專利名稱：核酸的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從生物材料中提取核酸的方法。
技術(shù)背景核酸的提取方法主要分為兩種，即在溶液狀態(tài)下進(jìn)行提取的方法 以及固體材料介入的方法，在后一種方法中，通過使含有核酸的溶液 與該固體材料接觸而使得所述核酸被吸附，并對所述核酸進(jìn)行洗滌， 然后再使所述核酸解吸附。在溶液狀態(tài)下進(jìn)行提取核酸的方法中，最早使用的提取方法是通 過將經(jīng)乙醇沉淀后的核酸粘著在玻璃棒上來進(jìn)行的。這種方法雖然非 常方便，但是在產(chǎn)率和純度方面存在較大的問題。作為改善上述問題的方法，例如在提取RNA時，已知有下列方 法P. D. Siebert禾口 A. Chenchik在Nucleic Acids Res., 21, 2019-2020 (1993)中所描述的AGPC (酸胍-酚-氯仿)法，在該方法中，通過加入 異硫氰酸胍使細(xì)胞裂解，然后在酸性條件下使用苯酚來除去共存的 DNA;以及胍-氯化銫離心方法，該方法利用了 RNA的浮游密度高于 DNA和蛋白質(zhì)。然而，這些方法有許多缺點(diǎn)，例如需要使用有毒的 有機(jī)化合物(例如苯酚和氯仿)，難以回收分子量較小的RNA，需 要復(fù)雜的操作以及需要熟練的技術(shù)來進(jìn)行精確的提取。作為改善所述這些缺點(diǎn)的方法，已經(jīng)開發(fā)出這樣的方法，其中通過使用能夠抑制核酸酶或類似的酶(其能夠促進(jìn)核酸的降解)的硫氰 酸胍或類似的離液鹽來使細(xì)胞裂解、并向其中加入乙醇，從而制備出 裂解物溶液；使該裂解物溶液與能夠吸附核酸的二氧化硅或類似的固 體材料接觸；對該材料進(jìn)行洗滌；然后使核酸解吸附(R.Boom等， Journal of Clinical Microbiology, 28， 495-503 (1990))。作為另外一種方法，已經(jīng)開發(fā)出利用磁性二氧化硅顆粒的核酸提取方法，并且對該方法的反應(yīng)效率和洗滌效率進(jìn)行了改進(jìn)。此外，己經(jīng)開發(fā)出利用多孔膜的核酸提取方法(JP-A-2003-128691)，這樣可以通過簡便的方法在短時間內(nèi)獲得高純度的核酸。發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種分離和純化核酸的方法，在該方 法中，分析物中的核酸被固相的表面所吸附，然后通過洗滌等步驟使 該核酸解吸附。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用固相來分離和純 化核酸的方法，該方法具有優(yōu)異的分離性能和良好的洗滌效率，并且 容易操作，而且采用該方法能夠大規(guī)模生產(chǎn)出具有基本上相同的分離 性能的物質(zhì)，此外，本發(fā)明的另一個目的是提供一種適用于實(shí)施所述 方法的核酸分離純化單元。本發(fā)明的另外一個目的是通過使用無需特 殊技術(shù)、復(fù)雜操作和特殊裝置的小型裝置來方便快捷地分離和純化核酸。本發(fā)明的再一個目的是在進(jìn)行提取操作時通過改善堵塞來實(shí)現(xiàn)在 保持高收率和高純度的同時改善裂解物溶液和洗滌液的穿過速率。本發(fā)明的目的在于通過以下方法來分離和純化核酸，所述方法為 使生物材料裂解；并使該生物材料中所含的核酸成分與容器接觸，所 述容器是通過將諸如多孔膜之類的固體材料固定在容器(例如柱)中 制備而成的。本發(fā)明涉及可以用于以下條件的方法，所述條件為可以 使裂解物溶液和洗滌液的穿過時間縮短，同時，可以使在常規(guī)方法中 由于發(fā)生堵塞而不能穿過的細(xì)胞種類和細(xì)胞個數(shù)在不發(fā)生堵塞的條 件下穿過。為了開發(fā)出這樣的方法，使用分散介質(zhì)(特別是磷酸鹽緩 沖液或Bis-Tris緩沖液)對以下多種條件進(jìn)行試驗(yàn)，所述條件例如有 在具有使生物材料發(fā)生裂解的作用的裂解液中的表面活性劑和離液 鹽的濃度；在加入裂解液之后進(jìn)行的移液操作；在加入水溶性有機(jī)溶 劑之后進(jìn)行的攪拌操作；其中密封有固體材料的柱，例如通過將多孔 膜密封于具有兩個開口的容器中而制得的核酸分離純化柱；密封于所 述柱中的膜的孔徑，最后發(fā)現(xiàn)通過聯(lián)合使用所述的這些條件可以達(dá)到 上文所述的目的，由此完成本發(fā)明。即，本發(fā)明由以下內(nèi)容構(gòu)成。 (1) 一種核酸的提取方法，該方法包括(a) 通過以下步驟(i)或(ii)制備含有溶液的生物材料步驟(i)，制備含有磷酸鹽緩沖液或Bis-Tris (N，N-雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷)緩沖液的生物材料；或步驟(ii)，用Bis-Tris緩沖液替換生物材料中所含有的 緩沖液；(b) 通過使所述的生物材料與裂解液接觸來使該生物材料溶解， 并溶出該生物材料中所含有的核酸；(c) 通過向由步驟(b)制得的含有溶出的核酸的溶液中加入水 溶性有機(jī)溶劑來制備裂解物溶液；(d) 通過使所述的裂解物溶液與固體材料接觸來使得該裂解物 溶液中所含有的核酸被所述的固體材料吸附；(e) 洗掉殘留在所述的固體材料中的除了待提取的核酸之外的 雜質(zhì)、和裂解液；以及(f) 通過回收液使被吸附的核酸從所述固體材料上解吸附。(2) 如上述(1)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(a)中的所述溶液為分散介質(zhì)。(3) 如上述(1)或(2)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(a)中的所述溶液的濃度為0.01摩爾/升至10摩爾/升、pH為3至9。(4) 如上述(1)至(3)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(b)中的所述裂解液含有離液鹽。(5) 如上述(4)所述的核酸提取方法， 其中所述離液鹽的濃度為0.1摩爾/升至10摩爾/升。(6) 如上述(1)至(5)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(b)中的所述裂解液含有濃度為小于等于50體積%的水溶性有機(jī)溶劑。(7) 如上述(6)所述的核酸提取方法， 其中所述裂解液中所含有的所述水溶性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇。(8) 如上述(1)至(7)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法，其中所述步驟(b)中的所述裂解液含有表面活性劑。(9) 如上述(8)所述的核酸提取方法， 其中所述裂解液中所含有的所述表面活性劑的濃度為0.001質(zhì)量%至30質(zhì)量％。(10) 如上述(1)至(9)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(b)中在加入所述的裂解液之后進(jìn)行至少一次的移液操作。(11) 如上述(1)至(10)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(b)中在加入所述的裂解液之后或在所述的移液操作之后再進(jìn)行攪拌操作。(12) 如上述(1)至(11)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(c)中的所述裂解物溶液是通過以下過程制備的，所述過程為向所述的含核酸的裂解液中加入水溶性有機(jī)溶劑，使得所 述的裂解物溶液含有濃度為10體積％至60體積％的水溶性有機(jī)溶劑。(13) 如上述(12)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(c)中使用的所述的水溶性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇。(14) 如上述(1)至(13)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(c)中在加入所述的水溶性有機(jī)溶劑之后進(jìn)行至少一次的移液操作或攪拌操作。(15) 如上述(14)所述的核酸提取方法， 其中攪拌時間為0.1秒至600秒。(16) 如上述(14)或(15)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(c)中在加入所述的水溶性有機(jī)溶劑以及進(jìn)行攪拌操作或移液操作之后，進(jìn)一步進(jìn)行移液操作或攪拌操作。(17) 如上述(16)所述的核酸提取方法， 其中攪拌時間為0.1秒至600秒。