專利名稱：：卡他莫拉氏菌與上皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及補(bǔ)體系統(tǒng)的相互作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及卡他莫拉氏菌(3/^0^//^似/7^//力及它們通過細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖連蛋白和層粘連蛋白與上皮細(xì)胞相互作用的能力，并且還涉及它們抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的能力。與這些細(xì)胞外蛋白質(zhì)的相互作用在疫苗的制備中是有用的。
背景技術(shù)：
：結(jié)合上皮細(xì)胞的能力對數(shù)個細(xì)菌物種是極其重要的。例如金黃色葡萄球菌(iSto/;/^/ococcM5"tf"re"5)和酉良腺鏈J求菌(5V/^/;tococcM51/y;ogeM&s)具備含有相關(guān)性序列組織結(jié)構(gòu)的纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBP)。這些FnBP稱作微生物表面成分識別祐附基質(zhì)分子(MSCRAMM)。這些FnBP在它們與纖連蛋白結(jié)合時利用纖連蛋白的模塊結(jié)構(gòu)形成擴(kuò)展的串聯(lián)p-拉鏈27，39，47，73]。起到介導(dǎo)細(xì)菌黏附并侵入宿主細(xì)胞的作用。重要的粘膜性病原體卡他莫拉氏菌是兒童急性中耳炎的第三號主要細(xì)菌性病因,位居肺炎鏈球菌(5Vr印toocc附/mewiwo附Vie)和流感嗜血桿菌(好"ewo^/h7附/w/Z恥razffe)之后[14，40，55?？ㄋ暇彩墙】祪和什孔畛Ｒ姷臈诱咧弧４送?、卡他莫拉氏菌還是患有慢性阻塞性肺病(COPD)的成人中鼻竇炎和下呼吸道感染的常見病因[74]。該物種在COPD患者內(nèi)的成功感染可能部分地與其繁多的全套黏附素有關(guān)。近年來的研究重心落在外膜蛋白及其與與人宿主的相互作用上[6，48，56。這些外膜蛋白中的某些似乎具有黏附功能，它們當(dāng)中包括卡他莫拉氏菌IgD結(jié)合蛋白(MID,又名Hag)、蛋白質(zhì)CD、卡他莫拉氏菌教附蛋白(McaP)和遍在表面蛋白(Usp)[l，22，33，48，61，81，84。發(fā)明簡述鑒于如此事實(shí)，即已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卡他莫拉氏菌是上氣道或下氣道內(nèi)感染的如此主要的病因，因此目前需要開發(fā)可以用于抗卡他莫拉氏菌的疫苗。本發(fā)明的目標(biāo)因此就是找到卡他莫拉氏菌與身體內(nèi)上皮細(xì)胞以何種方式相互作用并影響免疫系統(tǒng)。以這種方法，可以開發(fā)可能作為抗卡他莫拉氏菌疫苗起作用的物質(zhì)。在本研究中，使用從臨床分離林中衍生的卡他莫拉氏菌突變體，本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)UspAl和A2均結(jié)合纖連蛋白及層粘連蛋白。此外，本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)卡他莫拉氏菌干擾補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑，并且還闡明了它們以何種方式進(jìn)行干擾。眾多細(xì)菌通過纖連蛋白結(jié)合性MSCRAMMS與上皮細(xì)胞勦附[54，7"。銅綠假單胞菌(尸M"^附ow^flerag,Vww")具有與鼻上皮細(xì)胞上細(xì)胞結(jié)合性纖連蛋白相結(jié)合的FnBP[69。阻斷細(xì)菌-纖連蛋白蛋白質(zhì)的相互作用可以幫助宿主組織克服感染。事實(shí)上，已經(jīng)證實(shí)抗金黃色葡萄球菌FnBP的抗體引起迅速清除感染小鼠內(nèi)的細(xì)菌[71。已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明對重組截短的UspAl/A2蛋白連同覆蓋整個分子的較小片段測試了纖連蛋白結(jié)合作用。UspAl和A2均結(jié)合纖連蛋白并且發(fā)現(xiàn)纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于UspAl299'452內(nèi)及UspA2165_318內(nèi)。這兩種截短的蛋白質(zhì)均以如抗纖連蛋白抗體的相似程度抑制卡他莫拉氏菌對Chang結(jié)膜上皮細(xì)胞的結(jié)合。進(jìn)行的觀察證實(shí)卡他莫拉氏菌UspAl和A2均經(jīng)細(xì)胞結(jié)合性纖連蛋白參與對上皮細(xì)胞的黏附。因此建議UspAl299—452和UspA2165_318內(nèi)的生物活性位點(diǎn)作為待包含于抗卡他莫拉氏菌疫苗內(nèi)的潛在候選物。另外，本發(fā)明人已經(jīng)研究并表征了卡他莫拉氏菌對層粘連蛋白的結(jié)合?？ㄋ暇荂OPD患者內(nèi)感染性惡化的常見病因。該物種在COPD患者內(nèi)的成功感染可能部分地與其繁多的全套黏附素有關(guān)。此外，吸煙者中存在病理性改變?nèi)缟掀ね暾詥适Ъ盎け┞叮渲袑诱尺B蛋白層本身增厚[4j。已經(jīng)證實(shí)一些病原體能夠結(jié)合層粘連蛋白并且因此可能對這些病原體黏附至這類受損及棵露粘膜表面的能力有貢獻(xiàn)。這些病原體包括已知在氣道內(nèi)導(dǎo)致明顯疾病的病原體，如其中有金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌7，63。本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)卡他莫拉氏菌遍在表面蛋白(Usp)Al和A2還與層粘連蛋白結(jié)合。其中UspAl和A2的層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在于UspAl5"91和UspA230—351的氨基末端部分內(nèi)。這些結(jié)構(gòu)域還含有纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。然而，結(jié)合纖連蛋白的最小片段即UspAl299-452—UspA2165—318不以任何可覺察的程度結(jié)合層粘連蛋白。比UspAl氨基末端部分(UspAl5(M91)更小的片段喪失其全部的層粘連蛋白結(jié)合能力，而對于UspA2，僅UspA23(M7°結(jié)合層粘連蛋白，盡管在比完整重組蛋白(UspA23G-539)的結(jié)合水平更低。這些發(fā)現(xiàn)表明分子的不同部分可能具有不同的功能角色。還發(fā)現(xiàn)UspAim具有層粘連蛋白結(jié)合特性。然而比較UspAl和A2中最小的層粘連蛋白結(jié)合區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)就氨基酸同源性而言在UspA2格170與UspAlS""之間幾乎沒有相似性(數(shù)據(jù)未顯示)。這不令人驚訝，因?yàn)橐阎@兩種蛋白質(zhì)具有'棒棒糖'形的球狀頭結(jié)構(gòu)，盡管在兩種蛋白質(zhì)的氨基末端部分內(nèi)僅有22%同一性[2,32。建議UspA150—770和UspA230—539內(nèi)的生物活性位點(diǎn)作為待包含于抗卡他莫拉氏菌疫苗內(nèi)的潛在候選物。最后，本發(fā)明人研究了卡他莫拉氏菌遍在表面蛋白A1及A2與天然免疫系統(tǒng)間的相互作用，并且發(fā)現(xiàn)卡他莫拉氏菌干擾補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)是抵抗病原性微生物的首道防線之一，并且該系統(tǒng)的活化導(dǎo)致細(xì)菌表面上的蛋白質(zhì)沉積級聯(lián)，引起攻膜復(fù)合體形成或調(diào)理病原體，隨后引起吞噬[85，86]。最重要的補(bǔ)體蛋白之一是C3，該補(bǔ)體蛋白以類似于某些免疫球蛋白的濃度(l-1.2mg/ml)循環(huán)存在。C3不僅作為調(diào)理素發(fā)揮重要作用，還是補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑的共同樞紐。旁路途徑對經(jīng)典途徑和凝集素途徑起到放大回路的作用并且在補(bǔ)體抑制物不存在下還通過C3與微生物表面共價連接而自發(fā)地受到活化。C3沉積需要一個內(nèi)部硫酯鍵存在，其中該內(nèi)部硫酯鍵因C3a-鏈上的巰基(Cys旭o)與谷氨?；驶?Gln"u)接近而在此天然蛋白質(zhì)內(nèi)形成[76。從C3a-鏈的氨基末端中蛋白酶解性切割一個77個殘基的肽則產(chǎn)生C3a(過敏毒素)和C3b。隨后通過亞穩(wěn)定性硫酯的羰基與激活物表面上蛋白質(zhì)或糖結(jié)構(gòu)的-NH2或-OH基團(tuán)間的共價連接實(shí)現(xiàn)C3b的結(jié)合[36，37]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卡他莫拉氏菌UspAl和A2均非共價地并以劑量依賴方式結(jié)合來自EDTA處理的血清內(nèi)的第三成分(C3)和甲胺處理的C3(C3met)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)UspAl5"70和UspA230-539與C3和C3met結(jié)合。發(fā)現(xiàn)UspA2的C3-結(jié)合區(qū)域主要位于UspA2，-"8內(nèi)。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)UspAl在相互作用中的地位不重要。建議UspAl5G-77G和UspA2，539內(nèi)的生物活性位點(diǎn)作為待包含于抗卡他莫拉氏菌疫苗內(nèi)的潛在候選物。UspA家族由UspAl(分子量88kDa)、UspA2(62kDa)和雜合蛋白質(zhì)UspA2H(92kDa)組成2、43。這些蛋白質(zhì)在SDS-PAGE內(nèi)作為高分子量復(fù)合物遷移，相對保守并且因此是重要的疫苗候選物。UspAl與A2的氨基酸序列具有43%同一性并且具有同一性是93%的140個氨基酸殘基2。在來自患有中耳炎的年幼兒童內(nèi)的一系列108林卡他莫拉氏菌鼻咽分離林中，分別在107林(99%)和108林(100%)分離林內(nèi)檢測到和附/7j2基因。21%的分離林被鑒定為具有雜合的變異基因"s/l42H150]。此外，已知天然獲得的抗UspAl和A2抗體具有殺菌性[15。已經(jīng)賦予蛋白質(zhì)UspA家族數(shù)種功能。UspAl表達(dá)對于卡他莫拉氏菌結(jié)合至Chang結(jié)膜上皮細(xì)胞和Hep-2喉上皮細(xì)胞是必需的[43，49。在最近研究中，證實(shí)UspAl結(jié)合了表達(dá)于肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549內(nèi)的癌胚抗原相關(guān)性細(xì)胞勦附分子(CEACAM)[31]。還已經(jīng)證實(shí)純化的UspAl在點(diǎn)印跡實(shí)-驗(yàn)中結(jié)合纖連蛋白，而純化的UspA2則不結(jié)合[49]。UspAl和A2均可能在卡他莫拉氏菌血清抗性中發(fā)揮重要作用[1，5，58,60。本發(fā)明表明UspAl和A2均是臨床分離抹卡他莫拉氏菌BBH18和RH4內(nèi)卡他莫拉氏菌結(jié)合至纖連蛋白和層粘連蛋白的決定因素。有意義的是，從卡他莫拉氏菌Bc5中衍生的重組UspAl和A2均以相同程度結(jié)合纖連蛋白。在UspAl的氨基酸殘基299至452和UspA2的氨基酸殘基165至318內(nèi)找到了針對纖連蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這兩種結(jié)構(gòu)域共有31個氨基酸殘基序列同一性。重要的是，含有UspAl和UspA2內(nèi)的這些殘基的截短蛋白質(zhì)片段能夠抑制卡他莫拉氏菌與Chang上皮細(xì)胞結(jié)合，表明與這些細(xì)胞的相互作用借助細(xì)胞結(jié)合性纖連蛋白。在以上提到的氨基酸殘基內(nèi)找到了針對層粘連蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。使用重組蛋白的結(jié)合鑒定法揭示主要的結(jié)合區(qū)域位于氨基末端部分，在此處兩種蛋白質(zhì)形成球狀頭。將介導(dǎo)對組織和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分黏附的細(xì)菌性因子共同劃分成名為"微生物表面成分識別黏附基質(zhì)分子"(MSCRAMMS)的單一家族，由于UspAl/A2既結(jié)合纖連蛋白，又結(jié)合層粘連蛋白，故這些蛋白質(zhì)可以命名為MSCRAMMS。根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供具有序列號l的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物(degenerate)或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供具有序列號2的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供具有序列號3的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供具有序列號4的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供具有序列號5的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供具有序列號6的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供具有序列號7的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供具有序列號8的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供具有序列號9的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供具有序列號10的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的至少一種肽用于產(chǎn)生用來治療或預(yù)防感染的藥物的用途，感染優(yōu)選地是由卡他莫拉氏菌所致，特別是由粘膜表面上攜帶卡他莫拉氏菌所致的感染。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明還提供包含纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體，該配體由選自序列號l、序列號2和序列號3的氨基酸序列，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物組成。本發(fā)明還提供包含層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體，該配體由選自序列號4至序列號8的氨基酸序列，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物組成。此外，本發(fā)明提供包含C3或C3met結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體，該配體由選自序列號4、序列號6、序列號9和序列號10的氨基酸序列，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物以及其它次級加工產(chǎn)物組成。另外、本發(fā)明提供包含本發(fā)明的一種或多種配體和一種或多種可藥用的輔藥、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或防腐劑的藥物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的一種或多種配體和一種或多種可藥用的輔藥、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或防腐劑的疫苗。本發(fā)明還提供治療或預(yù)防個體中的感染、優(yōu)選由卡他莫拉氏菌所致感染、特別由粘膜表面上攜帶卡他莫拉氏菌所致感染的方法，包括施用藥用有效量的本發(fā)明藥物或疫苗。