專利名稱：：用于遺傳序列分析的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：概括而言，本發(fā)明涉及多重遺傳耙的擴(kuò)增方法和使用《效陣列對擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。
背景技術(shù)：
：精確而快速地鑒定在人類中引起急性呼吸道感染(ARI)的感染性病原體可在成功治療呼吸系統(tǒng)疾病、應(yīng)用合適的爆發(fā)控制措施以及有效使用珍貴抗生素和抗病毒藥物中是關(guān)鍵因素。然而，ARI的臨床區(qū)別診斷因不同病原體所致癥狀的相似性及這些病原(agent)的種數(shù)以及生物多樣性而是有挑戰(zhàn)性的。目前，最廣泛使用的鑒定呼吸道病原體的方法是培養(yǎng)法、免疫測定法和RT-PCR/PCR測定法。培養(yǎng)法和免疫測定技術(shù)通常對特定病原體是特異性的，并且因此限于在物種水平及有時在血清型水平上檢測單種可疑病原(agent)。相反，基于核酸的技術(shù)如RT-PCR/PCR則是通用的，提供在所有病原體的檢測中的高敏感性，所述病原體包括培養(yǎng)條件苛刻或難以培養(yǎng)的生物體。因PCR的通用性質(zhì)，該技術(shù)可以對多種媒介同時應(yīng)用，增加建立特定病因?qū)W的機(jī)會(McDonough等，"用于檢測臨床樣本中的肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌和百日咳博代氏桿菌的多重PCR(AmultiplexPCRfordetectionofMycoplasmapneumoniae,Chlamydophilapneumoniae,Legionellapneumophila,andBordetellapertussisinclinicalspecimens)"Mo/.Ce〃/Vo6as,19,314-322(2005))并允許精確地檢測涉及多于一種病原體的同時感染(Grondahl等，"通過單管多重反轉(zhuǎn)錄PCR快速鑒別引起急性呼吸道感染的九種生物體可行性研究(Rapididentificationofninemicroorganismscausingacuterespiratorytractinfectionsbysingle-tubemultiplexreversetranscription-PCR:feasibilitystudy)，，/C//".M/cra6/o/"37,1-7(1999))。在一個反應(yīng)內(nèi)通過多重方法檢測數(shù)種生物體是需要的，因為ARI病原可能在癥狀學(xué)上是非特異性的。因此，一次檢定一種病原體是效率低下的并且沒有產(chǎn)生關(guān)于可能同時感染的信息。已經(jīng)開發(fā)數(shù)種多重RT-PCR/PCR檢測法以解決這個問題(McDonough;Grondahl;Puppe等，"用于檢測九種呼吸道病原體的多重反轉(zhuǎn)錄酶PCRELISA的評估(EvaluationofamultiplexreverseC7/".Wra/.，30，165-174(2004);Bellau-Pujol等，"用于檢測12種呼吸RNA病毒的三重RT-PCR測定的開發(fā)(DevelopmentofthreemultiplexRT-PCRassaysforthedetectionof12respiratoryRNAviruses),,/Wro/.M"ef/70<is,126，53-63(2005);Miyashita等，"用于后天免疫性群體肺炎中肺炎衣原體、肺炎支原體和肺炎軍團(tuán)桿菌的同時檢測的多重PCR(MultiplexPCRforthesimultaneousdetectionofChlamydiapneumoniae,MycoplasmapneumoniaeandLegionellapneumophilaincommunity-acquiredpneumonia)，，i邵kMed"98,542-550(2004);Osiowy，"通過多重反轉(zhuǎn)錄PCR測定法直接檢測臨床呼吸樣本中呼吸道合胞體病毒、副流感病毒和腺病毒(Directdetectionofrespiratorysyncytialvirus,parainfluenzavirus,andadenovirusinclinicalrespiratoryspecimensbyamultiplexreversetranscription-PCRassay)"/C7/w.A/z.craWo/"36,3149-3154(1998);Verstr印enRNA(RapiddetectionofenterovirusRNAincerebrospinalfluidspecimenswithanovelsingle-tubereal-timereversetranscription-PCRassay),，《/C7/".^M/croZn'o/.，39,4093-4096(2001);Coiras等，"通過雙重反轉(zhuǎn)錄巢式-PCR測定法同時檢測臨床樣品中的十四種呼吸病毒(Simultaneousdetectionoffourteenrespiratoryvirusesinclinicalspecimensbytwomultiplexreversetranscriptionnested-PCRassays)"/MW.Wra/.,72,484-495(2004);Coiras等，"使用反向線點雜交測定法的用于同時才企測呼吸病毒的寡聚核苷酸陣列(Oligonucleotidearrayforsimultaneousdetectionofrespiratoryvirusesusingareverse-lineblothybridizationassay)，，《/MW.P7ra/.，76,256-264(2005);Gruteke等，"用于兒童中急性呼吸道感染的多重PCR的實際才丸4亍(PracticalimplementationofamultiplexPCRforacuterespiratorytractinfectionsinchildren)，，C7/".M/cra6/o/"42，5596-5603(2004)),但是該方法受目前擴(kuò)增子檢測方法的區(qū)分能力限制。基于凝膠的分析方法總是限于其產(chǎn)物可以僅由大小而得到區(qū)分的有限種類的病原體，而如實時PCR的熒光報告系統(tǒng)受到可以確定無疑進(jìn)行解析的熒光峰數(shù)目的限制一一不多于3個或4個。因此，需要允許快速區(qū)分并鑒定與具有眾多潛在病因的疾病綜合癥有關(guān)的病原體如ARI的診斷性鑒定法。已經(jīng)開發(fā)允許通過RT-PCR/PCR方法同時檢測更多病原體的數(shù)種技術(shù)。至多達(dá)22種呼吸道病原體的多重鑒定已經(jīng)通過MASSCODE多重RT-PCR系統(tǒng)(Briese等，"用于快速靈敏差異檢測病原體的診斷系統(tǒng)(Diagnosticsystemforrapidandsensitivedifferentialdetectionofpathogens)，，/"yk^.11,310-313(2005))實現(xiàn)。點樣(Spotted)(尤其長寡核苷酸)微陣列也已經(jīng)一定程度地成功用作多重PCR分析工具(Roth等，"用于與急性上呼吸道感染有關(guān)細(xì)菌的實驗室診斷的寡聚核苦酸陣列的應(yīng)用(Useofanoligonucleotidearrayforlaboratorydiagnosisofbacteriaresponsibleforacuteupperrespiratoryinfections)，，C//".M/craWo/.，42，4268-4274(2004);Chizhikov等，"微生物毒力因素的微陣列分析(Microarrayanalysisofmicrobialvirulencefactors)，，J;//.五謂'ra".M/craWo/.,67,3258-3263(2001);Chizhikov等，"通過寡聚核苷酸微陣列雜交檢測和基因分型人類A型4侖4犬病毒(DetectionandgenotypingofhumangroupArotavirusesbyoligonucleotidemicroarrayhybridization),，JC7/".M/cra6/o/.，40,2398-2407(2002);Wang等，"基于微陣列的病毒病原體檢測和基因分型(Microarray-baseddetectionandgenotypingofviralpathogens)"尸rac.TVa^/.6W.99，15687-15692(2002);Wang等，"使用DNA微陣列發(fā)現(xiàn)病毒并回4丈序歹寸(ViraldiscoveryandsequencerecoveryusingDNAmicroarrays)"P丄oS所o/.，1，E2(2003);Wilson等，"小亞基核糖體DNA探針的高密度微陣列(High-densitymicroarrayofsmall-subunitribosomalDNAprobes)"M/craWo/.