(18) 如上述(1)至(17)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(f)中所述回收液的浸泡時間為0.1秒至1,60010(19) 如上述(1)至(18)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中當(dāng)細(xì)胞的數(shù)目為小于等于500,000個時，所用的所述裂解物溶液的液體量為小于等于800 nL。(20) 如上述(1)至(19)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中當(dāng)細(xì)胞的數(shù)目為大于等于500,000個時，所用的所述裂解物溶液的液體量為大于等于300 pL。(21) 如上述(1)至(20)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(d)中所述固體材料為其表面具有羥基的固體材料。(22) 如上述(1)至(21)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在柱中保持有所述的固體材料的容器被用于步驟(d)中。(23) 如上述(1)至(22)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(d)中，將所述的裂解物溶液與其中預(yù)先使含有離液鹽的溶液穿過的所述的固體材料接觸。(24) 如上述(1)至(23)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中通過將所述步驟(c)中制得的所述裂解物溶液注入兩個或多個容器中來進(jìn)行提取操作。(25) 如上述(1)至(24)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中向一個柱中兩次或更多次注入在所述步驟(c)中制得的所述裂解物溶液。(26) 如上述(1)至(25)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(d)、所述步驟(e)和所述步驟(f)中，通過改變壓力或通過離心使所述的裂解物溶液、所述的洗滌液和所述的 回收液中的至少一種與所述的固體材料接觸。(27) 如上述(1)至(26)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述核酸是DNA、 RNA、 mRNA、質(zhì)?；蛩鼈兊幕旌衔镏械囊徽?。(28) 如上述(1)至(27)中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述的生物材料是經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞、動物細(xì)胞、動物組織、植物細(xì)胞、植物組織、病毒、細(xì)菌、真菌或核酸。附圖簡要說明
圖1是示出當(dāng)含有PBS的顆粒狀HL60細(xì)胞的PBS緩沖液被0.5 摩爾/升的Bis-Tris緩沖液代替時所需的穿過時間的表；圖2是示出分散介質(zhì)的種類和體積與RNA回收量和穿過時間之 間的關(guān)系的圖。在各緩沖液名稱的旁邊所示出的數(shù)值是分散液中使用 的緩沖液的液體體積(單位為pL) 。 PBS為含有137毫摩爾/升的氯 化鈉、2.7毫摩爾/升的氯化鉀、10毫摩爾/升的磷酸氫二鈉和2毫摩 爾/升的磷酸二氫鉀的溶液；圖3是示出裂解物和洗滌液1的穿過時間和RNA回收量相對于 濃度為0.5摩爾/升的Bis-Tris緩沖液(pH6.5)所繪制的曲線的圖；圖4是示出裂解液的種類與裂解物和洗滌液1的穿過時間以及 RNA的回收量之間的關(guān)系的圖；圖5是示出硫氰酸胍的濃度與RNA的回收量之間的關(guān)系的圖；圖6是示出硫氰酸胍的濃度與洗滌液的穿過時間之間的關(guān)系的圖；圖7是示出裂解物溶液的體積與裂解物和洗滌液1的穿過時間以 及RNA的回收量之間的關(guān)系的圖；圖8是示出裂解液中乙醇的量與裂解物、洗滌液1和洗滌液2的 穿過時間之間的關(guān)系的圖；圖9是示出裂解液中乙醇的量與使用每種回收液體積后的RNA 回收量之間的關(guān)系的圖。在右側(cè)示出的100 1iL至700 iiL的數(shù)值是當(dāng) 向一個提取柱中分次每次加入100 iaL份的回收液后的總液體體積；圖10是示出裂解物中乙醇的濃度與RNA回收量之間的關(guān)系的圖；圖11是示出加入乙醇后的攪拌時間與裂解物、洗滌液1和洗滌 液2的穿過時間之間的關(guān)系的圖；圖12是示出加入乙醇后的攪拌時間與RNA回收量之間的關(guān)系的 圖。在右側(cè)示出的100pL至300 的數(shù)值是當(dāng)向一個提取柱中分次 每次加入100 ^L份的回收液后的總液體體積；圖13是示出所述膜的孔徑與裂解物、洗滌液1和洗滌液2的穿過時間之間的關(guān)系的圖；圖14是示出所述膜的孔徑與RNA回收量之間的關(guān)系的圖；圖15是示出裂解物溶液的體積與回收量之間的關(guān)系的圖；以及圖16是示出當(dāng)預(yù)先用裂解液對固相進(jìn)行涂敷時核酸回收量的依賴性的表。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式當(dāng)從細(xì)胞中分離和純化生物材料(例如核酸成分)時，通過使用 含有離液鹽等的裂解液來裂解細(xì)胞、并向其中加入水溶性有機(jī)溶劑而 制得裂解物溶液，當(dāng)裂解液中所溶解的核酸發(fā)生凝聚時，由除核酸以 外的物質(zhì)所衍生的成分也會發(fā)生凝聚，在進(jìn)行所述的分離純化過程 中，含有這些凝聚物的裂解物溶液在穿過諸如多孔膜之類的固體材料 時，這些成分會堵塞多孔膜的孔或沉積在孔表面上，這樣使得裂解物 溶液和洗滌液的穿過時間延長。結(jié)果，當(dāng)堵塞成分較多時，例如待處 理的細(xì)胞的數(shù)量較大時，發(fā)生堵塞的可能性變大。根據(jù)本發(fā)明，通過 對裂解物溶液的制備方法、提取方法、洗滌方法和核酸回收方法進(jìn)行 各種研究而解決這些問題。本發(fā)明的核酸提取方法至少包括以下步驟(a)至(f): 步驟(a)，使用諸如緩沖液之類的分散介質(zhì)使生物材料分散(下文 也稱為"分散步驟")，步驟(b)，通過使生物材料與裂解液接觸使生物材料溶解，并溶出 生物材料中所含有的核酸(下文也稱為"溶解步驟")， 步驟(c)，通過向含有溶出的核酸的溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑來 制備裂解物溶液(下文也稱為"裂解步驟")，步驟(d)，通過使裂解物溶液與固體材料接觸而使得裂解液中所含 有的核酸被該固體材料吸附(下文也稱為"吸附步驟")， 步驟(e)，在保持核酸被吸附的狀態(tài)下使用洗漆液來洗漆所述的固 體材料(下文也稱為"洗滌步驟")，步驟(f)，使用回收液使核酸從固體材料上解吸附，并將其排放到上文所述的提取柱容器的外部(下文也稱為"回收步驟")。關(guān)于本文中所用的術(shù)語"堵塞"，以下情況可稱為堵塞裂解物溶液或洗滌液的穿過速率變?yōu)?;或者是裂解物溶液或洗滌液的穿過 速率會使所述操作達(dá)到某一閾值或更大，例如當(dāng)穿過速率使得穿過所 需的時間為120秒或更長時。當(dāng)從生物材料中提取核酸時，優(yōu)選的是將該生物材料預(yù)先分散于 合適的分散介質(zhì)中。在這種情況下，當(dāng)使用粒狀細(xì)胞時，這些細(xì)胞在 多數(shù)情況下是被凍結(jié)的，所以為了改善分散性，優(yōu)選的是將這些細(xì)胞 解凍。關(guān)于分散介質(zhì)的種類，可以使用任何物質(zhì)，只要使由于滲透壓的 差異而發(fā)生的生物材料的破裂和收縮達(dá)到最小程度并且所述物質(zhì)可 以分散細(xì)胞即可。作為這種溶液，可以列舉(例如)緩沖液。作為緩沖劑，可以列舉通常使用的pH緩沖劑(緩沖液)。特別 是，生物化學(xué)用途的pH緩沖劑是優(yōu)選的。本發(fā)明人經(jīng)過大量研究結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，在多種緩沖液中，Bis-Tris (N，N-雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲 基)甲垸)緩沖液的穿過時間短并且發(fā)生堵塞的可能性低，因此 Bis-Tris緩沖液適合使用。盡管對分散介質(zhì)的量沒有特別的限定，但是優(yōu)選的是分散介質(zhì)的 用量隨著細(xì)胞數(shù)量的增加而增加。然而，當(dāng)受到裂解物溶液的量的限 制時，離液鹽(其具有使裂解物中的生物材料成分(例如細(xì)胞)發(fā)生裂 解的能力，而且還具有抑制核酸酶(例如核糖核酸酶)的作用)的濃度 或量變低，因此，生物材料不能夠被充分溶解的可能性增大，并且由 于離液鹽所具有的抑制核酸酶(其具有降解RNA或類似核酸的作用) 的活性的作用沒有得到充分的發(fā)揮，所以回收量降低的可能性也增 大。因此，優(yōu)選的是分散介質(zhì)的量要盡可能的少。