專利名稱：：新型人工堿基對(duì)及其應(yīng)用的制作方法新型人工堿基對(duì)及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)主張以日本專利申請(qǐng)、特愿2005-226492(2005年8月4日申請(qǐng))和特愿2006-182062(2006年6月30日)為基礎(chǔ)的優(yōu)先權(quán)。基礎(chǔ)申請(qǐng)的內(nèi)容全部被本申請(qǐng)所沿用。本發(fā)明涉及基于新型人工堿基對(duì)的核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生物高分子核酸(DNA、RNA)僅用4種堿基的組合形成的序列記錄生命活動(dòng)所必需的大量遺傳信息。此外，核酸通過以自身為模板利用DNA聚合酶自我復(fù)制、利用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，經(jīng)由核糖體翻譯的過程，從DNA向DNA、DNA向RNA、RNA向蛋白質(zhì)傳遞遺傳信息。使這樣的遺傳信息的復(fù)制和傳遞成為可能的正是排他的堿基對(duì)形成(A.T/U、G.C)規(guī)則。此外，核酸形成多樣的高級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)揮各種各樣的功能。其中一個(gè)例子是到目前為止，通過invitro篩選法，發(fā)現(xiàn)了大量具有適體、核酶功能的新型核酸。但是，與20種氨基酸組成的蛋白質(zhì)相比，天然核酸只有四種堿基(2種堿基對(duì))的事實(shí)限制了核酸的化學(xué)、物理多樣性。例如，生物體中的tRNA、rRNA、mRNA等功能性RNA為了穩(wěn)定自身的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定RNA.RNA之間、RNA.蛋白質(zhì)之間的相互作用，利用了各種各樣的堿基修飾。所以認(rèn)為，在新型功能性核酸的開發(fā)中，擴(kuò)展新堿基(對(duì))的目錄是非常有價(jià)值的。以核酸的進(jìn)一步功能擴(kuò)展為目標(biāo)，科學(xué)家們展開了創(chuàng)造具有非天然型堿基的核苷或核苷酸的竟賽。作為向核酸導(dǎo)入修飾堿基(或者非天然型堿基)的方法可以考慮l)通過化學(xué)合成直接導(dǎo)入的方法，2)通過核酸合成酶導(dǎo)入的方法。l)的情況要解決amidite的穩(wěn)定性和存在堿基部分的適當(dāng)保護(hù)基等化學(xué)合成上的問題。此外，這些問題得到解決雖然能夠位置選擇性的導(dǎo)入各種各樣的非天然型堿基，但該核酸的擴(kuò)增困難，也很難合成長鏈的核酸。2)的情況，如果底物被酶所識(shí)別，能夠在人工堿基對(duì)之間互補(bǔ)地復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的話，就可以制備、擴(kuò)增該核酸，但是這樣的底物、堿基對(duì)(非天然型核苷酸)也尚在開發(fā)中。非天然型人工堿基對(duì)的研究背景天然雙鏈DNA中的A、T和G、C分別通過特異的氫鍵互相形成"排他的"堿基對(duì)。關(guān)于非天然型堿基對(duì)的研究，已知的有利用堿基間的氫鍵的組合和利用堿基的疏水性的組合，但并沒有發(fā)現(xiàn)在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的全部步驟中能夠與天然型堿基對(duì)拮抗的產(chǎn)品。在這種情況下，在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的至少一個(gè)步驟中能夠與天然型堿基對(duì)拮抗的非天然型堿基對(duì)即具有特殊的價(jià)值。最近的非天然型非氫^t5威基對(duì)的研究證明，對(duì)于在復(fù)制中有效地引入適合的核苷酸，配對(duì)堿基之間的氫鍵并非絕對(duì)必要，取而代之，堿基間形狀的互補(bǔ)性在復(fù)制中發(fā)揮重要作用(非專利文獻(xiàn)5-6)。由此可見，非氫鍵堿基對(duì)是創(chuàng)造新型生物技術(shù)、擴(kuò)展基因表格和密碼的潛在候補(bǔ)(非專利文獻(xiàn)7-9)。至于轉(zhuǎn)錄方面，能夠被RNA聚合酶高選擇性、高效率地識(shí)別的非氫鍵堿基對(duì)還未見報(bào)道。具體地說，本發(fā)明人此前開發(fā)了一種(s-y)堿基對(duì)，其基于2-氨基-6-(2-噻吩)-9H-嘌呤-9-基(s)與2-氧代-(lH)吡啶-3-基(y)的組合的氫鍵相互作用，并在試管內(nèi)成功地合成了位點(diǎn)特異性地含有非天然型氨基酸的蛋白質(zhì)(專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)14)。而專利文獻(xiàn)3開發(fā)了2-氨基-6-(2-噻唑)嘌呤-9-基(v)和2-氧代-(lH)吡啶-3-基(y)相組合的(v-y)堿基對(duì)(專利文獻(xiàn)3)。并且，作為s的核酸堿基對(duì)，除天然型4堿基、(s-y)外，在本發(fā)明之前還報(bào)道了(s-z)(z指2-氧雜-1,3-二氫咪唑-l-基)和(s-5位取代y)。這些(s-y)、(s-z)、(s-5位取代y)的非天然型堿基對(duì)全部包括氫鍵相互作用(專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)13-15)。但是，這些非天然型堿基對(duì)中，(s-y)和(s-5位取代y)對(duì)于以y為DNA模板將s插入到RNA的轉(zhuǎn)錄步驟選擇性不高，而(s-z)選擇性雖高，卻未必收率高。[化l]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>另一方面，有報(bào)道稱2-曱酰-lH-吡咯-l-基(Pa)除天然型4堿基之外，還可以與的9-甲基咪唑[(4,5)-b]吡啶(Q)形成非氫鍵堿基對(duì)(Pa-Q)(非專利文獻(xiàn)9)。[化2]但是，對(duì)于上述非氫鍵堿基對(duì)，只報(bào)道了通過DNA聚合酶的翻譯或通過逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA合成，其能否為RNA聚合酶所識(shí)別還是未知的。T7樣RNA聚合酶的單一亞基在結(jié)構(gòu)和機(jī)制方面與DNA聚合酶類似(非專利文獻(xiàn)16-17)，但根據(jù)最近的T7RNA聚合酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析，RNA聚合酶和DNA聚合酶之間的差異已經(jīng)明確(非專利文獻(xiàn)17-18)。在轉(zhuǎn)錄中，插入的底物與模板中的堿基以"開放，，的構(gòu)象形成堿基對(duì)，而且在從"開放的，，構(gòu)象到"閉合"的構(gòu)象遷移期間維持形成的堿基對(duì)(非專利文獻(xiàn)18)。但是，在復(fù)制中，是向"閉合，，構(gòu)象遷移之后，堿基對(duì)才開始形成。由此可以認(rèn)為，在轉(zhuǎn)錄中配對(duì)堿基之間的氫鍵比復(fù)制中更為重要，而且，還產(chǎn)生了非氫鍵堿基對(duì)在轉(zhuǎn)錄中是否能發(fā)揮功能的問題。如果非天然型堿基能夠介導(dǎo)特異性轉(zhuǎn)錄，那么就能夠創(chuàng)造出具有改進(jìn)功能的新型RNA分子，并擴(kuò)展基因密碼(非專利文獻(xiàn)1-4)。向RNA導(dǎo)入焚光探針最近RNA治療越來越熱門，向RNA中導(dǎo)入熒光探針已經(jīng)成為RNA熒光標(biāo)記法和解析RNA復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)之一。對(duì)于后者的結(jié)構(gòu)解析用熒光探針，一直以來使用具有熒光性堿基(2-氨基嘌呤)的核苷酸。這方面，上述2-氨基-6-(噻吩)-9H-嘌呤-9-基(s)是熒光堿基，含有此堿基的核苷酸具有強(qiáng)烈的熒光特性。所以，如果能將含有s堿基的核苷酸導(dǎo)入到RNA中的任意位點(diǎn)，就能夠制備有用的焚光探針。但是，將具有這些焚光性堿基的核苷酸通過轉(zhuǎn)錄導(dǎo)入到RNA的已知的方法在收率方面并不盡如人意。所以，將具有s等熒光性堿基的核苷酸通過轉(zhuǎn)錄導(dǎo)入到RNA中的一定位點(diǎn)實(shí)際上是不能做到的，因此長鏈RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)的解析很困難。如果開發(fā)出通過轉(zhuǎn)錄將熒光探針導(dǎo)入RNA中的方法，就能夠測定溶液中的RNA結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)學(xué)。而且，這些方法對(duì)于利用RNA的醫(yī)藥品的開發(fā)也會(huì)發(fā)揮作用。所以，建立使一般認(rèn)為不可能的向長鏈RNA中導(dǎo)入熒光探針得以實(shí)現(xiàn)的方法很重要。由此，可以開發(fā)新的方法，用于生物體內(nèi)的功能性RNA結(jié)構(gòu)解析和其與其它分子的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析。希望開發(fā)新型的人工堿基對(duì)，以在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的全部步驟中，向核酸中導(dǎo)入具有能夠拮抗天然型堿基對(duì)的非天然型的、且賦予了熒光特性的堿基的核苦酸。專利文獻(xiàn)l:WO2001/005801專利文獻(xiàn)2:WO2004/007713專利文獻(xiàn)3:WO2005/026187非專利文獻(xiàn)1:Benner,S.A.,Burgstaller,P.,Battersby,T.R.&Jurczyk,S.inTheRNAWorld(edsGesteland，R.F"Cech,T.R.&Atkins,J.F.)163-181(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1999).非專利文獻(xiàn)2:Bergstrom,D.E.Orthogonalbasepairscontinuetoevolve.Chem.Biol.11，18-20(2004).非專利文獻(xiàn)3:Wang,L.&Schultz，P.G.Expandingthegeneticcode.Chem.Commun.1-11(2002)非專利文南犬4:Hendrickson，T.L.，deCrecy-Lagard,V.&Schimmd,P.Incorporationofnonnaturalaminoacidsintoproteins.Annu.Rev.Biochem.73,147-176(2004).非專利文獻(xiàn)5:Morales,J.C.&Kool,E.T.Efficientreplicationbetweennon-hydrogen-bondednucleosideshapeanalogs.Nat.Struct.Biol.5，950-954(1998).非專利文南足6:Kool,E.T.Hydrogenbonding,basestacking,andstericeffectsinDNAreplication.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct30,1-22(2001).非專利文獻(xiàn)7:McMinn,D.L.etal.Effortstowardexpansionofthegeneticalphabet:DNApolymeraserecognitionofahighlyatable，self-pairinghydrophobicbase.J.Am.Chem.Soc.121,11585-11586(1999).非專利文南大8:Wu,Y.etal.Effortstowardexpansionofthegeneticalphabet:optimizationofinterbasehydrophobicinteraction.J.Am.Chem.Soc.122,7621-7632(2000).非專利文獻(xiàn)9:Mitsui,T.etal.Anunnaturalhydrophobicbasepairwithshapecomplementaritybetweenpyrrole-2-carbaldehydeand9-methylimidazo[(4，5)-b]pyridine.J.Am.Chem.Soc.125，5298-5307(2003).非專利文獻(xiàn)10:Piccirilli,J.A.，Krauch,T.,Moroney,S.E.&Benner,S.A.EnzymaticincorporationofanewbasepairintoDN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發(fā)明內(nèi)容發(fā)明擬解決的問題本發(fā)明的目的是提供基于新型人工堿基對(duì)的核酸。具體地說，本發(fā)明的核酸中，具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸與具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸形成堿基對(duì)。本發(fā)明雖不限于此，但本發(fā)明的核酸優(yōu)選前述取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基選自下組Al)2-曱酰-lH-吡咯-l-基，A2)2-曱酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，A3)2-甲酰-4-曱基-lH-吡咯-l-基，和A4)2-曱酰-4-乙炔基-lH-吡咯-l-基；并且，所述6位取代的9H-噪呤-9-基選自下組B1)2-氨基-6-(2-噻吩基)-911-嘌呤-9-基，B2)6-(2-噻吩基)-9H-噪呤-9-基，B3)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B4)6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-噤呤-9-基，85)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B6)6-(5-曱基-2-噻吩基)-9H-噪呤-9-基，B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B8)6-(2-噻唑基)-9H-噤呤-9-基，89)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B10)6-(4-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B11)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和B12)6-(5-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。本發(fā)明的核酸優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或者翻譯步驟中形成堿基對(duì)。本發(fā)明還提供一種核酸制備方法，所述核酸含有具有6位取代的9H-噤呤_9-基為堿基的核苷酸。本發(fā)明的制備方法包括以含有具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸的核酸為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，在前述具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸的互補(bǔ)位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種核酸，所述核酸含有前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸，其通過上述本發(fā)明的方法制備。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的核酸中包含前述具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核香酸的局部區(qū)域的立體結(jié)構(gòu)的解析方法。本發(fā)明的解析方法包括通過改變環(huán)境，如溫度變化、離子(例如鎂)濃度等的變化等來測定前述具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸中堿基來源的熒光強(qiáng)度。在一種實(shí)施方式下，本發(fā)明的解析方法是前述具有6位取代的9H-噪呤_9-基為堿基的核苷酸中的、堿基來源的熒光強(qiáng)度隨溫度的上升而實(shí)質(zhì)上上升時(shí)，判斷為在生物體內(nèi)溫度下，所述核苷酸在立體構(gòu)象上與存在于周圍的核苷酸相堆積；而熒光強(qiáng)度隨溫度上升而實(shí)質(zhì)上降低或未上升時(shí)，判斷為在生物體內(nèi)溫度下，所述核苷酸暴露于外部。本發(fā)明的另一目的是提供核酸的雙鏈形成的檢測方法。本發(fā)明的檢測方法包括I)使i)的核酸與ii)的核酸雜交，其中i)的核酸是包含所述具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸，其根據(jù)權(quán)利要求6至8所述的方法制備；ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，該堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-l-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2'，4,4，，5，,7,7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，，4，4，，5，，7，7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，，4，7,7，-四氯熒光素(5-丁￡丁)、6-羧基-2，，4,7,7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX);并且，II)測定熒光光譜的變化。