，68,2535-2541(2002);Wilson等，"使用微陣列技術(shù)的18個病原體樣t生物的序列特異性鑒定(Sequence-specificidentificationof18pathogenicmicroorganismsusingmicroarraytechnology)，，Afo/.Ce〃./V06es，16,119-127(2002);Call等，"使用DNA微陣列鑒定抗微生物劑抗性基因(IdentifyingantimicrobialresistancegeneswithDNAmicroarrays)"y4油'mfcraZ).々e她CTzem^/^,47,3290-3295(2003);Call等，"混合基因組微陣列揭示單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌的多重血清型和語系特異性差異(Mixed-genomemicroarraysrevealmultipleserotypeandlineage-specificdifferencesamongstrainsofListeriamonocytogenes)"/C7/".M/craWo/.,41，632-639(2003)。這些系統(tǒng)的主要限制是不能夠區(qū)分相同生物體親緣關(guān)系密切的抹系，原因在于所檢測的雜交事件可能對局部的序列多樣性不敏感。例如，點樣微陣列探針(spottedmicroarrayprobe)可以與變異多達(dá)25%的序列非特異性地交叉雜交-考慮到若能夠具體地定義多態(tài)性，則這種難以辨別的變異攜帶可以高度區(qū)分抹系的足夠信息的事實，這是個不利事件。林系水平的鑒定可能在其中親緣關(guān)系密切的生物體可以具有完全不同的臨床后果及流行病學(xué)模式的情況下是重要的。在此類情況下，林系必須得到區(qū)分以采取恰當(dāng)?shù)奶幚砑翱刂?。臨床相關(guān)的百日咳博代氏菌"oniete〃a;eWwM^)及其臨床不相關(guān)的姊妹物種副百日咳博代氏菌(5.para/eW船^)提供了經(jīng)典例證。另一個例子是流感病毒，對它區(qū)分疫苗敏感抹系和疫苗不敏感抹系及循環(huán)性人分離抹和可能的動物傳染毒株(例如禽H5N1)是具有重要而明顯價值的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括一種方法，該方法包括提供懷疑含有來自預(yù)定義病原體組內(nèi)的一種或多種病原體核酸的生物樣品；添加與預(yù)定義病原體組內(nèi)找得到的基因?qū)?yīng)的多種PCR引物至樣品內(nèi)；以及在樣品上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增與基因相對應(yīng)的核酸的亞群。引物包括用于每種病原體的至少一種引物對并且引物包含不與樣品內(nèi)任何病原體DNA或與任何背景DNA同源的尾隨序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)內(nèi)的至少一種引物的濃度不大于約100nM。實施本發(fā)明的方式在如下旨在說明而不是限制的說明書中，敘述具體細(xì)節(jié)以提供對本發(fā)明的徹底理解。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明可以在與這些具體細(xì)節(jié)不同的其它實施方案內(nèi)實施。在其它情況下，省略對公知方法及裝置的詳細(xì)描述，以便不以非必要的細(xì)節(jié)而使本發(fā)明的描述含混不清。臨床的綜合癥幾乎很少對單種病原體是特異性的，因此允許4僉驗并區(qū)分大量候選病原體的測定法毫無疑問將有益于公共健康工作。本文這里呈現(xiàn)的工作證實了聯(lián)合多重RT-PCR/PCR、RA和自動化序列相似性搜索及病原體鑒定的再測序陣列(resequencingarray,RA)途徑-RPMv.l系統(tǒng)在廣譜條件下對20種常見呼吸道病原體以及6種生物威脅因子(biothreatagent)的臨床診斷能力及流行病學(xué)監(jiān)測能力。通過聯(lián)合多重PCR擴(kuò)增的敏感性與RA特異性，可以避免當(dāng)評估診斷性鑒定法時經(jīng)常遇見的對特異性與敏感性之間的權(quán)衡。使用無論在提取緩沖液內(nèi)，或作為復(fù)雜混合物與提取緩沖液一起添加(spike)至健康患者臨床樣品內(nèi)的對照樣品證實這一點。數(shù)據(jù)還顯示使用來自患有流感樣疾病的患者中101份咽喉拭子樣品，該系統(tǒng)提供與用于HAdV和流感病毒A二者的已接受的基于RT-PCR/PCR和基于培養(yǎng)的方法的等效敏感性。短寡核苦酸再測序陣列法(RA)可以同時提供物種水平和抹系水平的對來自ARI病原體的PCR擴(kuò)增子的鑒定。通過在該陣列上所拼貼的(tiled)揭示區(qū)分已雜交靶與原型序列的序列差異的RA能力而提供林系特異性信息，該信息包括來自先前未知變種的獨特多態(tài)性(ProSeqs,見Malanoski等的美國專利申請?zhí)?1/_,一，名為"計算機(jī)執(zhí)行的生物序列鑒定系統(tǒng)和方法(Computer-ImplementedBiologicalSequenceIdentifierSystemandMethod)"并且在與本申請的相同日期提交)。先前研究將自定義設(shè)計(customdesigned)的呼吸道病原體微陣列(RPMv.l)與用于微生物核酸富集、隨機(jī)核酸擴(kuò)增和自動化序列相似性搜索的方法進(jìn)行組合，以便在物種水平和抹系水平上用毫無疑問的統(tǒng)計解釋實現(xiàn)鑒定廣譜呼吸道病原體(Lin等，"使用再測序DNA微陣歹'J鑒定廣'"i普呼吸道病^、體(Broad-spectrumrespiratorytractpathogenidentificationusingresequencingDNAmicroarrays)"GWoweTes.，16(4),527-535(2006);Wang等，"通過再測定微陣列快速、廣譜鑒定流感病毒(Rapid,￡werg./"/e".ZXs.，12(4),638-646(2006))。然而，在處理具有較低病原體滴度的臨床樣品時，類屬性擴(kuò)增(genericamplification)方法的成功有限。在本文中公開的是改良的多重PCR擴(kuò)增策略，該策略緩和與靶隨機(jī)擴(kuò)增有關(guān)的敏感問題。成功的概念驗證性實驗使用從顯示ARI的患者中得到的臨床樣品，證實可以實現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)參考測定法高物種水平的一致性(例如培養(yǎng)法、美國病理學(xué)家協(xié)會(CollegeofAmericanPathologist)[CAP]認(rèn)證的PCR),與此同時通過在改良的檢定時間內(nèi)(8.5小時)的直接序列讀數(shù)，仍產(chǎn)生正確的物種水平和林系水平鑒定。該結(jié)果提示此方法對于簡明的自動化及微型化方法是經(jīng)得起檢驗的，并且因此可以產(chǎn)生用于診斷目的和監(jiān)測目的基于微陣列的平臺。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。本發(fā)明方法使用可能含有特定病原體核酸的生物樣品。該方法不需要病原體核酸的存在，因而本方法可以例如在來自健康個體的標(biāo)本上進(jìn)行。作為初始步驟，病原體核酸可以從臨床樣品例如但不限于鼻沖洗物、咽喉拭子、痰、血液或環(huán)境樣品中提取。臨床樣品可以從包括但不限于人的任何生物物種中獲得?？梢詸z測任何類型的病原體，包括但不限于呼吸道病原體、腸道病原體和生物威脅因子如炭疽孢子。病原體的組可以例如在物種水平或林系水平上加以定義。本方法涉及與可以在病原體內(nèi)找得到的基因?qū)?yīng)的PCR引物。PCR引物是本領(lǐng)域內(nèi)公知。存在用于每種病原體的至少一種引物對。在本方法內(nèi)所用的引物具有與任意病原體的DNA或與樣品內(nèi)的任何背景DNA不同源的尾隨序列。背景DNA可以是從其中獲得臨床樣品的物種的DNA。有效的(Potential)尾隨序列可以隨機(jī)或額外地生成，并且可以例如通過與遺傳序列數(shù)據(jù)庫如GenBank進(jìn)行比較而受到評估。尾隨序列本身通常不與病原體DNA結(jié)合，并且可以減少PCR中引物二聚體的形成，原因在于尾隨序列不與任何其它引物互補(bǔ)。與從人中獲得的標(biāo)本一起使用的合適尾隨序列包括但不限于9CGATACGACGGGCGTACTAGCG(引物L(fēng)，SEQIDNO.l)和CGATACGACGGGCGTACTAGCGNNNNNNNNN(引物L(fēng)N，SEQIDNO.2)。在單個PCR內(nèi)的引物套可以例如包括至少30、40、50、60、70、80、90或100種不同引物。與長度不同的基因相對應(yīng)的引物可以在相同的PCR中使用。例如，可以在單個PCR內(nèi)產(chǎn)生長度小于50、100或200個核苷酸并且大于3000或2000個核苷酸的擴(kuò)增核酸。使用這些引物的PCR可以包括如PCR領(lǐng)域內(nèi)通常已知以及如本文內(nèi)公開的其它成分或使用如PCR領(lǐng)域內(nèi)通常已知以及如本文內(nèi)^^開的設(shè)備?？梢栽诜磻?yīng)內(nèi)使用低濃度的引物。一種引物至全部引物可以在不大于約100nM的濃度上存在?？梢允褂幂^低的濃度如40-50nM。生物樣品可以分成多個等分試樣并且在每一等分試樣上進(jìn)行使用不同引物的獨立PCR。