另一方面，當(dāng)不受 到裂解物溶液的量的限制時，可以增加分散介質(zhì)的量，但是當(dāng)分散介 質(zhì)的量增大時，為了使離液鹽的濃度保持在某一水平或更高，需要增 加裂解物溶液的量，并且裂解物溶液的量的增大會導(dǎo)致穿過時間增 長，特別是延長了裂解物溶液的穿過時間，所以不必要地增加裂解物 溶液的量是不優(yōu)選的。因此，優(yōu)選的是，本發(fā)明中使用的分散介質(zhì)的量優(yōu)選為裂解物溶液的量的80體積％或更少、更優(yōu)選為50體積％或 更少、最優(yōu)選為20體積％或更少。優(yōu)選的是，所使用的分散介質(zhì)的濃度可以使細(xì)胞不會由于受到滲 透壓等的作用而完全分解或部分分解。分散介質(zhì)的濃度會對裂解物溶 液和洗滌液的穿過時間產(chǎn)生影響。例如，當(dāng)Bis-Tris緩沖液(pH6.5) 被用作分散介質(zhì)并且液體體積為30 時，當(dāng)該分散介質(zhì)的濃度較低 時，裂解物溶液和洗滌液的穿過時間會延長。當(dāng)分散介質(zhì)的濃度較高 時，可能發(fā)生這樣的情況細(xì)胞發(fā)生部分裂解，細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白 質(zhì)等被溶出，核酸在溶出的核酸酶等的作用下被降解，因此導(dǎo)致所關(guān) 注的核酸的回收量降低?；诖耍鶕?jù)本發(fā)明，分散介質(zhì)的濃度優(yōu)選 為大于等于0.01摩爾/升且小于等于10摩爾/升、更優(yōu)選為大于等于 0.1摩爾/升且小于等于1摩爾/升。分散介質(zhì)的pH優(yōu)選為3至9、更 優(yōu)選為5.5至8.5?？梢愿鶕?jù)細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞的種類來調(diào)節(jié)分散介質(zhì)的量(液體體 積)。例如，在使用HL60細(xì)胞并且當(dāng)該細(xì)胞的數(shù)量小于等于5,000,000 時，為了減輕使用者的負(fù)荷，可以在不使用分散介質(zhì)的條件下進(jìn)行提 取，但是，在多數(shù)情況下，使用分散介質(zhì)時的重復(fù)性好并且可以得到 高回收量的核酸，因此優(yōu)選的是使用分散介質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量為 l，OOO,OOO或更多時，優(yōu)選的是使用分散介質(zhì)。當(dāng)不使用分散介質(zhì)或 只使用了少量的分散介質(zhì)時，核酸的回收量較低，并且在某些情況下 核酸的回收量發(fā)生波動的可能性較大。據(jù)信，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是 因?yàn)檫@些細(xì)胞形成了由未溶解的材料而構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，由 于細(xì)胞的密度較高，所加入的裂解液不能使細(xì)胞充分裂解，結(jié)果，待 提取的核酸或類似的成分被結(jié)合到所述的結(jié)構(gòu)中?；谝陨纤?，根 據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用分散介質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量較大時特別優(yōu)選使用分 散介質(zhì)。當(dāng)制備粒狀細(xì)胞時，通過盡可能地除去常用的PBS (磷酸鹽緩沖 鹽水)并將PBS更換為Bis-Tris緩沖液、或者通過向含有PBS的粒 狀細(xì)胞中加入Bis-Tris緩沖液而使得在提取時裂解物溶液和洗滌液的 穿過時間極大地縮短?；诖耍鶕?jù)本發(fā)明，可以通過除去能夠引起15穿過時間延長的PBS等類似的分散介質(zhì)或者成分、然后向其中加入其 它的分散介質(zhì)的操作來使細(xì)胞被再分散。對裂解液中的離液鹽沒有特別限定，可以使用任何公知的離液 鹽。作為離液鹽，可以使用胍鹽、異硫氰酸鈉、碘化鈉、碘化鉀、尿 素、溴化鈉、溴化鉀、溴化鈣、異硫氰酸銨、氯化鈉、氯化鉀、氯化 銨等。在這些物質(zhì)中，優(yōu)選胍鹽。作為胍鹽，可以例舉鹽酸胍、異硫 氰酸胍和胍的硫氰酸鹽(硫氰酸胍)，在這些胍鹽中，優(yōu)選鹽酸胍或 硫氰酸胍。這些鹽可以單獨(dú)使用，或者可將它們中的兩種或更多種組 合使用。本發(fā)明人經(jīng)過大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對離液鹽的濃度沒有特別的限 定，只要該濃度可以使細(xì)胞充分裂解并且可以使所制備的裂解物溶液 和洗滌液的穿過時間縮短即可。由低濃度的離液鹽制備的裂解液不能 使細(xì)胞裂解，雖然裂解物溶液和洗滌液的穿過時間顯著加快，但是完 全不能回收核酸。關(guān)于穿過時間得以加快的原因，據(jù)信，是因?yàn)椴糠?裂解的細(xì)胞不能進(jìn)入到固體材料的孔中，只能積聚在固體材料的上 面。此外，這也使得能夠降解核酸的酶從部分裂解的生物材料中溶出 而使核酸發(fā)生降解、從而使回收量降低的可能性增大?；诖耍瑑?yōu)選 的是裂解液中使用的離液鹽的濃度較高。當(dāng)離液鹽的濃度增大時，生物材料被逐漸降解，伴隨而來的是核 酸的回收量增大，而裂解物溶液和洗滌液的穿過時間也顯著延長。當(dāng) 離液鹽的濃度進(jìn)一步增大時，至少通過顯微鏡的觀察可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被 完全裂解，裂解物溶液和洗滌液的穿過時間縮短，核酸的回收量也顯者提咼。當(dāng)進(jìn)一步增大離液鹽的濃度時，裂解物溶液和洗滌液的穿過時間 不會明顯縮短并且核酸的回收量幾乎保持不變。然而，含有離液鹽的 裂解液在水中的溶解度降低，這樣制備裂解液變得困難，并且會產(chǎn)生 在低溫時離液鹽從所制備的裂解液中沉淀出來的問題?；谝陨纤?，優(yōu)選的是離液鹽的濃度較高。但是，考慮到制備 裂解液的容易程度和離液鹽在低溫時發(fā)生沉淀的情況，離液鹽的濃度優(yōu)選為0.1摩爾/升到10摩爾/升、更優(yōu)選為0.5摩爾/升至5摩爾/升、最優(yōu)選為3摩爾/升至4.5摩爾/升。當(dāng)裂解物溶液的pH較低時，裂解物溶液的穿過時間和洗滌液的 穿過時間變短。作為控制裂解物溶液的pH的有用的方法的例子包括以下方法使用分散介質(zhì)中所用的緩沖液來控制pH的方法；通過向 裂解液中加入緩沖液來控制pH的方法；在制備裂解物溶液時向水溶 性有機(jī)溶劑中加入緩沖液的方法；向洗滌液中加入緩沖液的方法；以 及不預(yù)先將緩沖液加入到上述這些溶液中而是先制備緩沖液然后再 將其加入的方法。作為可以使用的緩沖劑，可以例舉常用的pH緩沖劑(緩沖液)。 優(yōu)選的是，可以例舉用于生物化學(xué)用途的pH緩沖劑。作為這種緩沖 劑，可以使用Bis-Tris緩沖液。上述核酸溶解試劑中的緩沖液的濃度優(yōu)選為1毫摩爾/升至500 毫摩爾/升，考慮到裂解液制備后的pH，優(yōu)選使用pH為3至8、更優(yōu) 選pH為4至7、進(jìn)一步優(yōu)選pH為5至7的那些緩沖液。優(yōu)選的是裂解液中含有核酸穩(wěn)定劑。本文所用的術(shù)語"核酸穩(wěn)定劑"是指可以影響核酸在分析物中穩(wěn)定存在的試劑。這種核酸穩(wěn)定劑還包括這樣的試劑，該試劑可以影響核酸本身的穩(wěn)定存在并且還可以通過降低或完全抑制核酸的不穩(wěn)定性(例如通過降低或完全抑制可以降解核酸的核酸酶或類似的核酸降解酶的降解作用)來抑制核酸的降解。優(yōu)選的是使該核酸穩(wěn)定劑與選自有機(jī)溶劑、離液鹽、表面活性劑、緩沖液和消泡劑中的一種或多種物質(zhì)共存。作為具有能夠使核酸酶的活性失活作用的核酸穩(wěn)定劑，可以使用常用作還原劑的化合物。作為還原劑，可以例舉氫、碘化氫、硫化 氫、氫化鋁鋰、硼氫化鈉等氫化物；堿金屬、鎂、鈣、鋁、鋅等高正 電性金屬，或它們的汞合金；醛類、糖類、甲酸、草酸等有機(jī)氧化物； 以及巰基化合物等。在這些化合物中，巰基化合物是特別優(yōu)選的。作 為巰基化合物，可以例舉N-乙?；腚装彼帷€基乙醇和垸基硫醇 等。這些巰基化合物可以單獨(dú)使用，或者可將它們中的兩種或更多種 組合使用。優(yōu)選的是，核酸穩(wěn)定劑在裂解液中的濃度為0.01質(zhì)量％到20質(zhì)量％、更優(yōu)選為0.03質(zhì)量％到15質(zhì)量％。巰基化合物在裂解性化合物 中的濃度優(yōu)選為0.01質(zhì)量％到20質(zhì)量％、更優(yōu)選為0.05質(zhì)量％到15 質(zhì)量％、最優(yōu)選為0.05質(zhì)量％到5質(zhì)量％。(在本說明書中，質(zhì)量比 等于重量比。)此外，隨著巰基化合物在裂解液中濃度的增加，其還具有縮短裂 解物溶液和洗滌液的穿過時間的作用。然而，從工作者的工作環(huán)境的 觀點(diǎn)來看，不能夠使用濃度過高的巰基化合物。