最后，本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的配體、蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，以及其同系物、多態(tài)物(polymorphism)、簡并物和剪接變體。對本發(fā)明目標(biāo)、問題、解決方案和特征的進(jìn)一步公開將從如下對本發(fā)明的詳細(xì)描述中，及參考附圖及后續(xù)權(quán)利要求書而是顯而易見的。如本文中所用的表述"配體，，將說明與受體結(jié)合的完整分子及該分子中包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域以至保留受體結(jié)合特性的部分。包含等效的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體也包括在本發(fā)明中。表述"片段、同系物、功能性等效物和衍生物"涉及保留所需要的纖連蛋白、層粘連蛋白、C3或C3met結(jié)合特性的本發(fā)明肽和蛋白質(zhì)片段的變體、修飾和/或部分。將本發(fā)明UspAl的同系物定義為具有至少72%序列同一性的序列，如可從下表l中所見。將本發(fā)明的片段定義為在氨基末端被截短或延長1、2、5、10、15、20個氨基酸和/或在羧基末端被截短或延長l、2、5、10、15、20個氨基酸的任意的同系物序列。表述"簡并物、羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物和糖基化產(chǎn)物或其它次級加工產(chǎn)物"涉及本發(fā)明如此的肽和蛋白質(zhì)片段的變體和/或修飾，其中所述的肽和蛋白質(zhì)片段與原始的肽或蛋白質(zhì)片段相比，已經(jīng)由簡并作用、羥化、磺化或糖基化作用而被改變，但保留所需要的纖連蛋白、層粘連蛋白、C3或C3me結(jié)合特性。本發(fā)明尤其涉及由卡他莫拉氏菌引起的感染。本發(fā)明肽可以用于治療或預(yù)防中耳炎、鼻竇炎或下呼吸道感染。表l:全長UspAl蛋白質(zhì)序列的多重比對，附帶同一性百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>78表2:UspA2Pileup分析-所用菌抹和序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>因此，本發(fā)明提供從具有層粘連蛋白結(jié)合作用和/或纖連蛋白結(jié)合作用和/或C3結(jié)合作用的卡他莫拉氏菌外膜蛋白中分離的配體，其中該配體是如此的多肽或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化、磺化或糖基化產(chǎn)物或其它次級加工產(chǎn)物，其中所述的多肽包含或由選自衍生于以下所示的卡他莫拉氏菌BC5UspAl及UspA2全長序列的SEQIDNO:1-10的氨基酸序列組成。來自卡他莫拉氏菌菌林BC5的全長UspAl:mnkiykvkknvgkatnk工sgst工gsggynkggyneatienatgkgsfaagfilgsntdttgngtvsvgkk工kdlddevg;lsgrlldqkadidqkad;ltkdqdlaaynelqiakaqane服nkad工ak恥akaeadasfet:lqnqad工ttnr工肌t麗hqd;lpspsragehglsggvggsyaaghlvacsegd麗tangtyakgryst工ggstvggggy即工dnkamadnanaqngsvllggkerqivhvglgee工ns:leg工d麗工麗工yeikalesnveedayakqqteadg工aknqad工D工ANN工KN工Yltknqntl工ekta工eqninrqk工dq!jGYa:lHVIiFGSGYHNrwkfakghtkkavlt工gggdynkggyneatnqyakgrnstvagva:lgnknt工ehntagkaatiageisdtstde工f麗gda工aiaqqqdqhssglldlsgrli工dalnkassaqlhdkkitnlelaqqqdqhsqgealveqnktvangfe工ekkeqgqhf則rGQAAVSIiGAALGSJjLIVGIiLTKGRYST工GGst工gggd麗tGY麗EATGTDgensva工gsnvnsaevgglsAVNGSQLHVIjKNQAD工KTLEdiktlk麗vedqkadiaknqntdr工ataelgilhsmvarasdiktlakvsa工nqelegfankagiatnkq工saverqtagglsdtgkstygmattasaqkglfneatneyakgryst工ggstiaggrknqntvkkgqqnvltgfagasktatvvaqnkadsnveegkldleglld;lsgr:ladiaqnqtd工g工aenkkdaqvg麗tqgvataantdriaknahadvqdkq工g工ana工aiatk工glswsdag來自卡他莫拉氏菌菌林BC5的全長UspA2:mktmkllplkiavtsam工工glgaastanaqaktledlpyl工kkidqneleadigditalekyialsqygnilaleelnkaleeldedvgwnqndmileddvetltkafaeqgemkedlqgladfvegqegklqnets工kknt,lvngfeeknkdaakesiedlydfghevaesgehahneaqnet;lkg:l工tns工ent:itknkad工qa:leisinvveelfsgr:l工dqkad工d工nn工yelaqqqdqhssdifctlkknveegllelsdhiidqktd工aqnqan工qdlatynelqdqyaqkqteaidalnkassentqn工edlaaynelqdayakqqteaidalnkassentqn工edlaaynelqdayakqqaeaidalnkassentqn工aknqad工a卵工tn工yelaqqqdkhrsd工ktlaktsaantdr工akadddasfetltkngntl工ekdkehdkxitanktaidankasadtkfaatadaftkngna工t認(rèn)aks工tdlgtkvdgfdsrvtaldtkvnafdgr工taldskvengmaaqaalsglfqpysvgkf論taalggygsksava工gagyrvnpnlafkagaa工ntsgnkkgsynigvnyef在優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體是這樣的多肽(或與野生型多肽相比的多肽截短物)，其包含或由選自SEQIDNO:1-10的氨基酸序列或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化、磺化或糖基化產(chǎn)物或其它次級加工產(chǎn)物組成。本文中使用術(shù)語"配體"以說明與層粘連蛋白和/或纖連蛋白和/或C3結(jié)合的完整分子及該分子中包含層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或C3結(jié)合結(jié)構(gòu)域以至保留相應(yīng)結(jié)合特性的部分。因此，"配體"包括僅由層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或C3結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即對結(jié)合作用所需要的某肽區(qū)域或某些肽區(qū)域)組成的分子。為本發(fā)明的目的，可以如下確定多肽的層粘連蛋白結(jié)合特性、纖連蛋白結(jié)合特性或C3結(jié)合特性多肽可以用125碘或其它放射活性化合物標(biāo)記并在放射免疫測定(RIA)中作為液相或固相(例如點(diǎn)印跡)對結(jié)合作用加以測試。此外，多肽可以使用適宜抗體及探測系統(tǒng)，用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或流式細(xì)胞術(shù)對結(jié)合進(jìn)行分析。多肽與層粘連蛋、纖連蛋白或C3之間的相互作用還可以通過表面等離子體共振(Biacore)檢驗(yàn)。方法實(shí)例在材料和方法部分中詳細(xì)例舉。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽[或與野生型多肽相比的多肽截短物包含或由保守序列中的至少一種組成，其中所述的保守序列來自于本文中顯示的比對法內(nèi)所鑒定的SEQIDNO:1-10。因此，在該實(shí)施方案中，多肽[或與野生型多肽相比的多肽截短物包含或由如下序列中的至少一種組成來自UspAl(來自纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守片段-用"/"分開在一個位置上的備選氨基酸)gt/vvsvgs/kq/e/k/ag/nk/n/g/h/serqivn/hvgagq/n/e/kis/ra/dt/dstdavngsqlh/yalas/k/tt/a/v工/vstdavngsqllln/dlsgrll/工dqkad工dnn工nn/hiye/dlaQQQDQHSSDIKTIiKdqkad工dnminlaqqqdqhssd工kt:lk來自UspA2(來自纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守片段-用"/"分開在一個位置上的備選氨基酸)kad工dnn工nn/h工yelaqqqdqhssd工k/qt/alk/ek/n/snv/工e/veg/ell/fe/nlsd/gh/r工/l工dqkt/adi/la/tq/kn/d來自UspA2(來自C3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守片段-用"/"分開在一個位置上的備選氨基酸)IE/QDLAAYNELQDAYAKQQA/TEA工DALNKASSENTQNIAKNQADIANN工T/NNIYELAQQQDK/QHR/SSD工KTLAKT/ASAANTD/NR工DLAAYNELQDAYAKQQEA工DALNKASSENTQN工AKNQADIANNI將理解的是本發(fā)明的多肽配體可以包含本文中所提及序列的層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或C3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中通過在氨基末端或羧基末端或這兩個末端，向本文中所提及序列內(nèi)添加或從其中缺失氨基酸殘基而修飾該序列，修飾的肽相應(yīng)地保留結(jié)合層粘連蛋白和/或纖連蛋白和/或C3的能力。因此，本發(fā)明還提供包含如此多肽或由其組成的配體，在所述的多肽內(nèi)已經(jīng)在氨基末端或羧基末端或這兩個末端處，向本文中所提及的氨基酸序列添加或從其中缺失50、40、30、20、10、5、3或1個氨基酸殘基，其中所述修飾的多肽保留結(jié)合層粘連蛋白和/或纖連蛋白和/或C3的能力;和/或激發(fā)對非修飾的肽的免疫應(yīng)答。延長意思是指使用來自全長氨基酸序列(該序列從其衍生)中的肽序列延長該序列。就本發(fā)明多肽的片段而言，任何大小的片段可以用在本發(fā)明中(基于本文中討論的同系物序列/保守區(qū)域/功能性結(jié)構(gòu)域功能性結(jié)構(gòu)域)，只要該片段保留結(jié)合層粘連蛋白和/或纖連蛋白和/或C3的能力?？赡芟胍氖欠蛛x僅含有對受體結(jié)合作用所需要的那些區(qū)域的最小肽。截短而從已知的卡他莫拉氏菌UspAl或UspA2蛋白中衍生。截短物不是全長的天然UspAl或A2分子。因此，本發(fā)明還提供從氨基末端缺少至少(或確切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160等至298個氨基酸和/或從羧基末端缺少至少(或確切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180、200等至450個氨基酸的野生型UspAl序列。優(yōu)選地，截短物保留纖連蛋白結(jié)合功能(任選地還有層粘連蛋白結(jié)合功能和/或C3結(jié)合功能)。表3.野生型UspAl蛋白的N末端和C末端截短的可能組合。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>因此，本發(fā)明還提供從氨基末端缺少至少(或確切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、164個氨基酸和/或從羧基末端缺少至少(或確切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、180、200等至312個氨基酸的野生型UspA2序列。優(yōu)選地，截短物保留纖連蛋白結(jié)合功肯fe(任選地還有層粘連蛋白結(jié)合功能和/或C3結(jié)合功能)?？赡艿慕囟涛锟梢詮娜缦卤韮?nèi)所示的那些截短物中選擇，它們均處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。表4.野生型UspA2蛋白的N末端和C末端截短的可能組合至少缺失或確切缺失氨基酸的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>因此，本發(fā)明還提供從氨基末端缺少至少(或確切地)5、10、15、20、25或29個氨基酸和/或從羧基末端缺少至少(或確切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180、200等至453個氨基酸的野生型UspA2序列。優(yōu)選地，截短物保留層粘連蛋白結(jié)合功能(任選地還有纖連蛋白結(jié)合功能和/或C3結(jié)合功能)?？赡艿慕囟涛锟梢詮娜缦卤韮?nèi)所示的那些截短物中選擇，它們均處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。表5.對野生型UspA2蛋白的氨基末端和羧基末端截短的可能組合<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>因此，本發(fā)明還提供從氨基末端缺少至少(或確切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160等至301個氨基酸和/或從羧基末端缺少至少(或確切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160或172個氨基酸的野生型UspA2序列。優(yōu)選地，截短物保留C3結(jié)合功能(任選地還有纖連蛋白結(jié)合功能和/或?qū)诱尺B蛋白結(jié)合功能)。可能的截短物可以從如下表內(nèi)所示的那些截短物中選擇，它們均處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。表6.對野生型UspA2蛋白的氨基末端和羧基末端截短的可能組合至少缺失或確切缺失氨暴酸的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>可以用這種方式加以截短的已知野生型UspAl序列是菌林ATCC25238(MX2;GenBank登錄號AAD43465)、P44(AAN84895)、035E(AAB96359)、TTA37(AAF40122)、012E(AAF40118)、046E(AAF36416)、V1171(AAD43469)、TTA24(AAD43467)(見表1/圖19);或BC5(見上文)的那些序列?？梢杂眠@種方式加以截短的已知野生型UspA2序列是菌林035E(GenBank登錄號04407)、MC317(GenBank登錄號Q58XP4)、E22(GenBank登錄號Q848S1)、V1122(GenBank登錄號Q848S2)、P44(GenBank登錄號Q8GH86)、TTA37(GenBank登錄號Q9L961)、046E(GenBank登錄號Q9L962)、012E(GenBank登錄號Q9L963)、V1171(GenBank登錄號Q9XD51)、TTA24(GenBank登錄號Q9XD53)、SP12-5(GenBank登錄號Q8RTB2)、ATCC25238(GenBank登錄號Q9XD55)(見表2/圖20)或BC5[Forsgrei^UspA2(見上文)的那些序列。