等分試樣隨后可以在PCR后被重新合并。這可以在使用大量引物時完成。PCR內(nèi)使用的引物越多，形成引物二聚體的可能性越高。PCR可以隨具有不同引物混合物的多重等分試樣而進(jìn)行更好優(yōu)化。PCR之后，可以進(jìn)行病原體的鑒定。這可以如此完成，即通過使樣品與包含至少部分互補(bǔ)于已擴(kuò)增核酸的多個核酸序列的微陣列接觸，并允許已擴(kuò)增核酸與互補(bǔ)核酸雜交。此類方法在美國專利申請?zhí)?1/177,646內(nèi)描述?；パa(bǔ)核酸可以是，但不限于25至29聚物。這類短互補(bǔ)核酸的使用減少任意錯配與微陣列雜交的可能性?；パa(bǔ)核酸可以包括針對至少一種已擴(kuò)增核酸的并且至多針對全部已擴(kuò)增核酸的完全匹配探針及每一完全匹配探針的中央位置的三種不同單核苷酸多態(tài)性。這種排列允許確定基因的全部序列，而這可以允許鑒定病原體林。在雜交后，可以使用已知方法如熒光法以檢測哪些互補(bǔ)核酸已經(jīng)雜交擴(kuò)增的核酸。隨后可以基于檢測到哪些擴(kuò)增的核酸而鑒定病原體。這可以通過模式識別算法完成，其中病原體基于哪些基因與陣列雜交而得到鑒定。這還可以如上所述基于對雜交的基因測序而完成。分子診斷技術(shù)使得快速而敏感地鑒定病原(etiologicalagent)成為可能。當(dāng)前方法如PCR、RT-PCR和點樣微陣列等因假陽性及假陰性檢測結(jié)果而容易錯誤鑒定，并總是因在敏感性和特異性間的直接權(quán)衡而受不利影響。樣品由大量和多樣類型的背景生物體組成，其中所述的生物體也可能含有與診斷性PCR擴(kuò)增所用的靶序列相似的區(qū)域。非靶DNA(尤其人DNA)的遺傳復(fù)雜性可能因交叉反應(yīng)性而引起"假陽性"產(chǎn)物擴(kuò)增。此外，病毒通過突變和重組事件以極高的速率進(jìn)化，使非常敏感的檢測法處于經(jīng)常重新設(shè)計或幾乎馬上過時報廢的狀態(tài)。遺傳性變異也是臨床相關(guān)的，因為它們可能與對感染的持續(xù)性和治療應(yīng)答和/或接種應(yīng)答有潛在意義的抗原變異有關(guān)。為了用當(dāng)前的PCR方法研究遺傳性變異，總是需要額外的測序步驟。RPMv.l方法不僅在物種水平和抹系水平上檢測感染因子，還可以不需要其它實驗而鑒定細(xì)微的基因組差異。還證實該方法是以高敏感性和高特異性同時檢測至多達(dá)7種病原體的有效手段，并允許對病原體進(jìn)行毫無疑問的和可重復(fù)的基于序列的抹系鑒定，其中所述的病原體在微陣列(ProSeqs)上具有適度選擇的原型序列。這可以通過允許每種病原體的精確的指紋分析、抗生素耐藥性分布分析、遺傳漂變/漂移分析、辯論(forensics)和眾多其它參數(shù)而用于增強(qiáng)臨床管理和流行病暴發(fā)響應(yīng)。這種能力對于緊急疾病如禽流感病毒H5N1的快速檢測和生物恐怖事件的價值可能非常寶貴。在描述本發(fā)明后，給出如下實施例以說明本發(fā)明的具體應(yīng)用。這些具體的實施例不意圖限制在本申請內(nèi)描述的本發(fā)明的范圍。實施例1RPMv.l芯片設(shè)計-RPMv.l(呼吸道病原體微陣列)芯片設(shè)計包括允并在先前研究內(nèi)得到詳細(xì)描述(Lin等，"使用再測序DNA微陣列鑒定廣譜呼吸道病原體(Broad-spectrumrespiratorytractpathogenidentificationusingresequencingDNAmicroarrays)"Gewcwe16(4)，527-535(2006))。簡而T之，RPM陣列由代表選自靶生物基因組的序列內(nèi)每個堿基(并以其為中心)順序的25聚體完全匹配探針組成。此外，對于每種完全匹配探針，代表中央位置的三種可能單核苦酸多態(tài)性(SNP)的三種錯配探針也在陣列上拼貼。因此，與一系列完全匹配探針的雜交提供冗余的存在/不存在信息，而與錯配探針的雜交揭示抹系特異性SNP數(shù)據(jù)。在芯片上，給予兩種病原體即HAdV和流感病毒比其它病原體更多的探針代表。這些揮:針代表基于對直接感興趣群體(訓(xùn)練中的美國軍隊新兵)的臨床相關(guān)性進(jìn)行選擇。對于HadV,來自、六鄰體(7^xowy>基因和纖突(/6w)基因的含有血清型4、5和7的診斷性區(qū)域的部分序列得到拼貼，以便檢測全部ARI相關(guān)性HadV。類似地，用于流感病毒A檢測的拼貼區(qū)包含來自血凝素(亞型H1、H3和H5)基因、神經(jīng)氨酸酶基因(亞型Nl和N2)和基質(zhì)(wflWx)基因的部分序列。除了3種HAdV和3種流感病毒A以外，目前的RPM設(shè)計允許區(qū)分已知引起ARI(即感染早期的"類流感"癥狀)的15種其它常見呼吸道病原體和6種疾病預(yù)防控制中心A類別的生物恐怖病原體(表1)。用來檢驗RPMv.l敏感性和特異性的全部對照抹和野毒抹(fieldstrain)以及它們的來源列于表1。表1:基于微陣列的檢測對原型對照抹的分析敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>Note:@:噬斑純化；*:最低檢測限得以檢測；#:靶基因由布魯海若恩生物工藝(BlueHeronBiotechnology)(Bothell,WA)構(gòu)建并克隆至pUCl19。實施例2臨床樣品-歸檔的咽喉拭子從多個軍隊新兵訓(xùn)練中心、美國墨西哥邊界區(qū)和在1999-2005部署的海軍艦艇內(nèi)的具有ARI癥狀的患者中收集。這些咽喉拭子立即放置在含有1.5mL病毒運輸培養(yǎng)基(VTM)的降溫的2mL管形瓶內(nèi)，冷凍并在-80。C或以下貯存，以便在運輸期間維持病毒粒子。隨后將樣品運輸至海軍健康研究中心(NavalHealthResearchCenter,NHRC，圣地亞哥(SanDiego),CA)、解凍并等分，并且使用CAP認(rèn)證的診斷性RT-PCR/PCR和培養(yǎng)試驗對HAdV和流感病毒進(jìn)行檢驗。冷凍的等分試樣以雙盲方式(blindedfashion)隨后提交用于基于微陣列的檢測。實施例3核酸提取-使用MasterPureDNA純化試劑盒(艾匹森特技術(shù)(EpicentreTechnologies),麥迪遜(Madison)，WI),省略RNA消化，或使用MagNA純簡明核酸分離試劑盒I(MagNAPureCompactNucleicAcidIsolationKitI)(羅奇應(yīng)用科技(RocheAppliedScience)，印第安納波利斯(Indianapolis)，IN)按照制造商推薦方案，從臨床樣品中提取核酸。實施例4內(nèi)對照-選擇與NAC1和磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)對應(yīng)的兩個擬南芥(爿raWd0戸/W/2a"a"")基因作為逆轉(zhuǎn)錄(RT)和PCR反應(yīng)的內(nèi)對照，因為它們不可能天然存在于臨床樣品內(nèi)。含有這兩個基因約500bp的兩種質(zhì)粒pSP64poly(A)-NACl和pSP64poly(A)畫TIM由在基因組研究所(TheInstituteforGenomeResearch(羅克維爾(Rockville)，MD))的Dr.NormanH.Lee友好提供。NAC1通過PCR用SP6和M13R引物擴(kuò)增，并且使用QIAquickPCR純化試劑盒(奎阿根(Qiagen)，巴倫西亞(Valencia)，CA)純化PCR產(chǎn)物。為產(chǎn)生來自pSP64poly(A)-TIM的RNA，將該質(zhì)粒用五co^/線性化并使用MEGAscript高產(chǎn)轉(zhuǎn)錄試劑盒(HighYieldTransciptionKit)(艾姆f早恩(Ambion)，奧斯汀(Austin)，TX)從SP6啟動子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。使用NAC1和TIM各60fg作為檢查擴(kuò)增效率和標(biāo)本內(nèi)抑制物存在的內(nèi)對照。實施例5引物設(shè)計和多重RT-PCR擴(kuò)增-將引物分配至兩個獨立的反應(yīng)簡化了引物的設(shè)計及優(yōu)化。實施對兩種混合物(替換對新混合物擴(kuò)增不良的引物)的精細(xì)調(diào)整以確保將充分?jǐn)U增來自26種所靶向病原體(在陣列上包括西尼羅河病毒，但在該擴(kuò)增方案內(nèi)不包括)的全部靶基因以便允許雜交。設(shè)計用于RPMv.l芯片上的全部靶的基因特異性引物對(列于表2(a)和2(b))以確保用于多重PCR的優(yōu)異擴(kuò)增效率。設(shè)計全部引物以具有相似的復(fù)性溫度，并且使用GenBank數(shù)據(jù)庫的完全搜索，以BLAST程序?qū)σ阎蛄羞M(jìn)行檢查以確保獨特性。對全部引物檢查與其它引物的潛在雜交以減少引物二聚體形成的可能。此外，我們調(diào)整了由Shuber等，"用于開發(fā)多重PCR的簡化方法(AsimplifiedprocedurefordevelopingmultiplexPCRs)，，C7，mei^s.