此外，也是從上述這 些方面來考慮，巰基化合物在裂解性化合物中的濃度優(yōu)選為0.01質(zhì)量 %至20質(zhì)量％、更優(yōu)選為0.05質(zhì)量％至15質(zhì)量％、最優(yōu)選為0.05質(zhì) 量％至5質(zhì)量％。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過向裂解液中加入表面活性劑可以縮短裂解物 溶液的穿過時間和洗滌液的穿過時間。作為待加入的表面活性劑，可 以提及(例如)非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑和兩性離 子型表面活性劑。根據(jù)本發(fā)明，可優(yōu)選使用非離子型表面活性劑和陽離子型表面活 性劑。作為非離子型表面活性劑，可以舉例為聚氧乙烯烷基苯基醚類表 面活性劑、聚氧乙烯烷基醚類表面活性劑、脂肪酸鏈烷醇酰胺，在這 些表面活性劑中，聚氧乙烯烷基醚類表面活性劑是優(yōu)選的。在聚氧乙 烯(POE)垸基醚類表面活性劑中，更優(yōu)選的是POE癸基醚、POE 月桂基醚、POE十三垸基醚、POE亞垸基癸醚、POE脫水山梨糖醇 單月桂酸酯、POE脫水山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇單硬脂 酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐四油酸酯、POE烷基胺和POE炔二醇。作為陽離子表面活性劑，可以舉例為十六垸基三甲基溴化銨、十 二烷基三甲基氯化銨、十四烷基三甲基氯化銨和氯化十六烷基吡啶 鏡。對表面活性劑的濃度進(jìn)行大量的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著表面活性 劑濃度的增加，裂解物溶液的穿過時間和洗滌液的穿過時間縮短。但 是，當(dāng)表面活性劑的濃度增加過高時，根據(jù)離液鹽的種類，它會引起 核酸的回收量降低，并且發(fā)現(xiàn)會產(chǎn)生出現(xiàn)泡沫的問題?；谶@樣的結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是，表面活性劑在溶液中的濃度優(yōu)選為0.001質(zhì)量％至30質(zhì)量％、特別優(yōu)選為0.1質(zhì)量％至7.5質(zhì)量％。此外，由于在使用表面活性劑時裂解物溶液容易形成泡沫，所以可以不使用表 面活性劑，或也可以使用消泡劑，條件是為了易于操作即使不使用表 面活性劑也可以獲得充分的性能。消泡劑的例子包括硅類消泡劑(例如硅油、二甲基聚硅氧垸、 有機(jī)硅乳液、改性聚硅氧烷和有機(jī)硅復(fù)合物等)、醇類消泡劑(例如 炔二醇、庚醇、乙基己醇、高級醇和聚氧化亞垸基乙二醇等)、醚類消泡劑(例如庚基溶纖劑和壬基溶纖劑-3-庚基山梨糖醇等)、油脂類消泡劑(例如動物油或植物油等)、脂肪酸類消泡劑(例如硬脂酸、 油酸、棕櫚酸等)、金屬皂類消泡劑(例如硬脂酸鋁、硬脂酸鈣等)、 脂肪酸酯類消泡劑(例如天然蠟、磷酸三丁酯等)、磷酸鹽酯類消泡 劑(例如磷酸辛酯鈉等)、胺類消泡劑(例如二戊胺等)、酰胺類消 泡劑(例如硬脂酸酰胺等)和其它消泡劑(例如硫酸鐵、礬土等)。 這些消泡劑可以單獨(dú)使用，或者可將它們中的兩種或更多種組合使 用。特別優(yōu)選的是，將硅類消泡劑和醇類消泡劑這兩種成分組合在一 起使用。優(yōu)選的是，消泡劑在裂解液中的濃度為0.1質(zhì)量％到10質(zhì)量％。通過將裂解液與水溶性有機(jī)溶劑混合可以顯著地縮短洗滌液的 穿過時間。本文所用的術(shù)語"水溶性有機(jī)溶劑"是指在溶解于水中的狀態(tài)下其濃度為小于等于100%的水溶性有機(jī)溶劑。本發(fā)明人經(jīng)過大量的研究結(jié)果確定了水溶性有機(jī)溶劑的濃度，在該濃度下，可以有效 地縮短裂解物溶液和洗滌液的穿過時間、通過一次洗脫步驟就可以從 提取膜上洗脫下來更多量的核酸，以及可以提高核酸的回收量。作為加入水溶性有機(jī)溶劑的益處，除了上述的效果之外，還可以 提及裂解液中所含有的各種試劑的溶解性。此外，還可以提及通過增 加裂解液的體積使裂解物溶液和洗滌液的穿過時間縮短以及使核酸 回收量提高。在本發(fā)明這樣的使用提取柱的提取體系的情況下，提取 柱的尺寸是固定的，所以可施加到提取柱中的裂解物溶液的最大體積 取決于提取柱的尺寸。這意味著為了在超出由所選擇的提取柱的尺寸計算得到的液體的最大施加體積(即，裂解物溶液體積)時進(jìn)行提取 操作，必須要更換更大一些的提取柱，因此存在需要對提取器重新進(jìn) 行設(shè)計的可能性。為了解決這些問題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量研究，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)了這樣的方法作為本發(fā)明的裂解物溶液的制備方法，所述方法 為將裂解液加入到生物材料中，然后向其中加入水溶性有機(jī)溶劑，在 該方法中，所述的水溶性有機(jī)溶劑的液體體積被盡可能地減少，并且 水溶性有機(jī)溶劑的液體體積被減少后所得到的液體體積被用于裂解 液的液體體積增加。此外，就這一點(diǎn)而言，將裂解液與水溶性有機(jī)溶 劑混合是重要的。對裂解液中水溶性有機(jī)溶劑的濃度進(jìn)行大量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨 著水溶性有機(jī)溶劑的量增加，裂解物溶液的穿過時間和洗滌液的穿過 時間縮短，并且核酸的回收量也提高。然而，由于隨著裂解液中水溶 性有機(jī)溶劑濃度的增加，在核酸回收步驟中通過一次洗脫操作而被洗 脫下來的核酸的量減少，所以必須進(jìn)行多次提取操作以得到所需量的 核酸。因此，在裂解液中使用水溶性有機(jī)溶劑的情況下，由于當(dāng)裂解液 中醇的濃度過高時會使核酸的回收效率降低，所以優(yōu)選的是，裂解液中醇的濃度優(yōu)選為小于等于70體積％、更優(yōu)選為小于等于50體積％、 特別優(yōu)選為小于等于25體積％。關(guān)于加入到裂解液中的水溶性有機(jī)溶劑的種類，可以舉例為丙 酮、醇類和二甲基甲酰胺等。在這些物質(zhì)中，醇類是優(yōu)選的。所述醇 類可以是伯醇、仲醇和叔醇中的任意一種。特別是，可以更優(yōu)選使用 甲醇、乙醇、丙醇及其異構(gòu)體、丁醇及其異構(gòu)體。在這些醇中，就減 少環(huán)境的負(fù)荷和毒性而言，乙醇是特別優(yōu)選的。這些水溶性有機(jī)溶劑 可以單獨(dú)使用，或者可將它們中的兩種或更多種組合使用。此外，當(dāng)裂解物溶液和洗滌液的穿過時間足夠快時，可以不加入 水溶性有機(jī)溶劑。作為這種情況的例子，例如可以例舉只有少量細(xì)胞 被處理時的情況。在加入裂解液之前、在加入裂解液之后或在制備裂解物溶液之后 的任意一個步驟中可以對分析物進(jìn)行均化處理。據(jù)信，通過進(jìn)行均化處理可以改善堵塞和縮短穿過時間，這是因?yàn)槭勾┻^時間延遲的成分 (即，造成堵塞的物質(zhì))由此被碎化。進(jìn)行均化處理時可以采用下列 方式超聲波處理、使用尖銳的突出物進(jìn)行的處理、采用高速攪拌進(jìn) 行的處理、將分析物從微孔中擠出的處理、使用裝配有針頭的注射器 進(jìn)行的處理、用研磨器進(jìn)行處理、移液處理、使用由玻璃、不銹鋼、 二氧化鋯等制成的珠子進(jìn)行處理的方法，或者這些處理方式的組合。 對均化方法沒有特別限定。例如，在進(jìn)行混合的情況下，優(yōu)選的是使用攪拌裝置將分析物在30 rpm至10,000 rpm下混合1秒鐘至3 分鐘、更優(yōu)選的是在300 rpm至7,000 rpm下混合1秒鐘至1分鐘、 最優(yōu)選的是在3,000 rpm至6,000 rpm下混合5秒鐘至30秒鐘。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是在加入裂解液之后進(jìn)行移液操作。例如， 當(dāng)處理l,OOO，OOO或更多個細(xì)胞時進(jìn)行移液操作是有效的。當(dāng)進(jìn)行移液操作時，優(yōu)選的是在使用裝有裂解液的移液管加入裂解液的同時進(jìn) 行移液操作。據(jù)推測，進(jìn)行移液操作后的效果如下。由于分散后的細(xì)胞的密度 隨著分散介質(zhì)中細(xì)胞密度的增加而增加，所以具有高密度的由裂解后 的生物材料所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)的部分的形成可能性增大。當(dāng)形成所述結(jié)構(gòu) 時，據(jù)推測，所述結(jié)構(gòu)中存在的核酸難以被釋放到裂解液和裂解物溶 液中，與此同時，所述結(jié)構(gòu)中離液鹽與生物材料的濃度比降低，這樣 便難以對生物材料進(jìn)行裂解，并且對能夠降解核酸的酶的活性的抑制 作用也被降低，這樣就使得所釋放出來的核酸被降解的可能性增大， 由此回收量降低而且部分降解后的細(xì)胞會造成多孔膜的堵塞。