本發(fā)明的另一目的是提供一種核酸制備方法，所述核酸在同一鏈上含有下述i)的核苷酸和ii)的核苷酸，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸；ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苦酸，上述堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-l—萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，,4，4，，5，，7，7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，，4,4，，5，,7，7，-六氯熒光素(6石￡乂)、5-羧基-2，,4,7,7,-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，，4，7，7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)。本發(fā)明的制備方法包括以含有iii)的核苷酸和iv)的核苷酸的核酸為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，在所述iii)的核苷酸的互補(bǔ)位置插入所述i)的核苷酸，并且在所述iv)的核苷酸的互補(bǔ)位置插入所述ii)核苷酸，其中，iii)的核苷酸是具有取代或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸，iv)的核苷酸是具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸。本發(fā)明還提供通過上述方法制備的核酸。本發(fā)明還包括提供本發(fā)明的核酸的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)形成的檢測方法，所述核酸在同一鏈上含有具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核苷酸和具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸。本發(fā)明的檢測方法包括1)在本發(fā)明的核酸中，使i)的核苷酸與ii)的核苷酸雜交；并且，2)測定焚光光譜的變化。解決問題的方法本發(fā)明人等為了解決上述問題，研究了通過組合以前自行開發(fā)的數(shù)個(gè)非天然型堿基構(gòu)建的堿基對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-氨基-6-(2-噻吩基)。票呤-9-基(s)(非專利文獻(xiàn)13、14)和2-甲酰-lH-吡咯-l-基(Pa)(非專利文獻(xiàn)9)(圖1A)的組合在轉(zhuǎn)錄中表現(xiàn)高度的選擇性和效率。也就是說，將Pa核苷酸插入到DNA模板中進(jìn)行向RNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，能夠在生成的RNA中的與DNA模板Pa互補(bǔ)的位置選擇性且高效地導(dǎo)入s，從而想到了本發(fā)明。底物s能句多通過RNA聚合酶,在從DNA才莫板生成的RNA中，位點(diǎn)特異性地插入與模板中的Pa互補(bǔ)的位置。嘌呤堿基s具有能形成氫鍵的取代基(l位的氫受體基團(tuán)和2位的氫供體氨基)。但是，Pa的配對(duì)表面沒有這樣的親水性基團(tuán)。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)Pa堿基的曱?；械难趺嫦螂p鏈DNA的小溝(minorgroove),與聚合酶相互作用，不作為堿基對(duì)形成中的氬受體基團(tuán)發(fā)揮作用(非專利文獻(xiàn)9)。本發(fā)明中，可以認(rèn)為s-Pa對(duì)沒有顯著的氫鍵相互作用，但5元環(huán)堿基Pa與s有形狀互補(bǔ)性?；诒景l(fā)明的人工堿基對(duì)的核酸因而，在其一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種核酸，這種核酸具有具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸和具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸形成的堿基對(duì)。本發(fā)明中的"核苷"是指核酸堿基與糖的還原基通過糖苷鍵結(jié)合形成的糖苷化合物。"核酸堿基"是包含腺。票呤、鳥。票呤、胞嘧。定、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及這些堿基的衍生物的概念。"衍生物"的種類并不特別限定，具體地有例如相當(dāng)于取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基的堿基、相當(dāng)于6位取代的9H-噤呤-9-基的堿基等。"核苦酸"是指前述核苷的糖部分與磷酸形成酯的化合物。優(yōu)選為一、二、或三磷酸酯。核苷或者核苦酸的糖部分可以是呋喃核糖基、2，-脫氧呋喃核糖基、或者2，位具有卣素等取代基的2，-取代呋喃核糖基，而磷酸部分也可以是硫代磷酸?？傊遣糠趾土姿岵糠挚梢圆捎弥苤暮塑?、核苷酸或者它們的衍生物中可見的結(jié)構(gòu)。糖部分為呋喃核糖基的核糖核苷酸是RNA的構(gòu)成成分，糖部分為脫氧呋喃核糖基的脫氧核糖核苷酸是DNA的構(gòu)成成分。本發(fā)明的"取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基"具有用以下通式表示的結(jié)構(gòu)。其中吡咯環(huán)的4位R是氫，或者可以用以下任意一種取代基取代取代或無取代的d-C3烷基、取代或無取代的CVC3烯基、或者取代或無取代的CVC3炔基。上述烷基、烯基或炔基等可以進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述取代基團(tuán)獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、卣素、羥基、氨基、烷基氨基和芳香族雜環(huán)。本說明書中根據(jù)上下文，稱本發(fā)明的取代或無取代的2-曱酰-111-吡咯-l-基為"Pa"或"Pa類似物"。并非限定，但前述取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基可以選自下組Al)2-甲酰-lH-吡咯-l-基(Pa)，A2)2-曱酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，A3)2-甲酰-4-曱基-lH-吡咯-l-基，和A4)2-曱酰-4-乙炔基-1H-吡咯-1-基。優(yōu)選2-曱酰-lH-吡咯-l-基。本發(fā)明的具有"取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基"("Pa"或"Pa類似物")的核苷、核苷酸可以用周知的方法合成。其起始原料例如吡咯-2-曱醛，可以從例如Aldrich公司[1003-29-8]、Merck公司[807574]購買。而Pa衍生物基本上是從Pa衍生合成。例如Pa的4位導(dǎo)入了丙炔的衍生物在[化3]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>Bioorg.Med.Chem.Lett,13,p.4515-4518(2003)(非專利文獻(xiàn)28)中有所描述。本發(fā)明的"6位取代的9H-噤呤-9-基，，具有可以用以下通式表示的結(jié)構(gòu)。[化4]R2[其中，w是氫或者氨基，W是取代或無取代的2-噻吩基或2-噻唑基。]R2的噻吩基或噻唑基可以是無取代的，或者其4位和/或5位可被獨(dú)立地選自下組的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代曱基、氨基、硝基和羥基。對(duì)于本發(fā)明的6位取代的9H-。票呤-9-基，根據(jù)本說明書的上下文，將具有112被取代的2-遙吩基或無取代的2-瘞吩基的該化合物稱為"s"或"s類似物"。對(duì)于本發(fā)明的6位取代的9H-嘌呤-9-基，根據(jù)本說明書的上下文，將具有R2被取代的2-噻唑基或無取代的2-。塞唑基的該化合物稱為"v"或"v類似物"。并非限制，但前述6位取代的9H-嘌呤-9-基可以選自下組Bl)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s),B2)6-(2-p塞吩基)-9H-噤呤-9-基(s，)，B3)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B4)6-(4-曱基-2-蓬吩基)-9H-噤呤-9-基，B5)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B6)6-(5-曱基-2-噻吩基)-9H-噤呤-9-基，B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基(v),B8)6-(2-噻唑基)-9H-。票呤-9-基，B9)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B10)6-(4-曱基-2-p塞唑基)-9H-噪呤-9-基，Bll)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和B12)6-(5-甲基-2-p塞唑基)-9H-噤呤-9-基。優(yōu)選為2-氨基-6-(2-漆吩基)-9H-噤呤-9-基。上述堿基中，Bl)是"s"、B2)到B6)是"s類似物"。B7)是"v"，B8)到B12)是"v類似物"。更加優(yōu)選前述取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基是2-曱酰-lH-吡咯-l-基，并且前述6位取代的9H-嘌呤-9-基是2-氨基-6-(2-噻吩基)-91^-嘌呤-9-基。本發(fā)明的"6位取代的9H-噤呤-9-基"以及包含它的核苷、核苷酸可以用周知的方法合成。具體地，例如本說明書的實(shí)施例1中公開了從2-N-笨氧乙酰-6-(2-嗥吩基)-9-(2,3-二-0-乙酰-1-(3-D-呋喃核糖)噤呤，合成2-氨基-6-(2-瘞吩基)-9-(1-P-D-呋喃核糖)噤呤5'-三磷酸(sTP)的方法。s的合成例如Bioorg.Med.Chem.Lett.，11，p.2221-2223(2001)(非專利文獻(xiàn)29)的第2頁的第二段所述。v的合成例如專利文獻(xiàn)3的段落0026、0027、圖5-6等所述?；蛘?，如J.Am.Chem.Soc.，127，p.8652-8658(2005)(非專利文獻(xiàn)30)的第2頁的右側(cè)段落所述。除了s、v以外，具有本發(fā)明的"6位取代的9H-噪呤-9-基"的核苷、核香酸也可以用與s或v的任何一種的合成方法同樣的方法合成。例如，結(jié)合了呋喃的o可以用與s同樣的合成方法合成(非專利文獻(xiàn)29)。本發(fā)明提供一種核酸，該核酸中具有取代或無取代的2-曱酰-111-吡咯-1-基為堿基的核苷酸和具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸形成堿基對(duì)。本說明書中，"核酸"是指多于1個(gè)核苷酸沿5，—3'方向連接而成的核酸鏈的分子。本發(fā)明的核酸包含單鏈或者雙鏈的RNA或DNA。雙鏈可以是DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA。此外，DNA中包括以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA?；蛘吆怂嵋部梢孕纬扇?、四鏈等。本發(fā)明人等以核酸的進(jìn)一步功能擴(kuò)展為目標(biāo)，著手具有非天然型堿基的核苷或核苷酸的創(chuàng)造。作為新開發(fā)的人工堿基對(duì)的實(shí)施方式，包括具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基(例Pa)為堿基的核苷酸和具有6位取代的9H-。票呤-9-基(例s)為堿基的核苷酸形成堿基對(duì)(圖1)。由此，特別在使用包含Pa的DNA模板的T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄中，可向RNA中特異地插入So盡管s和Pa之間不存在顯著的氫鍵相互作用(非氫鍵s-Pa對(duì))，但在轉(zhuǎn)錄中，s-Pa對(duì)的效率和選擇性高，與天然^咸基對(duì)相當(dāng)。該s-Pa對(duì)比之前開發(fā)的親水性s-z對(duì)顯示更高的效率。s和Pa的互補(bǔ)形狀互相匹配，但與天然的噤呤類和嘧啶類的形狀不同?？梢哉J(rèn)為這種特異的立體化學(xué)匹配排除了與天然堿基的非規(guī)范的配對(duì)，其結(jié)果是，轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠獲得s-Pa的高選擇性。由此可見，形狀-互補(bǔ)性對(duì)于轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中的特異堿基配對(duì)發(fā)揮重要的作用。本發(fā)明的具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸和具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸可以存在于不同的兩條核酸上，通過堿基對(duì)形成雙鏈?；蛘?，兩種核苷酸也可以存在于同一條核酸上。這時(shí)，通過堿基對(duì)，單鏈可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸，或者具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸，可以通過轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)插入DNA或RNA等核酸中。或者，也可以與具有天然型堿基的核普或核苷酸一樣，通過化學(xué)合成插入DNA或RNA。轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或逆轉(zhuǎn)錄可以按照周知的方法進(jìn)行。并非限定，但例如轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用T7RNA聚合酶(Takara等)、復(fù)制反應(yīng)可以使用Klenow大片段(KF)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用AMVReverseTranscriptaseXL(AMV-RT)(LifeScience公司)。對(duì)于復(fù)制反應(yīng)，為了防止反應(yīng)中失去本發(fā)明的核苷酸，例如可以使用不具有3，—5，外切酶活性的TaqDNA聚合酶(TakaraTaqTM),也可以使用含有具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸的引物進(jìn)行模板DNA的PCR擴(kuò)增。并非限定，但在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸在核酸的轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或翻譯的步驟中形成堿基對(duì)。本發(fā)明的核酸在轉(zhuǎn)錄步驟中形成堿基對(duì)時(shí)，前述具有取代或無取代的2-甲酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸可以是DNA的一部分，并且前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸可以是RNA的一部分。核酸的制備方法本發(fā)明提供制備一種核酸的方法，所述核酸包含具有6位取代的9H-噤呤_9_基為堿基的核苷酸。本發(fā)明的制備方法包括以含有具有取代的或者無取代的2-甲酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸的核酸為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，在上述具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸的互補(bǔ)位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸。關(guān)于本發(fā)明的含有2-甲酰-lH-吡咯-l-基的核苷酸和含有6位取代的9H-。票呤-9-基的核普酸的定義，如本說明書前面的"依賴本發(fā)明的人工堿基對(duì)的核酸"項(xiàng)中所述。正如本說明書的實(shí)施例l-2中所闡明的那樣，即使是模板中存在連續(xù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸時(shí)，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)也能夠進(jìn)行，在互補(bǔ)位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸。所以，通過本發(fā)明的方法，使以往不可能的、存在兩個(gè)或者多個(gè)連續(xù)非天然堿基s的DNA和RNA的制備得以實(shí)現(xiàn)。所以，一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的制備方法的模板中存在2個(gè)以上的具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苦酸。本發(fā)明的另一目的是提供一種核酸，所述核酸含有前述具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸，其通過上述本發(fā)明的方法制備。含有本發(fā)明的核苷酸的核酸可以用作tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶或者適體。反義DNA或RNA是指抑制指定的基因表達(dá)的DNA或RNA。工調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法。含有本發(fā)明的核苷酸的反義DNA或RNA因?yàn)楹蟹翘烊恍蛪A基，所以能夠創(chuàng)造出對(duì)于目標(biāo)的互補(bǔ)性與只使用天然型堿基的時(shí)候不同的產(chǎn)品。核酶是以RNA為構(gòu)成成分的催化劑的總稱。適體是通過體外篩選法獲得的、具有與蛋白質(zhì)等一定分子結(jié)合功能的核酸。插入了本發(fā)明的核苦酸的核酸(DNA或RNA)(例如mRNA、合成RNA)也可以編碼蛋白質(zhì)、肽的全體或其一部分。本發(fā)明的核酸可以用作基因片段和探針等。本發(fā)明中還包含天然基因的一部分或全部用本發(fā)明的核酸取代的形式、向天然基因中加入1個(gè)或者多個(gè)本發(fā)明的核苷酸的產(chǎn)物，或者這些情況的組合。