使用兩種 或多種補(bǔ)料罐來添加。
此外，在進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行添加以使糖的量不超過30g/L， 優(yōu)選20 g/L，更優(yōu)選10 g/L的全部補(bǔ)料分批培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基。具體而言， 在微生物完成對數(shù)生長之后，優(yōu)選將糖濃度控制在前述濃度范圍之內(nèi)。能夠 通過美國專利號5,912,113中所述方法控制碳源的補(bǔ)料速率(feeding rate)。此 外，優(yōu)選補(bǔ)料糖和磷酸以使其濃度可使糖和磷酸成為細(xì)菌細(xì)胞生長的限制因 素。磷酸存在于補(bǔ)料培養(yǎng)基中，使得磷/碳(P/C)比率為2或更低，優(yōu)選1.5或 更低，更優(yōu)選1或更低(美國專利號5,763,230)。
在將連續(xù)培養(yǎng)方法用于本發(fā)明時(shí)，可將培養(yǎng)基同時(shí)取出和添加；或可提 取部分培養(yǎng)基，并且可隨后添加培養(yǎng)基。此外，所述方法也可以是連續(xù)培養(yǎng) 方法，其中將包含L-蘇氨酸和細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)基取出，并且僅將細(xì)胞再循環(huán) 至發(fā)酵罐(法國專利號2669935)。作為連續(xù)或間歇添加營養(yǎng)源的方法，使用與 補(bǔ)料分批培養(yǎng)中所用的相同方法。
將培養(yǎng)基間歇取出時(shí)，在L-蘇氨酸濃度達(dá)到預(yù)定濃度時(shí)收集部分L-蘇氨 酸，并且添加新鮮培養(yǎng)基以繼續(xù)培養(yǎng)。此外，至于待添加的新鮮培養(yǎng)基的量， 添加新鮮培養(yǎng)基之后，培養(yǎng)中總培養(yǎng)基的最終量等于提取之前培養(yǎng)基的量。 術(shù)語"等于"用于本文的意思是提取前培養(yǎng)基的量的大約93至107%。
在將培養(yǎng)基連續(xù)取出時(shí)，優(yōu)選在添加營養(yǎng)培養(yǎng)基的同時(shí)或之后開始取出。 例如，開始時(shí)間是添加開始之后的最多5小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)，更優(yōu)選1小時(shí)。 此外，培養(yǎng)基的取出量優(yōu)選等于添加的培養(yǎng)基的量。
重復(fù)使用細(xì)菌細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)方法是如下所述的方法在氨基酸濃度達(dá)
到預(yù)定水平時(shí)，將發(fā)酵培養(yǎng)基間歇或連續(xù)地取出，僅取出L-蘇氨酸，并且將
包含細(xì)菌細(xì)胞的過濾殘余物再循環(huán)(re-circulating)到發(fā)酵罐中，這種方法能夠 通過參考例如法國專利號2669935來進(jìn)行。
L-蘇氨酸和其它氨基酸的分析能夠通過如Spackman等(Analytical Chemistry 30:1190-1206 (1958))所述的陰離子交換層析然后是茚三酮衍生化 (ninhydrin derivation),或通過i口 Lindroth等(Analytical Chemistry 51:1167-1174) 所述的反相HPLC來進(jìn)行。
<2>基于本發(fā)明產(chǎn)生的發(fā)酵液產(chǎn)生動物飼料添加劑的方法 基于本發(fā)明產(chǎn)生的發(fā)酵液的動物伺料添加劑能夠通過以下分離方法制備。
L-蘇氨酸分離方法例如離心、過濾、傾析、絮凝或這些的組合能夠用于 去除或減少生物質(zhì)。
使用已知方法例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄層蒸發(fā)器(thin layer evaporator)、反滲 透(reverse osmosis)或納米過濾(nanofiltration),能夠?qū)⑼ㄟ^本發(fā)明獲得的培養(yǎng) 液(broth)提濃(thicken)或濃縮。(FR8613346B、 US4，997,754、 EP410005B、 JP1073646B)
隨后使用冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧?；?spray granulation)或任何其它 方法處理濃縮的培養(yǎng)液，以提供優(yōu)選自由流動的(free flowing)、細(xì)碎的(finely divided)粉末用于動物飼料添加劑。通過使用合適的壓制(compacting)或?；?法能夠?qū)⑦@種自由流動的、細(xì)碎的粉末轉(zhuǎn)化成粗?；?coarse-grained)、非常自 由流動的、穩(wěn)定并且基本上無粉塵(largely dust-free)的產(chǎn)品?？偠灾?，以此 方法將多于90%的水去除，從而使飼料動物添加劑的水含量按重量計(jì)少于 10%，優(yōu)選少于5%。
