專利名稱：：改進(jìn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物特異性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及源自于茂原鏈霉菌(S&e^o^yc"wo&raerae)的新型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶變體。所述變體可以用于以提高的選擇性改變肽。
背景技術(shù)：
：已知通過在蛋白質(zhì)上結(jié)合能恰當(dāng)改變肽的性質(zhì)的基團(tuán)可以改變肽的性質(zhì)和特征。尤其是對于治療用肽而言，可能希望甚至必要的是在所述肽上結(jié)^^基團(tuán)，這可以延長所述肽的半衰期。通常，這些結(jié)^^基團(tuán)是聚乙二醇(PEG)或脂肪酸-參見J.Biol.Chem.271，21969-21977(1996)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)先前已用于改變肽的性質(zhì)。在食品工業(yè)，尤其是在乳制品工業(yè)中，許多技術(shù)可供使用例如采用TGase使肽交叉結(jié)合。其他文獻(xiàn)7>開了應(yīng)用TGase改變生理活性肽的性質(zhì)。EP950665,EP785276和Sato,Adv.DrugDeliveryRev.^4,487-504(2002)公開了在TGase的存在下，含有至少一個Gin的肽和胺官能化PEG或者類似配體間的直接反應(yīng)，Wada在Biotech.Lett.21,1367-1372(2001)中公開了(3-乳球蛋白與脂肪酸通過TGase方法直接結(jié)合。國際專利申請WO2005070468公開了TGase可用于將官能團(tuán)引入含有谷氨酰胺的肽從而形成官能化的肽，而該經(jīng)過官能化的肽在隨后的步驟中可與諸如能夠與所述官能化的肽進(jìn)行反應(yīng)的PEG進(jìn)行反應(yīng)從而形成PEG化的肽。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)也已知為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，并催化以下一4a應(yīng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中Q-C(O)-麗2可表示含有谷氨酰胺的肽，而Q'-NH2表示胺供體，在以上討論的反應(yīng)中提供將被引入到所述肽中的官能團(tuán)。體內(nèi)常見的胺供體是與肽結(jié)合的賴氨酸，而上述反應(yīng)則提供了肽的交叉結(jié)合。凝結(jié)因子因子XIII(FactorXIII)是在受傷時能實(shí)現(xiàn)血液凝結(jié)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。不同的TGase相互之間也存在差別，例如，對作為底物的蛋白質(zhì)的Gin周圍的氨基酸殘基的要求不同，即根據(jù)鄰近所述Gin殘基的是哪些M酸殘基，不同的TGase將不同的含有谷氨酰胺的肽作為底物。該方面可在待修飾的肽含有多個Gin殘基時得到利用。如果僅僅希望在存在的Gin殘基中的一部分上選擇性地結(jié)合肽，則通iti4擇僅僅接受相關(guān)Gin殘基作為底物的TGase可實(shí)現(xiàn)該選擇性。人類生長激素(hGH)含有11個谷氨酰胺殘基，因此任何TGase介導(dǎo)的hGH的結(jié)合都潛在地受到低選擇性的妨礙。已發(fā)現(xiàn)在某些反應(yīng)條件下，上述兩步結(jié)合反應(yīng)中，hGH在茂原鏈霉菌wokzram^)TGase介導(dǎo)的反應(yīng)中官能化，可以使hGH在兩個位置被官能化，即40-Gln和141-Gln。因此需要鑒定能更特異性地介導(dǎo)hGH官能化的TGase的變體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)在源自于茂原鏈霉菌(S.moMram^)的TGase中取代某些氨基酸殘基能提供更特異性地介導(dǎo)hGH官能化的TGase。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及源自于茂原鏈霉菌(S".wo^raeme)的TGase(SEQIDNo.1),其中至多三個酸性或堿性氨基酸殘基已被其他堿性或酸性氨基酸殘基所取4戈。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉如在SEQIDNo.1中定義的肽，所述肽含有以下一個或多個取代Tyr-75^酸性氨基酸殘基；Tyr-302^堿性氨基酸殘基；以及Asp-304^堿性氨基酸戎基。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的肽的核酸構(gòu)建體。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有編碼本發(fā)明的肽的核酸的載體。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有載體的宿主，所述載體含有編碼本發(fā)明的肽的核酸。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的肽的組合物。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種結(jié)合hGH的方法，所述方法包括使hGH與胺供體在本發(fā)明的肽的存在下進(jìn)行反應(yīng)。圖1顯示了hGH與1,3-二氨基-2-丙醇的TGase催化谷氨酰胺轉(zhuǎn)移的典型CE分析圖。具體實(shí)施方式在本說明書中，術(shù)語"酸性氨基酸殘基"是指pKa低于7的天然氨基酸殘基。具體實(shí)例包括Asp和Glu。在本說明書中，術(shù)語"堿性氨基酸殘基"是指pKa高于7的天然氨基酸殘基。具體實(shí)例包括Tyr、Lys和Arg。在本說明書中，"轉(zhuǎn)氨作用"或類似術(shù)語是指其中谷氨酰胺側(cè)鏈上的氮與來自另一種化合物的氮，尤其是來自于另一含氮親核試劑的氮進(jìn)行交換的反應(yīng)。術(shù)語"結(jié)合"作為名詞是指經(jīng)修飾的肽，即連纟妻有能改變所述肽性質(zhì)的部分的肽。作為動詞，該術(shù)語是指將一部分(moiety)連接到肽上以改變所述肽的性質(zhì)的過程。在本說明書中，術(shù)語"特異性"和"選擇性"可互換，并用于描述相比于hGH中的其他特定谷氨酰胺殘基，TGase優(yōu)先與一個或多個特定谷氨酰胺歹tt反應(yīng)。