此外，插入了本發(fā)明的含有非天然堿基的核苷酸的核酸還可以用于RNA干涉(RNAinterference、RNAi)。RNA干涉是指如下現(xiàn)象通過雙鏈RNA(dsRNA)序列特異性地使mRNA分解，其結(jié)果抑制基因表達(dá)。RNA干涉的典型實(shí)例是屬于RNA酶III家族的切丁酶將dsRNA加工成3，末端具有2個(gè)堿基左右的突出端的約21堿基-23堿基的siRNA(shortinterferingRNA)。siRNA插入稱為RISC的siRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，序列特異性地分解mRNA。RNA干涉是在哺乳動(dòng)物(人、小鼠等)、線蟲、植物、果蠅、真菌等廣泛的物種之間保守的現(xiàn)象。插入了本發(fā)明的含有非天然堿基的核苷酸的核酸可以用作RNA干涉中的siRNA,或者將4皮分解的mRNA的一部分。此外，可以設(shè)計(jì)含有本發(fā)明的核香酸的新型密碼子。如前所述，即使是模板中存在連續(xù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基(例如Pa)的核苷酸時(shí)，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)也能夠進(jìn)行，在互補(bǔ)位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸(例如s)。所以，通過本發(fā)明的方法，使以往不可能的、存在兩個(gè)或者多個(gè)連續(xù)非天然堿基s的DNA和RNA的制備得以實(shí)現(xiàn)。因此，可以設(shè)計(jì)含有3個(gè)s的密碼子(sss)、含有2個(gè)s的密碼子(例如ssA、Gss、sGs)、含有1個(gè)s的密碼子(例如sAG、CsT、AGs)。新型的密碼子可以編碼天然氨基酸，也可以編碼非天然氨基酸。這樣，本發(fā)明不僅僅提供新型的非天然人工堿基，通過含有本發(fā)明的核苷酸的新型密碼子的設(shè)計(jì)，能夠設(shè)計(jì)全新的遺傳密碼，提供新的遺傳密碼世界。而且，通過根據(jù)本發(fā)明的新型密碼子設(shè)計(jì)的tRNA體系，可以設(shè)計(jì)能夠利用非常多的氨基酸的新型蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。能夠利用的氨基酸只要是核糖體中蛋白質(zhì)合成酶系統(tǒng)能夠利用的即可。所以，本發(fā)明提供利用前述本發(fā)明的密碼子的新型蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，能夠用本發(fā)明的核酸高效置換所希望位置的密碼子的核酸，或者通過向密碼子的所希望位置導(dǎo)入本發(fā)明的核酸，能夠制造含有所希望的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。立體結(jié)構(gòu)的解析方法具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核苷酸(例如s)是熒光堿基，以此為堿基的核苷酸具有強(qiáng)熒光特性。具體地說，使6位結(jié)合芳香族雜環(huán)等從而擴(kuò)展了電子共軛體系的嘌呤衍生物容易出現(xiàn)熒光特性。并非限定，但以前就知道2-氨基嘌呤具有熒光特性。所以，并非限定，但尤其是6位結(jié)合芳香族雜環(huán)且2位具有氨基的嘌呤顯示強(qiáng)熒光特性。特別是，s、s，、和v是優(yōu)選的焚光堿基。相對(duì)于以往的技術(shù)，如果能夠以人工堿基對(duì)通過轉(zhuǎn)錄向核酸中的一定位點(diǎn)導(dǎo)入結(jié)合了熒光染料的第5堿基，那么核酸的標(biāo)記以及依賴標(biāo)記的核酸解析、檢測就變得非常簡便。本發(fā)明中使用稱做Pa-s的人工堿基對(duì)，使這些得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明人等以熒光性人工堿基s為探針，位點(diǎn)特異性地?zé)晒鈽?biāo)記酵母tRNAphe,得到了相應(yīng)于標(biāo)記位點(diǎn)、溫度和Mg^濃度的特征性熒光光譜(實(shí)施例3)。進(jìn)而，將熒光光譜與對(duì)應(yīng)于同樣的s標(biāo)記的酵母tRNAPhe的UV光譜相比較。其結(jié)果，得到以下結(jié)論。第一，從含有s的各tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的UV吸收光譜的變化求得的熔解溫度(Tm值)與從天然tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的UV吸收光譜的變化求得的熔解溫度(Tm值)基本相同。這說明這些位置上的s取代并沒有顯著造成tRNA結(jié)構(gòu)整體的不穩(wěn)定化。第二，一定位置含有s的各tRNA顯示反映局部結(jié)構(gòu)特征的熒光強(qiáng)度的特征性變化。也就是在tRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)中，s與鄰近的堿基堆積時(shí)，熒光強(qiáng)度弱，隨著堆積(stacking)程度減少，熒光強(qiáng)度增加。該發(fā)現(xiàn)說明在RNA的一定位置導(dǎo)入s,通過測定例如隨溫度變化的熒光強(qiáng)度變化，能夠掌握高級(jí)結(jié)構(gòu)中的該s的堆積狀態(tài)。所以，作為含有s的RNA的用途，提供該RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)的新解析方法。更具體地，Mg2+(2和5mM)存在下的酵母tRNAPhe的s熒光光譜明確地分為兩個(gè)組。低溫度下，由組l(tRNA16s、17s和47s)發(fā)射的s熒光強(qiáng)度比由組2(RNA36s、57s和59s)發(fā)射的強(qiáng)度大1.7-3.4倍。溫度上升，則由組l發(fā)出的高強(qiáng)度減少，相反由組2發(fā)出的強(qiáng)度上升。這些結(jié)果說明組l的s堿基在生理學(xué)溫度下暴露在溶液中，并且隨著溫度上升發(fā)生折疊結(jié)構(gòu)的變性，s堿基與其它堿基的非特異性相互作用增強(qiáng)。與之形成對(duì)照，對(duì)于組2的堿基，在低溫下的折疊結(jié)構(gòu)中，鄰近的堿基堆積，并且隨溫度上升堿基堆積緩緩變性。該推論與tRNA的晶體結(jié)構(gòu)中各位點(diǎn)上的原有堿基的構(gòu)象(圖4)(非專利文獻(xiàn)20)極為一致。而且，組1的熒光強(qiáng)度在生理學(xué)溫度下隨Mg^的添加而劇烈上升。這說明，在Mg"存在下，tRNA形成活性型的L型結(jié)構(gòu)，這些位置上的堿基配置在外側(cè)。第三，從熒光光i普得到的Tm值與從UV熔解光譜得到的Tm值相比較，反映了tRNA結(jié)構(gòu)中各局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。例如，從tRNA36s的熒光光譜得到的Tm值比從UV光譜得到的Tm值高。這說明與全tRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相比，反密碼子莖環(huán)具有更高的穩(wěn)定性。相反，tRNA16s和17s的低穩(wěn)定性(從熒光光譜得到的低Tm值)說明含有D環(huán)的部分結(jié)構(gòu)可能是tRNA結(jié)構(gòu)整體的脆弱部分。所以通過將從各s標(biāo)記物的熒光光譜得到的Tm值與從UV熔解光譜得到的Tm值相比較，能夠判定經(jīng)s標(biāo)記的局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高低。由此可見，利用s標(biāo)記的位點(diǎn)特異性熒光探針化，可以成為研究三維RNA分子的局部結(jié)構(gòu)特征的有力工具。因而，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的核酸中包含前述具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸的局部區(qū)域的立體結(jié)構(gòu)的解析方法。本發(fā)明的解析方法包括在各種環(huán)境下(如溫度變化、離子(例如鎂)濃度的變化等)測定前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸中堿基來源的熒光強(qiáng)度。在一種實(shí)施方式下，本發(fā)明的解析方法是前述具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核苷酸中的、堿基來源的熒光強(qiáng)度隨溫度的上升而實(shí)質(zhì)上上升時(shí)，判斷為在生物體內(nèi)溫度下，所述核苷酸在立體構(gòu)象上與存在于周圍的核苷酸相堆積；而熒光強(qiáng)度隨溫度上升實(shí)質(zhì)上降低或未上升時(shí)，判斷為在生物體內(nèi)溫度下，所述核苷酸暴露于外部。"生物體內(nèi)溫度"是指各生物體在自然條件下生息時(shí)的體內(nèi)的溫度，其根據(jù)生物種類而變化，例如人是約35.(TC到約39.0°C，牛是約36.7。C到約39.3。C，小鼠是約35.(TC到約39.(TC，狗是約37.9。C到約39.9。C,豬是約38.7。C到約39.8°C。"核苦酸在立體構(gòu)象上與存在于周圍的核苷酸相堆積"更具體地是指2個(gè)以上的i威基在優(yōu)選約5A以內(nèi)堆積的狀態(tài)(stacking)。"核香酸暴露于外部"更具體地是指堿基部分與其它堿基不堆積(優(yōu)選相距約5A以上)的狀態(tài)，或者堿基部分與消光性堿基充分遠(yuǎn)離的狀態(tài)。熒光強(qiáng)度優(yōu)選根據(jù)上述6位取代的9H-嘌呤-9-基的種類，在其顯示最大熒光特性的一定波長測定。例如，在最大激發(fā)波長352nm激發(fā)Bl)2-氨基-6-(2-逸吩基)-9H-噤呤-9-基(s)，其顯示以434nm為中心的熒光波長。同樣，在325nm激發(fā)B2)6-(2-噻吩基)-9H-。票呤-9-基(s，)，其顯示以381nm為中心的熒光波長；在363nm激發(fā)B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基(v),其顯示以461nm為中心的熒光波長。"熒光強(qiáng)度隨溫度的上升而實(shí)質(zhì)上上升"是指例如在溫度從2(TC上升到卯。C時(shí)，能夠確認(rèn)熒光強(qiáng)度上升(例如1.1倍以上)。熒光強(qiáng)度上升的比例越大，就表示在生物體內(nèi)溫度下，該熒光性堿基在立體構(gòu)象上與周圍存在的更多的核苷酸相堆積，和/或與周圍存在的核苷酸更近距離地相堆積。"熒光強(qiáng)度隨溫度上升實(shí)質(zhì)上降低或未上升"是指例如溫度從20。C上升到9(TC時(shí)，能夠確定熒光強(qiáng)度降低(例如減少10%以上)或者未變化。熒光強(qiáng)度降低的比例越大，說明在生物體內(nèi)溫度下該熒光性堿基孤立存在，其所處部分核酸的結(jié)構(gòu)沒有形成一定的結(jié)構(gòu)。核酸的雙鏈形成的纟全測方法本發(fā)明還提供核酸的雙鏈形成的檢測方法，這是根據(jù)本發(fā)明的核酸制備方法制備的含有前述具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸的其它的實(shí)施方式之一。本發(fā)明的檢測方法包括I)使i)的核酸與ii)的核酸雜交，其中i)的核酸是包含所述具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核普酸的核酸，其根據(jù)本發(fā)明的核酸制備方法制備；ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，上述堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-l-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，,4,4，,5，,7,7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，,4,4，,5，，7，7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，,4,7,7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，,4,7，7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-R0X)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX);并且，n)測定焚光光譜的變化。本發(fā)明的核酸雙鏈形成的檢測方法利用了兩種核酸的雜交造成的熒光光譜的變化，一種核酸包含具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸，另一種核酸包含具有5位被熒光染料取代的、5位取代-2-氧代(11"1)吡啶-3-基為堿基的核普酸。正如專利文獻(xiàn)l、2和非專利文獻(xiàn)30等所述，6位取代的9H-噪呤-9-基(例如s、v)可與2-氧代(lH)吡啶-3-基(y)形成堿基對(duì)。而關(guān)于具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷或核苷酸的合成方法，本說明書中另外詳述。6位取代的9H-噤呤-9-基的熒光和與其具有不同性質(zhì)的熒光染料取代的5位取代-2-氧代(lH)吡咬-3-基的焚光存在于各核酸分子中時(shí)，一旦核酸雙鏈形成而焚光之間物理靠近，就會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET:FluorescenceResonanceEnergyTransfer),焚光光"i普發(fā)生變4匕。本發(fā)明的沖全測方法是通過測定由FRET引起的熒光光譜的變化來檢測核酸的雙鏈的形成。"熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)"是指由于共振，激發(fā)能量從某個(gè)熒光分子向其它分子轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。給與能量的分子稱為donor(供體)，接受的分子稱為aceptor(受體)。一旦發(fā)生FRET,失去能量的供體返回基態(tài)，同時(shí)接受能量的受體變成激發(fā)態(tài)。所以，供體的熒光減弱，而如果受體是熒光分子就能夠觀察到其熒光。如果受體是消光分子，那么僅有供體時(shí)觀察到的熒光，由于FRET將不能觀察到。利用FRET的蛋白質(zhì)檢測、核酸檢測的一般方法是周知的，例如向RNA適體中導(dǎo)入2種引起FRET的染料以檢測目標(biāo)蛋白的方法(Jhaverietal.,2000)、利用了發(fā)夾型核酸的互補(bǔ)鏈核酸的檢測方法(Tyagietal.,1996)。其它的，關(guān)于FRET在Walteretal.,2001和Klostermeieretal.，2001上有所概述。發(fā)生FRET需要滿足以下3個(gè)條件i)供體的熒光光譜和受體的吸收光譜有重疊。光譜的重疊范圍越大越好，但沒有必要完全重合。優(yōu)選供體的熒光光譜和受體的吸收光譜30。/。以上重疊，更優(yōu)選50%重疊。ii)供體和受體物理上鄰近。一般認(rèn)為以50%的概率發(fā)生FRET的距離為3nm至6nm，F(xiàn)RET的效率相對(duì)于該距離的變化而敏感地變化。例如，核酸形成雙鏈時(shí)，相對(duì)于以具有熒光特性的6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸，以與之具有不同特性的焚光染料取代的5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸與之相接近，兩者的距離優(yōu)選為10nm以內(nèi)，更優(yōu)選6nm以內(nèi)，最優(yōu)選3nm以內(nèi)時(shí)，能夠檢測出熒光光語的變化。iii)供體與受體的相對(duì)取向合適。在本發(fā)明的檢測方法的一種實(shí)施方式中，含有具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸的核酸，是在其堿基的5位上通過連接物結(jié)合有5-羧基熒光素(5-FAM)或6-羧基熒光素(6-FAM)的含有具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苦酸的核酸。如前所述，例如s的最大激發(fā)波長為353nm，且用352nm的最大激發(fā)波長激發(fā)，則顯示以434nm為中心的波長。另一方面，對(duì)于FAM，F(xiàn)AM的最大吸收波長為493nm,最大熒光波長為522nm。用353nm的波長激發(fā)時(shí)，具有s的核苷酸顯示以434nm為中心的波長。與此相對(duì)，具有FAM取代的5位取代-2-氧代(1H)吡咬-3-基為堿基的核苷酸(例如FAM-y)—接近s,就吸收s放出的焚光，而顯示最大熒光波長為522nm的熒光光譜。也就是說，用353nm的波長激發(fā)時(shí)，434nm的熒光光i普越減少，522nm的熒光光i普越增加，F(xiàn)AM-y就越接近s即含有s的核酸與含有FAM的核酸的雜交，這樣能夠檢測核酸的雙鏈的形成。具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷或核苷酸在具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷或核苷酸中，熒光染料直接或通過連接物與5位相連。關(guān)于這些標(biāo)記核苷或核苷酸，在本發(fā)明人早期提出的專利申請(qǐng)(特愿2004-324271,2004年11月8日申請(qǐng)，未公開)中有詳細(xì)描述。焚光染料可以使用周知的熒光染料，優(yōu)選選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(。TAMRA)、S-二曱氨基-l-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，,4,4，,5，,7,7，-六氯熒光素(5-1^乂)、6-羧基-2,，4,4，,5，,7,7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，,4,7，7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，,4，7,7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)。