加入裂 解液之后即刻進(jìn)行移液操作的原因在于在形成半裂解的生物材料之 前通過移液或攪拌操作來降低半裂解的細(xì)胞的細(xì)胞密度，或者即使形 成了半裂解的生物材料，也可以通過移液操作來分散這種結(jié)構(gòu)。此外， 據(jù)推測，當(dāng)在所形成的半裂解結(jié)構(gòu)的狀態(tài)中出現(xiàn)不均一性時，這種不 均勻性會對核酸回收量的不均一性以及裂解物溶液和洗滌液的穿過 時間的不均一性產(chǎn)生影響。移液操作和攪拌操作還具有降低這種不均 一性的作用?；谏衔乃?，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是當(dāng)細(xì)胞數(shù)量較多時進(jìn)行移液操作，并且雖然對移液操作的次數(shù)沒有特別限定，但是優(yōu)選進(jìn)行至 少1次以上50次以下、更優(yōu)選進(jìn)行3次以上10次以下。此外，當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量較少(例如5,000,000個或更少)時，或者當(dāng)在不進(jìn)行移液操作的條件下就可以獲得足夠快的穿過時間，并且核酸的回收量高且 穩(wěn)定時，為了減輕使用者的負(fù)擔(dān)和縮短提取操作的預(yù)處理時間，進(jìn)行 移液操作的次數(shù)可以更少一些或者可以根本不進(jìn)行移液操作。 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是對裂解液(該裂解液是通過對生物材料裂解后而制備的裂解液進(jìn)行移液操作而制得的)進(jìn)行攪拌操作；或者是 對生物材料裂解后而制得的裂解液進(jìn)行攪拌操作。隨著攪拌時間的延 長，裂解物溶液的穿過時間和洗滌液的穿過時間縮短，核酸的回收量 提高并且核酸的回收量穩(wěn)定。關(guān)于攪拌時間，就浮游細(xì)胞HL60而言， 當(dāng)該細(xì)胞的數(shù)量較少(例如1,000,000個或更少)時，可以通過在該 攪拌步驟之前的步驟(即，不進(jìn)行攪拌只進(jìn)行移液操作的步驟)來回 收核酸，或者通過進(jìn)行攪拌時間為至多1分鐘的攪拌來回收核酸，所 以可以不進(jìn)行攪拌操作或?qū)嚢钑r間設(shè)定為1分鐘或更短。將水溶性有機(jī)溶劑加入到通過上述步驟制備的裂解液中(其中通 過使生物材料裂解而使核酸溶出)，并將核酸與吸附性固體材料接觸。 對所述的固體材料沒有特別限定，可以使用尼龍等，但是其表面上具 有羥基的固體材料是優(yōu)選的。據(jù)推測，本發(fā)明的核酸吸附機(jī)制是通過 所述的操作，使樣品溶液中的核酸被固體材料的表面所吸附，特別是 被其表面上具有羥基的有機(jī)高分子化合物所吸附，或者是，在使用多 孔膜的條件下，核酸被濾膜的表面和孔所捕獲和吸附。根據(jù)本發(fā)明， 對水溶性有機(jī)溶劑沒有特別限定，但是優(yōu)選使用醇類。醇類可以是伯 醇、仲醇和叔醇中的任意一種，并且更優(yōu)選使用甲醇、乙醇、丙醇及 其異構(gòu)體、丁醇及其異構(gòu)體。這些水溶性有機(jī)溶劑可以單獨(dú)使用，或者可將它們中的兩種或更多種組合使用。乙醇可以用作特別優(yōu)選的水 溶性有機(jī)溶劑。關(guān)于待加入的水溶性有機(jī)溶劑的濃度，這樣加入該溶劑，使得其 在制備裂解物溶液時的濃度變?yōu)?0體積％至60體積％。當(dāng)水溶性有 機(jī)溶劑的濃度低時，核酸的回收量降低。其原因可能是在裂解物溶液穿過膜時，應(yīng)該保持在膜上的核酸被轉(zhuǎn)移到通過液體側(cè)中而沒有結(jié)合 在膜上，因此導(dǎo)致核酸的回收量降低。當(dāng)水溶性有機(jī)溶劑的濃度高時， 穿過時間變短，但是回收量也大幅降低。據(jù)推測，這是由于在高濃度 的水溶性有機(jī)溶劑的作用下由于凝聚使得引起堵塞的物質(zhì)的尺寸變 大，結(jié)果凝聚物不能進(jìn)入膜的孔內(nèi)而是積聚在膜的上面，由此使得裂 解物等溶液和洗滌液能夠很容易地穿過堆積物(由沉淀物形成)內(nèi)的 空間?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，根據(jù)本發(fā)明，在制備裂解物溶液時水溶性有 機(jī)溶劑的濃度有必要設(shè)定為10體積％至60體積％、特別優(yōu)選為20體積％至40體積％。加入水溶性有機(jī)溶劑之后，優(yōu)選的是進(jìn)行至少一次的移液操作或 攪拌操作或者進(jìn)行這兩種操作。當(dāng)進(jìn)行攪拌操作時，可以以一個樣品 接一個樣品的方式對每個樣品進(jìn)行一次攪拌，但是為了減輕使用者的 負(fù)擔(dān)，優(yōu)選的是進(jìn)行兩次攪拌，其中第一次攪拌時是以一個分析物接 一個分析物的方式對每個分析物進(jìn)行攪拌，第二次攪拌時是把所有的 分析物一起進(jìn)行攪拌。當(dāng)分析物的量較大時，這種操作是特別有效的。以下進(jìn)行說明，例如，在對一個或多個分析物進(jìn)行提取操作的情 況下，在第一次攪拌中，以一個分析物接一個分析物的方式向每個分 析物中加入水溶性有機(jī)溶劑之后即刻進(jìn)行攪拌；在第二次攪拌中，將 分析物一起進(jìn)行攪拌。當(dāng)進(jìn)行第一次攪拌時，優(yōu)選的是以這樣的方式 進(jìn)行攪拌，所述方式為使水溶性有機(jī)溶劑與裂解液(在該裂解液中生 物材料被裂解)的接觸面積盡可能最小，并且使它們的接觸時間盡可 能最短。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，所述趨勢變得更明顯。為了防止發(fā)生 這種現(xiàn)象，優(yōu)選的是在加入水溶性有機(jī)溶劑之后即刻進(jìn)行攪拌。關(guān)于第一次攪拌的時間，當(dāng)攪拌時間延長時，裂解物溶液和洗滌 液的穿過速率變快，核酸的回收量提高，并且裂解物溶液和洗滌液的 穿過時間及核酸的回收量也穩(wěn)定了。據(jù)推測，這是由于在攪拌操作的 作用下，當(dāng)加入裂解液來裂解生物材料時未裂解的部分減少了，或者 加入水溶性有機(jī)溶劑后而形成的引起堵塞的物質(zhì)減少了。此外，就第二次攪拌的時間而言，當(dāng)攪拌時間延長時，裂解物溶液和洗滌液的穿過速率變快，核酸的回收量提高，并且裂解物溶液和 洗滌液的穿過時間及核酸的回收量也穩(wěn)定了。據(jù)推測，其原因與第一 次攪拌的情況相同。
此外，隨著攪拌時間的延長，通過1次溶出操作而被溶出的核酸 的量會增多。例如，就使用HL60作為所述的細(xì)胞種類而言，當(dāng)細(xì)胞
的數(shù)量為10,000,000時，通過1次提取操作不能獲得所需的核酸回收 量，除非將攪拌時間設(shè)定為1分鐘或更長，當(dāng)攪拌時間設(shè)定為l分鐘 或更短時，必須進(jìn)行幾次溶出操作或者需要更多體積的提取液體。
對于第一次和第二次攪拌這二者而言，其攪拌時間均可以為至少 0.1秒且至多600秒鐘，特別優(yōu)選為至少IO秒且至多120秒鐘。此外， 為了減輕使用者的負(fù)擔(dān)，優(yōu)選的是將第一次攪拌時間設(shè)定為較短的時 間，而將第二次攪拌時間設(shè)定為比第一次的攪拌時間長。
與攪拌操作時的情況相似，隨著移液操作次數(shù)的增加，裂解物溶 液和洗滌液的穿過時間變短，并且核酸的回收量提高。
為了減輕使用者的負(fù)擔(dān)，當(dāng)所用的細(xì)胞的數(shù)量較少時，進(jìn)行l(wèi)次 攪拌操作或1次移液操作就足夠了。
當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量較少時，使用更少量的裂解物溶液就可以使細(xì)胞被 充分裂解，并且也可以進(jìn)行提取。當(dāng)裂解物溶液的量較少時，裂解物 溶液的穿過時間變短。此外，核酸的回收量也提高。據(jù)推測，這是由 于以下原因引起的，所述原因?yàn)橛捎诹呀馕锶芤褐械纳锊牧系臐舛?增大，使得核酸的濃度也增大；由于裂解物溶液中核酸凝聚物尺寸的 增大導(dǎo)致這些核酸凝聚物容易被多孔膜捕獲。
當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量較大時，需要更多量的裂解液來使細(xì)胞充分裂解。 據(jù)推測，當(dāng)裂解液的體積(即，離液鹽的量)不足時，不僅細(xì)胞不能 被充分裂解，而且對核酸降解酶的抑制作用也降低，使得從生物材料 中溶出的核酸非常有可能被降解，因此回收量降低。
基于此，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量為500,000或更少 時，使用800 pL或更少的裂解物溶液，當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量為500,000或更 多時，使用300 pL或更多的裂解物溶液。
優(yōu)選的是，裂解物溶液的表面張力為0.05 J/n^或更低，粘度為1mPa至10,000 mPa，比重為0.8至1.2。當(dāng)所述溶液的各項(xiàng)在所述范 圍內(nèi)時，可以容易地實(shí)施下一步驟，該步驟為使裂解物溶液穿過諸如 核酸吸附性多孔膜之類的固體材料來使核酸被吸附、然后除去殘余 物，而這樣的情況是優(yōu)選的。