理想地，該實(shí)施方案的UspAl截短物或UspA2截短物包含或由選自SEQIDNO:1-10的氨基#列或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物或其它次級加工產(chǎn)物組成；或包含或由保守序列中的至少一種組成，其中所述的保守序列來自于本文中所示比對法內(nèi)筌定的這些區(qū)域，例如來自UspAl(來自纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守片段-用"/"分開在一個位置上的備選氨基酸)gt/vvsvgs/kq/e/k/ag/nk/n/g/h/serq工vn/hvgagq/n/e/kis/ra/dt/dstdavngsqh/yalas/k/tt/a/vi/vstdavngsql:lln/d:lsgrll/idqkadidnn工nn/h工ye/dlaqqqdqhssd工ktlkdgkaddnn工nla<2qqd(2hssdikt:lk來自UspA2(來自纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守片段-用"/"分開在一個位置上的備選氨基酸)kadidnn工nn/h工ye!laqqqdqhssdik/qt/alk/ek/n/snv/ie/veg/ell/fe/nlsd/gh/ri/l工dqkt/adi/la/tq/kn/d來自UspA2(來自C3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守片段-用"/"分開在一個位置上的備選氨基酸)工e/qd:laayneqdayakqqa/teaida:lnkasSENTQN工KIS!QD工ANN工T/NN工YEIiAQQQDK/QHR/SSD工KT]jAKT/ASAANTD/NRIdlaayne!qdayakqqEAIDAIjNKASSENTQN工AKNQAD工ANN工可以方便地產(chǎn)生含有如本文中所述的多肽配體的融合蛋白。因此，在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的多肽配體的融合蛋白。優(yōu)選地，根據(jù)該實(shí)施方案的融合蛋白與任何已知的全長序列在其全部長度上的同一性小于50%。此類融合物可以構(gòu)成本發(fā)明多肽的衍生物。其它衍生物可以是使用本發(fā)明多肽作為載體共價偶聯(lián)肽或糖部分的衍生物。它們可以例如偶聯(lián)至肺炎鏈球菌莢膜寡糖或多糖或者卡他莫拉氏菌的脂低聚糖或不可分型的流感嗜血桿菌的脂低聚糖。本發(fā)明的同源肽可以通過序列比較進(jìn)行鑒定。同源肽優(yōu)選地與本發(fā)明相同，更優(yōu)選地以優(yōu)選遞增順序至少70%、80%、90%、95%或99°/。相同。優(yōu)選地，同源肽保留結(jié)合纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白和/或C3的能力和/或激發(fā)抗本文中公開的肽序列或其片段的免疫應(yīng)答。圖19和20顯示不同來源的UspAl和UspA2的肽序列的比對，該比對顯示序列中能夠被修飾以形成同源序列而同時保留功能(即纖連蛋白結(jié)合能力和/或?qū)诱尺B蛋白結(jié)合能力和/或C3結(jié)合能力)的區(qū)域。BC5SEQIDNO:1-10肽的同源肽例如是與圖19和20中來自其它菌抹的BC5序列相對應(yīng)的那些序列。本發(fā)明的疫苗本發(fā)明的多肽/肽/功能性結(jié)構(gòu)域/同系物/片段/截短物/衍生物應(yīng)當(dāng)理想地配制成包含有效量的所述成分及可藥用賦形劑的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以用于向患者施用以預(yù)防或治療卡他莫拉氏菌感染或中耳炎或鼻竇炎或下呼吸道感染。它們可以用任何已知的方式施用，包括肌內(nèi)、腸胃外、粘膜或鼻內(nèi)施用。本發(fā)明的聯(lián)合疫苗本發(fā)明的疫苗可以與其它卡他莫拉氏菌抗原組合以預(yù)防或治療前述疾病。本發(fā)明人尤其已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卡他莫拉氏菌具有阻礙宿主免疫系統(tǒng)攻擊該生物的至少兩種手段。此外，對于下文實(shí)施例中所提到的與C3(和C4BP)的相互作用，卡他莫拉氏菌通過蛋白質(zhì)MID(又稱作OMP106)表現(xiàn)對可溶性和膜結(jié)合性的人IgD的強(qiáng)親和力。對B淋巴細(xì)胞的莫拉氏菌依賴性IgD結(jié)合引起多克隆免疫球蛋白合成，這可能抑制特異性抗莫拉氏菌單克隆抗體產(chǎn)生?？ㄋ暇詳?shù)種方式阻礙人免疫系統(tǒng)的事實(shí)或許可以揭示為什么卡他莫拉氏菌是呼吸道的常見棲居者。本發(fā)明人相信組合參與IgD結(jié)合功能(MID)和C3結(jié)合功能(UspAl和/或UspA2)的抗原可以提供這樣的免疫原性組合物，該組合物給予宿主增強(qiáng)的抗莫拉氏菌阻礙人免疫系統(tǒng)的防御能力，因此極大減少粘膜表面上攜帶卡他莫拉氏菌。本發(fā)明的又一個方面因此是這樣的疫苗組合物，該組合物包含與有效量的蛋白質(zhì)MID(例如全長多肽或多肽/肽/功能性結(jié)構(gòu)域/同系物/片段/截短物/其衍生物，其優(yōu)選地保留人IgD結(jié)合功能)組合的有效量UspAl和/或UspA2(尤其后者)(例如如本文中描述的本發(fā)明的全長多肽或多肽/肽/功能性結(jié)構(gòu)域/同系物/片^/截短物/衍生物，其優(yōu)選地保留C3結(jié)合功能)，和可藥用賦形劑。蛋白質(zhì)MID及其結(jié)合IgD的同源物/片^截短物在WO03/004651(本文中引用作為參考)內(nèi)描述。特別適合于此目的片段是包含在WO03/004651內(nèi)描述的F2片段(或由其組成)的多肽，或與其具有至少60%、70%、80%、90%、95%、99。/o同一性并優(yōu)選保留人IgD結(jié)合活性的序列。這種聯(lián)合疫苗的MID和UspA成分可以是彼此分離的，或可以通過已知分子生物學(xué)技術(shù)方便地合在一起使用。附圖簡述圖1顯示測試?yán)w連蛋白結(jié)合作用的13株卡他莫拉氏菌菌林(A)。如通過抗UspAl/A2pAb(B-I)所檢測，纖連蛋白結(jié)合作用與UspAl/A2表達(dá)強(qiáng)烈相關(guān)?？ㄋ暇鶥BH18野生型和UspAl/A2缺陷突變體的流式細(xì)胞術(shù)圖譜顯示出與可溶性纖連蛋白的UspAl/A2依賴性結(jié)合。顯示野生型臨床分離林(B和F)和缺少UspAl(C和G)或UspA2(D和H)的相應(yīng)突變體以及同時缺少UspAl和UspA2的雙突變體(E和I)的圖i普。將細(xì)菌與兔抗UspAl/A2pAb溫育，或與纖連蛋白隨后與抗纖連蛋白pAb溫育。隨后添加FITC綴合的兔pAb，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。顯示了三個實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)結(jié)果和對應(yīng)于每個圖譜的平均熒光密度(MFI)。圖2顯示卡他莫拉氏菌RH4UspA2缺陷突變體不結(jié)合1251-標(biāo)記的纖連蛋白。包括大腸桿菌BL21作為不結(jié)合纖連蛋白的陰性對照。細(xì)菌與12SI-標(biāo)記的纖連蛋白溫育，隨后洗滌數(shù)次并用y計(jì)數(shù)儀分析。與同時表達(dá)UspAl和A2的RH4野生型菌的纖連蛋白結(jié)合作用i殳定為100%。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。用卡他莫拉氏菌BBH18得到相似的結(jié)果.圖3顯示驗(yàn)證缺少UspAl和UspA2的卡他莫拉氏菌突變體不與固定化纖連蛋白結(jié)合的圖。卡他莫拉氏菌野生型能夠高密度地黏附至纖連蛋白包被的載玻片上(A)?？ㄋ暇蛔凅w也高密度地滯留(B)，而卡他莫拉氏菌和J"5^4i/42雙突變體則黏附不良(C和D)。載玻片用纖連蛋白包^^并且與卡他莫拉氏菌RH4及其相應(yīng)UspAl/A2突變體溫育。數(shù)次洗滌后，對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色。圖4是顯示重組UspAl和A2以劑量依賴方式與纖連蛋白結(jié)合的圖。對UspAl^，和UspA2^外顯示出特異性纖連蛋白結(jié)合作用。將這兩種UspA蛋白質(zhì)(40nM)包被在微量滴定平板上并與遞增濃度的纖連蛋白溫育，隨后用兔抗人纖連蛋白pAb和HRP-綴合抗兔pAb檢測。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差棒表示SD。圖5.對于UspAl和UspA2的活性纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別位于氨基酸299至452和165至318之間。顯示了從UspAl(A)和UspA2(B)中衍生的截短蛋白質(zhì)。均在ELISA內(nèi)對全部片段檢測纖連蛋白結(jié)合作用。將40nM的每種截短片段包被在微量滴定平板上，并且對于UspAl而言，與80ng/ml纖連蛋白溫育；對于UspA2而言，與120ng/ml纖連蛋白溫育。結(jié)合的纖連蛋白用兔抗纖連蛋白pAb，隨后用HRP綴合抗兔pAb檢測。結(jié)果代表三組實(shí)驗(yàn)。誤差棒代表SD。圖6顯示根據(jù)序列號1的序列，以及UspAl2,452與UspA2"5-w之間的序列同源性。31個相同的氨基酸殘基位于括號內(nèi)。圖7顯示截短的UspAl^柳和UspAl299—452片段竟?fàn)幮缘匾种瓶ㄋ暇腢spA依賴性纖連蛋白結(jié)合作用。包括不結(jié)合纖連蛋白的卡他莫拉氏菌d附/7ylZ42雙突變作為陰性對照。在與卡他莫拉氏菌溫育前，UspAl重組蛋白與2mg/100ml纖連蛋白預(yù)溫育。顯示了通過FITC綴合抗纖連蛋白pAb在流式細(xì)胞術(shù)內(nèi)檢測到的帶已結(jié)合纖連蛋白的卡他莫拉氏菌的平均熒光值(MFI)。UspAl5"91和UspAl299-452分別產(chǎn)生95%和63%的抑制。誤差棒代表三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SD。圖8顯示UspAl299"52和UspA2"5—"s抑制了卡他莫拉氏菌通過細(xì)胞結(jié)合性纖連蛋白黏附至Chang結(jié)膜細(xì)胞。Chang上皮細(xì)胞在表面上表達(dá)纖連蛋白，如通過抗纖連蛋白pAb和流式細(xì)胞術(shù)所示(A)。與對照重組蛋白(UspAl""幼和UspA2鄧"")和對照抗體(抗ICAM1mAb)相比，與纖連蛋白結(jié)合性蛋白質(zhì)UspA1299—452、UspA2"5-"s或抗纖連蛋白pAb的預(yù)溫育引起與卡他莫拉氏菌RH4結(jié)合的顯著減少(B)。雙側(cè)配對Studentt檢驗(yàn)P〈0.05。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差棒表示SD。圖9A顯示卡他莫拉氏菌RH4通過UspAl和A2與層粘連蛋白結(jié)合?？ㄋ暇鶵H4野生型(wt)強(qiáng)烈地與固定化層粘連蛋白結(jié)合，平均OD是1.27。RH4J"5/^47顯示平均OD為1.14(野生型平均OD的89.8%)。RH4J"5/^2和雙突變體RH4J附/^J/42分別具有平均OD0.19和0.23(野生型平均OD的15.0%和18.1%)。這與對牛血清白蛋白包被的平板的殘留翻附無顯著差異。將30ng/ml層粘連蛋白或牛血清白蛋白包被在微量滴定平板上。對它們進(jìn)行封閉并隨后與細(xì)菌混懸液溫育，最后洗滌。結(jié)合的細(xì)菌用抗MIDpAb和HRP綴合抗兔pAb檢測。顯示3個代表性實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。圖9B顯示重組UspAl和A2以劑量依賴性結(jié)合層粘連蛋白。UspAl5G-77°和UspA23Q-539顯示出特異性纖連蛋白結(jié)合作用。將這兩種UspA蛋白質(zhì)(40nM)包被在微量滴定平板上并與遞增濃度的層粘連蛋白溫育，隨后用兔抗層粘連蛋白pAb和HRP-綴合抗兔pAb檢測。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差棒表示SD圖10A和B顯示UspAlSc，(A)和UspA2is"(B)的活性層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于氨基末端部分。將40nM重組USpAl5G-77G和UspA2格539連同截短蛋白質(zhì)一起包被在微量滴定平板上并與20jig/ml層粘連蛋白溫育，隨后用兔抗層粘連蛋白pAb和HRP綴合抗兔pAb檢測。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差棒表示SD。圖11是C3、共價結(jié)合的C3b和C3met的示意圖。(A)血清內(nèi)的C3-分子由一條a-鏈和和一條p-鏈組成。(B)a-鏈含有活化后可以與微生物表面共價結(jié)合的內(nèi)部硫酯位點(diǎn)。(C)C3已經(jīng)由甲胺處理，它與硫酯共價結(jié)合。圖12說明卡他莫拉氏菌通過外膜蛋白UspAl和A2對抗補(bǔ)體系統(tǒng)的。(A)將卡他莫拉氏菌RH4野生型(wt)、J附/^41、J"s/^2或zf附/^l/A2突變體在10%NHS存在下溫育。(B)J"s/"l/A2突變體與補(bǔ)充EDTA或Mg-EGTA的10%NHS溫育。在所示時間點(diǎn)上收集細(xì)菌。在過夜溫育后，計(jì)數(shù)集落形成單位(cfu)。將實(shí)驗(yàn)開始時的細(xì)菌數(shù)定義為100%。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差棒表示S.D。(A)5分鐘后對于J附/^J、J"印A2或J附/^4i/A2突變體的平均值顯著不同于野生型(P<0.05)。(B)5分鐘后對于J附/^JZ42突變體的平均值和在10分鐘后對于與Mg-EGTA溫育的J"s/;A/A2突變體的平均值顯著不同于野生型(P〈0.05)。圖13說明卡他莫拉氏菌依賴于補(bǔ)體活化而結(jié)合血清內(nèi)的C3。流式細(xì)胞術(shù)圖譜顯示C3結(jié)合至(A)卡他莫拉氏菌RH4或(B)肺炎鏈球菌。細(xì)菌與NHS或用EDTA預(yù)處理的NHS溫育。隨后，添加兔抗人C3dpAb和作為第二抗體層的FITC綴合山羊抗兔pAb，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。將不存在NHS但存在兩種pAb下的細(xì)菌定義為背景熒光。顯示三個實(shí)驗(yàn)中的一個代表性實(shí)驗(yàn)。圖14說明卡他莫拉氏菌以劑量依賴方式非共價地結(jié)合經(jīng)甲胺處理的純化的C3并且結(jié)合基于離子性相互作用。流式細(xì)胞術(shù)圖譜顯示在C3met濃度增加下的結(jié)合(A)。(B)顯示圖板(A)內(nèi)每一圖譜的平均熒光密度(mfi)。(C)RH4的C3met結(jié)合隨NaCl濃度增加而減少。細(xì)菌與C3met在所示的有或無NaCl下進(jìn)行溫育。C3met結(jié)合由流式細(xì)胞術(shù)測量為如圖3內(nèi)所描述。誤差才奉表示SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖15i兌明卡〗也莫拉氏菌RH4野生型和UspAl/A2缺陷突變體的流式細(xì)胞術(shù)圖譜顯示了UspAl/UspA2依賴性的C3met/C3結(jié)合。顯示野生型臨床分離林(A、F、K)和缺少蛋白質(zhì)MID(B、G、L)、UspAl(C、H、M)、UspA2(D、I、N)或同時缺少UspAl和UspA2(E、J、O)的相應(yīng)突變體的圖i普。細(xì)菌與C3met(A-E)、NHS-EDTA(F-J)或NHS(K-O)溫育并如圖3所述檢測。顯示三個實(shí)驗(yàn)中的一個典型實(shí)驗(yàn)，顯示對于每個圖譜的平均熒光密度(mfi)。圖16說明C3met與純化的重組UspA230-539結(jié)合，而僅觀察到C3met與UspAl,^微弱結(jié)合。此外，確定UspA2的C3met結(jié)合區(qū)域位于氨基酸殘基200至458之間。(A)將重組UspAl50-770與UspA230-539固定在硝酸纖維素膜上。將膜與[1251標(biāo)記的C3met過夜溫育并且使用增感屏，用PersonalFX(Bio-Rad)使結(jié)合的蛋白質(zhì)顯見。包含重組蛋白MID^"謂作為陰性對照。(B)將UspA15^770、UspA2格s外和一系列截短的UspA2蛋白質(zhì)包被在微量滴定平板上并與C3met溫育，隨后與山羊抗人C3pAb和HRP綴合抗山羊pAb溫育。顯示來自三個實(shí)驗(yàn)的平均值。將背景結(jié)合從全部樣品內(nèi)扣除。誤差棒對應(yīng)于S.D。頭P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。圖17說明向血清中添加重組UspAl^"和UspA2別—s外抑制借助旁路途徑的C3b沉積并抑制對卡他莫拉氏菌的殺傷。流式細(xì)胞術(shù)圖鐠顯示了與(A)NHS或經(jīng)重組(rec)UspAl5G-770及UspA23fl-539預(yù)溫育的NHS進(jìn)行溫育后，或與(B)NHS-Mg-EGTA或UspAl5°-77°及UspA23°-539預(yù)溫育的NHS-Mg-EGTA進(jìn)行溫育后，在RH4J";y/7A2/42上的C3b-沉積。