熒光素和羅丹明一般用開環(huán)型和螺環(huán)型兩種方式表示。關(guān)于這些熒光染料，在例如Tuschletal.,1994;Misraetal.,2004;Gibsonetal.,1996和Chehabetal.，1989中詳細(xì)描述。例如，F(xiàn)AM的最大p及收波長為493nm,最大熒光波長為522nm。此外，TAMRA的最大吸收波長為553nm,最大熒光波長為578nm。DANSYL的最大吸收波長為335nm,最大熒光波長為518nm。HEX的最大吸收波長為535nm,最大焚光波長為556nm。TET的最大吸收波長為521nm,最大熒光波長為536nm。5-ROX的最大吸收波長為567nm，最大熒光波長為591nm。6-ROX的最大吸收波長為570nm,最大熒光波長為590nm。具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷或核苷酸包含其5位取代基團(tuán)作為熒光分子，因而可以根據(jù)熒光分子的種類進(jìn)行核酸的檢測。因此，作為標(biāo)記核酸，可以用作檢驗(yàn)與該核酸相互作用的物質(zhì)的探針。另外，由于各焚光染料不同，熒光的顏色也不同，因此還可以用于多重染色。熒光染料可以與2-氧代(lH)吡啶-3-基的5位直接結(jié)合，或者通過連接物與之結(jié)合。連接物的種類并不特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)采用。并非限定，但連接物優(yōu)選從下述化學(xué)式I-III中選擇[A5]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>[式I中n從1至5的整數(shù)中選擇][化6]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>II[式II中m和1從1至5的整數(shù)中分別獨(dú)立地選擇]和[化7]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷或核苷酸的合成方法并不特別限制?？梢韵?-((3-0-呋喃核糖)-吡啶-2(111)-酮中首先向5位導(dǎo)入取代基，接著導(dǎo)入三磷酸?；蛘?，可以首先向3-((3-D-呋喃核糖)-吡啶-2(lH)-酮中導(dǎo)入三磷酸，接著導(dǎo)入取代基。特別是，導(dǎo)入大的基團(tuán)時(shí)，可以首先向5位導(dǎo)入氨基丙炔基(7纟乂7°口匕。-A)等，在其上連接活化的取代基?；蛘撸鶕?jù)熒光染料不同，具有2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸的修飾可以不是在單個(gè)的核芬酸合成時(shí)進(jìn)行，而是在通過轉(zhuǎn)錄等合成含有該核苷酸的核酸之后進(jìn)行。5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基與6位取代的9H-嘌呤-9-基在兩處形成氳鍵。5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基在立體結(jié)構(gòu)上不能與天然型嘌呤堿基A(腺嘌呤)和G(鳥噪呤)形成堿基對(duì)。而且，6位取代的9H-嘌呤-9-基由于空間位阻不能與天然型T(胸腺嘧咬)、U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)形成堿基對(duì)。所具有6位取代的9H-。票呤-9-基(例如s、v)與5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基可以特異性地形成石成基對(duì)。具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸可以通過轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)插入DNA或RNA等核酸中。具體地，使用含有具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸，例如含有s或v的模板DNA,通過T7RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，則含2-氧代(lH)吡啶-3-基的底物(例如yTP)位點(diǎn)特異性地、以與s或v互補(bǔ)的形式插入到RNA中。對(duì)于y，可以化學(xué)修飾其5位，所以能夠?qū)⒕哂懈鞣N功能的y衍生物插入RNA中的一定位點(diǎn)。或者，可以與具有天然堿基的核苷或核苷酸一樣，通過化學(xué)合成插入DNA或RNA中。制備同一鏈上含有2種人工堿基的核酸的方法本發(fā)明的另一目的是提供一種核酸制備方法，所述核酸在同一鏈上含有下述i)的核苦酸和ii)的核苷酸，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-噪呤_9-基為堿基的核苷酸；ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苦酸，上述堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基小茶磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，，4,4，，5，,7,7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，，4,4，,5，,7,7，-六氯熒光素(6-1^乂)、5-羧基-2，，4,7,7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，,4,7，7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)。本發(fā)明的制備方法包括以含有iii)的核苷酸和iv)的核苷酸的核酸為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，在所述iii)的核苷酸的互補(bǔ)位置組合入所述i)的核苷酸，并且在所述iv)的核苷酸的互補(bǔ)位置組合入所述ii)核苷酸，其中，iii)的核苷酸是具有取代或者無取代的2-甲酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸，iv)的核苷酸是具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸。本發(fā)明的上述制備方法將具有取代或無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸位模板插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸，和具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸位模板5位插入具有取代-2-氧代(1印吡啶-3-基為堿基的核苷酸相組合，并加以利用。本發(fā)明還提供通過上述方法制備的、在同一鏈上含有i)的核苷酸和ii)的核苷酸的核酸，其中，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸；ii)的核苦酸是具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，上述堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有焚光染料，所述熒光染料選自下組S-羧基焚光素(S-FAM)、^羧基熒光素(^FAM)、5_羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，,4，4，，5，，7,7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，,4,4，,5，，7,7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，，4,7，7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，，4，7,7，-四氯焚光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)。本發(fā)明的上述核酸可以用作tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶或者適體。還可以用于RNA干涉(RNAinterference,RNAi)。在本說明書的實(shí)施例4中，以含有Pa和v的DNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，制備了在同一鏈上含有s和y或s和FAM-y的RNA。核酸的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)形成的檢測方法本發(fā)明還包括提供本發(fā)明的核酸的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)形成的檢測方法，所述核酸在同一鏈上含有具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸和具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸。本發(fā)明的檢測方法包括l)在本發(fā)明的核酸中，使i)的核苷酸與ii)的核苷酸雜交；并且，2)測定熒光光語的變化。本發(fā)明的核酸的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)形成的檢測方法利用在前面"核酸的雙鏈形成的檢測方法"項(xiàng)中所述的FRET，也就是說，當(dāng)6位取代的9H-。票呤-9-基的熒光和與之具有不同性質(zhì)的熒光染料取代的5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基的熒光位于"同一分子內(nèi)"時(shí)，如果形成莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)而熒光基團(tuán)之間物理上接近，那么就會(huì)發(fā)生FRET，熒光光譜出現(xiàn)變化。本發(fā)明的檢測方法是通過測定由FRET引起的熒光光譜的變化來檢測檢測核酸的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)的形成?？梢砸耘c觀察單獨(dú)的兩條核酸之間形成雙鏈時(shí)的焚光光譜變化相同的方式，觀察由核酸的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)的形成造成的FRET所引起的熒光光譜變化。本發(fā)明優(yōu)選的一種實(shí)施方式中，核酸的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)是由于下述本發(fā)明的核酸的分子內(nèi)的含有s和FAM-y的自身互補(bǔ)序列形成莖部而形成的，所述本發(fā)明的核酸在同一鏈上含有具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苦酸和具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸。這樣，以核酸分子內(nèi)的s和FAM-y為探針，測定兩者間的FRET效率，可以得知莖環(huán)結(jié)構(gòu)等核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)。如果設(shè)計(jì)僅在其它目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)形成莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)的核酸分子，則用于實(shí)時(shí)分子間相互作用檢測系統(tǒng)、實(shí)時(shí)分子內(nèi)結(jié)構(gòu)變化檢測系統(tǒng)、分子燈標(biāo)、利用FRET效率的分子間距離推測等。目標(biāo)分子包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等。本說明書的實(shí)施例4中，對(duì)于在同一鏈上含有s和FAM-y的RNA分子，研究了s和FAM-y之間的FRET。在本說明書的實(shí)施例4中，當(dāng)在350nm激發(fā)s，無論是形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)而在s與FAM-y之間形成堿基對(duì)時(shí)，還是加入互補(bǔ)鏈RNA形成分子間雙鏈結(jié)構(gòu)而s與FAM-y分離時(shí)，兩種情況均能觀測到FRET,出現(xiàn)FAM-y來源的521nm附近的熒光。但是，比較導(dǎo)入了s和FAM-y的片段的s的熒光強(qiáng)度(圖12b和c的實(shí)線譜的440nm附近的強(qiáng)度)與作為其對(duì)照的導(dǎo)入了s和y的片段的s的熒光強(qiáng)度(圖12b和c的虛線語的440nm附近的強(qiáng)度)，發(fā)現(xiàn)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)s的熒光強(qiáng)度顯著減少。莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的s與FAM-y的距離為8-10A，雙鏈結(jié)構(gòu)中s與FAM-y的距離擴(kuò)大到65-67A。因而，s和FAM-y的距離接近時(shí)，兩者間的FRET效率提高。含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸的核含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。前述核酸中，由于含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸，相鄰的人工堿基之間產(chǎn)生自身消光，所以，與不出現(xiàn)連續(xù)的以9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸的情況相比，此時(shí)9H-噤呤-9-基的熒光強(qiáng)度顯著減少(參照?qǐng)D13c和d)。另一方面，即使在9H-噤呤-9-基之間產(chǎn)生自身消光，通過與5位被熒光染料取代的5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基的雜交，也能夠觀察到9H-嘌呤-9-基與熒光染料之間的FRET(參照?qǐng)D14c和d)。而且，在含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核普酸的核酸中，由于9H-噪呤-9-基的熒光強(qiáng)度減少即背景熒光低，能夠高效地觀察到與熒光染料之間的FRET(參照?qǐng)D15)。也就是說，本發(fā)明的FRET系統(tǒng)使用含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸的自身消光探針，能夠?qū)晒夤w的背景抑制在低水平，所以即使在大量焚光供體探針存在下，也能夠檢測出含有熒光受體的互補(bǔ)鏈，從這方面來講，其是特別有價(jià)值的。含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸可以用于上述核酸的雙鏈形成的檢測方法和核酸的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的4全測方法。在含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸中，連續(xù)的具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苦酸數(shù)只要是兩個(gè)以上即可，沒有特別限制，優(yōu)選為2至10個(gè)、2至5個(gè)、2至3個(gè)，最優(yōu)選2個(gè)。含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸，可以通過本發(fā)明的核酸制備方法或周知的化學(xué)合成來制備，但并不限于此。發(fā)明的效果本發(fā)明提示從發(fā)現(xiàn)了非天然堿基的新型堿基對(duì)Pa-s來看，即使在轉(zhuǎn)錄中，配對(duì)的堿基之間的形狀互補(bǔ)性也很重要(非專利文獻(xiàn)5-6)。由此，即使是在以往認(rèn)為困難的轉(zhuǎn)錄中，也可以插入具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苦酸。與以下以往周知的獲得在希望位置上具有s的RNA的方法相比，本發(fā)明的方法明顯收率更高(l)化學(xué)RNA合成法；(2)含有y核苷酸的模板DNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(3)含有具有2-氧雜-l,3-二氫咪唑-l-基的核苷酸(z)的模板DNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以往的諸如2-氨基。票呤核苷酸類(非專利文獻(xiàn)21-23)的常用熒光探針，由于不能夠通過轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)特異性地插入RNA中，所以特別是很難在長鏈RNA分子中應(yīng)用。也就是說，在以往的方法中，雖然通過化學(xué)合成將2-氨基噤呤的核苷酸衍生物導(dǎo)入RNA中，但在RNA的化學(xué)合成法中，合成長鏈的RNA(50個(gè)核苷酸以上)困難，其操作也復(fù)雜其花費(fèi)時(shí)間。其結(jié)果是，以往的方法的應(yīng)用受到限制。與此相對(duì)，本發(fā)明中可以將具有熒光特性的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核香酸位點(diǎn)特異性地插入RNA中。本發(fā)明中，雖然需要化學(xué)合成用作模板的DNA,但與RNA相比，DNA的化學(xué)合成可以合成更長的鏈長(150個(gè)核苦酸左右)，且化學(xué)合成的DNA還能夠用酶連接。這樣，使以往的熒光探針法做不到的長鏈RNA分析得以實(shí)現(xiàn)。這可以成為大RNA分子內(nèi)一定位置的局部構(gòu)象變化動(dòng)態(tài)研究的最強(qiáng)有力工具。在本發(fā)明的實(shí)施例3中，實(shí)際上進(jìn)行了tRNA內(nèi)局部高級(jí)結(jié)構(gòu)的解析。