出于本說明書的目的，相對于hGH中的Gln-141,本發(fā)明的月&tGln-40的特異性根據(jù)在實(shí)施例3中進(jìn)行描述的肽測試的結(jié)果來確定。所述孩i生物茂原鏈霉菌(5^e/tom;/cay附o6ara^1^)也一皮歸類為茂原《連輪絲菌(5^e^wwto〃zw附wMaram^)。從所述生物體中可分離出TGase,該TGase的特征在于相對較低的分子量(38kDa)以及非鈣依賴性。所述源自茂原鏈霉菌mokzramye)的TGase相對地得到很好的描述；例如已解析出其晶體結(jié)構(gòu)(US156956;Appl.Microbiol.Biotech.M,447-454(2004))。一種制備結(jié)合hGH的方法包括hGH和含有官能團(tuán)的胺儉沐之間的第一步反應(yīng)以提供官能化的hGH,所述第一步反應(yīng)由TGase介導(dǎo)(即催化)。在第二步反應(yīng)步驟中，所述官能化hGH進(jìn)一步和能夠與所述已引入的官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的例如PEG或脂肪酸進(jìn)行反應(yīng)從而提供結(jié)合的hGH。所述第一步反應(yīng)和克述如下。X表示官能團(tuán)或者潛在的官能團(tuán)(即通過進(jìn)一步反應(yīng)例如氧化或者水解能轉(zhuǎn)變?yōu)楣倌軋F(tuán)的基團(tuán))。當(dāng)上述反應(yīng)由源自茂原鏈霉菌(Xmo&rae朋e)的TGase介導(dǎo)時，hGH和H2N-X(所述胺供體)之間的反應(yīng)主要發(fā)生在Gln-40和Gln-141?？刹捎蒙鲜龇磻?yīng)用來例如PEG化hGH以獲得半衰期延長的治療性生長激素產(chǎn)品。由于通常希望治療性組合物為單化合物組合物，因此以上討論的特異性的缺乏要求再一步的純化步驟，其中將Gln-40官能化hGH與Gln-141官能化hGH和/或Gln-40/Gln-141雙官能化hGH進(jìn)行分離。相比hGH的Gln-141,本發(fā)明的月;U于Gln-40具有特異性，其與具有如SEQIDNo.1所示的^J^酸序列的肽對Gln-40的特異性并不相同(如實(shí)施例3所測量的，相比于Gln-141而言)。因此，相比于采用具有SEQIDNo.1的^JJ臾序列的TGase的反應(yīng)，本發(fā)明的肽可用在對hGH進(jìn)4亍轉(zhuǎn)谷氨酰胺化的方法中以改變在所述方法中制造的Gln-40官能化hGH或Gln-141官能化hGH的比例。以下是本發(fā)明的實(shí)施方式的非限制性列表。實(shí)施方式l:含有如SEQIDNo.1所定義的序列的分離肽，其中在選自Tyr-75、Tyr-302和Asp-304的一個或多個氨基酸殘基處對所述序列進(jìn)行修飾(modified)。實(shí)施方式2:如實(shí)施方式1所述的分離肽，其中在Tyr-75對所述序列進(jìn)行修飾。實(shí)施方式3:如實(shí)施方式2所述的分離肽，其中Tyr-75被酸性氨基酸殘基取代。實(shí)施方式4:如實(shí)施方式3所述的分離肽，其中Tyr-75被Asp或Glu取代。實(shí)施方式5:如實(shí)施方式4所述的分離肽，其中Tyr-75一皮Glu取代。實(shí)施方式6:如實(shí)施方式1~5中任一項(xiàng)所述的分離肽，其中在Tyr-302對所述序列進(jìn)4刊f飾。實(shí)施方式7:如實(shí)施方式6所述的分離肽，其中Tyr-302被不同于Tyr的堿性氨基酸殘基取代。實(shí)施方式8:如實(shí)施方式7所述的分離肽，其中Tyr-302被Arg或Lys取代。實(shí)施方式9:如實(shí)施方式8所述的分離肽，其中Tyr-302被Arg取代。實(shí)施方式10:如實(shí)施方式1~9中任一項(xiàng)所述的分離肽，其中在Asp-304對所述序列進(jìn)4刊務(wù)飾。實(shí)施方式ll:如實(shí)施方式10所述的分離肽，其中Asp-304被堿性^J^酸絲取代。實(shí)施方式12:如實(shí)施方式11所述的分離肽，其中Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代。實(shí)施方式13:如實(shí)施方式12所述的分離肽，其中Asp-304被Lys取代。實(shí)施方式14:如實(shí)施方式5所述的分離肽，具有如SEQIDNo.2所定義的序列。實(shí)施方式15:如實(shí)施方式9所述的分離肽，具有如SEQIDNo.3所定義的序列。實(shí)施方式16:如實(shí)施方式13所述的分離肽，具有如SEQIDNo.4所定義的序列。實(shí)施方式17:如實(shí)施方式2~13中任一項(xiàng)所述的分離肽，具有如SEQIDNo.5所定義的序列。實(shí)施方式18:具有如SEQIDNo.1所定義的序列的肽，所述肽含有以下一個或多個取代Tyr-75+酸性^^酸歹驢；Tyr-302^非Tyr的堿性^J^酸殘基；以及Asp-304^堿性llJ^酸殘基。實(shí)施方式19:如實(shí)施方式18所述的具有如SEQIDNo.1所定義的序列的肽，所述肽含有以下一個或多個取代Tyr-75^Asp或Glu;Tyr-302">Arg或Lys;以及Asp-304^Tyr、Lys或Arg。實(shí)施方式20:如實(shí)施方式18或?qū)嵤┓绞?9所述的具有如SEQIDNo.1所定義的序列的肽，所述肽含有一個或多個取代Tyr-75^Glu;Tyr-302^Arg;以及Asp-304今Lys。實(shí)施方式21:如實(shí)施方式18-20中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:1所定義，其中包括用Glu取代Tyr-75和用Arg取代Tyr-302。實(shí)施方式22:如實(shí)施方式18-20中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:2所定義。實(shí)施方式23:如實(shí)施方式18-20中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:3所定義。實(shí)施方式24:如實(shí)施方式18-20中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:4所定義。實(shí)施方式25:如實(shí)施方式18所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:5所定義。實(shí)施方式26:如實(shí)施方式1~25中任一項(xiàng)所述的肽，所述肽具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。實(shí)施方式27:如實(shí)施方式1~26中任一項(xiàng)所述的分離肽，相比hGH的Gln-141,所述肽具有對hGH的Gln-40的特異性，這與具有如SEQIDNo.1所示的絲西1^列的月;M目比hGH的Gln-141而言對hGH的Gln-40的特異性并不相同。