在添加多種NHS組合后，如圖13內(nèi)所述分析細(xì)菌。(C)RH4d附/^/Z42與10%NHS或NHS-Mg-EGTA溫育。為了抑制，NHS-Mg-EGTA在添加細(xì)菌前與100nMUspAl5()-77°和/或UspA2格539溫育。在所示時間點(diǎn)上收集細(xì)菌。將實(shí)驗(yàn)開始時的細(xì)菌數(shù)定義為100%。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差棒表示S.D。對于與重組蛋白預(yù)溫育的zf船/;Al/A2突變體的時間點(diǎn)10、20和30分鐘顯著不同于單獨(dú)與Mg-EGTA溫育的J附/l41/A2突變體(P<0.05)。圖18說明重組UspAl5G，和UspA2^"通過抑制旁路途徑而減少兔紅細(xì)胞溶血。NHS在37。C與100nMUspA150-770和/或UspA230-539溫育30分鐘或不與它們溫育。隨后將NHS以所示的濃度添加至兔紅細(xì)內(nèi)，溫育30分鐘后，將混懸液離心并通過分光光度法測量上清液。將每個實(shí)驗(yàn)中的最大溶血定義為100%。顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差棒對應(yīng)于S.D。用NHS濃度為2%、3%和4%的NHS+UspA230-539和NHS+UspAl5"70/UspA2膝539所得到結(jié)果顯著不同于NHS對照(P<0.05)。圖19說明對8林不同菌林的UspAl的pileup-分析，以顯示UspAl不同部分的同源性。圖20說明對13抹不同菌抹的UspA2的pileup-分析，以顯示UspA2不同部分的同源性。圖21說明在Forsgren序列上所鑒定的區(qū)域內(nèi)的。/o同一性，該同一性百分?jǐn)?shù)計(jì)算為完全配對的數(shù)目與區(qū)域比對的長度間的比率，其中區(qū)域比對是含有Forsgren區(qū)域的上文的總比對的部分。材料和方法卡他莫拉氏菌與纖連蛋白間的相互作用細(xì)菌菌抹和培養(yǎng)條件卡他莫拉氏菌臨床菌抹的來源列于表7。卡他莫拉氏菌BBH18和RH4突變體如前所述構(gòu)建[23，58?？ㄋ暇衷谀X心浸出液(BHI)液體肉湯內(nèi)或在BHI瓊脂平板上37°C常規(guī)培養(yǎng)。UspAl缺陷突變體在補(bǔ)加1.5ng/ml氯霉素(Sigma，St丄ouis，MO)的BHI內(nèi)培養(yǎng)，并且UspA2缺陷突變體與7ng/mlzeocin(Invitrogen，Carlsbad,CA)溫育。對雙突變體同時使用氯霉素和zeocin。表7.用于本研究中的卡他莫拉氏菌臨床菌林<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>Bc5鼻咽[20RH4血液[53RH6血液[53R14未知闊R4未知[10SO-1914鼓室吸液[23注意菌株CIO、R4沒有附/"J基因，而F16、R14、Z14缺少"5/^42基因[IO。其余菌林含有附/7/0基因和"^42基因(數(shù)據(jù)未顯示)。DNA方法為檢測情況未知的那些菌林內(nèi)附/;J/、和J2^基因的存在，使用如Meier等所述的引物和PCR條件501。還用RH4和BBH18各自的和"印/^基因的UspA尸"^及UspA2"5-"s的5'引物及3，引物實(shí)施部分測序。氨基酸殘基"DQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLK"的存在還如Mder等所述，用從該序列5'末端中設(shè)計(jì)的引物(5陽CAAAGCTGACATCCAAGCACTTG-3，)和用于"^/^及」2的3，引物，通過實(shí)施PCR予以證實(shí)[50。重組蛋白的構(gòu)建和表達(dá)重組最近已描述了缺少疏水性羧基末端的UspA15。，和UspA23Q-539[58。使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)從卡他莫拉氏菌Bc5提取基因組DNA。此外，還通過相同方法構(gòu)建與覆蓋UspA150—770和UspA230—539的多重區(qū)域相對應(yīng)的重組蛋白。所用的引物列于表8。全部構(gòu)建體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測序。重組蛋白的表達(dá)和純化如前所述完成591。蛋白質(zhì)使用含有鎳樹脂(Novagen)的柱，根據(jù)制造商用于天然條件的說明進(jìn)行純化。重組蛋白如所述在SDS-PAGE上分析[21]。表8.本研究中所用的引物蛋白質(zhì)5'引物3'引物UspA150-770gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccccctgaagctttagtgcataacctaattgUspAl50"491gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccttgagcaagcttagcttggtttttagcgUspAl50-197gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccacctgtggcaagcttcttcctgccUspA150-321gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccggtgtcactaagcttacctgcaccaacatgaacUspA1299-452ggatttgcaggtgcatcggatcctggtaatggtactgtcttttgtaagatcaagcttttgatcaatUspAl433-580catagctctgatatggatccacttaaaaaccatgctgagaagcttacctagattggUspA1557-704gccaaagcacaagcggatccaaataaagacggtcttattggtagtaagcttagcttggttttgUspAl680-770gttgagcaaaaggatcccatcaatcaagagccctgaagctttagtgcataacctaattgUspA230-539cgaatgcggatcctaaaaatgatataactttagaggcattaagcttggtgtetaatgcagttacUspA230-177cgaatgcggatcctaaaaatgatataactttagaggctcatgaccaaaatcaagcttatcttcgatagactcUspA210卜240gatattgcggatccggaagatgatgttgaaacgatcaataagcttaccgcttagattgaatagttcttcUspA2101-318gatattgcggatccggaagatgatgttgaaacgtcaatcgcttcaagcttcttttgagcatactgUspA2'65-318gagattgagaaggatccagatgctattgctgtcaatcgcttcaagcttcttttgagcatactgUspA2302-458gctcaaaaccaagcggatccecaagatctgggtgagcgtttcaagctttgcatcagcatcggcUspA2446-539gcaagtgctgcggatcctgatcgtattgctcattaagcttggtgtetaatgcagttac抗體近來詳細(xì)描述了兔抗UspAl/A2多克隆抗體(pAb)[58。所用的其它抗體是兔抗人纖連蛋白pAb、FITC綴合豬抗兔pAb、辣根過氧化物酶(HRP)綴合豬抗兔pAb和小鼠抗人CD54(ICAMl)單克隆抗體(mAb)?？贵w來自Dakopatts(GIostrup，丹麥)。流式細(xì)胞術(shù)分才斤通過流式細(xì)胞術(shù)分析UspAl/A2蛋白質(zhì)的表達(dá)和卡他莫拉氏菌與纖連蛋白結(jié)合的能力?？ㄋ暇吧途趾蚒spAl/A2缺陷突變體生長過夜并在含有3。/。魚明膠的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-明膠)內(nèi)洗滌兩次。隨后將細(xì)菌(108個)與抗UspAl/A2抗血清或5將纖連蛋白(Sigma，StLouis，MO)溫育。隨后洗滌細(xì)菌并將其在室溫(RT)與FITC綴合抗兔pAb(根據(jù)制造商說明稀釋)溫育30分鐘或在與FITC綴合抗兔pAb溫育之前同兔抗人纖連蛋白pAb(如果首先添加纖連蛋白的話)的1/100稀釋物室溫溫育30分鐘。在三次額外洗滌后，通過流式細(xì)胞術(shù)(EPICS，XL-MCL，Coulter,Hialeah，F(xiàn)L)分析細(xì)菌。全部溫育保持在終體積100plPBS-明膠內(nèi)并且用相同的緩沖液加以洗滌。分別添加抗纖連蛋白pAb和FITC綴合抗兔pAb作為所分析每種菌林的陰性對照。纖連蛋白抑制作用研究通過將0.25微摩爾UspA片段同2照纖連蛋白預(yù)溫育1小時，隨后與(108個)卡他莫拉氏菌細(xì)菌溫育而實(shí)施。殘留游離量的與卡他莫拉氏菌結(jié)合的纖連蛋白通過如上所述的流式細(xì)胞術(shù)確定。卡他莫拉氏菌與固定化纖連蛋白的結(jié)合載玻片以30nl等分試樣的纖連蛋白(lmg/ml)包被并在室溫下空氣干燥。在用PBS洗滌一次后，將載玻片與平皿內(nèi)的預(yù)冷的晚指數(shù)期細(xì)菌(在600nm上光密度(OD"0.9)溫育。在室溫2小時后，載玻片用PBS洗滌一次，隨后進(jìn)行革蘭氏染色。蛋白質(zhì)標(biāo)記和放射免疫測定(RIA)纖連蛋白以氯胺T方法用"5碟標(biāo)記(Amersham，Buckinghamshire,英格蘭)至高特異性活性(每摩爾蛋白質(zhì)0.05摩爾硤)[21?？ㄋ暇諦BH18和RH4以及它們對應(yīng)的突變體在固體培養(yǎng)基上生長過夜并在含2V。牛血清白蛋白(BSA)的PBS內(nèi)洗滌。將(108個)細(xì)菌在37。C與1251-標(biāo)記的纖連蛋白(1600kcpm/樣品)于含有2%BSA的PBS內(nèi)溫育1小時。在用含2%BSA的PBS洗滌三次后，與細(xì)菌結(jié)合的1251-標(biāo)記的纖連蛋白在Y計(jì)數(shù)儀(Wallac，Espoo，芬蘭)內(nèi)測量。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)微量滴定平板(Nunc-ImmunoModule;Roskilde，丹麥)用40nM純化的重組UspAlS0-770和UspA2格539蛋白質(zhì)在75mM碳酸鈉，pH9.6內(nèi)于4。C下包被過夜。平板用洗滌緩沖液(50mMTris-HCl、0.15MNaCl和0.1%Tween20，pH7.5)洗滌四次并在室溫用含有3%魚明膠的洗滌緩沖液封閉2小時。在四次額外洗滌后，板孔在室溫與3倍稀釋于(洗滌緩沖液中的)1.5。/。魚明膠內(nèi)的纖連蛋白(120ng/ml)溫育1小時。此后，將平板洗滌并與兔抗人纖連蛋白pAb溫育l小時。在額外的洗滌后，添加HRP綴合抗兔pAb并在室溫溫育1小時?？谷死w連蛋白和HRP綴合抗兔pAb均在含有1.5。/。魚明膠的洗滌緩沖液內(nèi)1:1，000稀釋。將板孔洗滌四次并使平板顯色以及在OD45Q上測量。覆蓋UspAlSG—^和UspA2格539的截短蛋白質(zhì)分別與80jug/ml和120pg/ml固定劑量纖連蛋白開展ELISA。細(xì)胞系黏附抑制分析法Chang結(jié)膜細(xì)胞(ATCCCCL20.2)在補(bǔ)加10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和12jig慶大霉素/ml的RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoBRL，LifeTechnologies,Paisley,蘇格蘭)內(nèi)培養(yǎng)。在勦附抑制實(shí)驗(yàn)前一日，收獲細(xì)胞，在無慶大霉素的RPMI1640內(nèi)洗滌兩次并在200jil無慶大霉素培養(yǎng)基內(nèi)以終濃度104個細(xì)胞/孔添加到96孔組織培養(yǎng)平板(Nunc)。此后，細(xì)胞在37°C于5%C02和95%空氣的濕潤環(huán)境下溫育過夜。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，對卡他莫拉氏菌翁附的抑制作用通過預(yù)溫育濃度遞增的含有纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UspA1299—452和UspA2"s-"s)的重組UspAl/A2截短蛋白質(zhì)或兔抗人纖連蛋白pAb(l:50稀釋)l小時而實(shí)施。使用非纖連蛋白結(jié)合性重組蛋白(UspAl433—58。和UspA2膝177)作為對照。已知Chang上皮細(xì)胞表達(dá)ICAM1[18]。因此，使用抗ICAM1抗體以區(qū)別抗纖連蛋白抗體的抑制效應(yīng)是否次于空間位阻作用。隨后，將PBS-明膠內(nèi)的卡他莫拉氏菌RH4(106)接種到匯合的細(xì)胞單層上。在全部實(shí)驗(yàn)中，將組織培養(yǎng)平板在3，000xg離心5分鐘并在37。C于5%C02內(nèi)溫育。30分鐘后，感染的細(xì)胞單層用PBS-明膠淋洗數(shù)次以除去未勦附的細(xì)菌，并且隨后用胰蛋白酶-EDTA(0.05。/o胰蛋白酶和0.5mMEDTA)處理以將Chang細(xì)胞從塑料支持物上釋放。此后，將得到的細(xì)胞/細(xì)菌混懸液于稀釋物內(nèi)接種在含有BHI的瓊脂平板上并在37°C于5%C02內(nèi)溫育過夜。測定Chang結(jié)膜上皮細(xì)胞內(nèi)的纖連蛋白表達(dá)Chang結(jié)膜上皮細(xì)胞通過刮取收獲，隨后在PBS-明月交內(nèi)重懸。細(xì)胞(lxl(^個/ml)用兔抗人纖連蛋白pAb標(biāo)記，隨后洗滌并與FITC綴合抗兔pAb溫育。在又洗滌三次后，細(xì)胞如上所述通過流式細(xì)胞術(shù)分析?？ㄋ暇c層粘連蛋白之間的相互作用細(xì)菌菌抹和培養(yǎng)條件卡他莫拉氏臨床菌菌林BBH18和RH4及其對應(yīng)的突變體如先前所描述[58。這兩種菌抹具有與UspAl相比的相對較高的UspA2表達(dá)[58。與野生型菌抹相比，突變體表達(dá)等量的卡他莫拉氏菌免疫球蛋白D結(jié)合蛋白(MID)。細(xì)菌在腦心浸出液(BHI)肉湯內(nèi)或在BHI瓊脂平板上37°C常規(guī)培養(yǎng)。UspAl缺陷突變、UspA2缺陷突變體和雙突變體如所述在補(bǔ)加抗生物的BHI內(nèi)培養(yǎng)[58。重組蛋白的構(gòu)建和表達(dá)制造了缺少疏水性羧基末端的重組USpAl5G-77G和UspA23G-539[581。此外，使用與覆蓋UspAl5fl-77Q和UspA23G-539的多重區(qū)域?qū)?yīng)的重組蛋白[78?？贵w使用兔抗UspAl/A2和抗MID多克隆抗體(pAb)[22，58蛋白pAb來自Sigma(StLouis,MO,美國)。辣根過氧化物豬抗兔pAb來自Dakopatts(Glostrup，丹麥)?？ㄋ暇c固定化層粘連蛋白的結(jié)合孩支量滴定平氺反(Nunc-ImmunoModule;Roskilde，丹麥)用。兔抗層粘連酶(HRP)綴合Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤層粘連蛋白(Sigma，SaintLouis,美國)或牛血清白蛋白(BSA)(30ng/ml)在Tris-HCL，pH9.0內(nèi)于4。C包被過夜。平板用磷酸鹽緩沖鹽水和0.05%Tween20，pH7.2(PBS-Tween)洗滌并隨后用PBS+0.1%Tween20，pH7.2內(nèi)的2%BSA封閉。隨后添加在100nl內(nèi)的(108個)卡他莫拉氏菌RH4和BBH18，然后溫育1小時。通過用PBS-Tween洗滌3次去除未結(jié)合的細(xì)菌。剩下結(jié)合的細(xì)菌通過抗MIDpAb檢測，隨后用HRP綴合抗兔pAb進(jìn)行檢測。使平板顯色并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案在OD4s。上測量。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)-微量滴定平板(Nunc-ImmunoModule)用40nM純化的重組UspAl50-77°和UspA23()-539蛋白質(zhì)在75mM碳酸鈉，pH9.6內(nèi)于4。C下包被過夜。平板用洗滌緩沖液(50mMTris-HCl、0.15MNaCl和0.1%Tween20，pH7.5)洗滌四次并在室溫用含有3%魚明膠的洗滌緩沖液封閉。在額外洗滌后，板孔與在(洗滌緩沖液中的)1.5%魚明膠內(nèi)如所示不同稀釋度上的層粘連蛋白室溫溫育1小時。