關(guān)于本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜，溶液可以從其內(nèi)部穿過。在這 種情況下，術(shù)語"溶液可以從其內(nèi)部穿過"是指當(dāng)在與多孔膜的一 面接觸的空間和與該多孔膜的另一面接觸的空間之間存在壓力差時， 溶液可從高壓空間一側(cè)向低壓空間一側(cè)流動而穿過所述多孔膜。或者 是指當(dāng)向所述多孔膜施加離心力時，溶液可以沿著離心力的方向穿 過該多孔膜。
此外，優(yōu)選的是本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜的表面上具有親水性 基團(tuán)。親水性基團(tuán)是指能與水發(fā)生相互作用的極性基團(tuán)(原子團(tuán))， 并且與核酸的吸附有關(guān)的所有基團(tuán)(原子團(tuán))都是合適的。關(guān)于親水 性基團(tuán)，其與水相互作用的強(qiáng)度為中等強(qiáng)度(參見由共立出版株式會 社出版的《化學(xué)大詞典》中所述的術(shù)語"親水性基團(tuán)"中的"親水性 不太強(qiáng)的基團(tuán)")是合適的，其實(shí)例包括羥基、羧基、氰基和氧化亞 乙基。在這些基團(tuán)中優(yōu)選羥基。
本文所用術(shù)語"具有親水性基團(tuán)的多孔膜"是指構(gòu)成多孔膜的材 料其本身具有親水性基團(tuán)的多孔膜，或者是通過對構(gòu)成多孔膜的材料
進(jìn)行處理或涂敷，從而引入親水性基團(tuán)的多孔膜。構(gòu)成多孔膜的材料
可以是有機(jī)物或無機(jī)物。例如，可使用如下多孔膜構(gòu)成多孔膜的材 料其本身是具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料這樣的多孔膜；通過對由不具 有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料所構(gòu)成的多孔膜進(jìn)行處理，從而向其中引入 親水性基團(tuán)而得到的多孔膜；通過使用具有親水性基團(tuán)的材料對由不 具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料所構(gòu)成的多孔膜進(jìn)行涂敷，從而向其中引 入親水性基團(tuán)而得到的多孔膜；構(gòu)成多孔膜的材料其本身是具有親水 性基團(tuán)的無機(jī)材料這樣的多孔膜；通過對由不具有親水性基團(tuán)的無機(jī) 材料所構(gòu)成的多孔膜進(jìn)行處理，從而向其中引入親水性基團(tuán)而得到的 多孔膜；通過使用具有親水性基團(tuán)的材料對由不具有親水性基團(tuán)的無 機(jī)材料所構(gòu)成的多孔膜進(jìn)行涂敷，從而向其中引入親水性基團(tuán)而得到的多孔膜，等等。從加工的容易性方面考慮，優(yōu)選的是使用有機(jī)高分 子化合物等有機(jī)材料作為構(gòu)成多孔膜的材料。
作為具有親水性基團(tuán)的材料所形成的多孔膜，可以舉例為由以下
物質(zhì)形成的多孔膜，所述物質(zhì)有聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥 乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧 乙烯、醋酸纖維素、乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物，在這些 多孔膜中，優(yōu)選使用由具有羥基的有機(jī)材料所構(gòu)成的多孔膜，特別優(yōu) 選的是使用由具有羥基的有機(jī)高分子所構(gòu)成的多孔膜。
作為由具有羥基的有機(jī)材料構(gòu)成的多孔膜，具有多糖結(jié)構(gòu)的材料
是優(yōu)選的，并且更優(yōu)選使用由乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物 構(gòu)成的有機(jī)高分子多孔膜。作為乙酰值互不相同的醋酸纖維素混合 物，可以優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物；三醋酸纖 維素和單醋酸纖維素的混合物；三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋
酸纖維素的混合物；以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。特 別優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。三醋酸纖維素和 二醋酸纖維素的混合比(質(zhì)量比)優(yōu)選為99:1到l:99，更優(yōu)選為90:10 到50:50。
作為更優(yōu)選的具有羥基的有機(jī)材料，可以舉例為專利文獻(xiàn) JP-A-2003-128691中公開的醋酸纖維素的皂化產(chǎn)物。所述的醋酸纖維 素的皂化產(chǎn)物是指乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物經(jīng)過皂化 處理而獲得的產(chǎn)物，并且優(yōu)選的是使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素 的混合物的皂化產(chǎn)物，三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化 產(chǎn)物，三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化 產(chǎn)物，以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物。更優(yōu) 選的是使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物。三醋 酸纖維素與二醋酸纖維素的混合比(質(zhì)量比)優(yōu)選為99:1到1:99。 更優(yōu)選的是，三醋酸纖維素與二醋酸纖維素的混合比為90:10到 50:50。在這種情況下，可以通過皂化處理的程度(皂化率)來控制 多孔膜表面上的羥基的量(密度)。
為了提高核酸分離的效率，優(yōu)選的是，使羥基的量(密度)較大。優(yōu)選的是，通過皂化處理而得到的有機(jī)材料的皂化率(表面皂化率) 優(yōu)選為至少5%且至多100%、更優(yōu)選為至少10%且至多100%。
此外，為了增加具有羥基的有機(jī)材料的表面積，優(yōu)選的是，對醋 酸纖維素多孔膜進(jìn)行皂化處理。
所述的多孔膜可以是其前表面與后表面彼此對稱的多孔膜，但是 優(yōu)選使用其前表面與后表面互不對稱的多孔膜。
本文所用術(shù)語"皂化處理"是指使醋酸纖維素與皂化處理液(例 如氫氧化鈉水溶液)接觸。通過皂化處理，纖維素的酯類衍生物的酯 基與皂化處理液接觸后被水解，從而引入羥基以形成再生纖維素。由 此制備得到的再生纖維素與原來的纖維素在結(jié)晶狀態(tài)等方面是不同 的。此外，當(dāng)改變皂化率時，可以通過改變氫氧化鈉的濃度和處理時
間來進(jìn)行皂化處理?？梢酝ㄟ^XPS來容易地測定皂化率(例如可以 通過羰基峰的數(shù)量減少的程度來測定)。
作為向不含親水性基團(tuán)的有機(jī)材料的多孔膜中引入親水性基團(tuán) 的方法，可以將在聚合物主鏈或側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物 鏈連接到多孔膜上。用于將接枝聚合物鏈連接到有機(jī)材料的多孔膜中
的方法包括以下兩種即，使多孔膜與接枝聚合物鏈發(fā)生化學(xué)鍵合的 方法；以及以多孔膜作為起點(diǎn)，使具有可聚合雙鍵的化合物發(fā)生聚合，
從而形成接枝聚合物鏈的方法。
首先，在使多孔膜與接枝聚合物鏈發(fā)生化學(xué)鍵合的方法中，使 用在聚合物的末端或側(cè)鏈上具有能夠與多孔膜發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)這 樣的聚合物，所述聚合物可以通過其官能團(tuán)與多孔膜的官能團(tuán)之間發(fā) 生化學(xué)反應(yīng)而使該聚合物與多孔膜接枝。對能夠與多孔膜發(fā)生反應(yīng)的 官能團(tuán)沒有特別限定，只要它能夠與多孔膜的官能團(tuán)反應(yīng)即可，其實(shí)
例包括垸氧基硅烷等硅垸偶聯(lián)基、異氰酸酯基、氨基、羥基、羧基、 磺酸酯基、磷酸酯基、環(huán)氧基、烯丙基、甲基丙烯?；捅；?。 作為特別用作在聚合物末端或側(cè)鏈上具有反應(yīng)性官能團(tuán)的聚合物的 化合物，可以舉例為在其末端具有三垸氧基甲硅垸基的聚合物、在 其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具