實(shí)施方式28:如實(shí)施方式27所述的分離肽，相對于hGH的Gln-141,所述月;b^hGH的Gln-40具有特異性，所述特異性高于具有如SEQIDNo.1所示的M酸序列的肽相比hGH的Gln-141而言對hGH的Gln-40的特異性。實(shí)施方式29:相比于hGH的Gln-141,對hGH的Gln-40具有特異性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，所述特異性不同于具有如SEQIDNo:1所示的M^酸序列的月i4目比hGH的Gln-141而言對hGH的Gln-40的特異性。實(shí)施方式30:如實(shí)施方式29所述的相比于hGH的Gln-141,對hGH的Gln-40具有特異性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，所述特異性高于具有如SEQIDNo:1所示的#^酸序列的";M目比hGH的Gln-141而言對hGH的Gln-40的特異性。實(shí)施方式31:編碼如實(shí)施方式1~30中任一項(xiàng)所述的肽的核酸構(gòu)建體。實(shí)施方式32:含有實(shí)施方式31的核酸構(gòu)建體的載體。實(shí)施方式33:含有實(shí)施方式32的載體的宿主。實(shí)施方式34:含有如實(shí)施方式1~30中任一項(xiàng)所述的肽的組合物。實(shí)施方式35:—種結(jié)合hGH的方法，其中所述方法包括4吏所述hGH和胺供體在如實(shí)施方式1~30中任一項(xiàng)所述的肽的存在下進(jìn)4亍反應(yīng)。實(shí)施方式36:如實(shí)施方式35所述的結(jié)合hGH的方法，其中，與在位點(diǎn)Gln-141結(jié)合的hGH量相比在位點(diǎn)Gln40結(jié)合的hGH量,和采用具有如SEQIDNo.1所示的^J^酸序列的肽替代如實(shí)施方式1~30中任一項(xiàng)所述的肽用于所述方法時與在位點(diǎn)Gln-141結(jié)合的hGH量相比在位點(diǎn)Gln-40結(jié)合的hGH量進(jìn)行比較明顯增加。實(shí)施方式37:如實(shí)施方式1~30中任一項(xiàng)所述的肽在制備結(jié)合hGH中的用途。實(shí)施方式38:如實(shí)施方式37所述的用途，其中所述hGH在位點(diǎn)Gln-40進(jìn)行結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽4支Gln-141而言的對Gln-40的特異性高于具有如SEQIDNo.1所示的ll^酸序列的肽較Gln-141而言的對Gln-40的特異性，結(jié)果使得在使用此處描述的TGase的轉(zhuǎn)谷氨酰胺反應(yīng)中較Gln-141而言的Gln-40的產(chǎn)量增加。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽4支Gln-141而言的對Gln-40的特異性為具有如SEQIDNo.1所示的JlJ^交序列的肽較Gln-141而言的對Gln-40的特異性的至少1.25倍高，例如至少1.50倍高，例如至少1.75倍高，例如至少2.0倍高，例如至少2.54咅高，例如至少3.(H咅高，例如至少3.54咅高，例如至少4.0倍高，例如至少4.5倍高，例如至少5.0倍高，例如至少5.5倍高，例如至少6.0倍高，例如至少6.5倍高，例如至少7.0倍高，例如至少7.5倍高，例如至少8.0倍高，例如至少8.5倍高，例如至少9.0倍高，例如至少9.5倍高，例如至少10.0倍高。如果采用如SEQIDNo.2定義的序列，將主要得到Gln-141官能化hGH,而僅得到可忽略量的Gln-40官能化hGH或者Gin-40/Gln-141雙官能化hGH。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有如SEQIDNo.1定義的MJ臾序列的肽，在所述序列中，Tyr-75已被Asp或Glu取代，和/或Tyr-302已被Arg或Lys取4戈；和/或Asp-304已被Tyr、Lys或Arg取4戈。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有如SEQIDNo.1定義的tt酸序列的肽，其中Tyr-75已被Glu取代；和/或Tyr-302已被Arg取代；和/或Asp-304已被Lys取代。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有如SEQE)No.2定義的JlJ^酸序列的肽，所述SEQEDNo.2為具有Tyr-75^Glu取代的SEQIDNo.1。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有如SEQIDNo.3定義的tt酸序列的肽，所述SEQIDNo.3為具有Tyr-302^Arg取代的SEQIDNo.1。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有如SEQIDNo.4定義的M酸序列的肽，所述SEQIDNo.4為具有Asp-304^Lys取代的SEQIDNo.1。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有如SEQEDNo.5定義的^J^酸序列的肽，所述SEQIDNo.5為具有Tyr-75^Glu取代，Tyr-302^Arg取代和Asp-304">Lys取代的SEQIDNo.1。根據(jù)在US5,156,956中描述的分析檢驗(yàn)進(jìn)行測定，本發(fā)明的月錄現(xiàn)出TGase活性。簡述之，指定肽的活性測量是通過進(jìn)4亍以下過程進(jìn)4亍的，即在不存在Ca^的情況下采用千七-谷氨酰甘氨酸和羥胺作為底物進(jìn)行反應(yīng)，在三氯乙酸的存在下形成與所得羥肟酸結(jié)合的鐵復(fù)合物，測量525nm下的吸光度并通過校準(zhǔn)曲線測定羥肟酸的量從而計算所述活性。為了本說明書的目的，在所述分析檢驗(yàn)中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的肽被認(rèn)為是具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。具體而言，本發(fā)明的TGase變體表現(xiàn)出的活性高于源自茂原鏈霉菌(S.wo^ramse)的TGase的活性的30%,例如高于50%，例如高于70%,例如高于90%。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含具有SEQIDNo.:2、3、4或5中任一序列的多肽的組合物。