，5，488-493(1995)和Brownie等，"減少PCR中引物二聚體積聚(Theeliminationofprimer-dimeraccumulationinPCR)"Wwc/e/c爿d^s25，3235-3241(1997)開發(fā)的方法，旨在通過添加22bp接頭序列(引物L(fēng))至本研究內(nèi)所用的引物5，端而進(jìn)一步抑制引物二聚體形成。逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)在20pl體積內(nèi)進(jìn)行，其中所述的20nl體積含有50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKCl、3mMMgCl2、dATP、dCTP、dGTP、dTTP的每種500nM、40U的RNA酶OUTTM、10mMDTT、2pM引物L(fēng)N、200USuperscriptIII(印威疇根生命技術(shù)(InvitrogenLifeTechnologies)，卡爾斯巴德(Carlsbad),CA)、兩種內(nèi)對照(NACl和TIM)各60fg和5-8pi已提取的臨床標(biāo)本或?qū)嶒炇覍φ?。在珀耳帖熱循環(huán)-PTC240DNA工具Tetrad2(PeltierThermalCycler-PTC240DNAEngineTetrad2)(MJ研究公司(MJResearchInc.),里諾(Reno)，NV)內(nèi)，使用制造商推薦的方案實施反應(yīng)。表2(a):用于多重PCR的引物混合物A內(nèi)的PCR引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*RSV:呼吸道合胞體病毒將RT反應(yīng)產(chǎn)物分成兩個lOpl體積以進(jìn)行兩種不同的多重PCR反應(yīng)。引物混合物A含有19對引物對并擴(kuò)增來自3種不同流感病毒A、l種流感病毒B、HadV的3種血清型和一個內(nèi)對照(TIM)的18個基因靶。引物混合物B含有38對引物對并擴(kuò)增其余37個基因靶和另一個內(nèi)對照(NAC1)。PCR反應(yīng)在50pi體積內(nèi)進(jìn)行，其中所述的50pl體積含有20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、2mMMgCl2、dATP、dCTP、dGTP、dUTP的每種400|iM、1U易受熱破壞的尿嘧啶-DNA糖基化酶(USB,Carlsbad,CA)、2pM引物L(fēng)、40nM來自混合物A的每種引物或50nM來自混合物B的每種引物、10U鉑(Platinum)ra《DNA聚合酶(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)和10piRT產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng)在PeltierThermalCycler-PTC240DNAEngineTetrad2(MJResearchInc.,Reno,NV)內(nèi)實施，在25。C初始溫育10分鐘，在94。C初次變性3分鐘，隨后是5個循環(huán)94"持續(xù)30秒，5(TC持續(xù)90秒，72。C持續(xù)120秒；隨后是35個循環(huán)94。C持續(xù)30秒，64。C持續(xù)120秒以及最終在72。C延長5分鐘。將來自兩個PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物合并為一個體積并進(jìn)行與RPMv.l芯片雜交前的純化和加工(見下文)。實施例6微陣列雜交和加工-將兩種PCR產(chǎn)物混合物在擴(kuò)增后再合并以便片段化及與微陣列雜交。微陣列雜交和加工根據(jù)制造商推薦方案(艾菲麥垂克斯公司(AffymetrixInc.)，圣克拉拉(SantaClara),CA)實施，具有如下改良。純化的PCR產(chǎn)物在37。C進(jìn)行片段化5分鐘，并隨后在37。C用生物素-N6-ddATP標(biāo)記30分鐘。雜交在4t轉(zhuǎn)電烤箱內(nèi)在45。C和60轉(zhuǎn)/分鐘實施2小時。在掃描后，使用GCOS軟件以縮減原始圖像(.DAT)文件至簡化文件格式(.CELfile),同時將密度賦予每種相應(yīng)探針位置。最后，使用GDAS軟件來應(yīng)用內(nèi)置版ABACUS(Cutler等，"用微陣列高通量變異檢測和基因分型(High-throughputvariationdetectionandgenotypingusingmicroarrays)"Ge〃ome11，1913-1925(2001))算法以便產(chǎn)生正確的堿基響應(yīng)(basecall)估計值，比較有義探針組及反義探針組各自的強(qiáng)度。為增加堿基響應(yīng)的百分?jǐn)?shù)，調(diào)節(jié)參數(shù)以允許最大容許的堿基響應(yīng)(見下文)。來自對再測序陣列法的每個拼貼區(qū)所產(chǎn)生-過濾條件無信號閾值=0.500(默認(rèn)=1.000000)弱信號加倍閾值=20000.000(默認(rèn)=20.000000)巨大信號噪聲比(SNR)閾值=20.000000(默認(rèn)=20.000000)-算法參數(shù)鏈質(zhì)量閾值=0.000(默認(rèn)=0.000000)總體質(zhì)量闞值=25.0000(默認(rèn)=75.000000)雜合體響應(yīng)的最大部分=0.99000(默認(rèn)=0.900000)模式類型(0=雜合體，1=純合體)=0完全響應(yīng)質(zhì)量閾值=0.500(默認(rèn)=2.000000)-終末可靠性原則臨近探針內(nèi)響應(yīng)的最小部分=1.0000(不能過濾)樣品的響應(yīng)最小部分=1.0000(不能過濾)實施例7自動化病原體鑒定算法(基于NA序列的病原體鑒定)-使用如此算法加工從微陣列雜交和掃描中產(chǎn)生的未處理輸出序列(rawoutputsequence)，其中所述算法使用對數(shù)據(jù)庫記錄的序列相似性比較而鑒定病原體。開發(fā)新的軟件程序即計算機(jī)執(zhí)行的基于生物序列的鑒定儀系統(tǒng)版本2(￡omputer-!mplementedgiologicalSequence-basedIdentifiersystemversion2,CIBSI2.0)來通過并入先前在再測序病原體鑒定(REPI)程序(Lin等，"使用再測序DNA微陣列鑒定廣錯呼吸道病原體(Broad-spectrumrespiratorytractpathogenidentificationusingresequencingDNAmicroa呵s)，，(7，weias.，16(4)，527-535(2006))內(nèi)進(jìn)行的任務(wù)，并且此外還進(jìn)行以前手工進(jìn)行的決策而徹底地分析該結(jié)果。對該方法包括對改良REPI算法更廣泛的討論在2006年6月6日提交的美國專利申請?zhí)?1/422,431內(nèi)詳細(xì)描述。實施例8病原體的定量4吏用多種原型抹和臨床樣品證實本鑒定法的特異性。結(jié)果未顯示輩巴之間可辨別的的干擾。隨后使用原型抹的連續(xù)十倍稀釋的核S吏模板評估RPMv.l鑒定法的分析^t感性。表1顯示對每種病原體的病原體最低可4企測稀釋度。該結(jié)果顯示用于原型林的敏感性范圍是每個反應(yīng)10-103個基因組拷貝，該敏感性與標(biāo)準(zhǔn)多重RT-PCR/PCR方法的敏感性是可比較的。應(yīng)當(dāng)指出基因組拷貝數(shù)不應(yīng)該等同于活力計數(shù)(噬斑形成單位)，因為對于呼吸道病原體而言，基因組拷貝數(shù)通常比活力計數(shù)如果不是高出數(shù)個數(shù)量級，至少高出一個數(shù)量級。RPMv.l鑒定和區(qū)分近親遺傳鄰居之間的能力首先用更特異性的方案證實，隨后已經(jīng)用該方案重現(xiàn)。A/^A腺病毒(HAdV)的17種不同血清型中產(chǎn)生的序列揭示該鑒定法可以區(qū)分多種AR1相關(guān)性HAdV林并證明該鑒定法可以用來檢測類型廣泛的變體(表3)。靶的交叉雜交僅在不同血清型間的HAdV六鄰體基因上觀察到；但是這不影響正確的靶向病原體的陽性鑒定。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>Mycoplasmapneumoniaeinclinicalsamplesbyreal-timePCR)，,/M/cro6/o/.Me^oA，41，45-51(2000);Corless等，"在懷疑腦膜炎和敗血癥的情況下使用實時PCR同時檢測腦膜炎萘瑟氏菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌(SimultaneousdetectionofNeisseriameningitidis,Haemophilusinfluenzae,andStreptococcuspneumoniaeinsuspectedcasesofmeningitisandsepticemiausingreal-timePCR)，，/C7/".M/craWo/.，39,1553-1558(2001);M6lling等，"通過LightCyclerPCR直接并快速對腦膜炎球菌及porA擴(kuò)增鑒定和基因分型(DirectandrapididentificationandgenogroupingofmeningococciandporAamplificationbyLightCyclerPCR)，，/C7/".M/cra&o/.