有環(huán)氧基的聚合物以及在其末端具有異氰酸酯基的聚合物。對在此種
27情況下所使用的聚合物沒有特別限定，只要其具有與核酸的吸附有關(guān) 的親水性基團(tuán)即可，其示例性的實(shí)例包括聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基 丙烯酸羥乙酯以及它們的鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸 和聚甲基丙烯酸以及它們的鹽、聚氧乙烯等。
以多孔膜作為起始點(diǎn)、使具有可聚合的雙鍵的化合物進(jìn)行聚合而 形成接枝聚合物鏈的方法通常被稱為表面接枝聚合法。表面接枝聚合 法是這樣一種方法通過等離子體輻射、光輻射、加熱等方法，在多 孔膜表面上形成活性物質(zhì)；將具有可聚合雙鍵的化合物排布成與多孔 膜接觸；并通過聚合反應(yīng)將所述化合物鍵合到多孔膜上。用于形成與 多孔膜相連的接枝聚合物鏈的化合物必須同時具有含可聚合的雙鍵 以及含與核酸的吸附有關(guān)的親水性基團(tuán)這兩個特征。作為這樣的化合 物，可以使用具有親水性基團(tuán)的聚合物、具有親水性基團(tuán)的低聚物和 具有親水性基團(tuán)的單體中的任何一種化合物，只要其分子中具有雙鍵 即可。特別有用的化合物是具有親水性基團(tuán)的單體。作為特別有用的 具有親水性基團(tuán)的單體的示例性例子可以提及以下單體。例如，特別 優(yōu)選使用的是丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯、單甲基丙烯酸 甘油酯等含有羥基的單體。此外，也優(yōu)選使用的是丙烯酸、甲基丙烯 酸等含有羧基的單體，或其堿金屬鹽和胺鹽。
作為另外一種把親水性基團(tuán)引入到由不具有親水性基團(tuán)的有機(jī) 材料構(gòu)成的多孔膜中的方法，可以用具有親水性基團(tuán)的材料進(jìn)行涂 敷。對用于涂敷的材料沒有特別限定，只要其具有與核酸的吸附有關(guān) 的親水性基團(tuán)即可，但為了易于操作，有機(jī)材料的聚合物是優(yōu)選的。 作為所述聚合物，可以舉例為聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基丙烯酸羥乙 酯以及它們的鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸和聚甲基丙 烯酸以及它們的鹽、聚氧乙烯、醋酸纖維素、乙酰值各不相同的醋酸 纖維素的混合物等，在這些化合物中，優(yōu)選具有多糖結(jié)構(gòu)的聚合物。
此外，可以將醋酸纖維素或乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合 物涂敷到由不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料構(gòu)成的多孔膜上，然后對所 涂敷的醋酸纖維素或乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物進(jìn)行皂 化處理。在這種情況下，優(yōu)選的是皂化率為至少5%且至多100%，更優(yōu)選的是皂化率為至少10%且至多100%。作為由具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料所構(gòu)成的多孔膜，可舉例為含 有二氧化硅化合物的多孔膜。作為含有二氧化硅化合物的多孔膜，可舉例為玻璃濾膜。此外，也可舉例為諸如日本專利No. 3058342中所述的二氧化硅多孔薄膜。這種二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制備 將能夠形成雙分子膜的陽離子型的兩性物質(zhì)的展開液在基材上展開； 通過除去液體膜中的溶劑，在基材上制成兩性物質(zhì)的多層雙分子薄 膜；使該多層雙分子薄膜與含有二氧化硅化合物的溶液接觸；然后取 出并移走所述的多層雙分子薄膜。作為向由不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料所構(gòu)成的多孔膜中引入 親水性基團(tuán)的方法，存在著如下兩種方法 一種方法是使多孔膜與具 有親水性基團(tuán)的接枝聚合物鏈發(fā)生化學(xué)鍵合；另一種方法是使用分子 內(nèi)具有雙鍵的、含有親水性基團(tuán)的單體，并以多孔膜作為起始點(diǎn)進(jìn)行 聚合而形成接枝聚合物鏈。在使多孔膜與具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物鏈發(fā)生化學(xué)鍵合時， 可向無機(jī)材料中引入能夠與接枝聚合物鏈的末端官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的 官能團(tuán)，并且使接枝聚合物鏈被化學(xué)鍵合到該官能團(tuán)上。此外，當(dāng)使 用分子內(nèi)具有雙鍵的、含有親水性基團(tuán)的單體并以多孔膜作為起始點(diǎn)進(jìn)行聚合而形成接枝聚合物鏈時，在具有雙鍵的化合物進(jìn)行聚合時作為起始點(diǎn)的官能團(tuán)被引入到無機(jī)材料中。作為具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物以及分子內(nèi)具有雙鍵并含有親水性基團(tuán)的單體，可以適當(dāng)?shù)厥褂迷谏衔奶岬降南虿痪哂杏H水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜中引入親水性基團(tuán)的方法中所述的具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物以及分子內(nèi)具有雙鍵并含有親水性基團(tuán)的單體。作為向不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜中引入親水性基團(tuán)的另外一種方法，可以涂敷具有親水性基團(tuán)的材料。對涂敷所用的材 料沒有特別限定，只要其具有與核酸吸附有關(guān)的親水性基團(tuán)即可，但 是為了易于操作，有機(jī)材料的聚合物是優(yōu)選的。作為所述聚合物，可 以舉例為聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基丙烯酸羥乙酯以及它們的鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它們的鹽、聚氧乙烯、醋酸纖維素、乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物等。 此外，還可以將醋酸纖維素或乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合 物涂敷于不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜上，然后對經(jīng)涂敷的醋酸 纖維素或乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物進(jìn)行皂化處理。在這種 情況下，優(yōu)選的是皂化率為至少5%且至多100%，更優(yōu)選的是皂化率為至少10%且至多100%。作為不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜，可以舉例為由鋁等 金屬、玻璃、水泥、陶等陶瓷、或者新型陶瓷、硅、活性炭等加工制 成的多孔膜。優(yōu)選的是，上文所述的核酸吸附性多孔膜可以使溶液從其內(nèi)部穿過，并且該核酸吸附性多孔膜的厚度為10 pm到500 nm。更優(yōu)選的 是，該厚度為50 !im到250 pm。為了便于洗滌和縮短裂解物溶液的 穿過時間，優(yōu)選的是所述核酸吸附性多孔膜的厚度盡可能地薄。優(yōu)選的是，溶液可從其內(nèi)部穿過的核酸吸附性多孔膜的最小孔徑 為0.22pm或更大。更優(yōu)選的是，最小孔徑為0.5 |im或更大。此外， 優(yōu)選的是使用最大孔徑與最小孔徑之比為大于等于2的多孔膜，從而 可得到足夠的用于吸附核酸的表面積，并且?guī)缀醪粫l(fā)生堵塞。更優(yōu) 選的是，最大孔徑與最小孔徑之比為5或更大。優(yōu)選的是，溶液可從其內(nèi)部穿過的所述核酸吸附性多孔膜的孔隙 率為50%到95%。更優(yōu)選的是，孔隙率為65%到80%。此外，優(yōu)選的 是，所述核酸吸附性多孔膜的泡點(diǎn)為0.1 kgf/cn^到10kgf/cm2。更優(yōu) 選的是，其泡點(diǎn)為0.2 kgf/cm2到4 kgf/cm2。優(yōu)選的是，溶液可從其內(nèi)部穿過的所述核酸吸附性多孔膜的壓力 損失為0.1 kPa到100kPa。