本發(fā)明的肽可按照不同方法進(jìn)行制備。所述肽可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的蛋白質(zhì)合成方法進(jìn)行制備。由于所述肽的大小，更方便的是通過合成所述肽的幾個片,殳，然后將其連接形成本發(fā)明的肽。然而，在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽通過含有編碼本發(fā)明的肽的核酸的適宜宿主的發(fā)酵而制備。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的肽的核酸構(gòu)建體。在此處所使用的術(shù)語"核酸構(gòu)建體"是指任何cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA來源的核酸分子。術(shù)語"構(gòu)建體"是指可以是單鏈或雙鏈的核酸片段，并且可以基于對感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的完整或者部分天然核苷酸序列。所述構(gòu)建體可以任選地含有其他核酸片段。編碼本發(fā)明的肽的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可適宜地為基因組或cDNA來源，例如通過以下過程獲得，即制備基因組或cDNA庫，并通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)采用合成寡聚核苷酸探針的雜交從而對編碼完整或部分蛋白質(zhì)的DNA(參見J.Sambrooketal，1989，A/o/ecw/"rC7o/7z'"g，J^^""2^,，2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)并通過引入本領(lǐng)域已知的相關(guān)的突變來進(jìn)行篩選。編碼所述蛋白質(zhì)的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體也可通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetters22,1859-1869(1981)所描述的phosphoamidite法，或者M(jìn)atthes等，EMBOJournal》，801-805(1984)描述的方法。根據(jù)所述phosphoamidite法，在例如自動DNA合成儀中合成寡聚核苷酸，純化，退火，連接，并在合適的載體中克隆。此外，所述核酸構(gòu)建體可以是混合的合成和基因組、混合合成和cDNA或者混合基因組和cDNA來源，這是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成、基因組或cDNA來源(適當(dāng)?shù)?的片段制備而成的，所述片l殳對應(yīng)于整個核酸構(gòu)建體的不同部分。所述核酸構(gòu)建體也可采用特定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，例如在US4,683,202或Saiki等,Science239，487-491(1988)中所描述。所述核酸構(gòu)建體優(yōu)選為DNA構(gòu)建體，在下文中將唯一使用該術(shù)語。在其他方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的重組載體。其中插入有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是任何能方便地進(jìn)行重組DNA過程的載體，并且所述載體的選擇通常取決于其將導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是自主復(fù)制載體，即以基因組外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于基因組復(fù)制，例如質(zhì)粒。作為另外一種選擇，所述載體可以是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時整合到宿主細(xì)胞基因組中并與其整合入的染色體一起進(jìn)行復(fù)制的載體。所述載體優(yōu)選為表達(dá)載體，其中所述編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA序列與DNA轉(zhuǎn)錄所必需的其他片段可操作地相連。通常，所迷表達(dá)載體源自于質(zhì)?；虿《綝NA,或者含有二者的元件。術(shù)語"可操作地連接"指所述片段經(jīng)設(shè)置使得與其預(yù)期目的相一致的發(fā)揮功能，例如轉(zhuǎn)錄在啟動子內(nèi)啟始并沿編碼所述蛋白質(zhì)的DNA序列進(jìn)4亍。所述啟動子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可來源于與所述宿主細(xì)胞同源或異源的編碼蛋白質(zhì)的基因。的啟動子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.塑，12073-12080(1980);AlberandKawasaki,J.Mol.Appl.Gen.丄，419-434(1982))或醇脫氫酶基因(Young等,inGeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals(Hollaenderetal,eds.)，PlenumPress,NewYork，1982)或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，Nature304,652-654(1983))啟動子。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的適宜啟動子的實(shí)例是例如ADH3啟動子(McKnight等，TheEMBOJ.4,2093-2099(1985))或tpiA啟動子。其他有用的啟動子的實(shí)例是來自編碼米曲霉他卡淀粉酶(ATAKAamylase)、米黑才艮毛霉天冬氨酸蛋白酶(A/z&o附wcor/w'e/za'asparticproteinase)、黑曲霉中性a-淀粉酶(Aneutrala-amylase)、黑曲霉酸穩(wěn)定ot-淀粉酶(Aacidstablea-amylase)、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(Am'geroravramonglucoamylase)(gluA)、米黑才艮毛霉月旨肪酶(i^/zzzo-mwcor脂'e/2e"ipase)、米曲霉械性蛋白酵(爿."zaealkalineprotease)、米曲霉石舞酉臾丙if唐異計勾酶(Atriosephosphateisomerase)或才勾巢曲霉乙酰胺酶(Am血/amacetamidase)的基因的啟動子。