，40，4531-4535(2002);Vabret等，"用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)直接診斷人呼吸冠形病毒229E和OC43(Directdiagnosisofhumanrespiratorycoronaviruses229EandOC43bythepolymerasechainreaction)"/Wra/.MeAoA,97，59-66(2001))確定其它病原體的基因組拷貝數(shù)。表4.用于定量實時PCR的PCR引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>*RSV:呼吸道合胞體病毒，0雙標(biāo)記探針在5，端含有6-羧基-熒光素(FAM)作為熒光報告染料并在3，端含有BlackHole猝滅劑。參考文獻(xiàn)Stone等，"通過實時PCR快速檢測和同步亞型區(qū)分流感病毒A(RapiddetectionandsimultaneoussubtypedifferentiationofinfluenzaAvirusesbyrealtimePCR),，/腸/.她A喊117,103-112(2004).Vabret等，"用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)直接診斷人呼吸冠形病毒229E和OC43(Directdiagnosisofhumanrespiratorycoronaviruses229EandOC43bythepolymerasechainreaction)，，/Wra/.Me/Zzo成97,59-66(2001)Hardegger等，"通過實時PCR快速檢測臨床樣本中的肺炎支原體(RapiddetectionofMycoplasmapneumoniaeinclinicalsamplesbyreal-timePCR),,/M'cra歸.MeA喊41,45-51(2000)Corless等，"在懷疑腦膜炎和敗血癥的情況下使用實時PCR同時檢測腦膜炎萘瑟氏菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌(SimultaneousdetectionofNeisseriameningitidis,Haemophilusinfluenzae,andStreptococcuspneumoniaeinsuspectedcasesofmeningitisandsepticemiausingreal-timePCR)"乂C7/w.M/cra6/。/.，39，1553-1558(2001)Mentel等，"改善呼吸道合胞體病毒感染診斷的實時PCR(Rea-timePCRtoimprovethediagnosisofrespiratorysyncytialvirusinfection)"/A/et/.Af/c/-oZ)/o/"52，893-896(2003)M6lling等，"通過LightCyclerPCR直接并快速對腦膜炎球菌及porA擴(kuò)增鑒定和基因分型(DirectandrapididentificationandgenogroupingofmeningococciandporAamplificationbyLightCyclerPCR)，，/C7/".Mz'cto6/。/.，40,4531-4535(2002)實施例9呼吸道病原體的同時檢測和區(qū)分_先前研究已經(jīng)證實，除精確鑒定單個病原物種之外，對病原體檢測使用RPMv.l測定法的突出益處之一是能夠檢測同時感染。在本研究中，通過制備病原體模板的多種組合(表5和表6)進(jìn)一步評估RPMv.l測定法同時鑒定多種病原體的能力。使用模板的連續(xù)稀釋物來估計對多種病原體的檢測敏感性和特異性。將含有每反應(yīng)每種病原體即HAdV-4、化膿性鏈球菌、肺炎支原體和鼠疫耶爾森氏菌的106-103個基因組拷貝的核酸模板混合在一起并用RPMv.l陣列進(jìn)行檢驗。這些結(jié)果證實本測定法允許甚至在每反應(yīng)每靶的最低濃度103個基因組拷貝時對全部4種病原體進(jìn)行可重復(fù)的基于序列的鑒定(表5)。在這種復(fù)雜混合物內(nèi)沒有可辨別得出的干擾，該事實進(jìn)一步支持RA的核苷酸堿基響應(yīng)能力及附帶的鑒定算法的耐用性，甚至在復(fù)雜混合物內(nèi)也是如此。為進(jìn)一步估計這種方法對檢測復(fù)雜混合物內(nèi)多種病原體的效率，將3-7種培養(yǎng)的生物體以不同滴度[102-105個(菌落形成單位或噬斑形成單位)/mL]添加到從自志愿者中收集的匯集的鼻沖洗物內(nèi)，并且將150pi制備的樣品用于才企驗。初步結(jié)果揭示該方法允許毫無疑問地同時檢測在最低滴度100個菌落形成單位(噬斑形成單位)/mL上的7種病原體HAdV-4、HAdV-7、炭疽芽孢桿菌、流感病毒A-H1N1、副流感病毒l、RSV-A、肺炎支原體和化膿性鏈球菌檢測其中6種。在這些病原體中，HAdV-4、炭疽芽孢桿菌、流感病毒A-H1N1、RSV-A和肺炎支原體在最低滴度100個菌落形成單位(噬斑形成單位)/mL上得到檢測，而化膿性鏈球菌在1000cfli/mL上得到檢測到(表6)。鼠疫耶爾森氏菌甚至在最高濃度上不能得到檢測。這歸咎于用于完整鼠疫耶爾森氏菌病原體的核酸提取方案的不適當(dāng)性，因為當(dāng)使用純化的核酸模板時，可以4全測到的鼠疫耶爾森氏菌的1000個基因組拷貝(表1和表5)。為進(jìn)一步證實，RPMv.l在4種病原體的相同組合上以培養(yǎng)的生物體進(jìn)行檢驗，其中所述的病原體使用純化的核酸模板(表5)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示該鑒定法可以重復(fù)檢測出在100個菌落形成單位(噬斑形成單位)/mL上的HAdV-4和肺炎支原體而無檢測失敗，對化膿性鏈球菌的敏感性較低(1000個菌落形成單位/mL)，但不能檢測到鼠疫耶爾森氏菌。當(dāng)同時枱二驗3種病原體時，在該例子中是炭疽芽孢桿菌、流感病毒A-H1N1和HCoV-229E或RSV-A,測定法檢測到滴度低至100個菌落形成單位(噬斑形成單位)/mL的全部3種病原體(表6)。這些結(jié)果表明基于RA的方法是對來自鼻沖洗物樣品的多種病原體進(jìn)行直接檢測并分型的有效手段，具有用于檢測至少7種病原體同時感染的高敏感性和特異性益處。該方法將用于群體內(nèi)這些病原體的日常診斷和流行病學(xué)調(diào)查，提供有關(guān)多種病原體發(fā)生率的新信息。表5:通過RPMv.l同時檢測多種核酸模板<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注意樣品通過在TE緩沖液內(nèi)混合純化的核酸模板以產(chǎn)生106個基因組拷貝/ul貯存液而生成。從該濃度開始，制備TE緩沖液內(nèi)的IO倍連續(xù)稀釋物。表6;通過RPMv.l同時檢測多種病原體<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>注意樣品通過培養(yǎng)物樣品與自正常志愿者中收集的匯集的鼻沖洗物混合以產(chǎn)生105個菌落形成單位(噬斑形成單位)/ml而生成。從該濃度開始，制備含有自正常志愿者中收集的匯集的鼻沖洗物的IO倍連續(xù)稀釋物。對于每種稀釋物，將150pl樣品用于RPMv.l方法。BA-炭疽芽孢桿菌(Sterne)、H1N1-流感病毒A-H1N1、HCoV229E-人冠狀病毒229E、HAdV-人腺病毒、GAS-化膿性鏈球菌(A組鏈球菌)、MP-肺炎支原體、PIV1:副流感病毒l、RSV-呼吸道合胞體病毒、YP-鼠疫耶爾森氏菌。+:檢測到、-:未檢測到。實施例10臨床標(biāo)本的評估-在成功地證實RPMv.l測定法用于病原體檢測的能力后，該鑒定法用于前瞻性診斷和回顧性診斷引起ARI的感染。使用主要從表現(xiàn)ARI的軍隊新兵中收集的臨床標(biāo)本來比較基于^:陣列的診斷法與建立更久的呼吸道病原體檢測方法的用途。樣品(n=101)由病毒轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基內(nèi)的具有臨床已記錄呼吸道疾病的咽喉拭子組成。樣品從已經(jīng)使用CAP認(rèn)證的診斷方法(細(xì)胞培養(yǎng)和/或PCR)在NHRC檢驗對HAdV或流感病毒呈陽性的組內(nèi)隨機(jī)選擇。將這些樣品雙盲化(P逸機(jī)重新編號并與相關(guān)的臨床記錄分開)并送到海軍研究實驗室(NRL)以進(jìn)行RPMv.l檢驗。比較性實驗由兩個獨立實驗室進(jìn)行并且樣品身份僅在結(jié)果已經(jīng)最終完成后才揭示。對于流感病毒A,RPMv.l方法顯示相對于最初診斷結(jié)果的87%檢測敏感性和96%特異性以及92%整體符合度(表7)。對于腺病毒，RPMv.l檢測敏感性是87%，特異性是97%，整體符合度97°/。(表7)。在進(jìn)一步比較RPMv.l結(jié)果與培養(yǎng)方法及PCR方法的結(jié)果時，數(shù)據(jù)顯示出與培養(yǎng)測定方法或PCR測定方法可比較的檢測敏感性和特異性(表8)。