飼料添加劑的蛋白含量按重量計(jì)可少于10%，優(yōu)選少于5%,并且L-蘇 氨酸的濃度可多于50%,優(yōu)選多于85%，更優(yōu)選多于95%。 (US5，431,933、 JP1214636B 、 US4,956,471 、 US4,777,051 、 US4946654 、 US5，840358 、 US6，238,714、 US2005/0025878)
不必要必需進(jìn)行上述分離步驟，但是可以以技術(shù)上有利的方式將其組合。
<3>能夠用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細(xì)菌
能夠用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細(xì)菌是具有產(chǎn)生L-蘇氨酸的能力的埃希氏 菌屬細(xì)菌，并且術(shù)語"產(chǎn)生L-蘇氨酸的能力"用在本發(fā)明中的意思是將所述 細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生游離L-蘇氨酸的能力，即，將游離
L-蘇氨酸產(chǎn)生至細(xì)胞外，其程度使得能夠從培養(yǎng)基收集L-蘇氨酸。優(yōu)選地，
用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細(xì)菌是經(jīng)過培育以使該菌抹與野生型菌抹或親本菌
屬相比能夠產(chǎn)生更高的L-蘇氨酸量的菌林。具體而言，優(yōu)選在使用未調(diào)節(jié)硫 濃度的通常培養(yǎng)方法時(shí)，所述埃希氏菌屬菌抹產(chǎn)生30g/L或更高，更優(yōu)選50 g/L或更高，特別優(yōu)選75 g/L或更高的L-蘇氨酸量。
用于獲得適用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細(xì)菌的埃希氏菌屬細(xì)菌的親本菌抹 無具體限定，其具體實(shí)例包括在Neidhardt等(Neidhardt, F.C. " a/.， Eyc/zen'c/^ co// and iS"a//wcwe//a 23^ /z/薩n'膽，American Society for Microbiology, WashingtonD.C.， 1029,表l)的工作中提到的那些菌抹。在這些菌抹之中，例 如，大腸桿菌是優(yōu)選使用的。大腸桿菌的具體實(shí)例包括均源自原型野生型菌 抹K12的大腸桿菌W3110 (ATCC 27325)和大腸桿菌MG1655 (ATCC 47076) 等。
為了獲得這些菌抹，能夠從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(地址P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)獲得它們。為各細(xì)菌菌抹提供一個(gè)對應(yīng)的注冊號，并且使用該注冊 號能夠預(yù)定各菌抹。對應(yīng)于細(xì)菌菌抹的注冊號列于美國典型培養(yǎng)物保藏中心 的目錄中。
<3-1>賦予L-蘇氨酸產(chǎn)生能力
在下文中，將描述將L-蘇氨酸產(chǎn)生能力賦予埃希氏菌屬細(xì)菌的方法。 為了賦予L-蘇氨酸產(chǎn)生能力，能夠使用已被常規(guī)采用的培育埃希氏菌屬 細(xì)菌或棒狀桿菌型細(xì)菌的方法，例如獲得全都具有L-蘇氨酸產(chǎn)生能力的營養(yǎng) 缺陷突變體、類似物抗性菌抹(analogue resistant strain)或代謝調(diào)控突變菌抹 (metabolism control mutant strain),以及構(gòu)建其中將L-蘇氨酸生物合成酶的活 性增強(qiáng)的重組菌抹。例如，可對突變或重組菌抹進(jìn)行修飾，以使L-蘇氨酸生 物合成酶不受到反饋抑制；或可對重組菌林進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)L-蘇氨酸生物 合成酶基因的表達(dá)。在通過這些方法培育產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌時(shí)，可單獨(dú)地 或組合地賦予例如營養(yǎng)缺陷型(auxotrophy)、類似物抗性和代謝調(diào)控突變等性 質(zhì)。在將L-蘇氨酸生物合成酶的活性增強(qiáng)時(shí)，可將一種或多種這些酶的活性
增強(qiáng)。此外，如上所述，賦予上述性質(zhì)和增強(qiáng)酶活性可組合進(jìn)行。
將產(chǎn)生L-蘇氨酸的能力賦予埃希氏菌屬細(xì)菌的方法實(shí)例，或通過增強(qiáng)L-蘇氨酸生物合成酶的活性來增強(qiáng)產(chǎn)生L-蘇氨酸的能力的方法實(shí)例，將在下進(jìn)