優(yōu)選的是卡他淀粉酶和gluA啟動子。在細(xì)菌宿主細(xì)胞中使用的適宜啟動子的實(shí)例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌(5acz〃uyWeaTOAeww/^z/i^)麥芽糖淀4分酶基因，地衣芽孢桿菌(Sa"'〃ws/zc/^w/w7w;y)a-淀粉酶基因，淀粉芽孢桿菌(謹(jǐn)y/o/一咖czera)BAN淀粉酶基因，枯草桿菌(Sa"〃w"M"fo)堿性蛋白酶基因，或者短小芽孢桿菌(Stt"〃w/wwz7w5)木糖普酶基因的啟動子，或者噬菌體LambdaPR或PL啟動子或大腸4干菌(E.coli)lac、trp或tac啟動子。如果必需，編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA序列也可與適宜的終止子可操作地相連，諸如人類生長激素終止子(Palmiter等，op.cit.)或(對真菌宿主而言)TPI1(AlberandKawasaki，op.cit.)或ADH3(McKnight等，op.cit.)終止子。所述載體可進(jìn)一步含有元件諸如聚腺苷酸化信號(例如來自SV40或腺病毒5Elb區(qū)域)，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列(例如SV40增強(qiáng)子)和翻譯增強(qiáng)子序列(例如編碼腺病毒VARNA的翻譯增強(qiáng)子序列)。本發(fā)明的重組載體可進(jìn)一步含有能使所述載體在被討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。當(dāng)所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞時，能使所述載體進(jìn)行復(fù)制的適宜序列是酵母質(zhì)粒2n復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞時，能使所述載體進(jìn)行復(fù)制的序列是DNA聚合酶m復(fù)合體編碼基因和復(fù)制起點(diǎn)。所述載體還可以含有可選擇的標(biāo)記，例如基因，其產(chǎn)物與宿主細(xì)胞中的缺陷互補(bǔ)，諸如編碼二氳葉酸還原酶(DHFR)或栗酒裂殖酵母TPIgene(P.R.Russell,Gene迎，125-130(1985)所描述)，或者能賦予對藥物，例如氨千青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蟲萊呤的抗性的基因。對于絲狀真菌，可選擇的標(biāo)記包括amdS、pvrG、argB、niaD和sC。為將本發(fā)明的蛋白質(zhì)導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞的分泌途徑，在所述重組載體中可"^供分泌信號序列(也已知為前導(dǎo)序列(leadersequence)、前序列(preprosequence或presequence))。所述分泌信號序列在正確的閱讀框內(nèi)連接到編碼所述蛋白質(zhì)的DNA序列上。分泌信號序列通常位于編碼所述蛋白質(zhì)的DNA序列的5'端。所述分泌信號序列可與所述蛋白質(zhì)正常聯(lián)合或者來自編碼其他分泌蛋白質(zhì)的基因。為從酵母細(xì)胞中分泌，所述分泌信號序列可編碼任何信號肽，所述信號肽確保將所表達(dá)的蛋白質(zhì)高效地導(dǎo)入所述細(xì)胞的分泌途徑。所述信號肽可以是天然生成的信號肽，或者其功能部分，或者它可以是合成肽。已發(fā)現(xiàn)適宜的信號肽是ot-因子信號肽(參見US4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶的信號肽(參見O.Hagenbuchle等，Nature289,643-646(1981))，改進(jìn)羧肽^[言號肽(參見L.A.Valls等，CellII,887-897(1987)),酵母BAR1信號肽(參見WO87/02670)，或者酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等，Yeasty127-137(1990))。為在酵母中有效分泌，編碼前導(dǎo)肽的序列也可插入在所述信號序列的下游和編碼所述蛋白質(zhì)的DNA序列的上游。所述前導(dǎo)序列的功能是使所表達(dá)的蛋白質(zhì)能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入高爾基體并^i^進(jìn)入分泌嚢泡從而分泌^培養(yǎng)基(即所述蛋白質(zhì)跨細(xì)胞壁輸出或者至少通過細(xì)胞膜iiTv所述酵母細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)空間)。所述前導(dǎo)肽可以是酵母a-因子前導(dǎo)肽(其使用在例如US4,546,082、EP16201、EP123294、EP123544和EP163529得以描述)。作為另外一種選擇，所述前導(dǎo)肽可以是合成前導(dǎo)肽，也就說未在自然界中發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)肽。例如，合成前導(dǎo)肽可按照WO89/02463或WO92/11378的描述進(jìn)行構(gòu)建。為在絲狀真菌中使用，所述信號肽可方便地來源于編碼曲霉屬物種(^y/^g,〃ztfsp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼米黑根毛霉(K/^omwcw而'e/zez)月旨肪酶或蛋白酶或高溫毛殼霉(//w脂'co/a/a做gz"(w")月旨肪酶的基因。所述信號肽優(yōu)選來源于編碼米曲霉(Awy加e)他卡淀粉酶、黑曲霉(」.中性a-淀粉酶、黑曲霉U.酸穩(wěn)定淀粉酶或黑曲霉U.葡糖淀粉酶的基因。用于分別連接編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA序列、所述啟動子和可選的終止子和/或分泌信號序列，并將其插入含有復(fù)制必需信息的合適載體中的過程對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是/^口的(參見，例如Sambrook等，op.cit.).將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞可以是任何能制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高級真核細(xì)胞。