數(shù)據(jù)表明RPMv.l具有比培養(yǎng)法和PCR法更好的敏感性及特異性，這是可以預(yù)期的，因為分子方法通常比培養(yǎng)法更敏感，并且RPMv.l方法的測序能力提供比PCR更高的特異性(表9)。該數(shù)據(jù)還有力地證實基于微陣列的診斷法在未培養(yǎng)的患者標(biāo)本內(nèi)正確鑒定臨床相關(guān)性流感病毒A抹的能力。表7:RPMv.l用于臨床樣品內(nèi)腺病毒、流感病毒A和陰性對照檢測的評估<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>CAP認(rèn)證的PCR;*將CAP認(rèn)證的PCR陰性樣品中的一個樣品對流感病毒A進(jìn)行培養(yǎng)，RPMv.l顯示同時感染HAdV-4和流感病毒A，證實另一個陰性樣品具有低滴度的HAdV-4;4份流感病毒A培養(yǎng)法陽性樣品也不能通過定量實時PCR得以檢測，表明模板降解。表8:對40份臨床樣品內(nèi)流感病毒A陽性對照和陰性對照檢測的RPMv.l與培養(yǎng)法和實時PCR測定法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表9:對40份臨床樣品內(nèi)流感病毒A陽性對照和陰性對照檢測的培養(yǎng)法與實時PCR鑒定法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>本研究證實本測定法鑒定流感病毒亞型并追蹤遺傳性變化的能力。這對于流感病毒流行病學(xué)尤其重要，因為抗原漂變是流感病毒逃脫因先前自然暴露和接種所誘導(dǎo)的免疫壓力的^U制。對從RPMv.l中產(chǎn)生的血凝素(HA)序列和神經(jīng)氨酸酶(NA)序列的分析重現(xiàn)從1999-2005通過抗原漂變而出現(xiàn)的已知譜系變化(表10)。7份在2003-2004流感季節(jié)前收集的流感病毒A/H3N2臨床標(biāo)本被鑒定為屬于A/巴拿馬/2007/99樣譜系，而9份在2003-2004流感季節(jié)內(nèi)收集的流感病毒A/H3N2樣品明白無誤地攜帶在HA基因內(nèi)的特征A/福建/411/2002-樣譜系核苷酸置換。從A/福建/411/2002樣抹至A/加利福尼亞/7/2004樣抹的漂移(shift)在18份于2004-2005流感季節(jié)中收集的流感病毒A/H3N2樣品內(nèi)是明顯的。3份樣品被鑒定為A/福建/411/2002樣株，而其余樣品在HA基因內(nèi)顯示特征性加利福尼亞樣核苷酸置換。2份在相同時間期間收集的樣品僅能夠被鑒定為流感病毒A/H3N2。其原因在于靶的不良擴(kuò)增和/或雜交，導(dǎo)致用于抹水平鑒定的信息不充分。2份在2000-2001內(nèi)收集的流感病毒A/H1N1樣品被鑒定為與A/新喀里多尼亞/20/99親緣關(guān)系密切。表10:流感病毒抹和使用RPMv.l的譜系鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>7079321-Nov-03A/紐約/18/2003(H3N2)(CY001061)*A/福建/411/200251672l-Dec-03A/紐約/28/2003(H3N2)(CY000009)A/福建/411/200243269l-Dec-03A/紐約/28/2003(H3N2)(CY000009"A/福建/411/200251673l-Dec-03A/紐約/43/2003(H3N2)(CYOOO169)*A/福建/411/20026241616-Dec-03A/紐約/51/2003(H3N2)(CY001064)承A/福建/411/20029078117-Dec-03A/紐約/41/2003(H3N2)(CY000153"A/福建/411/20024893012-Jan-04A/芬蘭/305/2003(H3N2)(DQ167271)A/福建/411/20024893413-Jan-04A/紐約/34/2003(H3N2)(CY0000431)A/福建/411/20023232318-Jan-05A/濟(jì)州/311/2002(H3N2)(AY589649)A/福建/411/20023232720-Jan-05A/紐約/464/2005(H3N2)(CY003648)A/加利福尼亞/7/20044937024-Jan-05A/紐約/378/2005(H3N2)(CY002016)A/加利福尼亞/7/20045206705-Jan-05A/紐約/244/2005(H3N2)(CY002080)承A/加利福尼亞/7/20043232921-Jan-05A/紐約/386/2004(H3N2)(CY002040)A/加利福尼亞/7/20044936922-Jan-05A/紐約/387/2004(H3N2)(CY002048)A/加利福尼亞/7/200449376l-Feb-05A/紐約/461/2005(H3N2)(CY006076)A/加利福尼亞/7/2004柳7702-Feb-05A/紐約/372/2004(H3N2)(CY002224yA/加利福尼亞/7/20044937802-Feb-05A/紐約/359/2005(H3N2)(CY002000)A/加利福尼亞/7/20046281803-Feb-05A/紐約/359/2005(H3N2)(CY002000)A/加利福尼亞/7/20045208205-Feb-05A/H3N2N.D.3234914-Feb-05A/紐約/379/2004(H3N2)(CY002026"A/加利福尼亞/7/20045208715-Feb-05A/Aichi/143/2005(H3N2)(AB243872)A/加利福尼亞/7/20045208916-Feb-05A/紐約/396/2005(H3N2)(CY002072)A/加利福尼亞/7/20044941724-Feb-05A/紐約/373/2005(H3N2)(CY002456"A/加利福尼亞/7/20045209525-Feb-05A/芬蘭/170/03(H3N2)(AY661032)A/福建/411/20025209626-Feb-05A/芬蘭/170/03(H3N2)(AY661032)A/福建/411/20025209928-Feb-05A/坎特伯雷/67/2005(H3N2)(CY008059)A/加利福尼亞/7/20044942828-Feb-05A/紐約/382/2005(H3N2)(CY002032)*A/加利福尼亞/7/200449432Ol-Mar-05A/紐約/373/2005(H3N2)(CY002456)承A/加利福尼亞/7/20044944907-Mar-05雄3N2N.D.Note:*表示僅單抹得到鑒定除了檢測臨床樣品內(nèi)的單種病原體之外，可以在臨床樣品內(nèi)檢測到多種同時感染如HAdV-4/流感病毒A、HAdV-4/化膿性鏈球菌和流感病毒A/肺炎支原體(數(shù)據(jù)未顯示)。這些同時感染使用公開的型特異性PCR測定法(Stone等,"通過實時PCR快速檢測和同步亞型區(qū)分流感病毒A(RapiddetectionandsimultaneoussubtypedifferentiationofinfluenzaAvirusesbyrealtimePCR)"/Wra/.Me決oA，117，103-112(2004);Hardegger等，"通過實時PCR快速檢測臨床樣本中的肺炎支原體(RapiddetectionofMycoplasmapneumoniaeinclinicalsamplesbyreal-timePCR)，，/Mcrobiol.Methods,41,45-5(2000))和自有(in-house)特異性PCR引物(表4)(數(shù)據(jù)未顯示)進(jìn)一步驗證。此外，該測定法還檢測到在26°/0臨床樣品內(nèi)的肺炎鏈球菌和在16%臨床樣品內(nèi)的腦膜炎奈瑟氏菌。肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟氏菌的存在通過公開的物種特異性定量實時PCR鑒定法(數(shù)據(jù)未顯示)在40份臨床樣品的亞群(因樣品的可獲得體積而受限制)內(nèi)進(jìn)行-瞼證。公知肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟氏菌是在嘴和上呼吸道系統(tǒng)內(nèi)的共生性細(xì)菌，因此在臨床樣品內(nèi)找到這些細(xì)菌通常不令人驚訝。然而，定量實時PCR數(shù)據(jù)顯示，盡管大多數(shù)臨床樣品內(nèi)存在的肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟氏菌的滴度低(^103基因組拷貝411),32°/。的流感陽性樣品攜帶高滴度的肺炎鏈球菌(7/25)或腦膜炎奈瑟氏菌(1/25K2105基因組拷貝4il)(數(shù)據(jù)未顯示)。存在于這些臨床樣品內(nèi)的高滴度細(xì)菌可能歸因于病毒誘導(dǎo)性細(xì)菌超感染。實施例11用引物L(fēng)和LN的多重PCR方案—如下是實施例方法的詳細(xì)方案。準(zhǔn)備工作1.從pSP64poly(A)-TIM中制備TIMRNA-MEGAscriptSP6試劑盒(Ambion，目錄號1330)a)用EcoRI酶線性化的1嗎的pSP64poly(A)-TIMxplpSP64poly(A)-TIM2pl10xEcoRI緩沖液2^1EcoRI(NEB，目錄號R0101S)_(16-x)|ilH20_20pi總體積將反應(yīng)物在37。