此外，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了RNA干涉等RNA在生物體內(nèi)的許多新功能，利用這些現(xiàn)象的醫(yī)藥品的開發(fā)也正在進(jìn)行。但是，研究這些RNA分子的生物體內(nèi)行為的方法并不多。所以，本熒光探針法成為生物體內(nèi)的RNA解析以及研究RNA醫(yī)藥品在生物體內(nèi)的作用的良好方法。而且，本發(fā)明中最新闡明的s-Pa堿基對(duì)能夠通過翻譯將氨基酸類似物位點(diǎn)特異性地插入蛋白質(zhì)中，所以可以實(shí)際應(yīng)用于基因密碼的擴(kuò)展。(圖l)圖1顯示非天然型s-Pa(A)堿基對(duì)和s-z(B)堿基對(duì)。(圖2)圖2顯示s-Pa堿基對(duì)介導(dǎo)的T7轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)方案，和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。圖2A:實(shí)驗(yàn)方案圖2B:使用含有1個(gè)或2個(gè)Pa或z石咸基的模板DNA、加入天然NTPs(lmM)和sTP(lmM)時(shí)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的凝膠電泳。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用[y-32P]GTP的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的收率進(jìn)行比較來決定，各收率從34個(gè)數(shù)據(jù)組求平均值得到。(圖3)圖3顯示由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(17-mer)的核酸酶消化獲得的標(biāo)記核糖核香3，-一磷酸的2D-TLC分析。其為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用[a盧P]NTP內(nèi)部標(biāo)記、由在lmMsTP存在下轉(zhuǎn)錄的17-mer片段得到的二維TLC。中圖中模板DNA中的N,N2N3為PaAC，右圖中的N,N2N3為CAC。(圖4)圖4顯示向酵母來源的tRNAPhe中導(dǎo)入s的位點(diǎn)和tRNA的結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)20)。圖4是原始tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的二維結(jié)構(gòu)。s取代的位置用O圈出。虛線顯示三維結(jié)構(gòu)上的堿基-堿基相互作用。劃框的G-C對(duì)從原始的C-G-對(duì)變化而來，該變化未顯著改變?cè)紅RNA的結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)26)。(圖5)圖5顯示向酵母來源的tRNAPhe中導(dǎo)入s的位點(diǎn)和tRNA的結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)20)。圖5是原型tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)。(圖6)圖6AC是包括向酵母來源的tRNAPhe中導(dǎo)入s的位點(diǎn)的區(qū)域的擴(kuò)大圖。深色的堿基(群)是取代為s的位點(diǎn)，這些堿基與淺色堿基(群)堆積，且球(黃色)表示Mg2+。圖中的堿基表示被修飾的堿基，括號(hào)內(nèi)記載的堿基相當(dāng)于原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的堿基。(圖7)圖7A顯示s的核糖核苷(lpM)的激發(fā)和熒光光譜。黑圓實(shí)線表示用352nm激發(fā)的熒光光譜。白圓虛線表示用434nm激發(fā)的熒光光譜。圖7B和C顯示用352nm激發(fā)的(B)tRNA47s(lMM)的熒光光譜；和(C)tRNA57s(ljuM)的熒光光譜。焚光光譜在50mM二曱胂酸鈉(pH7.2)、50mMKCl和0.1mMEDTA中，20。C下測定。(B)中黑圓實(shí)線、白圓實(shí)線和x實(shí)線分別表示tRNA47s在OmMMg2+、2mMMg2+和5mMMg"存在下的熒光光譜。(C)中黑圓實(shí)線、白圓實(shí)線和x實(shí)線分別表示tRNA57s在OmMMg2+、2mMMg2+和5mMMg"存在下的熒光光譜。(圖8)圖8顯示(A)s核糖核苷的焚光強(qiáng)度的溫度依賴性，(B)用s的核糖核苷修正tRNA36s的焚光強(qiáng)度的實(shí)例。tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度通過等式Y(jié)ct=Yt/(Rt/R20)來修正。其中，Yet是t。C的各tRNA的修正后強(qiáng)度，Yt是t。C的各tRNA的測定熒光強(qiáng)度，Rt是t。C的s的核糖核苷的觀察到的焚光強(qiáng)度，R20是20'C的s的核糖核苷的觀測到的熒光強(qiáng)度。(圖9)顯示在各種位置包含s的tRNA的、通過434nm的熒光強(qiáng)度變化求得的熔解曲線(實(shí)線)和通過260nm的UV吸收變化求得的熔解曲線(虛線)。粗(黑)實(shí)線、中(藍(lán))實(shí)線、細(xì)實(shí)線(紅)分別表示通過OmMMg"、2mMMg2+和5mMMg"存在下的434nm的焚光強(qiáng)度變化求得的熔解曲線。粗(黑)虛線、中(藍(lán))虛線、細(xì)虛線(紅)分別表示通過OmMMg2+、2mMMg2+和5mMMg2+存在下的260nm的熒光強(qiáng)度變化求得的熔解曲線。(圖IO)顯示通過利用v-y堿基對(duì)和s-Pa堿基對(duì)的轉(zhuǎn)錄，將y和s位點(diǎn)特異性地導(dǎo)入RNA中的方法，和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳結(jié)果。在圖10a中，序列中的P表示人工》咸基Pa。(圖ll)圖11顯示通過利用v-y堿基對(duì)和s-Pa堿基對(duì)的轉(zhuǎn)錄制備的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Bhp2-1)的核苷酸組成的分析結(jié)果。在圖lib中，各點(diǎn)的定量歸納于表4中。(圖12)圖12顯示導(dǎo)入了人工堿基s和y或FAM-y的RNA(Bhp2-l)的熒光測定結(jié)果。圖12b顯示Bhp2-l與互補(bǔ)性RNA形成雙鏈時(shí)的熒光光語。圖12c顯示Bhp2-l單鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)的結(jié)果。圖12b和圖12c兩者中，實(shí)線為13位有FAM-y、36位有s的Bhp2-1的結(jié)果，虛線為13位有y、36位有s的Bhp2-l的結(jié)果。(圖13)圖Ua為磷酸緩沖液(pH7.0)中s脫氧核糖核苷(細(xì)線)和FAM-yTP(粗線)的熒光(flu，黑線)和吸收(abs,虛線)光譜。圖13b是FRET實(shí)驗(yàn)的方案。對(duì)于非天然堿基，當(dāng)對(duì)s或v進(jìn)行激發(fā)(^)時(shí)，用黑圓表示低焚光狀態(tài)，用白圓表示高焚光狀態(tài)。圖13c和d是包含s堿基(c:DNA35sl、DNA35s2a和DNA35s2b)和包含v堿基(c:DNA35vl、DNA35v2a和DNA35v2b)的單鏈DNA的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜。(圖14)圖14顯示DNA/RNA雙鏈的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光語。使各35-merDNA(a，DNA35sl;b,DNA35vl;c,DNA35s2a;d,DNA35v2a;e,DNA35s2b;f,DNA35v2b)與含有FAM-y(白圓和黑圓)或FAM-hx-y(白三角或黑三角)的17-merRNA雜交。白圓和白三角是20°C的光鐠，黑圓和黑三角是70°C的光譜。(圖15)圖15顯示過量使用含有人工堿基的DNA探針時(shí)的DNA/RNA雙鏈的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)光光譜。使各35-merDNA(l)iM)(a,DNA35sl;b，DNA35vl;c,DNA35s2a;d，DNA35v2a)與含有FAM-y(白圓和黑圓)或FAM-hx-y(白三角和黑三角)的17-merRNA(100nM)雜交。白圓和白三角是20°C的光譜，黑圓和黑三角是70。C的光譜。實(shí)施例以下通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但這些并不限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書的描述可以很容易地對(duì)本發(fā)明加以修飾、變更，這些全部包括在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1:利用s-Pa堿基配對(duì)的T7轉(zhuǎn)錄在本實(shí)施例中，利用s-Pa堿基對(duì)進(jìn)行T7轉(zhuǎn)錄。1)試劑、溶劑等試劑和溶劑從標(biāo)準(zhǔn)的供應(yīng)商購入，不需進(jìn)一步純化即可使用。電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)在WatersZMD4000LC/MS系統(tǒng)上進(jìn)行記錄(記鉍)。DNA模板是使用Pa(非專利文獻(xiàn)9)和天然堿基的磷酰胺類，通過自動(dòng)DNA合成儀(model392,PerkinElmerAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)化學(xué)合成的。用凝膠電泳純化了寡核苷酸。2)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9-(l-(3-D-呋喃核糖)嘌呤5，-三磷酸(sTP)的合成將2->^苯氧乙酰-6-(2-噻吩基)-9-(2,3-二-0-乙酰-1-(3-D-呋喃核糖)噤呤(57mg，O.lmmol)(非專利文獻(xiàn)29)溶解到吡啶中，在真空下蒸餾除去溶劑，共沸除去樣品中的水分。將殘?jiān)芙獾竭拎?100pl)和二氧雜環(huán)己烷(300W)中。接著，添加2-氯-4H-l,2,3-苯并二氧雜二乙氧磷酰硫膽堿(《乂乂"^才年廿爾77才yy)-4-酮(0.11mmol)的1M二氧雜環(huán)己烷溶液(100nl)(非專利文獻(xiàn)25)。IO分鐘后，向該溶液中快速添加0.5M雙(三丁基銨)焦磷酸(0.15mmo1)的DMF溶液(300(il)和三-正丁基胺(100pl)。將該反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。接著加入1。/。碘溶液(p比啶/水(98:2,v/v)溶液，2ml)。15分鐘后，向反應(yīng)溶液中加入5。/。NaHSO3水溶液(150^d),接著，向反應(yīng)液中加入5ml的水。將溶液在室溫?cái)嚢?0分鐘，然后加入濃氨水(20ml)。在55。C氨解12小時(shí)。在真空下濃縮溶液，并依次通過DEAESephadex(A-25)柱層析(50mM至1MTEAB的線性梯度洗脫)、C18-HPLC(100mM醋酸三乙基胺中的0%至30%的CH3CN梯度洗脫)(帶有EichoromTechnologies公司的SynchropakRPP的GilsonHPLC純化系統(tǒng))來純化產(chǎn)物，得到了sTP。[化8]'HNMR(270MHz,D!O)d，.U(t,27H,J=7.3Hz),3.05(Q,18H,J=7.3and14.8Hz)，4.19(m,2H),4.32(n,，H),4.56(n,1H)，4.83(n,1H),5.94(d,1H,J=5.9Hz),7.19(dd,1H,J-4.0and4.9Hz),7.66(d,1H，J-4.SHz)，B.16(d,1H，J-4,0Hz),8.33(s,1H)."PNMR(109MHz,D!O)S-22.38(t,1H,J=19.5and20.1Hz),-10.68(d,1H,J-19.5Hz〉，-9.24(d,1H,J-20.1Hz〉.ES卜USforC"H，7Ns0,3P,S(M-H〉calcd,587.38;found,587.70.3)用于T7轉(zhuǎn)錄的模板的制備將化學(xué)合成的DNA模板(用于17-merRNA合成的、10pM的35-mer的編碼鏈和21-mer的非編碼鏈)，在含有10mMNaCl的10mMTris-HCl(pH7.6)緩沖液中95。C加熱，然后漸漸冷卻到4。C,進(jìn)行了退火。4)T7轉(zhuǎn)錄(17-merRNA)在含有24mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01%TritonX-100的40mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液(20pl)中，在ImM天然NTPs或ImMsTP、2pCi[Y-32P]GTP、2pM模板和50單位T7RNA聚合酶(Takara,Kyoto)的存在下進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。通過使用[y-^P]GTP,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物僅5，末端被標(biāo)記，由此求出了收率。在37。C溫育3小時(shí)后，通過加入含有10M尿素和0.05%BPB的染料溶液(20nl)終止反應(yīng)。將混合物在75。C加熱3小時(shí)，在20。/。聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠上對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了分析。5)結(jié)果在本實(shí)施例中，使用s(sTP)底物和下述DNA模板進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄，所述DNA模板含有1個(gè)或2個(gè)Pa堿基，非天然堿基位于相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的13-15位的互補(bǔ)位置上。圖2A表示實(shí)驗(yàn)方案。圖2A中，用于合成17-merRNA的10|iM的35-mer的編碼鏈和21-mer的非編碼鏈的序列，和17-merRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基序列如下。模板互補(bǔ)鏈(序列編號(hào)1)5，-ataatacgactcactataggg-3，模板鏈(序列編號(hào)2)3'-tattatgctgagtgatatccctcgaagggannntc-5'17-merRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(序列編號(hào)3)5，-gggagcuucccunnnag-3'作為對(duì)照，本發(fā)明人等還研究了另一DNA模板(圖1B),其含有咪唑啉-2-酮(2);z是通過T7轉(zhuǎn)錄向RNA中位點(diǎn)特異性地插入s的良好模板堿基，但轉(zhuǎn)錄效率比天然轉(zhuǎn)錄低。s-z對(duì)可以在堿基之間形成2個(gè)氬鍵，其形式與s-Pa類似。用這些模板進(jìn)行3小時(shí)轉(zhuǎn)錄，將用[Y-"P]GTP標(biāo)記了5'末端的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在凝膠電泳上進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2B所示。具體地說，圖2B是用含有1個(gè)或者2個(gè)Pa或zi威基的模板，加入天然型NTP(lmM,N=A，G,C,U)和sTP(lmM)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物的凝膠電泳的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用[Y-"P]GTP標(biāo)記了其5，末端。以僅由天然型堿基組成的模板的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為100%,各轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相對(duì)收率與之相比較來確定。各收率取3-4個(gè)數(shù)據(jù)組的平均值。如圖2B所示，來自含有1個(gè)Pa的模板DNA的全長(17-mer)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(含有1個(gè)s堿基)的相對(duì)收率為92%(圖2B，泳道1，N廣Pa),這比來自含有1個(gè)z的模板DNA的轉(zhuǎn)錄收率(35。/o)(圖2B，泳道4)要高，且與使用僅有天然型的模板(N廣C)和NTP的轉(zhuǎn)錄的收率(圖2B,泳道8)基本上同樣高。在使用含有2個(gè)Pa堿基的模板的轉(zhuǎn)錄中，其相對(duì)收率比天然型的轉(zhuǎn)錄(圖2B，泳道8)低，但能夠得到全長的產(chǎn)物(圖2B，泳道2和3)。作為對(duì)照，在使用含有2個(gè)z的模板的轉(zhuǎn)錄中，不能得到全長的轉(zhuǎn)錄物(圖2B，泳道5和6)。實(shí)施例2:T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(17-merRNA)中的核苷酸組成分析在本實(shí)施例中，為了研究轉(zhuǎn)錄中s-Pa堿基對(duì)的選擇性，進(jìn)行了Pa、z、和天然模板的轉(zhuǎn)錄中得到的全長(17-mer)轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸的組成分析。用[a-32P]UTP、[a-32P]ATP或[a-"P]GTP中的一種內(nèi)部標(biāo)記轉(zhuǎn)錄物，用RNA酶T2將該轉(zhuǎn)錄物完全分解成核苷3，磷酸體。用2D-TLC分析得到的標(biāo)記核苷酸(圖3)，并對(duì)各核苷3，一磷酸的點(diǎn)進(jìn)行了定量(表1)。