在經(jīng)過培養(yǎng)后能制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例是革蘭氏陽性菌例如桿菌(^^7/^)林諸如枯草芽孢桿菌(S.sw^fo)、地衣芽孢桿菌(S.//c/zew/o，w)、緩慢芽孢桿菌(S./e對m)、短小芽孢桿菌(及Z^t^)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(丑WearaAermo//n7m)、嗜堿芽孢桿菌(丑a汰a/o//H7u)、水解淀4分芽孢桿菌(S.)、凝結(jié)芽孢桿菌(S.coagw/a朋)、4灸裝芽孑包斗干菌"'rcw/a"s)、及/awfus、巨大芽孑包才干菌(B.meg加/zermm)或蘇云金芽孢桿菌//2w〃"gwraw)的菌4朱，或者鏈霉菌()4朱諸如5"./h^/"ra或S.ww〃m^，或者革蘭氏陰性菌諸如大腸才干菌(ic/zenc/2Z(2co/,)。按照本身已知的方式通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或者采用感受態(tài)細(xì)胞能實(shí)現(xiàn)所述細(xì)菌的轉(zhuǎn)化(參見Sambrook等，supra).其他合適的宿主包括S.mo&raerae、S/zW聽和C.g/wto薩謂(Appl.Microbiol.Biotechnol.^4,447畫454(2004))。當(dāng)在細(xì)菌諸如大腸桿菌(EcW)中表達(dá)蛋白質(zhì)時，所述蛋白質(zhì)可保留在細(xì)胞質(zhì)中，通常為不溶性顆粒(稱之為內(nèi)含體)，或者可通過細(xì)菌分泌序列導(dǎo)入細(xì)胞周質(zhì)空間。在前一種情況下，所述細(xì)胞凈支溶解并收集所述顆粒并使之變性，隨后通過稀釋所述變性劑使所述蛋白質(zhì)重新折疊。在后一種情況下，通過例如超聲波降解或滲透壓沖擊(osmoticshock)使細(xì)胞破裂從而釋放細(xì)胞周質(zhì)空間中的內(nèi)容物并收集所述蛋白質(zhì)，從而從所述細(xì)胞周質(zhì)空間中收集所述蛋白質(zhì)。合適的酵母細(xì)月包的實(shí)例包才舌iS^cc/Mfraw^cas*spp.、5b/nzaracc/2(3raw_ycesspp.,尤其是酉良酒酵母(S"cc/zara附y(tǒng)ce《cewW&ae)或5"(2c'c/z"ra附3;casA:/z^yven.菌抹。用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并由此制造異源蛋白質(zhì)的方法在US4,599,311、US4,931,373、US4，870,008、US5，037,743和US4,845,075中進(jìn)行描述，將其全部在此以引用的方式引入。通過由可選擇的標(biāo)記，通常為耐藥性或者在缺乏特定營養(yǎng)物例如亮氨酸的情況下生長的能力確定的表型選牙奪轉(zhuǎn)化細(xì)胞。優(yōu)選的用在酵母中的載體是在US4,931,373中公開的POT1載體。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA序列之前可以有信號序列以及可選的前導(dǎo)序列，如上所述。合適的酵母細(xì)胞的其他實(shí)例是克魯維酵母(A7甲eTOmyc^)菌抹諸如乳酸克魯維酵母(〖/acto),漢遜酵母(T/朋^mi")諸如多形漢遜酵母(///70/>W0^7/z"),或畢赤酵母(尸ZC/^)諸如巴斯得畢赤酵母(尸./7^ton;y)(參見Gleeson等，J.Gen.Microbiol.巡，3459-3465(1986);US4,882,279)。其他真菌細(xì)胞的實(shí)例是絲狀真菌細(xì)胞，例如曲霉屬U^wgz7/^spp.)、鏈孑包霉屬(臉wras/7oraspp..)、嫌刀霉屬(Fura"'廳spp.)或木霉屬(7Wc/2(%/e/77aspp.),尤其是米曲霉(vl07zae)、構(gòu)巢曲霉U.mtMara)或黑曲霉(vl"&er)菌抹。采用曲霉(A^wgV/uyspp.)以表達(dá)蛋白質(zhì)在例如EP2722"和EP230023中得以描述。例如，尖孢鐮刀菌(Fojqwwwm)的轉(zhuǎn)化可按照Malardier等Gene2^,147-156(1989)的描述進(jìn)行。當(dāng)采用絲狀真菌作為宿主細(xì)胞時，可使用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，簡便地通過將所述DNA構(gòu)建體整合到所述宿主染色體中以得到重組宿主細(xì)胞。所述整合通常被認(rèn)作優(yōu)點(diǎn)，這是由于所述DNA序列更可能穩(wěn)定地保留在所述細(xì)胞中。可按照傳統(tǒng)方法例如通過同源或異源重組將所述DNA構(gòu)建體整合進(jìn)入所述宿主染色體。以上描述的轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞隨后在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在允許本發(fā)明的肽表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在此之后從所述培養(yǎng)基中收集所得蛋白質(zhì)。用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于生長所述宿主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，諸如含有適當(dāng)補(bǔ)充物的最小或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可由商業(yè)供應(yīng)商纟是供或者纟艮據(jù)7>開的配方制備(例如在AmericanTypeCultureCollection的目錄中)。然后可通過常規(guī)手段從所述培養(yǎng)基中回收由所述細(xì)胞制造的蛋白質(zhì)，包括通過離心或過濾從所述培養(yǎng)基中分離所述宿主細(xì)胞，通過鹽例如碌u酸4妄沉淀所述上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)成分，通過各種色譜方法，例如離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親合色譜等進(jìn)行純化，取決于所討論的蛋白質(zhì)的類型。所有參考文獻(xiàn)，包括此處引用的出版物、專利申請和專利在此以引用的方式整體引入，并達(dá)到如同每篇參考文獻(xiàn)在此被個別地、具體地指明以引用的方式引入并闡明其全部內(nèi)容的相同的程度(至法律所允許的最大范圍)，在描述本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語"a","an"和"the"以及類似詞語應(yīng)解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非另外指出或者與內(nèi)容明顯相4氐觸。