行說明。可通過如下方法增強(qiáng)酶活性例如，將突變引入編碼該酶的基因或
擴(kuò)增該基因以使酶的細(xì)胞內(nèi)活性增加。這些能夠通過使用基因重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
編碼L-蘇氨酸生物合成酶的基因的實(shí)例包括天冬氨酸激酶III基因 (/"C)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(m力、Ar操縱子中包括的天冬氨酸激酶I 基因0/zM， SEQ ID NO: 1的核香酸編號337至2799)、高絲氨酸激酶基因(/Zzr萬, SEQ ID NO: 1的核香酸編號2801至3733)和蘇氨酸合酶基因(^<:, SEQ ID NO: 1的核苷酸編號3734至5020)。括號中所示是這些基因的縮寫名稱。可 將這些基因的兩種或多種引入細(xì)菌?？蓪-蘇氨酸生物合成基因引入其中蘇 氨酸降解受到抑制的埃希氏菌屬細(xì)菌。其中蘇氨酸降解受到抑制的埃希氏菌 屬細(xì)菌的實(shí)例包括蘇氨酸脫氫酶活性缺陷的TDH6菌抹(EP1149911A)等。
L-蘇氨酸生物合成酶的酶活性受到作為終產(chǎn)物的L-蘇氨酸的抑制。因此， 為了構(gòu)建產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌，有益的是對L-蘇氨酸生物合成體系基因進(jìn)行 修飾從而使編碼的酶不受到L-蘇氨酸的反饋抑制。前述A"、 f/z^和ArC基 因構(gòu)成蘇氨酸操縱子，并且該蘇氨酸操縱子具有弱化子結(jié)構(gòu)。蘇氨酸操縱子 的表達(dá)受到存在于培養(yǎng)基中的異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并且通過弱化作用 抑制。前述修飾能夠通過去除弱化區(qū)中的前導(dǎo)序列(SEQIDNO:6)完成，或通 過去除弱化子(SEQIDNO: 1)完成(國際專利7>開WO02/26993; Biotechnology Letters, Vol. 24, No. 21， November 2002;國際專利/^開WO05/049808、 WO98/04715、 WO03/097839)。具體而言，期望的是修飾蘇氨酸操縱子以從 SEQIDNO: 1的序列中除去核苷酸188至310的序列?；蛘?，修飾蘇氨酸操 縱子以從SEQIDNO: 1的序列中除去核苷酸148至310的序列也是期望的。
天然啟動子存在于蘇氨酸操縱子的上游區(qū)，并且可將其用非天然啟動子 取代(參考WO98/04715)。或者，可構(gòu)建蘇氨酸操縱子以使涉及蘇氨酸生物合 成的基因的表達(dá)受到X噬菌體的阻抑物(repressor)和啟動子的調(diào)節(jié)(參考?xì)W洲 專利號0593792)。此外，經(jīng)修飾從而不受到L-蘇氨酸反饋抑制的埃希氏菌屬 細(xì)菌也能夠通過選擇對a-氨基-(3-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌抹來獲得(參考 WO03/097839)。
此外，優(yōu)選能夠存在經(jīng)修飾從而不受到L-蘇氨酸反饋抑制的蘇氨酸操縱
子的多拷貝?；蛘?，將所述操縱子連接至強(qiáng)啟動子從而增加表達(dá)。能夠通過 使用質(zhì)粒將其擴(kuò)增和/或使用轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體等將其轉(zhuǎn)移至染色體上來增
加L-蘇氨酸操縱子的拷貝數(shù)(US5,175，107)。
此外，經(jīng)修飾而不受到L-賴氨S交反饋抑制的天冬氨酸激酶III基因(/^C) 是優(yōu)選使用的。這種/，C基因能夠通過美國專利號5,932,453中所述的方法獲得。
除了 L-蘇氨酸生物合成酶之外，還優(yōu)選增強(qiáng)以下基因的表達(dá)涉及糖酵 解途徑、TCA循環(huán)或呼吸鏈的基因，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的基因，和糖攝取基因。 對L-蘇氨酸產(chǎn)生具有作用的基因?qū)嵗ㄞD(zhuǎn)氫酶(^2"S)基因(歐洲專利號 7B712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因0 epC)(國際專利公開WO95/06114、 US2005-0136518)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(p戸)(歐洲專利號877090)和棒狀 桿菌型細(xì)菌或芽孢桿菌屬(Sa"7/w"細(xì)菌的丙酮酸羧化酶基因(國際專利公開 W099/18228;歐洲專利
發(fā)明者加藤直人, 城永佑志, 小山直人, 辻雄一郎 申請人:味之素株式會社