具體地，在含有24mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01%TritonX-100的40mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液(20jil)中,在10mMGMP、lmM天然型NTP(lmM,N-A,G，C,U)、0或1或3mMsTP、2pC%-P]UTP或[y-32p]ATP或[y-32p]GTP(Amersham)、2jiM模板DNA和50單位T7RNA聚合酶(Takara)(非專利文獻(xiàn)14、15)的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在37。C溫育3小時(shí)后，加入染料溶液終止了反應(yīng)。將混合物在75。C加熱3小時(shí)，然后用15。/。聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠進(jìn)行了電泳。從凝膠中洗脫出全長產(chǎn)物，并向其中加入0.05A26o單位的大腸桿菌來源的tRNA,乙醇沉淀產(chǎn)物。將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在15mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中用0.075U/pl的RNA酶T2在37。C消化2小時(shí)。通過該處理，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被RNA酶T2完全分解成核苷3'-—^岸酸。對(duì)于消化產(chǎn)物，通過使用MerckHPTLC板(100x100mm)(Merck,Darmstadt,Germany)的2D-TLC進(jìn)行了分析。使用的展開溶劑第一維為異丁酸/NH40H/H20(66:1:33v/v/v),第二維為異丙醇/HCl/H20(70:15:15v/v/v)。用BiolmageAnalyzer分析了TLC板上的產(chǎn)物。各點(diǎn)的定量是從3-9個(gè)數(shù)據(jù)組求平均值。結(jié)果如圖3所示。將定量各核苷3，-一磷酸的結(jié)果歸納在表1中。表1T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核苷酸組成分析<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>a:圖2所示轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的插入在U(編號(hào)1-8)、A(編號(hào)9-12)或G(編號(hào)13-16)的5'側(cè)的核苷酸的組成。b:該值用下式確定(各核苷酸的放射活性)/(全部的核苷酸3'-—磷酸)x([a-"p]NTP的5，側(cè)的核苷酸總數(shù))c:各核苷酸的理論數(shù)用中括號(hào)表示。d:標(biāo)準(zhǔn)偏差用括號(hào)表示e:沒有纟全測到根據(jù)圖3和表1所示的結(jié)果，可以確認(rèn)使用含有1個(gè)Pa堿基的模板時(shí)，以高選擇性地向RNA中插入s。在圖3中，僅在使用含有Pa的模板、用[y-32P]UTP進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，能夠在2D-TLC上觀察到標(biāo)記的s-核苷3，-一磷酸。根據(jù)表1所示，與模板DNA中的Pa互補(bǔ)地向RNA中插入s的選擇性(97%)(表1,編號(hào)l)與使用s-z堿基對(duì)時(shí)的選擇性(表1，編號(hào)2)或僅使用天然堿基對(duì)轉(zhuǎn)錄時(shí)的選擇性基本上同樣高(表1，編號(hào)3和5),且未觀察到與模板中的天然堿基互補(bǔ)的、錯(cuò)誤的sTP的插入(表1，編號(hào)4和6)。使用含有2個(gè)Pa堿基的模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，在第1個(gè)位置上插入s的選擇性非常高(95%)，但在第2個(gè)位置上插入s的選擇性為84-87%左右。但是，通過提高sTP的濃度(3mM)，該選擇性得到一定程度(89-93%)改善。所以，作為用于向RNA中位點(diǎn)特異性地插入s的模板堿基，Pa比z更好，而且，該結(jié)果提示非氬鍵性堿基對(duì)也能夠在轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮機(jī)能。實(shí)施例3:16s、17s、36s、47s、57s和59stRNA的制備及其熒光光譜和UV熔解曲線1)16s、17s、36s、47s、57s和59stRNA的制備為了顯示s堿基作為熒光探針的有用性，本發(fā)明人等將s插入酵母來源的tRNA的一定位點(diǎn)，且通過在各種條件下分析tRNA的各位點(diǎn)的s的熒光特性，研究了tRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)。由于s堿基的熒光會(huì)因鄰近堿基的堿基堆積(stacking)而消光，所以可以得到RNA分子中s周圍的局部結(jié)構(gòu)的信息。發(fā)明人等向tRNA中的6處分別導(dǎo)入了s:具體地是D-環(huán)中的第16位或者第17位(tRNA16s或17s)、反密碼子中的第36位(tRNA36s)、額外環(huán)(工年7卜，/P—7。)中的第47位(tRNA47s)和TWC環(huán)中的第57位或第59位(tRNA57s或59s)。各位點(diǎn)的s被導(dǎo)入不與tRNA中的其它堿基形成堿基對(duì)的位點(diǎn)(圖4)。制備含有s的酵母tRNAPhe分子的各模板序列(用于RNA合成的5(iM的94-mer模板DNA及其互補(bǔ)鏈DNA)如以下表2所示(序列編號(hào)4-11)。[表2]l.舍有s的tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的DNA才莫板序列全tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的非模板鏈(94-mer)ArAArACGACTCACTATAGGGGATTTAGCTCAGTTGGGAGAGCGCCAGACTGAAGATCTGGAGGTCCTGTGTTCGATCCACAGAATTCCCACCA(序列編號(hào):4)原始tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的模板鏈(94-mer)(Tm-2'-OMe-T,Gm=2'-OMe-G)TmGmGTGGGAATTCTGTGGATCGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGCGCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列編號(hào):5)tRNA36s的模板鏈(94-mer)(Tm=2'-OMe-T，Gm=2'-OMe-G)TmGmGTGGGAATTCTGTGGATCGAACACAGGACCTCCAGATCPaTCAGTCTGGCGCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列編號(hào):8)tRNA47s的模板鏈(94-mer)(Tm=2'-OMe-T，Gm=2'-OMe-G)TmGmGTGGGAATTCTGTGGATCGAACACAGGPaCCTCCAGArCTTCAGTCTGGCGCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列編號(hào):9)tRNA57s的模板鏈(94-mer)(Tra=2'-OMe-T,Gm=2'-OMe-G)TmGmGTGGGAATTCTGTGGATPaGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGCGCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列編號(hào)10)tRNA59s的模板鏈(94-mer)(Tm=2'-OMe-T，Gm=2'-OMe-G)TraGmGTGGGAATTCTGTGGPaTCGAACACAGGACCTCCAGATCTTCAGTCTGGCGCTCTCCCAACTGAGCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAT(序列編號(hào):11)用于RNA合成的5pM的94-mer模板DNA及其互補(bǔ)鏈DNA序列該序列中，C2-G71堿基對(duì)用G2-C71(非專利文獻(xiàn)26)取代。通過用2，-0-曱基核糖核苷取代模板鏈DNA的5，末端的2個(gè)核苷(G和T)，來抑制比目的產(chǎn)物更長的非模板依賴性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生成(非專利文獻(xiàn)27)。用于RNA合成的94-mer模板DNA及其互補(bǔ)鏈DNA的制備按與實(shí)施例l中的"3)用于T7轉(zhuǎn)錄的模板的制備"項(xiàng)所述相同的方式進(jìn)行。圖4-6中顯示了酵母來源的tRNAPhe中的s導(dǎo)入位點(diǎn)和tRNA的結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)20)。圖4是原始的tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。s取代的堿基以〇圈出。虛線表示堿基-堿基相互作用。劃框的G-C堿基對(duì)在原始的tRNA中是C-G堿基對(duì)，但該取代中tRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)26)沒有明顯變化。圖5是天然tRNA的三維結(jié)構(gòu)，圖6A-C表示插入了s的各位點(diǎn)的擴(kuò)大圖。深色堿基(群)被取代成s,其與淺色堿基(群)堆積。而且，球(黃色)表示tRNA中的Mg"。圖中的堿基表示在天然tRNA中被修飾的堿基，括號(hào)內(nèi)所述的堿基表示轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的堿基。各位點(diǎn)導(dǎo)入了s的tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是用含有Pa的模板DNA，在lmMs丁P和天然NTPs存在下通過T7RNA聚合酶來制備的。具體地，首先在含有24mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、O.OlQ/oTritonX-100的40mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液中，在10mMGMP、lmM天然NTPs、lmMsTP、0.5liM模板DNA和2.5U4dT7RNA聚合酶的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在37。C溫育6小時(shí)后，加入1.75倍的染料溶液終止轉(zhuǎn)錄。將該溶液在75。C加熱3小時(shí)，用10。/。聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠進(jìn)行了電泳。從膠中洗脫出全長產(chǎn)物，乙醇沉淀。將產(chǎn)物溶解在450nl的10mMEDTA(pH8)中，75。C溫育5分鐘。接著，用MicroconYM-10過濾器(Amicon),將緩沖液交換成測定Tm用的緩沖液(含有50mM二曱胂酸鈉(pH7.2)和50mMKC1)。通過260nm的吸光度確定tRNA的量。而且，為了熒光和UV熔解測定，配制了溶液，使得在含0.lmMEDTA、2mM或5mMMgCl2的Tm緩沖液中含有1pMtRNA。2)熒光光譜和UV熔解曲線在20到90。C的范圍，以0.5。C/分鐘的加熱速度，用FP-6500熒光光語儀(JASCO)和UV-2450分光光度計(jì)(SHIMADZU)記錄了一定位點(diǎn)含有s的各tRNA的熒光光譜和UV熔解曲線。s堿基具有2個(gè)最大激發(fā)波長(299和352nm),圖7A表示核糖核苷(l(iM)的激發(fā)和熒光光譜。由圖7A可見，s顯示以434nm為中心的熒光光譜，其熒光量子產(chǎn)率在pH7.0下為0.41。圖7B和C表示在352nm激發(fā)的(B)tRNA47s(lj^M)的熒光光譜和(C)tRNA57s(l[iM)的熒光光譜。熒光光譜是在50mM二曱胂酸鈉(pH7.2)、50mMKC1和0.lmMEDTA中、在20°C測定的。本實(shí)施例是在含50mM二曱胂酸鈉(pH7.2)、50mMKC1和O.lmMEDTA，或者不含EDTA而加入2mM或5mMMgCl2的溶液中，測定(以352nm為中心、以3nm的光譜帶寬激發(fā)的)s在434nm的熒光強(qiáng)度和260nm的UV吸收，研究了各tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(lpM)的熱力學(xué)熔解曲線。因與溶劑分子撞擊而產(chǎn)生的s的消光，溫度越高就越容易發(fā)生(圖8A)。所以，通過s的核香單體歸一化了各tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化。利用IGORPro軟件(WaveMetrics.Inc.)計(jì)算了通過熒光強(qiáng)度隨溫度的變化求得的tRNA熔解溫度。具體地，圖8中，(A)表示s的核糖核苷的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化，(B)表示對(duì)s的核糖核苷的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化進(jìn)行了修正后的tRNA36s熒光強(qiáng)度的溫度依賴性。tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度通過等式Y(jié)ct=Yt/(Rt/R20)來修正。其中，Yet是t°C的各tRNA的修正后強(qiáng)度，Yt是fC的各tRNA實(shí)際測得的熒光強(qiáng)度，Rt是t。C的s的核糖核苷的熒光強(qiáng)度，R20是2(TC的s的核糖核苷的熒光強(qiáng)度。3)結(jié)果對(duì)于16s、17s、36s、47s、57s和59stRNA,通過434nm的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化求得的熔解曲線(實(shí)線)和通過260nm的UV吸收變化求得的熔解曲線(虛線)如圖9所示。首先，第一，含有s的各tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的UV熔解溫度(2mMMgCl2中，64.6-66.4。C)與天然tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的熔解溫度(2mMMgCl2中，65.5°C)基本上同樣高。這說明這些位置即使用s取代，也不會(huì)顯著造成tRNA結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定化。第二，在一定位置含有s的各tRNA顯示反映局部結(jié)構(gòu)特征的熒光強(qiáng)度的特征變化。Mg、2和5mM)存在下的熒光特性明確地分為兩組一組包括tRNA16s、17s和47s(組1)，另一組包括tRNA36s、57s和59s(組2)。在2mM或5mMMg"+存在下，低溫度下的組1的s的熒光強(qiáng)度比組2的s的熒光強(qiáng)度大1.7-3.4倍。組1的高s菱光強(qiáng)度隨溫度上升而減少，組2的s熒光強(qiáng)度隨溫度上升而增大。這些結(jié)果說明，第16、17或47位的s堿基在生理學(xué)溫度下暴露在溶液中，并且伴隨著溫度上升引起的tRNA變性，s堿基與其它堿基的非特異性相互作用增強(qiáng)。與之形成對(duì)照，對(duì)于第36、57或59位的s堿基，在低溫下，其在形成L型結(jié)構(gòu)的tRNA中與鄰近的堿基堆積，并且由于溫度上升，tRNA緩慢變性，s與鄰近堿基的堆積結(jié)構(gòu)被破壞。該推論與由X射線晶體結(jié)構(gòu)解析得到tRNA的L型結(jié)構(gòu)中各位點(diǎn)上原有堿基的構(gòu)象(圖4)(非專利文獻(xiàn)Z0)極為一致。tKNA16s、17s和47s的焚光強(qiáng)度在生理學(xué)溫度下由于Mg2+的添加而劇烈上升。這說明，通過Mg"與tRNA的結(jié)合，tRNA形成L型結(jié)構(gòu)，其結(jié)果是處于這些位置的堿基被配置在暴露于溶液中的位置。第三，從熒光光鐠得到的Tm值與從UV熔解光譜得到的Tm值相比較，反映了tRNA結(jié)構(gòu)中各局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。表3中顯示了從一定位點(diǎn)含有s的酵母來源的tRNAphe的焚光和UV光語得到的熔解溫度(Tm)。表3從一定位點(diǎn)含有s的酵母來源的tRNAPhe的焚光和UV光語得到的熔解溫度(Tm)表3<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>熒光和UV光諳是在50mM二曱胂酸鈉(pH7.2)和50mMKC1中，在Mg"共存下或者非共存下，使用各tRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(lpM)得到的。各個(gè)熔解溫度用IgorPro軟件(WaveMetrics.Inc.)計(jì)算得到。未計(jì)算n.c.。例如，從tRNA36s的焚光光譜得到的Tm值(2mMMgCl2中，69.5°C)比從其UV光鐠得到的Tm值(2mMMgCl2中，65.2。C)高。這說明與tRNA整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相比，反密碼子莖環(huán)具有更高的穩(wěn)定性。與之形成對(duì)照，tRNA16s(2mMMgCl2中，58.0。C)和17s(2mMMgCl2中，59.6。C)的低穩(wěn)定性說明含有D環(huán)的局部結(jié)構(gòu)是tRNA整體結(jié)構(gòu)的脆弱部分。實(shí)施例4:含有人工堿基s和FAM-y的RNA鏈的FRET實(shí)驗(yàn)通過將s-Pa堿基對(duì)用于轉(zhuǎn)錄，能夠向RNA中高效導(dǎo)入熒光性人工堿基s。通過將該s-Pa堿基對(duì)與本發(fā)明人等已經(jīng)開發(fā)的v-y堿基對(duì)組合，能夠?qū)和y或者s和5位修H:年的y分別導(dǎo)入一條RNA中的任意位置。特別是通過利用導(dǎo)入了FAM的y,能夠觀察s與FAM-y之間的FRET。在本實(shí)施例中，化學(xué)合成了各位點(diǎn)導(dǎo)入了Pa和v的轉(zhuǎn)錄用模板DNA,使用這些模板和s與y或FAM-y的各種底物(sTP、yTP、FAM-yTP)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。