例如，短語"所述化合物"應(yīng)被理解為指代本發(fā)明的各種"化合物"或者具體描述的方面，除非另外指明。除非另外指明，所有在此提供的精確數(shù)值是對應(yīng)的近似數(shù)值的代表(例如，關(guān)于特定因子或者測量而提供的所有精確示例性數(shù)值可被視為還提供了相應(yīng)的近似測量結(jié)果，在適當(dāng)時，可以用"大約，，進(jìn)行修飾)。此文中，使用諸如"包含，，、"具有，，、"包括"、"含有"等術(shù)語的關(guān)于一個或多個要素的本發(fā)明的任何方面的描述旨在提供對"由該特定要素構(gòu)成的"、"基本由該特定要素構(gòu)成的"或"基本包含該特定要素的"本發(fā)明的相似方面的支持，除非另外說明或者明顯與上下文相纟氐觸(例如，此處描述為包含特定要素的組合物應(yīng)當(dāng)理解為描述由該要素構(gòu)成的組合物，除非另外說明或者明顯與上下文相^Jt蟲)。實(shí)施例實(shí)施例1hGH的PEG化a)hGH溶解在磷酸鹽緩沖液(50mM，pH8.0)中。該溶液與溶解在磷酸鹽緩沖液(50mM,1ml，pH8.0,在溶解所述胺M之后用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0)中的胺供體例如1,3-二M-丙-2-醇的溶液相混合。最后，加入溶解在磷酸鹽緩沖液(50mM,pH8.0,1ml)中的TGase(~40U)溶液，并加入磷酸鹽緩沖液(50mM,pH8)調(diào)節(jié)體積為10ml。合并所得的混合物在37。C溫育大約4小時。降低溫度至室溫并加入N-乙基-馬來酰亞胺(TGase抑制劑)至1mM的最終濃度。在另外1小時^后，用10倍體積的tris緩沖液(50mM,pH8.5)稀釋所述混合物。b)如果在所述胺供體中存在潛在的官能團(tuán)，則由a)所得的轉(zhuǎn)氨hGH可任選地進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)以對該官能團(tuán)進(jìn)行活化。c)由a)或b)所得到的官能化hGH隨之和能夠與引入hGH的官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的適當(dāng)官能化的PEG進(jìn)行反應(yīng)。舉例，可通過使羰基部分(醛或酮)與烷氧胺進(jìn)行反應(yīng)形成肟鍵。實(shí)施例2TGase特異性分牙斤I所描述的方法可用于測定所述hGH中的Gln殘基，所述hGH已在如實(shí)施例1所描述的反應(yīng)中被改變。也就是說此處所描述的方法可用于測定本發(fā)明的TGase的選擇性。確定PEG化位點(diǎn)采用離子交換色譜和凝膠過濾的組合純化在實(shí)施例1中得到的單PEG化hGH。為確定PEG化的位點(diǎn)，所純化的化合物用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺進(jìn)行還原和烷J^化。隨后，用非特異性蛋白酶，蛋白酶K消化所述化合物，然后使用乙腈/TFA緩沖液體系在反相C-18HPLC柱分離所得消化物。在這些條件下，PEG化肽將明顯晚于非PEG化肽被洗脫出，此外所有PEG化肽(如果有多于一種時)將在同一峰中被洗脫出，這是由于PEG化肽的保留時間主要取決于所述PEG部分。收集含有PEG化肽的峰，并采用自動Edman分析進(jìn)行氨基酸測序。所得結(jié)果同時4是供了關(guān)于PEG化的準(zhǔn)確位置-PEG化氨基酸將在測序分析中形成空白循環(huán)-和存在的肽的數(shù)目以及相對量的信息，因此揭示了是否在多處位點(diǎn)發(fā)生PEG化。實(shí)施例3測試TGase突變體對hGH中Gln-141VSGln-40的特異性20jal1,3-二^J^-2-丙醇(180mg/ml在10mM磷酸鹽緩沖液中，通iti口入濃HCl調(diào)節(jié)pH至8.3)加入到在10mM磷酸鹽緩沖液pH8.1(50)中的hGH(1mg)溶液中。以使最終反應(yīng)混合物體積為100|ul的量加入10mM磷酸鹽緩沖液。通過加入所述酶(最終濃度0.07至7|uM)開始反應(yīng)。所述反應(yīng)混合物在37。C溫育，反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳(CE)。向所述反應(yīng)混合物的等分試樣(10)ul)中加入N-乙基馬來酰亞胺100mM(l|ul)。所述混合物在環(huán)境溫度下溫育5分鐘，然后在CE分析之前在H20中稀釋IOO倍。4吏用AgilentTechnologies3D-CE系統(tǒng)(AgilentTechnologies)進(jìn)4亍CE。使用AgilentTechnologies3DCEChemStation進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和信號處理。所述毛細(xì)管為來自安捷倫(Agilent)的長64.5cm(56.0cm有效長度)內(nèi)徑50|um的"ExtendedLightPathCapillary"。在200塑下進(jìn)4亍UV4全測(16nmBw,參比380nm和50nmBw)。所述流動電解液是磷酸鹽緩沖液50mMpH7.0。所述毛細(xì)管用0.1MNaOH處理3分鐘，隨后用Milli-Q水處理2分鐘，用所述電解液處理3分鐘。在每次運(yùn)行后，用milli-Q水沖洗毛細(xì)管2分鐘，然后用磷酸沖洗2分鐘，用milli-Q水沖洗兩分鐘。液流注射在50mbar下歷經(jīng)4.0秒鐘完成。電壓為+25kV。毛細(xì)管溫度為30。C。運(yùn)行時間為10.5分鐘。圖1顯示了hGH與1,3-二M-2-丙醇的TGase催化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移的典型CE分析圖。調(diào)節(jié)酶量使得單轉(zhuǎn)氨產(chǎn)物量在5小時的反應(yīng)時間內(nèi)達(dá)到最大值。反應(yīng)速率的指標(biāo)可由半數(shù)的底物hGH已被轉(zhuǎn)氨化所需的時間表示。表1顯示了對于選定的TGase的結(jié)果表l<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>WT具有SEQIDNo.1的氨基酸序列的TGaseY75E具有SEQIDNo.2的氨基酸序列的TGaseY302R具有SEQIDNo.3的氨基酸序列的TGaseY75E,Y302R如SEQIDNo.1所定義的TGase,其中Tyr-75已一皮Glu取代，Tyr-302已被Arg取代權(quán)利要求1.