此后，將平板洗滌并與兔抗層粘連蛋白pAb溫育。在額外的洗滌后，添加HRP綴合抗兔pAb并在室溫溫育。抗層粘連蛋白pAb和HRP綴合抗兔pAb均在含有1.5%魚明膠的洗滌緩沖液內(nèi)1:1，000稀釋。洗滌板孔并使平板顯色以及在OD45Q上測量。使用與相同稀釋度的層粘連蛋白溫育的未包被的板孔作為背景對照。截短的覆蓋UspAls()-77()和UspA23()-539的蛋白質(zhì)分別與80jLig/ml和120Mg/ml固定劑量層粘連蛋白開展ELISA。卡他莫拉氏菌與C3和C3met之間的相互作用細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件卡他莫拉氏菌臨床分離林及相關(guān)亞種最近已經(jīng)詳細(xì)描述[21，53。典型菌林來自哥德堡大學(xué)培養(yǎng)物保藏中心(CCUG;臨床細(xì)菌學(xué)系，Sahlgrenska醫(yī)院，瑞典哥德堡)或美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;Manassas，Va);淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrheae)CCUG15821、釀膿鏈球菌CCUG25570和25571、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)CCUG4208、肺炎鏈球菌ATCC49619、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)ATCC33152、銅綠假單胞菌ATCC10145、金黃色葡萄球菌ATCC29213以及金黃色葡萄球菌ATCC25923。表9內(nèi)其余菌株是來自瑞典蘭德大學(xué)馬爾默大學(xué)醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)系、微生物系的臨床分離林。表9.卡他莫拉氏菌是獨(dú)特的C3/C3met結(jié)合細(xì)菌。相關(guān)的莫拉氏菌亞種和其它常見的人病原體不結(jié)合C3/C3met(mfK2.0)。在與EDTA處理的NHS或C3met溫育后，使用兔抗C3dpAb和FITC綴合山羊抗兔pAb,通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)菌。物種_NHS-EDTA(mfi)C3met(mfi)卡他莫拉氏菌RH48.722.1奧斯陸莫4立氏菌(Af.仍/oe附/s)<2.0<2.0牛莫拉氏菌(AT.6tfv,X)<2.0<2.0Mc朋i.cm//<2.0<2.0不液化莫拉氏菌(AT.<2.0<2.0咽奈瑟氏球菌(7V:/;/i"o;"g/s)<2.0<2.0干燥奈瑟氏球菌(TV.s/ccfl)<2.0<2.0黃色奈瑟氏球菌(A^^/Zflvfl)<2.0<2.0微黃奈瑟氏球菌(iV.s"6y7flvfl)<2.0<2.0解脲寡源桿菌(0"^//"<2.0<2.0m/w/Wcflf)(n=2)流感嗜血桿菌(n-7)<2.0<2.0肺炎鏈球菌(11=11)<2.0<2.0嗜肺軍團(tuán)菌(11=2)<2.0<2.0銅綠假單胞菌(n-2)<2.0<2.0單核細(xì)胞增生李斯特菌<2.0<2.0小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌<2.0<2.0金黃色葡萄球菌(n-3)<2.0<2.0釀膿鏈球菌(n-2)<2.0<2.0無乳鏈球菌<2.0<2.0糞腸球菌(五"temcocc"s<2.0<2.0幽門螺桿菌(/^//aZ^ctef<2.0<2.0大腸桿菌(11=2)<2.0<2.0綿羊莫拉氏菌(AT.ov/"<2.0<2.0豚鼠莫拉氏菌(AT.<2.0<2.0淋病奈瑟氏球菌<2.0<2.0腦膜炎奈瑟氏球菌(TV.<2.0<2.0粘液奈瑟球菌(7V:m"c仍")<2.0<2.0將不同的非莫拉氏菌物種在適宜的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上培育?？ㄋ暇衷谀X心浸出液(BHI)液體肉湯內(nèi)或在BHI瓊脂平板上37。C常規(guī)培養(yǎng)?？ㄋ暇鶥BH18和RH4突變體如先前所描述產(chǎn)生[22、23、58。MID缺陷突變體在含有含有50ng/ml卡那霉素的BHI內(nèi)培養(yǎng)。UspAl缺陷突變體在補(bǔ)加1.5jig/ml氯霉素(Sigma、St丄ouis、MO)的BHI內(nèi)培養(yǎng)，并且UspA2缺陷突變體與7ng/mlzeocin(Invitrogen、Carlsbad、CA)溫育。氯霉素和zeocin同時用于培育UspAl/A2雙突變體?？贵w的200ng重組全長UspAl肌內(nèi)免疫，并在第18日和36日用弗氏不完全佐劑內(nèi)的相同劑量蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫[22。3周后放血。為提高特異性，抗UspAl抗血清用重組UspAlS"7。綴合的Sepharose進(jìn)行親和純化[58j?？寡迮cUspAl和UspA2同等地結(jié)合并且因此命名為抗UspAl/A2pAb。兔抗人C3dpAb和FITC綴合豬抗兔pAb從Dakopatts(Glostrup，丹麥)購買，并且山羊抗人C3來自AdvancedResearchTechnologies(SanDiego，CA)。從Serotec(Oxford，UK)獲得辣根過氧化物酶(HRP)綴合驢抗山羊pAb。蛋白質(zhì)和多典才示i己最近已描述了缺少疏水性羧基末端的重組UspAl^^和USpA23G-S39的制造23。截短的UspAl蛋白和UspA2蛋白如Tan等詳細(xì)所述[78制造。C3b從AdvancedResearchTechnologies購買。C3(H;jO)通過冷凍和融化純化的C3得到。C3b-樣分子(C3met)通過將純化的C3與100mM曱胺(pH8.0)在37。C溫育2小時而產(chǎn)生，并隨后對100mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl透析。對于結(jié)合研究，使用氯胺T方法25，以每摩爾蛋白質(zhì)0.05mol125I(Amersham，Buckinghamshire,英格蘭)標(biāo)記C3met。流式細(xì)力包術(shù)分析C3對卡他莫拉氏菌及其它物種的結(jié)合通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長過夜并在含有2%BSA(Sigma)的PBS(PBS-BSA)內(nèi)洗滌兩次。隨后將細(xì)菌(108個集落形成單位；cfu)與C3met、C3b、C3(H20)或10%NHS在存在或不存在10mMEDTA或4mMMgCl2和10mMEGTA(Mg-EGTA)下于PBS-BSA內(nèi)在37。C溫育30分鐘。洗滌后，將細(xì)菌與與抗人C3dpAb在冰上溫育30分鐘，隨后洗滌并在冰上與FITC綴合山羊抗兔pAb再溫育30分鐘。在額外洗滌三次后，通過流式細(xì)胞術(shù)(EPICS，XL-MCL，Coulter,Hialeah，F(xiàn)L)分析細(xì)菌。全部溫育保持在終體積100piPBS-BSA內(nèi)并且用相同的緩沖液完成洗滌。分別添加抗人C3dpAb和FITC綴合抗兔pAb作為所分析每種菌抹的陰性對照。在抑制研究中，血清與100nM的重組UspAl50-77。和UspA23^39蛋白質(zhì)在370C預(yù)溫育30分鐘。為分析卡他莫拉氏菌與C3相互作用的特征，將遞增濃度的NaCl(O-l.OM)添加到細(xì)菌和C3met中。為分析UspAl/A2的表達(dá)，將細(xì)菌(108cfu)與抗uspAl/A2pAb溫育并如上所述洗滌。根據(jù)制造商說明稀釋的FITC綴合山羊抗兔pAb用于檢測。為確保EDTA不破壞外膜蛋白UspAl和UspA2，將卡他莫拉氏菌與或不與EDTA—起溫育，隨后檢測UspAl/A2表達(dá)。在NHS-EDTA實(shí)驗(yàn)內(nèi)所用濃度上的EDTA不改變UspAl/A2的密度。血清和血清殺菌測定從5位健康志愿者中得到正常人血清(NHS)。讓血液在室溫凝固30分鐘并且隨后在冰上孵育60分鐘。離心后，將血清合并、等分并貯存在-70。C。為使經(jīng)典途徑和旁路途徑失活，添加10mMEDTA。相反，加入Mg-EGTA以使經(jīng)典途徑失活。C4BP缺陷的人血清通過將新鮮血液通過經(jīng)mAb104(—種抗C4BP的a-鏈CCP1的小鼠mAb)偶聯(lián)的HiTrap柱(AmershamBiosciences)而制備[41。收集流出物并將耗盡的血清以等分試樣方式貯存在-70。C。使用Biorex70離子交換色鐠(Bio-Rad，Hercules，CA)，從純化Clq的第一步驟中得到耗盡Clq的血清[79。得到的血清顯示正常的溶血活性。因子D和備解素缺陷的血清由AndersSjiiholm博士(瑞典蘭德鎮(zhèn)蘭德大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物系)友好提供。卡他莫拉氏菌菌抹在含有0.;T/。(wt/vol)明膠、1mMMgCl2、0.15mMCaCh和2.5%葡萄糖(DGVB+,的2.5mMVeronal緩沖液，pH7.3內(nèi)稀釋。細(xì)菌(103個cfu)與10%NHS和EDTA或Mg-EGTA在lOOjil終體積內(nèi)共同溫育。將細(xì)菌/NHS在37。C溫育，并且將IOnl等分試樣在不同時間點(diǎn)上取出并涂布在BHI瓊脂平板上。在抑制研究中，在添加細(xì)菌前，將10%血清與100nM的重組UspA150-770和UspA2^—^蛋白質(zhì)在37。C溫育30分鐘。點(diǎn)印跡分析使用點(diǎn)印跡裝置，將在100nl0.1MTris-HCl，pH9.0內(nèi)三倍稀釋的純化重組UspAl5G-77°和UspA23G-539(1.9-150nM)施加至硝酸纖維素膜(Schleicher&Schtill，Dassel，德國)。在飽和后，將膜與含有5%脫脂乳粉的PBS-Tween在室溫下溫育2小時并用PBS-Tween洗滌四次。此后，添加在含有2%脫脂乳粉的PBS-Tween內(nèi)的5kcpm["5l-標(biāo)記C3met，4。C過夜。使用增感屏，用PersonalFX(Bio-Rad)使結(jié)合的蛋白質(zhì)顯見。表面等離子體共振(Biacore)使用表面等離子體共振(Biacore2000;Biacore，Uppsala,Sweden)如最近對UspAl/2-C4BP相互作用所述那樣58]進(jìn)一步分析UspAl5°-77()或UspA23()-539與C3之間的相互作用。使用由Biaevaluation軟件(Biacore)提供的穩(wěn)態(tài)親和力模式，從結(jié)合曲線中計(jì)算KD(平衡解離常數(shù))，其中所述的結(jié)合曲線顯示的對濃度的平衡反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)微量滴定平板(Nunc-ImmunoModule;Roskilde，丹麥)用40nM純化的重組UspAl5"70、UspA2鄧-539或截短的UspAl及UspA2片段(75mM碳酸鈉，pH9.6)—式三份在4。C包被過夜。平板用洗滌緩沖液(具有的0.1%Tween20的PBS,pH7.2)洗滌四次并用補(bǔ)充1.5%卵清蛋白的洗滌緩沖液(封閉緩沖液)在室溫封閉2小時。在洗滌后，板孔與封閉緩沖液內(nèi)的0.25照C3met在4。C溫育過夜。此后，將平板洗滌與封閉緩沖液內(nèi)的山羊抗人C3在室溫下溫育1小時。在額外的洗滌后，添加HRP綴合驢抗山羊pAb，在室溫又溫育1小時。將板孔洗滌四次并使平板顯色以及在OD45Q上測量。溶血測定兔紅細(xì)胞用含有0.;r/o(wt/vol)明膠、7mMMgCl2、10mMEGTA和2.5%葡萄糖(]\^++￡01人)的冰冷2.5mMVeronal緩沖液，pH7.3洗滌三次，并重懸為濃度0.5xl(^個細(xì)胞/ml。紅細(xì)胞與稀釋于]\^++￡01入內(nèi)的多種濃度(0至4。/。)的血清溫育。在37。C1小時后，將紅細(xì)胞離心，并且裂解的紅細(xì)胞數(shù)通過在405nm上的分光光度法測量已釋放的血紅蛋白而確定。對于用UspAl和UspA2的抑制，將10%血清與100nM的重組UspA150-770蛋白和/或UspA2^5"蛋白質(zhì)37。C預(yù)溫育30分鐘，并且隨后添加到濃度0至4%的紅細(xì)胞內(nèi)。多形核白細(xì)胞的分離和吞噬人多形核白細(xì)胞(PMN)使用中分子右旋糖酐(PharmalinkAB，UpplandsVSsby，瑞典)從健康志愿者新鮮血液中分離。將PMN在300g上離心10分鐘，在PBS內(nèi)洗滌并重懸于RPMI1640培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Paisley,蘇格蘭)內(nèi)。細(xì)菌混懸液(0.5乂108)用3%的NHS或NHS-EDTA，或20jig純化的C3met在37。C調(diào)理15分鐘。洗滌后，將細(xì)菌與PMN(lx107個細(xì)胞/ml)在細(xì)菌/PMN比10:1下混合，隨后在37。C以持續(xù)滾轉(zhuǎn)方式溫育。通過活力計(jì)數(shù)確定在溫育0、30、60和120分鐘后的存活細(xì)菌。將NHS處理的被吞噬的細(xì)菌數(shù)與在NH不存在下的被吞噬的細(xì)菌數(shù)比較。使用以NHS調(diào)理的金黃色葡萄球菌作為陽性對照。實(shí)施例和結(jié)果卡他莫拉氏菌和纖連蛋白間的相互作用缺少UspAl和A2的卡他莫拉氏菌不結(jié)合可溶性或固定化的纖連蛋白我們隨機(jī)選擇一組卡他莫拉氏菌臨床菌林(11=13)(表7)并通過流式細(xì)胞術(shù)分析對它們測試與其UspAl/A2表達(dá)相關(guān)的纖連蛋白結(jié)合作用。如高的平均熒光密度(MFI)所測定的高UspAl/A2表達(dá)與UspAl/A2表達(dá)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)0.77,PO.05)(圖1A)。然而，用我們的抗UspAl/A2pAb不可能區(qū)分UspAl表達(dá)與UspA2表達(dá)。此外，對結(jié)合作用有貢獻(xiàn)的UspA2H蛋白質(zhì)不可能存在，因?yàn)樵诒狙芯績?nèi)中所有菌林內(nèi)未找到附/^2好基因(數(shù)據(jù)未顯示)。還通過流式細(xì)胞術(shù)分析了兩林卡他莫拉氏菌分離林(BBH18和RH4)及其缺少UspAl、UspA2或這兩種蛋白質(zhì)的特定突變體?？ㄋ暇鶥BH18強(qiáng)烈地結(jié)合纖連蛋白，平均熒光密度(MFI)是96.1(圖1F)。相反，BBE18J"印/4i顯示減少的纖連蛋白結(jié)合作用，MFI是68.6(圖1G)。對BBH18zT"印/12及雙突變體BBH18zT"s/^4//42的纖連蛋白結(jié)合作用分別僅顯示10.7和11.5的MFI(圖1H，11)。用卡他莫拉氏菌臨床菌林RH4的UspAl/A2突變體得到相似的結(jié)果?？傊@些結(jié)果表明UspAl和A2結(jié)合纖連蛋白并且表明細(xì)菌結(jié)合纖連蛋白的能力強(qiáng)烈依賴于UspAl/A2表達(dá)。為進(jìn)一步分析纖連蛋白與卡他莫拉氏菌間的相互作用，將1251-標(biāo)記的纖連蛋白與兩林卡他莫拉氏菌臨床分離林(BBH18和RH4)及其對應(yīng)突變體溫育。野生型卡他莫拉氏菌RH4強(qiáng)烈地結(jié)合1251-纖連蛋白，而對應(yīng)的^附/7yU突變體顯示80%的野生型結(jié)合作用。相反，J附/^2和雙突變體分別以略高于背景水平(5.0至10%)的14%和12%的野生型結(jié)合作用結(jié)合1251-纖連蛋白(圖2)。用卡他莫拉氏菌BBH18和對應(yīng)的UspAl/A2突變體得到相似的結(jié)果。因此，我們的結(jié)果表明UspAl和A2均是卡他莫拉氏菌最大程度結(jié)合可溶性纖連蛋白所需要的。為研究細(xì)菌與固定化纖連蛋白的結(jié)合，卡將他莫拉氏菌RH4及其對應(yīng)的J附/l^/42突變體施加至纖連蛋白包4皮的載玻片。在溫育2小時后，洗滌載玻片并隨后進(jìn)行革蘭氏染色。發(fā)現(xiàn)卡他莫拉氏菌野生型和J附/^4i突變體強(qiáng)烈地勦附至纖連蛋白包被的載玻片(圖3A和3B)。相反，卡他莫拉氏菌J"s/7/42和J"s/^4^42雙突變體微弱地軲附至纖連蛋白包被地載玻片，洗滌后僅留下少量細(xì)菌(分別見圖3C和3D)。用另一種卡他莫拉氏菌臨床分離林(BBH18)及其衍生性突變體的實(shí)驗(yàn)顯示類似的模式，表明UspA2對卡他莫拉氏菌與固定化的纖連蛋白結(jié)合是非常重要的。纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括位于UspAl的299和452之間和UspA2的165和318之間的氨基酸殘基為進(jìn)一步分析UspAl和A2與纖連蛋白的相互作用，將截短的UspAl5G，和UspA2秦^在大腸桿菌內(nèi)重組地產(chǎn)生，包被在微量滴定平板上并與遞增濃度的纖連蛋白溫育。結(jié)合的纖連蛋白用抗人纖連蛋白pAb檢測，隨后與辣根過氧化物酶綴合的抗兔pAb溫育。重組UspAlSG-77()和UspA23°_539均結(jié)合可溶性纖連蛋白并且相互作用是劑量依賴性的(圖4)。為確定UspAl的纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,制造了覆蓋UsPAl5()-77()完整分子的重組蛋白。將纖連蛋白與固定化的UspAl蛋白質(zhì)片段溫育并且通過ELISA對相互作用定量。UspAl5"91幾乎如UspAl5G-，那樣對纖連蛋白的高效結(jié)合表明該結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于此蛋白質(zhì)的該部分內(nèi)。在其它的截短片段中，UspAl，-^高效地結(jié)合纖連蛋白(圖5A)。平行地，分析纖連蛋白與包括氨基酸UspA23()-539的數(shù)種重組UspA2片段間的相互作用。兩種片段UspA2皿"s和UspA2"5"s強(qiáng)烈地結(jié)合纖連蛋白(圖5B)。我們的發(fā)現(xiàn)提供如此證據(jù)，即結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在UspAl299"52和UspA2165—318內(nèi)找得到的殘基。在這兩種結(jié)合性片段之間的序列比較表明UspAl和A2有31個氨基酸殘基"DQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLK"相同(圖6)。此外，這種重復(fù)序列也在卡他莫拉氏菌BBH18和RH4的UspAl和A2基因內(nèi)找到(數(shù)據(jù)未顯示)。UspAl5"91和UspAl299"52片段竟?fàn)幮缘匾种瓶ㄋ暇睦w連蛋白結(jié)合作用為進(jìn)一步驗(yàn)證我們在UspAl/A2纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的發(fā)現(xiàn)，對重組的截短UspAl蛋白質(zhì)測試它們阻斷纖連蛋白與卡他莫拉氏菌結(jié)合的能力。纖連蛋白(2jig)與0.25孩t摩爾重組UspAl片段預(yù)溫育并隨后與卡他莫拉氏菌溫育。最終，通過流式細(xì)胞術(shù)測量卡他莫拉氏菌的UspA依賴性纖連蛋白結(jié)合。與UspA150—491和UspA1299—452的預(yù)溫育導(dǎo)致減少的纖連蛋白結(jié)合，對于UspAl5"91而言，減少95%并且對UspAl299—452而言，減少63%(圖7)。當(dāng)纖連蛋白與截短的UspA2皿^預(yù)溫育時，產(chǎn)生50%抑制。因此，UspAl和A2的纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域阻斷了纖連蛋白與卡他莫拉氏菌間的相互作用。UspAl，^和UspA2"s^抑制卡他莫拉氏菌黏附至Chang上皮細(xì)胞已知上皮細(xì)胞表達(dá)纖連蛋白并且眾多細(xì)菌通過細(xì)胞結(jié)合的纖連蛋白結(jié)合至上皮細(xì)胞上[46、54、69、77。先前的研究已經(jīng)證實(shí)卡他莫拉氏菌與上皮細(xì)胞私附43、49。我們分析了經(jīng)常在用呼吸道病原體的黏附實(shí)驗(yàn)中使用的Chan結(jié)膜細(xì)胞。Chang細(xì)胞高度表達(dá)纖連蛋白，如由流式細(xì)胞術(shù)分析所顯示(圖8A)。為分析UspA依賴性纖連蛋白結(jié)合作用對細(xì)菌黏附是否重要,將Chang上皮細(xì)胞與抗人纖連蛋白pAb或重組蛋白UspAl299"52和UspA2165—318預(yù)溫育。此后，添加卡他莫^立氏菌RH4并分析細(xì)菌黏附。與每200jil的0.4n摩爾UspA12,452、UspA2"5^或抗人纖連蛋白pAb預(yù)溫育后的相對黏附(通過集落形成單位的數(shù)目測量)分別是36%、35%和32%。較高濃度的重組肽沒有導(dǎo)致進(jìn)一步抑制。相反，非纖連蛋白結(jié)合性片段UspAl""糾和UspA2^"不抑制卡他莫拉氏菌與Chang上皮細(xì)胞間的相互作用(圖8B)。因此，在Chang上皮細(xì)胞上的纖連蛋白可以起到卡他莫拉氏菌受體的作用責(zé)這種相互作用的配體,卡他莫拉氏菌與層粘連蛋白之間的相互作用卡他莫拉氏菌通過UspAl和A2結(jié)合層粘連蛋白通過完整細(xì)胞ELISA分析兩株卡他莫拉氏菌臨床分離林(BBH18和RH4)及其缺少UspAl、UspA2或這兩種蛋白質(zhì)的特定突變體?？ㄋ暇鶵H4強(qiáng)烈地結(jié)合至固定化的層粘連蛋白(圖9A)。相反，卡他莫拉氏菌RH4uspAl突變體(RH4AuspAl)粘連蛋白層結(jié)合作用顯示為野生型的89.9%?？ㄋ暇鶵H4uspA2突變體(RH4AuspA2)及雙突變體RH4AuspAl/A2結(jié)合能力分別顯示為野生型的15.2%和18.1%。這與對BSA所包被平板的殘余黏附無顯著差異。用源自卡他莫拉氏菌臨床菌林BBH18的UspAl/A2突變體得到相似的結(jié)果。在這兩種菌抹(BBH18和RH4)中，與UspAl相比，UspA2是優(yōu)勢表達(dá)的蛋白質(zhì)，這解釋了野生型與RH4AuspAl間在結(jié)合作用方面的細(xì)微差異?？傊@些結(jié)果顯示UspAl和A2結(jié)合層粘連蛋白。為進(jìn)一步分析UspAi/A2與層粘連蛋白間的結(jié)合，將截短的UspAlso-77()和UspA2^^在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)生。將重組蛋白包被在微量滴定平板上并與遞增濃度的層粘連蛋白溫育。結(jié)合的層粘連蛋白用兔抗層粘連蛋白pAb檢測，隨后與HRP綴合抗兔pAb溫育。重組UspAl5G-77G和UspA23()-539均強(qiáng)烈地結(jié)合可溶性層粘連蛋白并且結(jié)合具有劑量依賴性和飽和性(圖9B)。為確定UspAl的層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，制造了覆蓋完整分子的重組UspAl和A2。將層粘連蛋白與固定化的截短UspAl和A2片段溫育并且通過EL1SA進(jìn)行定量。UspA150-491幾乎如UspAl5Q-77Q那樣對層粘連蛋白的高效結(jié)合表明該結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于此蛋白質(zhì)的該部分內(nèi)。然而，在覆蓋該區(qū)域的其它截短片段中，似乎沒有其它片段結(jié)合層粘連蛋白。與全長蛋白質(zhì)相比，氨基末端部分即UspA230-351能夠保留44.7%的結(jié)合能力。較短的蛋白質(zhì)UspA230-177顯示43.7%的結(jié)合能力(圖IOB)。這些結(jié)果表明卡他莫拉氏菌與C3和C3met之間的相互作用卡他莫拉氏菌外膜蛋白UspAl和UspA2既抑制補(bǔ)體級聯(lián)的經(jīng)典途徑，又抑制旁路途徑UspA2的表面表達(dá)對正常人血清(NHS)內(nèi)的卡他莫拉氏菌存活至關(guān)重要[l，58，即莫拉氏菌UspA2缺陷突變體在接觸NHS時被迅速殺死。我們最近已經(jīng)證實(shí)UspAl和A2均結(jié)合C4BP并且因此可能抑制補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑[58]。為進(jìn)一步闡明卡他莫拉氏菌與補(bǔ)體系統(tǒng)的相互作用。在用添加MgCl2的EGTA(Mg-EGTA)處理或用EDTA處理的血清內(nèi)進(jìn)行研究UspAl/A2雙突變體的存活。Mg-EGTA抑制經(jīng)典途徑和凝集素途徑，并且因此允許分別分析旁路途徑。相反，EDTA通過吸附二價陽離子(Mg2+和Ca2+)而抑制所有補(bǔ)體途徑?？ㄋ暇鶵H4野生型在溫育30分鐘后存活，而RH4AuspAl/A2雙突變體在接觸NHS的10分鐘后被殺死(圖12)。當(dāng)經(jīng)典途徑受到抑制(NHS+Mg-EGTA)時，與無任何螯合劑的NHS相比，RH4AuspAl/A2突變體的存活時間顯著較長，但是不及野生型細(xì)菌的存活時間。此外，當(dāng)用EDTA阻斷經(jīng)典途徑和旁路途徑時，卡他莫拉氏菌RH4AUspAl/A2存活。類似的模式用卡他莫拉氏菌BBH18分離林及對應(yīng)的BBH18AUspAl/A2突變體(未顯示)得到。平行地，用Clq和因子D/備解素缺陷型血清的實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)典途徑和旁路途徑均受卡他莫拉氏菌抑制(未顯示)。因此，卡他莫拉氏菌(一種經(jīng)常定植于人呼吸道內(nèi)的病原體)通過外膜蛋白UspAl和A2不僅對抗補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑，還對抗旁路途徑?？ㄋ暇絹碜訣DTA滅活的血清中的C3C3b共價地與微生物表面結(jié)合并且因此誘導(dǎo)旁路途徑(圖IIB)。為分析卡他莫拉氏菌是否可與C3相互作用，將我們的RH4野生型菌林與NHS或經(jīng)EDTA處理的NHS溫育。用識別C3和C3b的抗C3d多克隆抗體(pAb)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析檢測C3/C3b在卡他莫拉氏菌RH4細(xì)菌表面的結(jié)合或沉積(通過共價鍵)。細(xì)菌與含完好補(bǔ)體的NHS的溫育引起C3沉積(圖13)。有意思的是，當(dāng)補(bǔ)體級聯(lián)在EDTA下被滅活時，卡他莫拉氏菌RH4仍結(jié)合C3(圖13A)。包括用于比較的肺炎鏈球菌不吸附來自經(jīng)EDTA處理的血清內(nèi)的C3(圖13B)。與肺炎鏈球菌不同，卡他莫拉氏菌則結(jié)合C3，無論補(bǔ)體活化與否。C3的內(nèi)部硫酯在液相中被自發(fā)地水解成C3(H20)。因此，完好的C3或C3(H20)是最可能存在的與卡他莫拉氏菌相互作用的C3形式。由于卡他莫拉氏菌也結(jié)合C4BP[58，我們想排除C4BP參與C3結(jié)合作用，并且為此目的，我們使用C4BP耗盡血清。卡他莫拉氏菌如對NHS那樣的相同程度吸附來自C4BP耗盡血清中的C3(未顯示)。C3met對卡他莫拉氏菌的結(jié)合是劑量依賴性和非共價性的我們的實(shí)驗(yàn)表明C3與卡他莫拉氏菌表面結(jié)合，無論補(bǔ)體活化與否。因此，我們分析無功能性的已轉(zhuǎn)化C3是否可能與該細(xì)菌結(jié)合。天然C3從人血清中純化并用曱胺處理，其中甲胺將C3轉(zhuǎn)換成與C3b等效的C3met分子，其中C3met分子沒有與微生物共價結(jié)合的能力(圖IIC)。流式細(xì)胞術(shù)分析揭示卡他莫拉氏菌RH4野生型菌林以劑量依賴性及可飽和性方式高效地結(jié)合C3met(圖14A和B)。這種相互作用不由C3分子的C3a部分介導(dǎo)，因?yàn)镃3b和C3(H20)也結(jié)合卡他莫拉氏菌(未顯示)。卡他莫拉氏菌RH4與C3met間的結(jié)合很大程度上基于離子性相互作用，因?yàn)檫f增濃度的NaCl抑制這種相互作用(圖14C)。用卡他莫拉氏菌BBH18野生型菌林得到相似的結(jié)果(未顯示)。為確定C3的結(jié)合是否為全部卡他莫拉氏菌菌株的一般特點(diǎn)，我們隨機(jī)選擇一系列臨床分離抹(11=13)并分析它們結(jié)合C3met的能力。所分析的全部卡他莫4i氏菌菌抹結(jié)合C3met，如用抗C3dpAb通過流式細(xì)胞術(shù)分析所示。Mfi值是4至39。然而，包括用于比較的肺炎鏈球菌及大腸桿菌不結(jié)合C3met?？ㄋ暇仟?dú)特的結(jié)合C3和C3met的細(xì)菌為擴(kuò)展我們對細(xì)菌吸附來自NHS內(nèi)C3的分^f，將相關(guān)的莫"t立氏菌亞種(11=13)以及常見的人病原體(11=13)在NHS-EDTA存在下進(jìn)行溫育。有意義的是，在全部測試的細(xì)菌物種中，卡他莫拉氏菌是結(jié)合滅活補(bǔ)體的血清內(nèi)C3的僅有細(xì)菌(表9)。也對全部相關(guān)的莫拉氏菌菌林以及其它人病原體分析C3met的結(jié)合作用。與C3結(jié)合作用相一致，卡他莫拉氏菌是結(jié)合C3met的僅有物種?？傊ㄋ暇哂幸苑枪矁r方式強(qiáng)烈地結(jié)合C3和C3met的獨(dú)特特性。卡他莫拉氏菌通過外膜蛋白UspAl和UspA2結(jié)合C3met為確定負(fù)責(zé)C3結(jié)合作用的卡他莫拉氏菌蛋白質(zhì)，我們測試了一系列缺少外膜蛋白MID、UspAl和/或UspA2的細(xì)菌突變體[22、58。有意義的是，C3met的結(jié)合作用與Usp表達(dá)顯著相關(guān)(圖15)?？ㄋ暇鶵H4Amid以如野生型對應(yīng)物那樣的相同程度結(jié)合C3met(圖15A-B)。RH4AuspAl突變體僅顯示輕^:下降的結(jié)合作用，而與野生型對應(yīng)物相比，RH4AuspA2是更弱的結(jié)合物(圖15C-D)。與此同時，C3met與RH4AUspAl/A2雙突變體結(jié)合被徹底消除(圖15E)。此外，當(dāng)使用NHS-EDTA開展相同實(shí)驗(yàn)，觀察到相同的模式(圖15F-J)。當(dāng)使用正常人血清時，全部突變體均在其表面顯示相似量的C3，因?yàn)檫@是C3共價性沉積和結(jié)合的綜合結(jié)果(圖15K-0)。用卡他莫拉氏菌BBH18分離抹及對應(yīng)的BBH18突變體得到相似的結(jié)果。為了進(jìn)一步分析C3與UspAl/A2之間的相互作用，將UspAl,^和UspA23G-539在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)生并純化。將重組蛋白點(diǎn)樣印跡至硝酸纖維素膜上，隨后與碘標(biāo)記的C3met溫育。將從卡他莫拉氏菌外膜蛋白MID[59中衍生的重組MID962-12GG包括在內(nèi)作為陰性對照。檢測到對UspAl5G-77G的微弱結(jié)合，而[125Il-C3met強(qiáng)烈地與UspA2膝s外結(jié)合(圖16A)。使用表面等離子體共振(即Biacore)，這些結(jié)果得到進(jìn)一步支持。將UspAl5()-77()和UspA23G-539使用氨基偶聯(lián)法固定在CM5芯片的表面并且注射C3met直至達(dá)到飽和。對于C3met與UspA2鄧-s"或與UspAl5°—77°間的相互作用的kD分別是3jiM和14nM?？傊覀儼l(fā)現(xiàn)UspA2是卡他莫拉氏菌的主要C3met結(jié)合蛋白，而UspAl對結(jié)合作用有較低程度的貢獻(xiàn)。C3結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于UspA2的氨基酸殘基200和458間。為確定UspA2的C3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，制造了覆蓋UspA23G—539完整分子的重組蛋白。將C3met與固定化的全長UspAl5°-77()、UspA23。—539和一系列截短的UspA2蛋白質(zhì)溫育。隨后，通過ELISA對相互作用定量。與點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)(圖16A)—致，UspAl5"70在ELISA中以與UspA23"39相比的極低程度結(jié)合C3met(圖16B)。在截短的蛋白質(zhì)片段當(dāng)中，UspA2165—318、UspA22GG-539和UspA23。2—458高效地結(jié)合C3met，表明結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于氨基酸殘基200與458內(nèi)。重組UspAl/A2中和C3活性為更詳細(xì)檢驗(yàn)UspAl/A2依賴性抑制旁路途徑的作用，用這樣的細(xì)菌開展一系列流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，其中所述的細(xì)菌與10。/。NHS或與已經(jīng)同100nM重組UspAl^^和UspA2格sw預(yù)溫育的血清溫育。有意義的是，當(dāng)NHS用UspAl5()-77G和UspA23G-539預(yù)處理時，觀察到在卡他莫拉氏菌RH4z/附j(luò)"l/A2表面上顯著減少的C3沉積/結(jié)合(圖17/4)。當(dāng)經(jīng)典途徑用Mg-EGTA徹底切斷時，得到相似的結(jié)果(圖17丑)。