C下溫育5小時。b)通過添加如下物質(zhì)終止限制酶切消化1/20體積0.5MEDTA(1pil)1/10體積3M乙酸鈉(2^1).2體積乙醇(40jlU)c)充分混合并在-20。C冷凍20分鐘。隨后在微量離心機(jī)內(nèi)在最高速度使DNA沉淀(pellet)15分鐘。d)除去上清液，使管再離心(re-spin)數(shù)秒，并用非常尖的吸頭除去殘余液體。重懸于20nl無核酸酶的水內(nèi)。e)將RNA聚合酶酶混合物放置在冰上f)渦旋混合10x反應(yīng)緩沖液與4種核糖核苦酸溶液g)(ATP、CTP、GTP和UTP)直至它們完全溶解于溶液內(nèi)。h)核糖核苷酸一旦融化則在冰上貯存，但是組成(assembling)反應(yīng)時將10x反應(yīng)緩沖液維持在室溫下。i)應(yīng)當(dāng)在開啟之前使全部試劑短暫微量離心，以防止可能存在于管邊緣周圍的材料損失和/或污染。j)在室溫下形成如下轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物16nl線性化pSP64poly(A)-TIM1NTP(ATP、GTP、CTP、UTP各4pl)410x反應(yīng)緩沖液4pl酶混合物_40pl總體積將反應(yīng)物在37。C下溫育6小時。k)純化RNA產(chǎn)物用探針QuantTMG-50微量柱(Amersham，目錄號27533501)1)測量所回收RNA的O.D.并稀釋以產(chǎn)生60fg/pl貯存液。2.用platinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen，目錄號10966-034)從/15P"/w/j;fH)-A^(^-PCR中制備NAC1DNA片段1nlpSP64poly(A)-NACl(ln,)10xPCR緩沖液2pl50mMMgCl21pl10mMdNTP混合物1plSP6(10,)5，-ATTTAGGTGACACTATAGAAT畫3，1|ilSP6(10nM)5'-CAGGAAACAGCTATGACCATG畫3,0.5plPlatinumTaq聚合酶38.5piH2050總體積運行如下PCR程序:94°C-3分鐘40個循環(huán)94°C-30秒50°C-30秒72。C-40秒72°C-5分鐘4。C一永久純化的PCR產(chǎn)物-QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen,目錄號28106)a)添加250jLil緩沖液PB至50plPCR樣品。b)將QIA快速離心柱(spincolumn)放在提供的2ml收集管內(nèi)。c)為結(jié)合DNA，施加樣品至QIA快速柱并離心30""60秒。d)棄去流過的液體。將QIA快速柱放回相同管內(nèi)。e)為洗滌，添加0.75ml緩沖液PE至QIA快速柱并離心30-60秒。f)棄去流過的液體并將QIA快速柱放回相同管內(nèi)。g)^f吏該柱額外離心1分鐘。h)將QIA快速柱放在一個清潔的1.5ml微量離心管內(nèi)。i)為洗脫DNA,添加50pl緩沖液EB(lOmMTris'Cl，pH8.5)或H20至QIA快速膜的中央，擱置該柱l分鐘并隨后使該柱離心l分鐘。j)測量PCR產(chǎn)物的0,D.并稀釋以產(chǎn)生60fg/jil貯存液。3.通過混合10pi的100pM寡核苦酸^存液(表2(a))并添加水至1m，產(chǎn)生1ml的lpM引物混合物A貯存液1。充分混合，隨后分成100^1等分試樣。4.通過混合10jliI的100寡核苦酸貯存液(表2(b))并添加水至1ml,產(chǎn)生1ml的1引物混合物B貯存液。充分混合，隨后分成lOOpl等分試樣。多重PCR1.核酸提取-MasterPureDNA純化試劑盒(Epicentre,目錄號MC89010)。a)添加100^的lxPBS至50pl鼻沖洗物。b)添加含有l(wèi)jil蛋白酶K的150^12xT&C裂解溶液。c)在65。C下溫育15分鐘，每隔5分鐘渦旋混合。d)在冰上或4。C下溫育3-5分鐘。e)添加150plMPC》容液至才羊品內(nèi)，渦旋混合10秒。f)在最大速度上離心(spin)10分鐘。g)轉(zhuǎn)移上清液至一只1.5ml新管，隨后添加500nl異丙醇，充分混合。h)在最大速度于4。C離心IO分鐘。棄去上清液，隨后用80%乙醇洗滌兩次。i)使沉淀(pellet)干燥并重懸于8pl無核酸酶的水內(nèi)。2.用引物L(fēng)N-InvitrogenSuperscriptIII(Invitrogen,目錄號18080-093)的逆轉(zhuǎn)錄來自步驟1的NA8pi引物L(fēng)N(40iaM)1pi5'-CGATACGACGGGCGTACTAGCGNNNNNNNNN-3,lOmMdNTP1piTIM(60fg/pl)1JulNAC1(60fg/pl)1pi_總體積12|al在65。C下溫育5分鐘，隨后在冰上放置超過l分鐘添加如下反應(yīng)混合物至管內(nèi)并通過抽吸加以溫和混合5x第一鏈緩沖液4pl0.1MDTT2piRNA酶OUT1^SuperscriptIII1|jl總體積8pi在PCR儀器上運行如下程序25°C-IO分鐘50°C-50分鐘85°C-5分鐘3.分割具有引物L(fēng)的多重PCRa.反應(yīng)A:10xPCR緩沖液5jal50mMMgCl24pi50xdNTP2pi引物L(fēng)(100pM)1pi5'畫CGATACGACGGGCGTACTAGCG-3，引物A混合物(1pM)2^15XQ-溶液5piRT模板(來自步驟2)10piPlatinumtaq2pi無核酸酶的水18^1UDG__總體積50jliIb.反應(yīng)B:10xPCR緩沖液5pi50mMMgCl24^150xdNTP2pi引物L(fēng)(lOOpM)1^15'-CGATACGACGGGCGTACTAGCG-3,引物B混合物(lpM)2.5pi5xQ-溶液5piRT模板10^Platinumtaq2jil無RNA酶的水17.5piUDG__總體積50(il運fi"如下PCR程序94°C-3分鐘5個循環(huán).-94°C-30秒50°C—90秒72°C-2分鐘35個循環(huán)94°C-30秒64°C-2分鐘72。C-5分鐘4°C-永久陣列制備1.0kbTagIQ-EX或7.5kbTagIQ-EX1.0kbTagIQ-EXPCR正向引物(lkb)3pi反向引物3|ilTagIQ-EX5MlMgCl2(50mM)5pldNTP(10mM)2^1lOxPCR緩沖液10|ilPlatinumTaqDNA聚合酶1pi水71pl總體積羅nl94°C,3分鐘30個循環(huán)94°C,30秒；68°C，30秒；72°C,40秒72°C，10分鐘7.5kbTagIQ-EXPCR正向引物(7.5kb)3W反向引物3piTagIQ-EXdNTP(LAPCR試劑盒)16pilOxPCR緩沖液(LAPCR試劑盒)1TaKaRaTaq1^1水62pl總體積100nl94°C，3分鐘30個循環(huán)94°C,30秒；68°C,7分鐘30秒68°C，10分鐘^/AW戶C及/^-J5X重PC及,-QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，目錄號28106)a)添加500jLU緩沖液PB至100)ilPCR樣品(合并反應(yīng)A和B).b)將QIA快速離心柱放在提供的2ml收集管內(nèi)。c)為結(jié)合DNA,施加樣品至QIA快速柱并離心3040秒。d)棄去流過的液體。將QIA快速柱放回相同管內(nèi)。e)為洗滌，添加0.75ml緩沖液PE至QIA快速柱并離心30"60秒。f)棄去流過的液體和將QIA快速柱放回相同管內(nèi)。g)使該柱離心額外l分鐘。h)將QIA快速柱放在一個清潔的1.5ml微量離心管內(nèi)。i)洗脫DNA，添加40pl緩沖液EB(lOmMTris'Cl，pH8.5)或H2C)至QIA快速膜的中央，擱置該柱(letthecolumnstand)l分鐘并隨后使該柱離心l分鐘。j)測量PCR產(chǎn)物的O.D.。片段化和標(biāo)記1.每個用于片段化的樣品設(shè)立一個管，對于每一反應(yīng)，添加EB緩沖液至終體積35pl。處理TagIQ-EX作為一個樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>2.在冰上制備片段化混合物10x片段化緩沖液4.3pil水3.23pi片段化試劑_0.07ul總體積7.6pi3.在水上冷凍片段化混合物，隨后添加7.6pl至從步驟1和2制備的每種DNA上。4.運行如下程序37°C，5分鐘95°C，10分鐘4°C，保持5.制備標(biāo)記混合物(每反應(yīng))Tdt緩沖液(5x)12pl基因芯片DNA標(biāo)記試劑(5mM)2plTdT(30U/pl)_3.4pi總計17.4^16.添加17.4pl標(biāo)記混合物至每一個反應(yīng)內(nèi)和對照片段化PCR產(chǎn)物內(nèi)。7.運行如下程序。37°C，30分鐘95°C，5分鐘4°C，保持雜交1.開啟設(shè)定在45。C上的雜交爐，加溫芯片至室溫.2.制備預(yù)雜交溶液。l%Tween-202^1lM丁ris,pH7.82|ul^_196^1總體積(每個芯片)20(Hd3.芯片與預(yù)雜交緩沖液在45。C預(yù)雜交。4.形成雜交主混合物。