含有SEQIDNo.1所定義的序列的分離肽，其中在選自Tyr-75、Tyr-302和Asp-304的一個或多個氨基酸殘基處所述序列被修飾。2.權(quán)利要求l所述的分離肽，其中在Tyr-75處所述序列被修飾。3.權(quán)利要求2所述的分離肽，其中Tyr-75被酸性M酸歹緣取代。4.權(quán)利要求3所述的分離肽，其中Tyr-75被Asp或Glu取代。5.權(quán)利要求4所述的分離肽，其中Tyr-75被Glu取代。6.權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的分離肽，其中在Tyr-302處所述序列被修朱7.權(quán)利要求6所述的分離肽，其中Tyr-302被不同于Tyr的堿性M酸歹錄取代。8.權(quán)利要求7所述的分離肽，其中Tyr-302被Arg或Lys取代。9.權(quán)利要求8所述的分離肽，其中Tyr-302被Arg取代。10.權(quán)利要求19中任一項(xiàng)所述的分離肽，其中在Asp-304對所述序列進(jìn)行修飾。11.權(quán)利要求IO所述的分離肽，其中Asp-304被堿性氨基酸殘基取代。12.權(quán)利要求ll所述的分離肽，其中Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代。13.權(quán)利要求12所述的分離肽，其中Asp-304被Lys取代。14.權(quán)利要求5所述的分離肽，具有SEQIDNo.2所定義的序列。15.權(quán)利要求9所述的分離肽，具有SEQIDNo.3所定義的序列。16.權(quán)利要求13所述的分離肽，具有SEQIDNo.4所定義的序列。17.權(quán)利要求2~13中任一項(xiàng)所述的分離肽，具有SEQIDNo.5所定義的序列。18.包含SEQE)No.1所定義的序列的肽，所述肽包含以下一個或多個取代Tyr-75^酸性氨基酸殘基；Tyr-302^非Tyr的堿性氨基酸殘基；以及Asp-304^堿性^^酸歹鎮(zhèn)。19.權(quán)利要求18所述的具有SEQIDNo.1所定義的序列的肽，所述肽包含以下一個或多個取代Tyr-75+Asp或Glu;Tyr-302—Arg或Lys;以及Asp-304^Tyr、Lys或Arg。20.權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的具有SEQIDNo.1所定義的序列的肽，所述肽包含一個或多個取代Tyr-75^Glu;Tyr-302^Arg;以及Asp-304^Lys。21.權(quán)利要求1820中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.1所定義，其中包括用Glu取代Tyr-75和用Arg取代Tyr-302。22.權(quán)利要求1820中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.2所定義。23.權(quán)利要求18~20中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.3所定義。24.權(quán)利要求18~20中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.4所定義。25.權(quán)利要求18所述的肽，其中所述序列如SEQEDNo.5所定義。26.權(quán)利要求1~25中任一項(xiàng)所述的肽，所述肽具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。27.4又利要求1~26中任一項(xiàng)所述的分離肽，相比hGH的Gln-141,所述肽具有對hGH的Gln-40的特異性，這與具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的月;M目比hGH的Gln-141而言對Gln-40的特異性并不相同。28.權(quán)利要求27所述的分離肽，相對于hGH的Gln-141,所述月b于hGH的Gln-40具有特異性，所述特異性高于具有SEQIDNo.1所示的M酸序列的肽相比hGH的Gln-141而言對Gln-40的特異性。29.相比于hGH的Gln-141,對hGH的Gln-40具有特異性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，所述特異性不同于具有SEQIDNo.1所示的^llJ^酸序列的肽相比hGH的Gin-141而言對Gln-40的特異性。30.權(quán)利要求29所述的相比于hGH的Gln-141,對hGH的Gln-40具有特異性的轉(zhuǎn)谷氨酖胺酶，所述特異性高于具有SEQIDNo.1所示的#^@踏列的肽相比hGH的Gln-141而言對Gln-40的特異性。31.編碼權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)所述的肽的核酸構(gòu)建體。32.含有權(quán)利要求31的核酸構(gòu)建體的載體。33.含有權(quán)利要求32的載體的宿主。34.含有權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)所述的肽的組合物。35.—種結(jié)合hGH的方法，其中所述方法包括使hGH和胺供體在權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)所述的肽的存在下進(jìn)行反應(yīng)。36.權(quán)利要求35所述的結(jié)合hGH的方法，其中，與在位點(diǎn)Gln-141結(jié)合的hGH量相比的在位點(diǎn)Gln-40結(jié)合的hGH量，和在所述方法中采用具有SEQIDNo.1所示的^J^酸序列的肽替代權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)所述的肽時與在位點(diǎn)Gln-141結(jié)合的hGH量相比的在位點(diǎn)Gln-40結(jié)合的hGH量相比明顯增加。37.權(quán)利要求1~30中任一項(xiàng)所述的肽在制備結(jié)合hGH中的用途。38.權(quán)利要求37所述的用途，其中所述hGH在位點(diǎn)Gln-40被結(jié)合。全文摘要在位點(diǎn)Tyr-75、Tyr-302或Asp-304處具有一個或多個取代的源自于茂原鏈霉菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。文檔編號C12N9/10GK101263225SQ200680030084公開日2008年9月10日申請日期2006年8月18日優(yōu)先權(quán)日2005年8月18日發(fā)明者L·諾斯科夫-勞里特森,N·L·J·約翰森申請人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司