因此，重組蛋白UspAl5"70和UspA23()-539吸附了來自NHS的C3并抑制C3的沉積/結(jié)合。為確定因重組UspAl落"Q和UspA2膝539所致的C3吸附是否增加細(xì)菌存活，將雙突變體卡他莫拉氏菌RH4df/5/;/4/Z42與補(bǔ)加UspAl5Q_77Q和UspA2鄧-s"的血清溫育，隨后測定存活細(xì)菌數(shù)。反應(yīng)中包括Mg-EGTA以便抑制經(jīng)典途徑。有意義的是，向NHS添加重組UspAl^，和UspA230—539阻止對UspAl/A2缺陷型卡他莫拉氏菌的殺傷(圖17Q。如與UspAl5"70相比，UspA2膝^最有效地抑制殺傷細(xì)菌。當(dāng)將兩種重組蛋白共同補(bǔ)加時，未檢測到額外的旁路途徑抑制。10%NHS對應(yīng)于大約600nM的C3。為研究更多的UspAl分子是否可以中和C3活性，添加UspAl5。-77()和/或UspA2膝s外直至多達(dá)600nM。然而，更高濃度的重組蛋白未進(jìn)一步增加抑制作用(未顯示)。還包括由兔紅細(xì)胞和NHS組成的旁路途徑溶血測定法，以4更確立UspAl和A2作為旁路途徑抑制物的作用。NHS與重組UspAl5()-77°、UspA2^s"或這兩種蛋白質(zhì)一起預(yù)溫育，隨后添加紅細(xì)胞。在l小時溫育后，測定紅細(xì)胞裂解的量。有意義的是，當(dāng)NHS與UspAl5G-77?；騏spA230—539預(yù)溫育時，如與未處理的NHS相比，觀察到顯著減少的溶血(圖18)。與UspA:2鄧-s"或UspAlSG-^存在下的細(xì)胞存活增加相一致(圖17C)，如與NHS同UspAl^，的預(yù)溫育相比，單獨(dú)與UspA2^"的預(yù)溫育引起更有效的旁路途徑抑制。得到的結(jié)論是，重組UspAl5G—"o或UspA2^"因其捕獲C3的能力而干擾旁路途徑的活性。除了作為補(bǔ)體級聯(lián)中的關(guān)鍵分子以外，沉積的C3b和iC3b(滅活的C3b)在調(diào)理吞噬過程中引導(dǎo)微生物以便清除。為研究非共價地在卡他莫拉氏菌表面結(jié)合的C3或C3met是否依然能夠作為調(diào)理素發(fā)揮功能，開展一系列吞噬實(shí)驗(yàn)。將卡他莫拉氏菌與C3met、NHS或經(jīng)EDTA處理的NHS預(yù)溫育，隨后添加多形核白細(xì)胞。有意義的是，在C3met存在下，卡他莫拉氏菌未被吞謹(jǐn)，而NHS強(qiáng)烈地促進(jìn)吞謹(jǐn)(數(shù)據(jù)未顯示)，然而，當(dāng)NHS用EDTA預(yù)處理時，卡他莫拉氏菌不被多形核白細(xì)胞吞噬。因此，C3/C3met在卡他莫拉氏菌細(xì)胞表面上是無活性的并且不作為調(diào)理素發(fā)揮作用。討論卡他莫拉氏菌和纖連蛋白之間的相互作用來自卡他莫拉氏菌臨床菌林Bc5的UspAl，^和UspA2165-318是仍然結(jié)合纖連蛋白的最短片段。有意義的是，包含在UspAl299-452和UspA2165_318內(nèi)找到的基^列的較長片段對纖連蛋白表現(xiàn)更有效的結(jié)合(圖和5)。這可能意味著這兩個區(qū)域代表部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點(diǎn)高度依賴于特定的分子結(jié)構(gòu)。UspAl勝^和UspA2"s^共有含31個相同氨基酸殘基的序列，包括23個殘基'，INNIYELAQQQDQHSSDIKTL"(麗I麗IY序列)。該序列含有保護(hù)性單克隆抗體(mAb)17C7的表位，其中該單克隆抗體對此表位存在普遍反應(yīng)性[2、50、30。在小鼠模型中，采用mAbl7C7的被動免疫提供保護(hù)和改善的卡他莫拉氏菌肺部清除[301。因此最有意義的是，UspAl/A2纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有這些殘基并為該區(qū)域在卡他莫拉氏菌呼吸道感染病理中的重要性提供證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中所用的纖連蛋白結(jié)合性卡他莫拉氏菌BBH18和RH4還在它們UspAl/A2蛋白內(nèi)攜帶31個氨基酸殘基。大多數(shù)卡他莫拉氏菌具有該序列的部分(即NNINNIY序列)。然而在其UspA2基因內(nèi)具有NNINNIY序列的菌株如035E則不表達(dá)纖連蛋白結(jié)合性UspA2蛋白質(zhì)[49?？赡艿慕忉屖窃趥?cè)翼區(qū)域內(nèi)變異可能影響與纖連蛋白的相互作用。此外，保守的NNINNIY序列本身可以具有少量的單個氨基酸堿基改變[28]。因此有可能纖連蛋白結(jié)合作用不僅依賴于UspAl/A2表達(dá)，還依賴于每種UspA蛋白質(zhì)的個體組成。有意義的是，可以在(卡他莫拉氏菌TTA37和046E)具有黏附特性的雜合蛋白UspA2H內(nèi)找到幾乎相同的氨基#列[431。這支持我們的發(fā)現(xiàn)，即這個31氨基酸序列在勦附作用是重要的。在我們最后一組實(shí)驗(yàn)中，我們測試卡他莫拉氏菌對Chang結(jié)膜細(xì)胞的黏附是否受纖連蛋白結(jié)合性片段(UspAl，^和UspA2"5"s)抑制(圖85)。與UspA1299—452、UspA2165-318或抗纖連蛋白pAb的預(yù)溫育導(dǎo)致與Chang上皮細(xì)J包結(jié)合減少。這些結(jié)果證實(shí)這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域在UspAl/A2與Chang上皮細(xì)胞的相互作用中的重要性并且還表明纖連蛋白是UspA的重要受體。此外，已知FnBP促進(jìn)細(xì)菌祐附于未分化及受損傷的氣道[54、69。肺成纖維細(xì)胞的纖連蛋白表達(dá)還因香煙提取物而增加[87。卡他莫拉氏菌UspAl/A2對ECM纖連蛋白或上皮細(xì)胞結(jié)合性纖連蛋白的結(jié)合作用因此在COPD患者內(nèi)是極為重要的，并且可以解釋這類患者內(nèi)常見發(fā)生的卡他莫才立氏菌感染[40?？傊覀円呀?jīng)證實(shí)卡他莫拉氏菌BBH18、RH4和Bc5的UspAl/A2是至關(guān)重要的FnBP。來源于Bc5的重組UspAl和A2以這樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合纖連蛋白，其中所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域共有包括保守NNINNIY序列在內(nèi)的相同氨基酸殘基。此外，卡他莫拉氏菌UspAl/A2與上皮細(xì)胞的相互作用借助了細(xì)胞結(jié)合性纖連蛋白。確定這些纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域因此是開發(fā)抗卡他莫拉氏菌疫苗的重要步驟?？ㄋ暇蛯诱尺B蛋白之間的相互作用卡他莫拉氏菌是COPD患者內(nèi)感染性惡化的常見病因。該物種在COPD患者內(nèi)的成功感染可能部分地與其繁多的全套黏附素有關(guān)。此外，吸煙者中存在病理性改變?nèi)缟掀ね暾詥适Ъ盎け┞叮渲袑诱尺B蛋白層本身增厚[4。已經(jīng)證實(shí)一些病原體能夠結(jié)合層粘連蛋白并且因此可能促進(jìn)了這些病原體黏附至這類受損及棵露的粘膜表面的能力。這些病原體包括已知在氣道內(nèi)導(dǎo)致明顯疾病的病原體，如其中有金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌7，63j。我們最近證實(shí)UspAl和A2均結(jié)合纖連蛋白[78。纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于UspAl299"52和UspA2165-318內(nèi)。在本研究中，氨基末端部分UspAl5"91和UspA2脈^(含有纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)也結(jié)合層粘連蛋白。然而，結(jié)合纖連蛋白的最小片段即UspAl299'452和UspA2"s-"s不以任何可覺察的程度結(jié)合層粘連蛋白。事實(shí)上，比UspAl氨基末端部分(UspAl5"")更小的片段喪失其全部的層粘連蛋白結(jié)合能力，而對于UspA2，僅UspA23(M7()結(jié)合層粘連蛋白，盡管比完整重組蛋白(UspA23^539)結(jié)合水平更低。這些發(fā)現(xiàn)表明分子的不同部分可能具有不同的功能作用。然而比較UspAl和A2中最小的層粘連蛋白結(jié)合區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)就氨基酸同源性而言在UspA23(M7G與UspAlS""之間很少存在相似性(數(shù)據(jù)未顯示)。這并不令人驚訝，因?yàn)橐阎@兩種蛋白質(zhì)具有'棒棒糖'形的球狀頭結(jié)構(gòu)，盡管在兩種蛋白質(zhì)的氨基末端部分內(nèi)僅有22%同一性[2,32。我們推測三級結(jié)構(gòu)可能影響該頭狀區(qū)域內(nèi)與層粘連蛋白在體內(nèi)的相互作用。結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于氨基末端將合乎邏輯的，因此這里是暴露最充分及在體內(nèi)與人基膜接觸最密切的位置。將介導(dǎo)對組織和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分黏附的細(xì)菌性因子共同劃分成名為"微生物表面成分識別黏附基質(zhì)分子"(MSCRAMMS)的單一家族，由于UspAl/A2既結(jié)合纖連蛋白，又結(jié)合層粘連蛋白，故這些蛋白質(zhì)可以命名為MSCRAMMS。我們的結(jié)果表明UspAl和A2是以不同的結(jié)構(gòu)域與呼吸道內(nèi)不同配體相互作用的多功能黏附素。已經(jīng)報(bào)道過其它細(xì)菌蛋白質(zhì)具有類似的廣譜結(jié)合性圖譜，如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的與UspAl和A2具有結(jié)構(gòu)相關(guān)性的YadA[45，70。YadA也同時結(jié)合纖連蛋白和層粘連蛋白[32?？傊?，我們已經(jīng)證實(shí)UspAl/A2對卡他莫拉氏菌與基膜糖蛋白層粘連蛋白的相互作用是至關(guān)重要的并且這在COPD患者內(nèi)的感染病理中將具有重要作用[74]。卡他莫拉氏菌與C3和C3met之間的相互作用補(bǔ)體抗性是最重要的細(xì)菌毒力因子之一[66。來自下部呼吸道感染患者的大部分(89%)卡他莫拉氏菌分離林抗補(bǔ)體介導(dǎo)性殺傷作用[34?？ㄋ暇鶸spAl和A2對細(xì)菌在體內(nèi)存活于Ajfe清內(nèi)是至關(guān)重要的[l，15，并且我們已經(jīng)證實(shí)這兩種外膜蛋白與經(jīng)典途徑的補(bǔ)體液相調(diào)節(jié)物C4BP結(jié)合[58。在本研究中，我們證實(shí)卡他莫拉氏菌可以通過非共價地結(jié)合C3而抑制旁路途徑(圖17和18)。對C3的結(jié)合最有可能還抑制經(jīng)典途徑。然而，這未經(jīng)詳細(xì)分析，因?yàn)榭ㄋ暇步Y(jié)合C4BP。有意義的是，卡他莫拉氏菌依賴性C3結(jié)合作用是獨(dú)特的，因?yàn)閿?shù)個相關(guān)的莫拉氏菌亞種以及常見人病原細(xì)菌不結(jié)合C3(表9)。與C3和甲胺處理C3的相互作用主要由UspA2介導(dǎo)，而UspAl發(fā)揮很少作用(圖15和16)。UspA2的C3結(jié)合區(qū)域位于氨基酸殘基200至458之間。該區(qū)域含有與UspAl內(nèi)的某區(qū)域具有93%同一性的一段140個氨基酸殘基[2。然而，盡管有這種序列相似性，UspAl卻以低得多的程度結(jié)合C3。這可能歸因于蛋白質(zhì)間在構(gòu)象上的具體差異。UspAl與UspA2在C3結(jié)合作用上的差異同UspAl/A2與C4BP的相互作用形成鮮明對比[58?？ㄋ暇鹊氐挚菇?jīng)典途徑和旁路途徑(圖12B)。該細(xì)菌結(jié)合了抑制經(jīng)典途徑的C4BP[58]，并且在本文中，我們證實(shí)與旁路途徑的相互作用借助于對C3的結(jié)合。確定這些機(jī)制中的哪個機(jī)制在體內(nèi)各種環(huán)境下對卡他莫拉氏菌的血清抗性最重要是困難的。例如，經(jīng)典途徑的重要性將主要取決于卡他莫拉氏菌的感染史和產(chǎn)生補(bǔ)體活化性抗體的能力。不過，提供保護(hù)以避開補(bǔ)體的每種機(jī)制對病原體當(dāng)然是有益的。由于C3是補(bǔ)體系統(tǒng)內(nèi)到關(guān)鍵分子，對C3的結(jié)合最有可能造成調(diào)節(jié)全部三種活化途徑并且可能對血清抗性的貢獻(xiàn)最大。補(bǔ)體系統(tǒng)作為初級防御機(jī)制的重要性由微生物已經(jīng)發(fā)展出干擾或中和補(bǔ)體系統(tǒng)諸成分的多種策略的事實(shí)所反映[42，35，88]。除卡他莫拉氏菌以外，釀膿鏈球菌、百日咳桿菌(50/7^^//"/^似^^)、大腸桿菌K1、白假絲酵母(CVm力V/"a仿/ca附)和淋病奈瑟氏球菌均表達(dá)結(jié)合C4BP的特定表面分子并且因此保護(hù)細(xì)菌免受經(jīng)典補(bǔ)體途徑作用[8，9，52，58，64，65，80。此外，為抑制經(jīng)典途徑，數(shù)種細(xì)菌(例如白假絲酵母、腦膜炎奈瑟氏球菌(7V.we/iiVig紐必M)、釀膿鏈球菌和肺炎鏈球菌(綜述見[68，89)結(jié)合因子H和因子H-樣分子，并且因此被部分地保護(hù)免受抗旁路補(bǔ)體途徑作用。UspAl和A2吸附來自血清的C3并且因而最有可能抑制補(bǔ)體活化。類似地，肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)似乎在體外或體內(nèi)均抑制旁路途徑。PspA是肺炎鏈球菌的重要毒力因子。PspA缺陷的肺炎鏈球菌菌林將立即從血液中清除，而表達(dá)PspA的菌^^活[82。此外，在菌血癥的小鼠才莫型中，PspA缺陷的肺炎鏈球菌與表達(dá)PspA的肺炎鏈球菌相比，具有顯著降低的毒力[ll。已經(jīng)證實(shí)C3b在PspA陰性的肺炎鏈球菌上比在PspA陽性的肺炎鏈球菌上更多地沉積[67，82。因此，PspA的表達(dá)通過限制由C3b所致的調(diào)理作用而減少肺炎鏈球菌的補(bǔ)體介導(dǎo)性清除及吞噬12，67]。在正常小鼠內(nèi)無毒力的PspA缺陷型肺炎鏈球菌在C3缺陷和因子B缺陷小鼠內(nèi)變成有毒力的[82。據(jù)我們所知，目前僅有非共價地結(jié)合C3并因此干擾補(bǔ)體功能的兩種細(xì)菌蛋白質(zhì)的實(shí)例。其一是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞外細(xì)胞血纖蛋白原結(jié)合蛋白(Efb)，其中發(fā)現(xiàn)該結(jié)合蛋白結(jié)合C3b[44。Efb以硫酯構(gòu)象不依賴性方式抑制經(jīng)典途徑和旁路途徑，即對C3b結(jié)合是非共價的。第二個實(shí)例是肺炎鏈球菌的膽堿結(jié)合蛋白(CbpA)，已經(jīng)證實(shí)該蛋白結(jié)合甲胺處理的C3，表明這是不依賴于補(bǔ)體活化的非共價性相互作用[16。CbpA是肺炎鏈球菌細(xì)胞壁的成分，但是僅當(dāng)CbpA分泌時才可以結(jié)合C3。為驗(yàn)證文獻(xiàn)中并沒有充分建立的這個假設(shè)，我們通過流式細(xì)胞術(shù)對11林不同的肺炎鏈球菌分離抹分析C3結(jié)合作用(甲胺處理的C3或NHS-EDTA)(圖125和表9)。在肺炎鏈球菌表面不能檢測到結(jié)合的C3。當(dāng)使用曱胺處理的C3，隨后用抗人C3pAb在蛋白質(zhì)印跡中分析肺炎鏈球菌的裂解物和培養(yǎng)上清液時，我們證實(shí)了Cheng及其合作者的結(jié)果[16(未顯示)。根據(jù)Efb和CbpA(均是兩種革蘭氏陽性細(xì)菌分泌的C3結(jié)合蛋白)，革蘭氏陰性卡他莫拉氏菌是具有在細(xì)菌表面上結(jié)合C3并抑制旁路途徑的膜錨定性蛋白質(zhì)的獨(dú)特物種。已經(jīng)證實(shí)白假絲酵母結(jié)合C3b、iC3b和C3d。然而，C3b以比iC3b和C3d低得多的親和力結(jié)合[29。我們發(fā)現(xiàn)C3與卡他莫拉氏菌結(jié)合及與白假絲酵母結(jié)合之間尋在巨大差異(未顯示)；盡管假絲酵母結(jié)合C3met(56。/。陽性細(xì)胞)，但與卡他莫拉氏菌的mfi36.9相比，其平均焚光密度(mfi)僅小于2.0。此外，當(dāng)白假絲酵母與經(jīng)EDTA處理的血清溫育時，未見到可檢測的結(jié)合。