通過T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(一定位點(diǎn)上含有s和y的RNA3屮mer的解析)雙鏈模板DNA(5nM)的退火操作在含有10mMNaCl的10mMTris-HCl緩沖液(pH7.6)中進(jìn)行(溫度條件95。C加熱3分鐘后，以-0.1。C/秒的梯度漸漸冷卻到4°C)。T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在含有40mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液、8mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01%TritonX-IOO、2(iCi|>32P]GTP、lmMNTPs、O-lmMsTP、O-lmMyTP、0.5jiM模板DNA和50單位T7RNA聚合酶(Takara)的反應(yīng)溶液(總量20(il)中進(jìn)行。在37。C反應(yīng)3小時(shí)后，加入等量(20pl)的含有10M尿素的電泳用染料溶液終止反應(yīng)。該溶液在75。C加熱3分鐘后，用15%聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠進(jìn)行電泳，用BiolmageAnalyzer(生物影像分析儀)解析了轉(zhuǎn)錄物。通過T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在含有40mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液、8mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01%TritonX-100、2fiCi[a-32P]ATP或2pCi[a陽32p]GTP或2nCi[a-32P]CTP或2^a[a-32P]UTP、lmMNTPs、O-lmMsTP、O-lmMyTP、0.5|aM模板DNA和50單位T7RNA聚合酶(Takara)的反應(yīng)溶液中進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄物用15%聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠進(jìn)行電泳來純化，并從凝膠中洗脫，然后加入tRNA(0.05OD),進(jìn)行乙醇沉淀回收。將該樣品溶解到lOjil滅菌水中，取溶液(8.5pl)用RNA酶T2進(jìn)行完全分解反應(yīng)。向溶液(8.5nl)中加入RNA酶T2(1.5nl、0.5U/pl),37。C反應(yīng)2小時(shí)。將該溶液的一部分點(diǎn)樣到TLC(Merck,10cmxl0cm),進(jìn)行二維展開。展開液第一維使用異丁酸濃氨水水-66:l:33(v/v/v)，第二維使用2-丙醇鹽酸水=65:10:25(v/v/v)。展開后的點(diǎn)用BiolmageAnalyzer檢測，進(jìn)行了解析(圖11,表4)。通過T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(一定位點(diǎn)上含有s和y，或者s和FAM-y的RNA39-mer的解析)T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在含有40mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液、8mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01%TritonX-100、lmMNTPs、ImMsTP、ImMyTP或lmMFAM-yTP、0.5)iM模板DNA和125單位T7RNA聚合酶(Takara)的反應(yīng)溶液(總量50pl)中進(jìn)行。在37。C進(jìn)行反應(yīng)6小時(shí)后，加入DNaseI溶液，在37。C保溫15分鐘以分解模板DNA。加入等量(50pl)的含有IOM尿素的電泳用染料溶液終止反應(yīng)后，將反應(yīng)溶液在75。C加熱3分鐘，然后用15%聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠進(jìn)行電泳，純化了目的轉(zhuǎn)錄物39-mer。用滅菌水從凝膠洗脫后，進(jìn)行乙醇沉淀，回收轉(zhuǎn)錄物，從UV吸收確定目的轉(zhuǎn)錄物RNA39-mer的濃度。熒光光譜測定使用一定位點(diǎn)含有s和y或者s和FAM-y的RNA39-mer(0.2(JVI),在20。C測定了其在10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、100mMNaCl、O.lmMEDTA中熒光光譜。在測定前的RNA樣品的退火操作中，將含有RNA39-mer(0.2(oM)的溶液，和含有RNA-39mer和具有與該39-mer互補(bǔ)的序列的互補(bǔ)RNA42-mer(0.4pM)的溶液在75。C加熱3分鐘后，以-0.1。C/3秒的梯度漸漸冷卻到4。C。進(jìn)行了退火操作之后的樣品在4。C保存，測定時(shí)將樣品移至測定池，在20。C放置2分鐘以上后，再開始光譜掃描(360-650nm)。熒光測定(激發(fā)波長350nm)使用3x3mm比色池，響應(yīng)0.5s、掃描速度2000nm/分、靈敏度按照手冊(cè)設(shè)定固定在PMT500V、狹縫寬度固定在5nm，進(jìn)行了光鐠測定(圖12)。結(jié)果圖10顯示了通過利用v-y堿基對(duì)和s-Pa堿基對(duì)的轉(zhuǎn)錄向RNA中位點(diǎn)特異性地導(dǎo)入y和s的策略和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳的結(jié)果。詳細(xì)地說，圖10a顯示了模板DNA的序列和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件(序列中Pa用P表示)。用聚丙烯酰胺電泳研究轉(zhuǎn)錄物(Bhp2-l、Bhp2-2、Bhp2-3)(圖10b)，在同時(shí)添加sTP和yTP的轉(zhuǎn)錄中，轉(zhuǎn)錄物的量都增多。所以，為了研究s和y是否選擇性地插入到RNA中，分別添加各種底物即向ct位導(dǎo)入了放射性磷的[a-32p]ATP、[a-32P]GTP、[a-32P]CTP、[a-32P]UTP，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，用RNA酶T2將放射性標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物水解成核苷3，-一磷酸，用二維TLC分析磷酸經(jīng)放射性標(biāo)記的核苷3，-一磷酸，研究了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核苦酸組成(圖11)。在該方法中，如果插入了放射性底物，就能夠在TLC上檢測出其5，端的核苷酸。例如圖lib中顯示了Bhp2-1的二維TLC結(jié)果。在Bhp2-l中，y位于A的5，側(cè)，s位于G的5，側(cè)，所以如果y以與模板上的v互補(bǔ)的形式、s以與Pa互補(bǔ)的形式分別選擇性地插入RNA中，那么[a-^P]ATP標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物的二維TLC上會(huì)出現(xiàn)yp(y的核苷3，-一磷酸)的點(diǎn)，此外，[a-32P]GTP標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物會(huì)出現(xiàn)sp(s的核苷3，-一磷酸)的點(diǎn)。實(shí)際上，在圖llb中，各個(gè)TLC上出現(xiàn)了期待的點(diǎn)。[a-"P]CTP或[a;P]UTP標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物中，沒有發(fā)現(xiàn)yp和sp任何一種的點(diǎn)，所以可知各種人工堿基沒有以與模板上的天然堿基互補(bǔ)的形式錯(cuò)誤地插入。定量二維TLC上的各個(gè)點(diǎn)，其結(jié)果如表4所示。[表4〗含有s和y的RNA(Bhp2-l)的核苷酸的組成分析<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>a:插入圖11所示的A(編號(hào)1，2和9-11)、G(編號(hào)3，4和12-14)、C(編號(hào)5和6)或U(編號(hào)7和8)的5'側(cè)的核苷酸的組成。b:該值用下式確定(各核苷酸的放射活性)/(全部的核苷酸3，-一磷酸)x([a-32P]NTP的5，側(cè)的核苷酸總數(shù))c:各核苦酸的理論數(shù)用中括號(hào)表示。d:標(biāo)準(zhǔn)偏差用括號(hào)表示e:沒有檢測到顯示轉(zhuǎn)錄中yTP的量在0.5mM和lmM進(jìn)行的結(jié)果。編號(hào)1-8的結(jié)果全部與理論值(括號(hào)內(nèi)的數(shù)值)良好吻合。編號(hào)9-14是使用只有天然型堿基的模板DNA時(shí)的結(jié)果，但在編號(hào)10中可見使用lmM的yTP時(shí)有少量的yp與天然型堿基互補(bǔ)性地插入。所以，轉(zhuǎn)錄中yTP的量以0.5mM為宜。根據(jù)以上結(jié)果，可知通過組合s-Pa堿基對(duì)和v-y堿基對(duì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，能夠向一條RNA中分別選4奪性地導(dǎo)入s和y。所以，代替y的底物，使用y的5位結(jié)合了FAM的底物(FAM-yTP)和sTP進(jìn)行Bhp2-l的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用凝膠電泳純化，研究了其熒光特性。因?yàn)锽hp2-1單獨(dú)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，s和FAM-y被配置在形成堿基對(duì)的位置，所以使用兩者可以觀測到FRET。而且，如果加入該RNA的互補(bǔ)鏈RNA,則形成雙《連結(jié)構(gòu)，s與FAM-y分離，F(xiàn)RET的效率降低。該雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA的熒光圖譜如圖12b所示，發(fā)夾型RNA的熒光圖譜如圖12c所示(實(shí)線)。各自的熒光圖譜與導(dǎo)入了s和y的RNA的圖譜相比較(虛線該RNA中不發(fā)生FRET，顯示s的熒光圖i普，作為對(duì)照)。任何一組都在350nm對(duì)s進(jìn)行激發(fā)，觀測到FRET，出現(xiàn)FAM-y的521nm附近的熒光。但是，發(fā)夾型的RNAFAM-y的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，此外，與對(duì)照(虛線)相比的s的消光也更顯著。由該結(jié)果可見，能夠觀測到與s和FAM-y兩者之間的距離相關(guān)的FRET。所以，通過將s和FAM-y導(dǎo)入RNA中的不同位點(diǎn)，測定兩者的FRET的效率，能夠推算兩者之間的距離，在RNA的結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮作用。在以往的X射線晶體結(jié)構(gòu)解析和通過NMR的結(jié)構(gòu)解析中，只能夠獲得關(guān)于靜態(tài)RNA結(jié)構(gòu)的信息，但利用本方法，能夠了解溶液中RNA結(jié)構(gòu)變化的運(yùn)動(dòng)學(xué)。實(shí)施例5:核酸雙鏈中的s或v與FAM-y的人工堿基對(duì)的FRET實(shí)驗(yàn)在DNA/RNA雙鏈中，在熒光性人工堿基2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基或2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基(以下在本實(shí)施例中分別稱為s或v)和連接了焚光團(tuán)的2-氧代-(lH)吡啶-3-基(以下在本實(shí)施例中稱為y)之間進(jìn)行了FRET實(shí)驗(yàn)。s或v的發(fā)光光譜與核苦酸衍生物即連接了FAM的5-(3-氨基-l-丙炔基)-y(FAM-yTP)或連接了FAM的5-(3-(6-氨基己酰胺基)-l-丙炔基)-y(FAM-hx-yTP)的吸收光譜重疊(圖lh)。所以，DNA片段中的s或v作為熒光供體發(fā)揮作用，且互補(bǔ)RNA片段中的FAM-y或FAM-hx-y作為熒光受體發(fā)揮作用。含有人工堿基s或v的DNA的合成含有人工堿基s或v的DNA是例如按照國際公開WO01/05801號(hào)或國際公開WO2005/026187號(hào)所迷的方法，使用含有人工堿基s或v的核香酸的氰乙基亞磷酰胺(、>7/工千/1^卞7求口7$夕、V卜)衍生物，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的DNA化學(xué)合成法合成的?；瘜W(xué)合成的35merDNA的序列為5'-CAN!N2N3CTCGGGATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT-3，(序歹'J編號(hào)2Q其中，N^2N3是CTs或CTv的DNA分別稱為DNA35sl或DNA35vl,是Css或Cvv的DNA分別稱為DNA35s2a或DNA35v2a，是sTs或者vTv的DNA分別稱為DNA35s2b或者DNA35v2b)。得到的DNA通過凝膠電泳進(jìn)行了純化。含有FAM-v或FAM-hx-v的RNA的制備在N，的位置上含有FAM-y或FAM-hx-y的17merRNA(5'-GGGAAUCCCGAGN，AGUG-3，序列編號(hào)21)，是使用T7RNA聚合酶和FAM-y或FAM-hx-y底物(FAM-yTP或者FAM-hx-yTP)通過T7轉(zhuǎn)錄制備的。將模板(編碼鏈DNA35vl，非編碼鏈5'-ATAATACGACTCACTATAGGG-3，(序列編號(hào)22)各10pM)在含有10mMTris-HCl(pH7.6)和10mMNaCl的緩沖液中，在95。C加熱，然后緩慢冷卻到4°C，退火。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在含有40mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液、24mMMgCl2、2mM亞精胺、5mMDTT、0.01%TritonX-100的緩沖液中，在lmM天然NTPs、lmMFAM-yTP或FAM-hx-y、2pM模板和2.5單位/)aLT7RNA聚合酶(Takara)存在下進(jìn)行。在37。C溫育3小時(shí)后，加入等量的含有10M尿素和0.05%BPB的染料溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物在75。C加熱3分鐘，通過凝膠電泳純化了17-mer轉(zhuǎn)錄物。熒光光譜測定熒光光譜在含有10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、100mMNaCl和O.lmMEDTA的緩沖液中測定。對(duì)于s在350nm、對(duì)于v在360nm的激發(fā)波長下記錄發(fā)射光語。發(fā)光的光譜狹縫(/《乂K八。7)為5nm。使一定位點(diǎn)上含有FAM-y或FAM-hx-y的17-merRNA與一定位點(diǎn)上含有1個(gè)或2個(gè)s或v堿基的35-merDNA(DNA35sl、35s2a、35s2b、35vl、35v2a和35v2b)雜交，在不同溫度(20和70。C)測定DNA/RNA雙鏈的發(fā)光光譜。結(jié)果在從s或v的4氐焚光狀態(tài)到FAM-y或FAM-hx-y的高焚光狀態(tài)之間，觀察到了共振能量轉(zhuǎn)移。在20。C,DNA35sl或DNA35vl與一定位點(diǎn)含有FAM-y或FAM-hx-y的17-merRNA形成雙鏈時(shí)，發(fā)生FRET;且在70。C雙鏈變性時(shí)，F(xiàn)RET顯著減少(圖14a和b)。而且，DNA35s2a和DNA35v2a與一定位點(diǎn)含有FAM-y或FAM-hx-y的RNA形成的雙鏈中，也能有效地發(fā)生FRET(圖14c和d)。令人感興趣的是，含有兩個(gè)連續(xù)人工堿基的DNA35s2a或DNA35v2a單鏈的熒光強(qiáng)度顯著減少，而含有用1個(gè)T隔開的兩個(gè)人工堿基的DNA35s2b或DNA35v2b單鏈的熒光強(qiáng)度則未見顯著減少(圖13c和d)。DNA35s2a或DNA35v2a單鏈的熒光強(qiáng)度減少是由于兩個(gè)相鄰的人工堿基之間的自身消光引起的。即使與連續(xù)的兩個(gè)堿基間發(fā)生自身消光的DNA35s2a或DNA35v2a形成雙鏈，仍可觀察到17-merRNA的強(qiáng)FAM熒光，因此，使用自身消光探針的該FRET體系可以使對(duì)于目標(biāo)鏈?zhǔn)褂眠^量的探針變得容易。當(dāng)對(duì)于17-merRNA使用10摩爾當(dāng)量的含有一個(gè)人工堿基的DNA35sl和DNA35vl時(shí)，共振能量轉(zhuǎn)移分別被DNA35sl和DNA35vl的背景熒光完全掩蓋(圖15a和b)。作為對(duì)照，當(dāng)對(duì)于17-merRNA使用IO摩爾當(dāng)量的含有連續(xù)2個(gè)人工堿基的DNA35s2a和DNA35v2a時(shí)，分別可以清楚地觀察到含有ss-和vv-的DNA與含有FAM的RNA之間的FRET(圖15c和d)。所以，對(duì)于使用含有相鄰的兩個(gè)人工堿基的自身消光探針的FRET體系而言，既能減少熒光供體的背景，又可以觀察到FRET現(xiàn)象，所以即使在大量供體探針存在下也能夠檢測出含有熒光受體的互補(bǔ)鏈。而且，大量的自身消光DNA探針使得與互補(bǔ)的熒光受體鏈形成雙鏈變得容易，所以能夠增加FRET效率。權(quán)利要求1.一種核酸，其中，具有取代的或者無取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基為堿基的核苷酸與具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸形成堿基對(duì)。2.