TagIQ-EX*(片段化的0.26嗎)L2pl5MTMAC132pllMTris，pH7.82，l%Tween-202，緋魚精子DNA(10mg/ml)2.2^1乙跣化BSA2.2^1對照寡核苷酸B23.4pl^_13.9|il終體積(每個芯片)160nl*使用如下計算以確定多少片段化的TagIQ-EX用于雜交主混合物。純化的PCR產(chǎn)物濃度(例如100ng/pl)x35pi=3500ng在進(jìn)行片段化和標(biāo)記后的終體積是60pl片段化的TagIQ-EX的終濃度=58.3ngl將需要260/58.3=4.4658.3^15.添加160pl至60pl標(biāo)記的樣品。運行如下程序。95°C，5分鐘45°C,5分鐘6.從芯片上除去預(yù)雜交緩沖液并填滿雜交混合物。7.在45。C下雜交過夜，60轉(zhuǎn)/分鐘。洗滌和染色1.制備洗滌緩沖液A與B洗液A20xSSPE300ml<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>充分混合并分成60P|il的2份等分試樣(染色液1和染色液3)3.制備抗體溶液(每個芯片)20xSSPE，1l%Tween-206pl50mg/ml乙?；疊SA25^110mg/ml正常山羊IgG6pl0.5mg/ml生物素化抗體3.6plDI水_379.4|il_終體積600|J4.運行洗滌方案-DNA陣列WS4。與常見方法不同，優(yōu)化的RPMv.l測定法不僅可以鑒定病原體，還可以提供序列信息，允許在相同測定法內(nèi)檢測數(shù)量眾多的病原體并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分類。序列信息證實作為遺傳性變異分析循環(huán)性和新發(fā)性病毒(即流感病毒)的有力工具的RPMv.l鑒定類型廣泛變體(例如HAdV)的能力。這種能力還用于追蹤已知變體的變化。這種用途清楚地在流感病毒A陽性臨床樣品內(nèi)得到證實，顯示出從A/A/巴拿馬/2007/99樣抹(在2003年流感季節(jié)之前)至2003-2004年流感季節(jié)內(nèi)的A/福建/411/2002樣抹，隨后至2004-2005年流感季節(jié)內(nèi)的A/加利福尼亞/7/2004樣4朱的譜系變化。在流感病毒A內(nèi)相對保守的l又一種M基因(H1N1)序列拼貼在RPMv.l上。但是，M基因ProS叫仍能夠檢測到完全不同亞型的同源區(qū)域，允許正確區(qū)分(表IO)。這種M基因ProSeq理論上將允許檢測在陣列上未拼貼抗原性HA序列和NA序列的任何其它類型的流感病毒。本研究"i正實這種系統(tǒng)可以顯示優(yōu)異的臨床敏感性和特異性、解析復(fù)雜的同時感染而不喪失壽文感性的能力，并且^t感性對于全部26種靶向的病原體和潛在生物戰(zhàn)劑是相似的。與培養(yǎng)法和PCR測定法相反，本測定法平臺顯示可比較的對HAdV和流感病毒A的檢測敏感性和特異性(表7)。該數(shù)據(jù)支持使用RPMv.l系統(tǒng)作為診斷工具，以便在直接臨床標(biāo)本內(nèi)以與常規(guī)監(jiān)測方法非常相關(guān)的方式正確鑒定并分型臨床相關(guān)性腺病毒抹和流感病毒A抹的可行性。顯然，本發(fā)明的眾多修改和變型在以上教授內(nèi)容影響下是可能的。因此將理解的是所要求權(quán)力的本發(fā)明可以與如具體所述的不同方式加以實施。任何處于單數(shù)形式的對權(quán)力部分的指稱，例如使用冠詞"a"、"an"、"這個"或"所述"不被解釋為限制該部分至單數(shù)。權(quán)利要求1.一種方法，其包括提供懷疑含有來自預(yù)定義病原體組內(nèi)的一種或多種病原體核酸的生物樣品；添加與預(yù)定義病原體組內(nèi)找得到的基因?qū)?yīng)的多種PCR引物至樣品內(nèi)；其中，所述引物包括用于每種病原體的至少一種引物對；其中，所述引物包含尾隨序列，所述尾隨序列與預(yù)定義病原體組的任意病原體的DNA或與樣品內(nèi)的任何背景DNA不同源；以及在樣品上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增與基因?qū)?yīng)的核酸的亞群；其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)內(nèi)至少一種引物的濃度不大于約100nM。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)內(nèi)每種引物的濃度不大于約100nM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述尾隨序列是CGATACGACGGGCGTACTAGCG(SEQIDNO.l)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述尾隨序列是CGATACGACGGGCGTACTAGCGNNNNNNNNN(SEQIDNO.2)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括提取來自臨床樣品的核酸以生產(chǎn)生物樣品。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述臨床樣品包含鼻沖洗物、咽喉拭子、痰、血液或環(huán)境樣品。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述臨床樣品來自生物；并且尾隨序列與該生物物種的DNA不同源。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述生物是人。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述病原體是呼吸道病原體。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述病原體是腸道病原體或生物威脅因子。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增的核酸包括小于200個核苷酸的序列和大于2000個核苷酸的序列。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述尾隨序列減少引物二聚體的形成。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述PCR引物包括至少50種不同引物。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，添加多種PCR引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別在生物樣品的多個等分試樣上進(jìn)行；其中，對每個等分試樣使用不同的多種PCR引物；并且其中，等分試樣在PCR反應(yīng)后合并。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括使樣品接觸包含多種與所擴(kuò)增核酸的至少部分互補(bǔ)的核酸序列的微陣列；并且允許所擴(kuò)增的核酸與互補(bǔ)核酸雜交。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述互補(bǔ)核酸是25聚體至29聚體。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述互補(bǔ)核酸包括針對至少一種已擴(kuò)增核酸的完全匹配探針和每種完全匹配探針的中央位置的三個不同單核苦酸多態(tài)性。18.根據(jù)權(quán)利要求0所述的方法，該方法還包括檢測哪種已擴(kuò)增的核酸與互補(bǔ)核酸雜交。19.根據(jù)權(quán)利要求0所述的方法，該方法還包括基于檢測到哪種已擴(kuò)增的核酸而鑒定病原體。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述鑒定基于模式識別。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述鑒定基于對已擴(kuò)增核酸的測序。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述鑒定包括病原體的抹系。全文摘要本發(fā)明涉及PCR方法，其包括提供懷疑含有一種或多種病原體核酸的生物樣品；添加多種與病原體內(nèi)找得到的基因相對應(yīng)的PCR引物；以及在樣品上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增與基因相對應(yīng)的核酸的亞群。所述引物包括用于每種病原體的至少一種引物對，并且引物含有與任何病原體DNA或與樣品內(nèi)任何背景DNA不同源的尾隨序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)內(nèi)至少一種引物的濃度不大于約100nM。文檔編號C12P19/34GK101273143SQ200680029583公開日2008年9月24日申請日期2006年6月9日優(yōu)先權(quán)日2005年6月16日發(fā)明者喬爾·M.·施努爾,凱特·M.·布萊尼,大衛(wèi)·A.·斯滕格,安東尼·P.·馬拉諾斯基,林寶川申請人:海軍部長代表的美國政府