兩種C3d結(jié)合蛋白已經(jīng)從白假絲酵母中分離并且表征最充分的蛋白質(zhì)是最初由抗人補(bǔ)體受體2(CD21)抗體識別的60kD甘露糖蛋白[13。然而，卡他莫拉氏菌UspAl和A2不被抗CD21的多克隆抗體識別(未顯示)。與葡萄球菌和肺炎鏈球菌[52，64一致的是還存在來自白假絲酵母的分泌型C3d結(jié)合蛋白[72。最后，白假絲酵母iC3b受體已經(jīng)得到分離并且它在結(jié)構(gòu)上與人CR3(CDllb)類似[3]。并未充分了解這些受體參與病理的可能機(jī)制。以上C3結(jié)合性病原體實(shí)例與卡他莫拉氏菌明顯不同在于這些物種經(jīng)常是血流分離林?？ㄋ暇蔷哂芯Y感染的罕見抗性的粘膜性病原體。因此，結(jié)合并滅活C3最有可能在粘膜表面發(fā)生。這受到如此事實(shí)支持，即在疾病狀態(tài)如急性中耳炎中存在強(qiáng)烈持久的補(bǔ)體活化以及繼發(fā)炎癥[57。據(jù)信補(bǔ)體蛋白質(zhì)因血漿滲出而被轉(zhuǎn)運(yùn)到粘膜表面[26，621。例如在來自兒童的中耳滲出物(MEE)中，還可以發(fā)現(xiàn)濃度大幅度升高的C3產(chǎn)物[51]。此外，已經(jīng)證實(shí)MEE液體內(nèi)的補(bǔ)體因子對于抗其它粘膜病原體如不可分型的流感嗜血桿菌的殺菌活性是重要的[75]。卡他莫拉氏菌是嚴(yán)格的人病原體。它不在動物內(nèi)引起疾病如中耳炎或肺炎。已經(jīng)在數(shù)例中使用了小鼠肺部清除模型和灰鼠(c/iZm^7/a)中耳炎模型。然而，中耳炎或肺炎均未發(fā)生并且細(xì)菌被迅速清除[19，83。因此在體內(nèi)檢測細(xì)菌性C3結(jié)合的生物學(xué)意義是困難的。由于UspAl和A2是多功能蛋白質(zhì)[l，15，31，43，58，78，不可能把卡他莫拉氏菌清除方面的任何差異與C3結(jié)合作用聯(lián)系起來。如此事實(shí)尤其最有可能影響清除率，即UspAl是卡他莫拉氏菌的重要黏附素并結(jié)合CEACAM1和纖連蛋白[31，78。然而，因?yàn)樵诩膊顟B(tài)如中耳炎中的強(qiáng)烈補(bǔ)體活化，C3的莫拉氏菌依賴性結(jié)合可能代表對付粘膜防御的重要途徑。卡他莫拉氏菌以數(shù)種方式阻礙人免疫系統(tǒng)的事實(shí)可以解釋為何卡他莫拉氏菌是如此常見的呼吸道棲居者73?？傊?，卡他莫拉氏菌已經(jīng)發(fā)展出對付體液免疫系統(tǒng)和天然免疫系的復(fù)雜途徑?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明卡他莫拉氏菌在細(xì)菌細(xì)胞表面具有其它細(xì)菌物種內(nèi)所不能找到的獨(dú)特的C3結(jié)合能力。參考文獻(xiàn)1.AebiC,LafontaineER,CopeLD,等,PhenotypiceffectofisogenicuspAlanduspA2mutationsonMoraxellacatarrhalis035E.InfectI訓(xùn)un1998/66:3113-9.2.AebiC,MaciverI,LatimerJL,等，Aprotective'epitopeofMoraxellacatarrhalisisencodedbytwodifferentgenes.InfectImmun1997/65:4367—77.3.Alaei,S.,C.Larcher,C.Ebenbichler,W.M.Prodinger,J.Janatova,和M.P.Dierich.1993.IsolationandbiochemicalcharacterizationoftheiC3breceptorofCandida<3_Zjbics_ns.infect.Zmmim.61:1395-1399.4.AminK,Ekberg-J"anssonA,LofdahlCG和VengeP.Relationshipbetweeninflammatorycellsandstructuralchangesinthelungsofasymptomaticandneversmokers:abiopsystudy.Thorax2003/58:135-42.5.AttiaAS,LafontaineER,LatimerJL,AebiC,SyrogiannopoulosGA和HansenEJ.TheUspA2proteinofMoraxellacatarrhalisisdirectlyinvolvedintheexpressionofserumresistance.InfectIirmrnn2005,'73:2400-10，6.BartosLC,MurphyTF.Comparisonoftheoutermembraneproteinsof50strainsofBranhamellacatarrhalis.JInfectDis1988/158:761-5.7.deBentzmannS,TristanA,EtienneJ,BrousseN,VandeneschF和LinaG.Staphylococcusaureusisolatesassociatedwithnecrotizingpneumoniabindtobasementmembranetype工andIVcollagensandlaminin.JInfectDis2004;190:1506-15.8.Berggard,K.,E.Johnsson,F.R.Mooi,和G.Lindahl.1997.BordetellapertussisbindsthehumancomplementregulatorC4BP:roleoffilamentoushemagglutinin.Xnfect.Xnunuii.65:3638—3643.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>proteinfromStreptococcuspne咖oniae.J5ioohem,39:5450-5457*17.CopeliD,IjafontaineER,SlaughterCA,等，CharacterizationoftheMoraxellacatarrhalisuspAlanduspA2genesandtheirencodedproducts.JBacteriol1999zl81:4026-34,18.DeSaintJeanM,BaudcminC,DiNolfoM,等，Comparisonofmorphologicalandfunctionalcharacteristicsofprirtiary-culturedhumanconjunctivalepitheliumandofWong-KilbournederivativeofChangconjunctivalcellline.ExpEyeRes2004^78:257-74.19.Fulghum,R.S.,和H.G.Marrow.1996.ExperimentalotitismediawithAToraxeUa(^Brazj^a/neJJaJcatarrhaJis.Ann.OtoL處i加J,I/aryngrcd,105:234-241.20.Forsgren,A.,和A.Grubb.1979.Manybacterialspeciesbindhuman工gD.J.I"jwnimo_Z122:1468—1472.21.ForsgrenA,BrantM,MollenkvistA,等,Isolationandcharacterizationofanovel工gD-bindingproteinfromMoraxellacatarrhalis.JImmunol2001,.167:2112-20.22.ForsgrenA,BrantM,KaramehmedovicM和RiesbeckK.TheimmunoglobulinD-bindingproteinMIDfromMoraxellacatarrhalisisalsoanadhesin.InfectI腿un2003'.71:3302-9.23.ForsgrenA,BrantM和RiesbeckK.ImmunizationwiththetruncatedadhesionmoraxellacatarrhalisimmunoglobulinD-bindingprotein(M工D764-913)isprotectiveagainstM.catarrhalisinamousemodelofpulmonaryclearance.JInfectDis2004190:352-5.24.Gj6rloff-Wingren,A,,R.Hadzic,A.Forsgren,和K.Riesbeck.2002.AnovelIgD-bindingbacterialproteinfromAforaxeUacatarrhalisinduceshumanBlymphocyteactivationandisotypeswitchinginthepresenceofTh2cytokines.J.Z"imnur!oJ.168:5582-5588.25.GreenwoodFC,HunterWM和GloverJS，ThePreparationof工-131-;LabelledHumanGrowthHormoneofHighSpecificRadioactivity.BiochemJ1963,'89:114-23,26.Greiff,D，,工.Erjefalt,C，Svensson,P,Wollmer,U.Alkner,M，Andersson,和C.G.Persson-1993.Plasmaexudationandsoluteabsorbtionacrosstheairwaymucosa,C7in.處ysio2.13:219-233.27.HanskiE,CaparonM.ProteinF,afibronectin-bindingprotein,isanadhesinofthegroupAstreptococcusStreptococcuspyogenes.ProcNatlAcadSciUSA1992/89:6172-6，28.HaysJP,vanderScheeC,LoogmanA,等,Totalgenomepolymorphismandlowfrequencyofintra-genomicvariationintheuspAlanduspA2genesofMoraxellacatarrhalisinotitisproneandnon-pronechildrenupto2yearsofage.ConsequencesforvaccinedesignVaccine2003;21:1118-24,29.Heidenreich,F1.,和P.Dierich.1985.CandidaaliicaiisandCauciidast;eltoidea,incontrasttootherCandidaspecies,bindiC3bandC3dbutnotC3b.工njfect.I"腳u仏50:598-600.30.HelminenME,Maciver工,LatimerJL,等，Alarge,antigenicallyconservedproteinonthesurfaceofMoraxellacatarrhalisisatargetforprotectiveantibodies.JInfectDis1994/170:867-72.31.HillDJ,VirjiM.Anovelcell-bindingmechanismofMoraxellacatarrhalisubiquitoussurfaceproteinUspA:specifictargetingoftheN-domainofcarcinoembfyonicantigen—relatedcelladhesionmoleculesbyUspAl.MolMicrobiol200348:117-29.32.HoiczykE,RoggenkampA,ReichenbecherM,LupasA和HeesemannJ.StructureandsequenceanalysisofYersiniaYadAandMoraxellaUspAsrevealanovelclassofadhesins.EMBOJ2000/19:5989—99.33.HolmMM,VanlerbergSL,FoleyIM,SledjeskiDD和LafontaineER.TheMoraxellacatarrhalispor:Ln-lilceoutermembraneproteinCDisanadhesinforhumanlungcells.InfectI讓un200472:1906-13,34.Hoi,C.,C.M.Verduin,E.E.VanDijke,J.Verhoef,A.Fleer,H.vanDijk.1995.ComplementresistanceisavirulencefactorofBranhamelJla(Moi:axeJLla〕catsr由Jis,_FEMSJnununoJ,Me丄MicrobioJ.11:207-21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至序列號3的氨基酸序列，或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物或其它次級加工產(chǎn)物組成。15.包含層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體，其中該配體由選自序列號4至序列號8的氨基^列，或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物或其它次級加工產(chǎn)物組成。16.包含C3結(jié)合結(jié)構(gòu)域或C3met結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體，其中該配體由選自序列號4、序列號6、序列號9和序列號10的氨基酸序列或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、簡并物或羥化產(chǎn)物、磺化產(chǎn)物或糖基化產(chǎn)物或其它次級加工產(chǎn)物組成。17.藥物，其包含根據(jù)權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)內(nèi)所述的一種或多種配體和一種或多種可藥用的輔藥、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或防腐劑。18.疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)內(nèi)所述的一種或多種配體和一種或多種可藥用的輔藥、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或防腐劑。19.治療或預(yù)防個體感染的方法，包括施藥用有效量的根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的藥物或疫苗。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中感染由卡他莫拉氏菌引起。21.編碼本發(fā)明的配體、蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，以及其同系物、多態(tài)物、簡并物和剪接變體。22.多肽或多肽截短物，其包含具有結(jié)合纖連蛋白的能力的序列號1至序列號3的保守序列的至少一種。23.多肽或多肽截短物，其包含具有結(jié)合層粘連蛋白的能力的序列號4至序列號8的保守序列的至少一種。24.多肽或多肽截短物，其包含具有結(jié)合C3和/或C3met的能力的序列號4、6、9、和10的保守序列的至少一種。25.疫苗組合物，其包含與有效量的蛋白質(zhì)MID組合的有效量的UspAl和/或UspA2，以及一種或多種可藥用的輔藥、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或防腐劑。26.與有效量蛋白質(zhì)MID組合的有效量的UspAl和/或UspA2的用途，用于產(chǎn)生用來治療或預(yù)防感染的藥物。27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中感染由卡他莫拉氏菌引起。全文摘要本發(fā)明涉及卡他莫拉氏菌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)及它們通過細(xì)胞結(jié)合性纖連蛋白和層粘連蛋白與上皮細(xì)胞相互作用的能力，并且還涉及它們抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的能力。這些細(xì)胞外蛋白用于制備疫苗。本發(fā)明提供與纖連蛋白、層粘連蛋白和補(bǔ)體系統(tǒng)相互作用的肽。文檔編號A61P31/00GK101243104SQ200680029470公開日2008年8月13日申請日期2006年8月8日優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日發(fā)明者克里斯蒂安·里斯貝克,阿恩·福斯格倫申請人:阿恩·福斯格倫股份公司