權(quán)利要求1所述的核酸，其中，所述取代的或者無取代的2-甲酰-lH-吡咯-l-基選自下組Al)2-曱酰-lH-口比咯-l-基，A2)2-曱酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，A3)2-曱酰-4-甲基-lH-吡咯-l-基，和A4)2-甲酰-4-乙炔基-lH-吡咯-l-基；并且，所述6位取代的9H-噪呤-9-基選自下組Bl)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B2)6-(2-p塞吩基)-9H-嘌呤-9-基，B3)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-噤呤-9-基，B4)6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，85)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B6)6-(5-甲基-2-p塞吩基)-9H-噤p令-9-基，B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B8)6-(2-逸唑基)-9H-噤呤-9-基，B9)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻唑基)-9H-噪呤-9-基，B10)6-(4-曱基-2-p塞唑基)-9H-噤呤-9-基，B11)2-氨基-6-(5-曱基-2-^塞峻基)-9!1-。票p令-9-基，和B12)6-(5-曱基-2-p塞唑基)-9H-。票呤-9-基。3.權(quán)利要求1或2所述的核酸，其中，所述取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基是2-曱酰-lH-吡咯-l-基，且所述6位取代的9H-噤呤-9-基是2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基。4.權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的核酸，所述核酸在轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或翻譯步驟中形成堿基對(duì)。5.權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的核酸，其中所述具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸是DNA的一部分，且所述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸是RNA的一部分。6.—種制備核酸的方法，所述核酸含有具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸，所述制備方法包括以含有具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸的核酸為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，在上述具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸的互補(bǔ)位置插入具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸。7.權(quán)利要求6所述的制備方法，其中，所述取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基選自下組Al)2-曱酰-lH-p比咯-l-基，A2)2-曱酰-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基，A3)2-曱酰-4-曱基-lH-吡咯-l-基，和A4)2-曱酰-4-乙炔基-1H-吡咯-1-基；并且，所述6位取代的9H-嘌呤-9-基選自下組Bl)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B2)6-(2-p塞吩基)-9H-噪呤-9-基，B3)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B4)6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-噤呤-9-基，B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-p塞p分基)-9H-。票p令-9-基，B6)6-(5-曱基-2-p塞p分基)-9H-噪p令-9-基，B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B8)6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B9)2-氨基-6-(4-曱基-2-p塞哇基)-9H-。票呤-9-基，B10)6-(4-曱基-2』塞唑基)-9H-嘌呤-9-基，Bll)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和B12)6-(5-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基。8.權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其中，模板中存在2個(gè)以上的所述具有取代的或者無取代的2-曱酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸。9.通過權(quán)利要求6至8所述的方法制備的、含有前述具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苦酸的核酸。10.權(quán)利要求9所述的核酸，該核酸是tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶、適體或者siRNA。11.權(quán)利要求9或10所述的核酸中包含下述核苷酸的局部區(qū)域的立體結(jié)構(gòu)的解析方法，所述核苷酸是具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核普酸，該方法包括測定上述核苦酸中堿基來源的熒光強(qiáng)度的溫度變化和/或離子濃度變化。'12.權(quán)利要求11所述的解析方法，其中，所述具有6位取代的9H-嘌呤_9_基為堿基的核香酸中堿基來源的熒光強(qiáng)度隨溫度的上升而實(shí)質(zhì)上上升時(shí)，判斷為在生物體內(nèi)溫度下，所述核苷酸在立體構(gòu)象上與存在于周圍的核苷酸相堆積；而熒光強(qiáng)度隨溫度上升而實(shí)質(zhì)上降低或未上升時(shí)，判斷為在生物體內(nèi)溫度下，所述核苷酸暴露于外部。13.檢測核酸雙鏈形成的方法，其包括I)使i)的核酸與ii)的核酸雜交，其中i)的核酸是包含所述具有6位取代的9H-噤呤-9-基為堿基的核苷酸的核酸，其根據(jù)權(quán)利要求6至8所述的方法制備；ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，該堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-l-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，,4，4，，5，,7,7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，,4,4，,5，,7，7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，，4，7,7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，,4,7,7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX);II)測定熒光光譜的變化。14.權(quán)利要求13所述的檢測方法，其中，I)i)的6位取代的9H-嘌呤-9-基選自下組Bl)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B2)6-(2-p塞吩基)-9H-。票呤-9-基，B3)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B4)6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-噪呤-9-基，B5)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B6)6-(5-曱基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B8)6-(2^塞11生基)-911-噤p令-9-基，B9)2-氨基-6-(4-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B10)6-(4-曱基-2-噻唑基)-911-嘌呤-9-基，B11)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和B12)6-(5-曱基-2-漆唑基)-9H-嘌呤-9-基。15.權(quán)利要求13或14所述的檢測方法，其中，I)ii)的核酸為包含下述核苷酸的核酸，所述核苷酸具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基，該堿基的第5位上直接或通過連接物結(jié)合有5-羧基熒光素(5-FAM)或6-羧基熒光素(6-FAM)。16.—種制備核酸的方法，所述核酸在同一鏈上含有下述i)的核苷酸和ii)的核苷酸，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸；ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，該堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-l-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，,4,4，,5，,7，7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，，4,4，,5，，7，7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，，4，7,7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，,4,7,7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX);所述制備方法包括以含有m)的核苷酸和iv)的核苦酸的核酸為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，在所述iii)的核苷酸的互補(bǔ)位置插入所述i)的核苷酸，并且在所述iv)的核芬酸的互補(bǔ)位置插入所述ii)核香酸，其中，iii)的核苷酸是具有取代或者無取代的2-甲酰-lH-吡咯-l-基為堿基的核苷酸，iv)的核苷酸是具有6位取代的9H-噪呤-9-基為堿基的核苷酸。17.通過權(quán)利要求16所述的方法制備的、在同一鏈上含有i)的核苷酸和ii)的核香酸的核酸，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核芬酸；所述ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，該堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，,4,4，,5，，7,7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，，4,4，,5，,7，7，-六氯熒光素(6"￡乂)、5-羧基-2，,4，7，7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，，4，7，7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)。18.權(quán)利要求17所述的核酸，其為tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶、適體或者siRNA。19.檢測核酸莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的方法，包括1)在權(quán)利要求17或18所述的核酸中，使i)的核苷酸和ii)的核苷酸雜交，并且2)測定熒光光譜的變化。20.權(quán)利要求19的檢測方法，其中核酸的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)是通過權(quán)利要求17或18所述的核酸與目標(biāo)分子結(jié)合而形成的。21.—種核酸，其中含有連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核香酸。22.權(quán)利要求21所述的核酸，其為tRNA、mRNA、反義DNA或RNA、核酶、適體或者siRNA。23.檢測核酸雙鏈形成的方法，其包括I)使i)的核酸與ii)的核酸雜交，其中i)的核酸包含連續(xù)2個(gè)以上的具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸，ii)的核酸包含具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，該堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有焚光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基焚光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-l-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，，4，4，，5，，7，7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，,4,4，,5，,7,7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，，4,7，7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，,4,7,7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX);并且，n)測定熒光光譜的變化。24.權(quán)利要求23所述的檢測方法，其中I)i)的6位取代的9H-嘌呤-9-基選自下組Bl)2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B2)6-(2-噻吩基)-9H-噤呤-9-基，B3)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B4)6-(4-曱基-2-噻吩基)-9H-。票呤-9-基，B5)2-氨基-6-(5-甲基-2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基，B6)6-(5-曱基-2-蓬吩基)-9H-嘌呤-9-基，B7)2-氨基-6-(2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B8)6-(2-噻唑基)-9H-。票呤-9-基，89)2-氨基-6-(4-甲基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，B10)6-(4-曱基-2-蓉唑基)-9&噤呤-9-基，Bl1)2-氨基-6-(5-曱基-2-噻唑基)-9H-嘌呤-9-基，和B12)6-(5-曱基-2-p塞唑基)-9H-噤呤-9-基。25.權(quán)利要求23或24所述的檢測方法，其中，I)ii)的核酸為包含下述核普酸的核酸，所述核苷酸具有5位取代-2-氧代(lH)p比啶-3-基為堿基，該堿基的第5位上直接或通過連接物結(jié)合有5-羧基熒光素(5-FAM)或6-羧基焚光素(6-FAM)。26.檢測核酸莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的方法，所述檢測方法包括1)在下述核酸中，使i)的核苷酸與ii)的核苷酸雜交，所述核酸在同一鏈上含有i)的核苷酸和ii)的核苷酸，且包含連續(xù)2個(gè)以上的i)的核苷酸；并且，2)測定熒光光譜的變化；其中，所述i)的核苷酸是具有6位取代的9H-。票呤-9-基為堿基的核苷酸，所述ii)的核苷酸是具有5位取代-2-氧代(lH)吡啶-3-基為堿基的核苷酸，該堿基的5位上直接或通過連接物結(jié)合有熒光染料，所述熒光染料選自下組5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)、5-羧基四曱基羅丹明(5-TAMRA)、6-羧基四曱基羅丹明(6-TAMRA)、5-二曱氨基-l-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2，，4，4，，5，,7,7，-六氯熒光素(5-HEX)、6-羧基-2，，4,4，，5,,7，7，-六氯熒光素(6-HEX)、5-羧基-2，,4,7,7，-四氯熒光素(5-TET)、6-羧基-2，,4,7,7，-四氯熒光素(6-TET)、5-羧基-X-羅丹明(5-ROX)和6-羧基-X-羅丹明(6-ROX)。全文摘要本發(fā)明提供基于新型人工堿基對(duì)的核酸，以及相應(yīng)核酸的制備方法、應(yīng)用。本發(fā)明的核酸中，具有取代的或者無取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基為堿基的核苷酸與具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸形成堿基對(duì)。本發(fā)明的核酸的制備方法包括以含有具有取代的或者無取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基為堿基的核苷酸的核酸為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，在前述具有取代或無取代的2-甲酰-1H-吡咯-1-基為堿基的核苷酸的互補(bǔ)位置插入具有6位取代的9H-嘌呤-9-基為堿基的核苷酸。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101268188SQ200680029029公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2006年8月4日優(yōu)先權(quán)日2005年8月4日發(fā)明者平尾一郎,平尾路子,橫山茂之申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所