通過設(shè)定壓力損失，在壓力過高時也可獲 得均勻的壓力。更優(yōu)選的是，壓力損失為0.5 kPa到50 kPa。關(guān)于這 一點(diǎn)，壓力損失是指使水通過100pm厚的膜時所需的最小壓力。關(guān)于溶液可從其內(nèi)部穿過的所述核酸吸附性多孔膜的透水量，優(yōu) 選的是，在lkg/cn^的壓力、25"C的條件下使水通過時，每lcm2的 膜每1分鐘的透水量為lmL到5,000 mL。更優(yōu)選的是，在1 kg/cm2 的壓力、25。C的條件下使水通過時，每1 cr^的膜每1分鐘的透水量為5 mL至(J 1,000 mL。優(yōu)選的是，溶液可從其內(nèi)部穿過的所述核酸吸附性多孔膜是這樣 一種纖維素衍生物當(dāng)將邊長為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三 氟乙酸中時，該纖維素衍生物在1小時以內(nèi)不溶解，但是在48小時 以內(nèi)溶解。此外，也優(yōu)選這樣的纖維素衍生物當(dāng)將邊長為5mm的 正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸中時，該纖維素衍生物在1小時以 內(nèi)溶解，但是當(dāng)將所述膜浸在5 mL二氯甲烷中時，該纖維素衍生物 在24小時以內(nèi)不溶解。在這些纖維素衍生物中，更優(yōu)選的是這樣的 纖維素衍生物當(dāng)將邊長為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙 酸中時，該纖維素衍生物在1小時以內(nèi)溶解，但是當(dāng)將所述膜浸在5 m L 二氯甲烷中時，該纖維素衍生物在2 4小時以內(nèi)不溶解。當(dāng)使裂解物溶液穿過核酸吸附性多孔膜時，為了使溶液能夠與多 孔膜均勻接觸，優(yōu)選的是使裂解物溶液從多孔膜的一側(cè)流到另一側(cè)。 當(dāng)使裂解物溶液穿過核酸吸附性多孔膜時，為了不發(fā)生堵塞，優(yōu)選的 是使裂解物溶液從核酸吸附性多孔膜的較大孔徑一側(cè)穿到核酸吸附 性多孔膜的較小孔徑一側(cè)。當(dāng)使裂解物溶液穿過核酸吸附性多孔膜時，優(yōu)選的是其流速為 每平方厘米膜面積2 ^L/秒到1,500 )iL/秒，從而使溶液與多孔膜達(dá)到 合適的接觸時間。當(dāng)溶液與多孔膜的接觸時間太短時，不能得到充分 的分離純化效果；而當(dāng)接觸時間太長時，從操作性方面來說不是優(yōu)選 的。更優(yōu)選的是所述流速為每平方厘米膜面積5 ^L/秒到700 pL/秒。此外，所使用的溶液可以從其內(nèi)部穿過的核酸吸附性多孔膜可以以一層膜的方式被使用，但也可以以兩層或多層膜的方式被使用。兩層或多層的核酸吸附性多孔膜可以彼此相同或互不相同。兩層或多層的核酸吸附性多孔膜可以是無機(jī)材料核酸吸附性多孔 膜與有機(jī)材料核酸吸附性多孔膜的組合。例如，作為這樣的組合可以提及玻璃濾膜與再生纖維素多孔膜的組合。此外，兩層或多層的核酸吸 附性多孔膜可以是無機(jī)材料核酸吸附性多孔膜與有機(jī)材料非核酸吸 附性多孔膜的組合。例如，作為這樣的組合可以提及玻璃濾膜與尼龍 或聚砜多孔膜的組合?？蓛?yōu)選使用這樣的核酸分離純化柱該核酸分離純化柱在具有至 少兩個開口的容器中容納有所述的核酸吸附性多孔膜，溶液可穿過該核酸吸附性多孔膜。此外，可優(yōu)選使用這樣的核酸分離純化柱該核 酸分離純化柱在具有至少兩個開口的容器中容納有兩層或多層所述 的核酸吸附性多孔膜，溶液可穿過該核酸吸附性多孔膜。在這種情況 下，在具有至少兩個開口的容器中所容納的兩層或多層的核酸吸附性 多孔膜可以彼此相同或互不相同。優(yōu)選的是，除了溶液可從其內(nèi)部穿過的核酸吸附性多孔膜以外， 所述的核酸分離純化柱在所述的具有至少兩個開口的容器中不再容 納有其它部件。作為上述容器的材料，可以使用聚丙烯、聚苯乙烯、 聚碳酸酯、聚氯乙烯等塑料。此外，也優(yōu)選使用可生物降解的材料。此 外，所述容器可以是透明的或有顏色的。作為所述核酸分離純化柱，可以使用裝備有用于區(qū)分各個核酸分 離純化柱的單元這樣的核酸分離純化柱。作為用于區(qū)分各個核酸分離純 化柱的單元，可以舉例為條形碼、二維條形碼、磁帶、IC卡等。此外，也可使用具有這種結(jié)構(gòu)的核酸分離純化柱，所述結(jié)構(gòu)使得 可以很容易地從所述具有至少兩個開口的容器中取出核酸吸附性多 孔膜。在使核酸從多孔膜上解吸附的過程中，當(dāng)回收液對膜的浸漬時間 較短時，需要進(jìn)行多次提取操作，但是當(dāng)浸漬時間延長時，可能通過 一次或較少次數(shù)的提取操作就能洗脫出更多量的核酸。本發(fā)明人經(jīng)過 仔細(xì)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在提取核酸的過程中，當(dāng)浸漬時間為至少0.1秒 且至多600秒時，可以獲得足夠量的核酸。當(dāng)裂解液中表面活性劑的濃度增加時，裂解物溶液和洗滌液的穿 過時間變短，但是為了獲得所需量的核酸需要進(jìn)行多次提取操作，由 此產(chǎn)生了所回收的核酸的濃度降低的問題，然而，可以通過延長核酸 吸附性膜在回收液中的浸漬時間來回收得到更多量的核酸。將所制備的裂解物溶液注入兩個或多個提取柱中可能會使分析 物穿過，而當(dāng)所用的提取柱數(shù)量少于上述情況時，所述的分析物原本 會造成堵塞，或使裂解物溶液和洗滌液的穿過時間延遲。通過洗滌步驟使最終獲得的RNA的回收量和純度提高，并且可以使含有所需RNA的分析物的液體量達(dá)到最少。此外，當(dāng)自動進(jìn)行 洗滌操作和回收操作時，可以簡單快速地實(shí)施所述操作。當(dāng)需要加快 速度時，可以實(shí)施一次洗滌步驟，但是當(dāng)純度更為重要時，則需要重 復(fù)洗滌兩次或更多次。在洗滌步驟中，使用試管、移液管、自動注射裝置或其它的具有 類似功能的供給部件，將洗滌液提供到容納有核酸吸附性多孔膜的核 酸分離純化柱中?？梢詫⑾礈煲簭暮怂岱蛛x純化柱的開口 1 (核酸混 合物溶液已通過該開口注入)供入，并且通過使用與所述開口 1連接 的壓力差產(chǎn)生裝置(例如滴液管、注射器、泵、電動移液管等)在核 酸分離純化柱的內(nèi)部被調(diào)節(jié)為加壓狀態(tài)的條件下使溶液穿過該核酸 吸附性多孔膜而從不同于所述開口 1的另一個開口排出。此外，洗滌 液也可以由開口 1供入并由該開口 1排出。還可以將洗滌液由核酸分 離純化柱的不同于所述開口1(核酸混合物溶液已通過該開口注入)的另一個開口供入和排出。在這些方式中，更優(yōu)選的方式如下洗滌液由核酸分離純化柱的開口l供入，并使溶液穿過核酸吸附性多孔膜 而從不同于所述開口1的另一個開口排出，這是因?yàn)樵摲绞骄哂袃?yōu)異 的洗滌效率。優(yōu)選的是，在洗滌步驟中洗滌液的溫度為4。C到70。C。此外， 更優(yōu)選的是，將洗滌液溫度設(shè)定為室溫。在洗滌步驟中，在進(jìn)行洗滌 步驟的同時可以對核酸分離純化柱施加機(jī)械振動或超聲波來進(jìn)行攪 拌?？晒┻x用的其它方式是，可通過實(shí)施離心操作來進(jìn)行洗滌。優(yōu)選的是，在洗滌步驟中洗滌液為這樣的溶液其含有水溶性有機(jī)溶液和水溶性鹽中的至少一種。洗滌液必須具有能夠洗出核酸混合 物溶液中的雜質(zhì)(該雜質(zhì)與核酸一起被吸附在核酸吸附性多孔膜上)的能力。為了達(dá)到這種效果，洗滌液必須為這樣的組分該組分不會 使核酸從核酸吸附性多孔膜上解吸附，但能夠使雜質(zhì)解吸附。為達(dá)到 這個目的，由于核酸微溶于醇類等水溶性有機(jī)溶劑中，因此水溶性有 機(jī)溶劑適合于使除核酸之外的其它成分解吸附而使核酸保留在核酸 吸附性多孔膜上。此外，由于加入水溶性鹽可以增強(qiáng)核酸的吸附效果，從而可以使選擇性地除去雜質(zhì)和不需要的成分的作用得以提高。作為洗滌液中所含有的水溶性有機(jī)溶劑，可以使用醇類。作為醇 類，可以舉例為甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇和丁醇。丙醇可以是異丙醇或正丙醇，丁醇可以是直鏈或支鏈的?？梢允褂盟龃贾械膬煞N 或多種。在這些醇中，優(yōu)選使用乙醇。在洗滌液中所含有的水溶性有機(jī)溶劑的量優(yōu)選為5質(zhì)量％到100質(zhì)量％、更優(yōu)選為5質(zhì)量％到40質(zhì)量％。此范圍是優(yōu)選的，這是因?yàn)?可以在不會增加DNA等污染物、不會使所關(guān)注的RNA從多孔膜上解 吸附的條件下使RNA的回收量提高并由此使RNA具有高純度。另一方面，優(yōu)選的是洗滌液中所含有的水溶性鹽為鹵化物，特別 是氯化物。此外，優(yōu)選的是該水溶性鹽含有單價或二價正離子，特別 優(yōu)選為堿金屬鹽或堿土金屬鹽，在這些金屬鹽中，鈉鹽和鉀鹽是優(yōu)選 的，并且鈉鹽是最優(yōu)選的。當(dāng)洗滌液中含有水溶性鹽時，水溶性鹽的濃度優(yōu)選為至少10毫 摩爾/升，對其上限沒有特別限定，只要該濃度范圍不會破壞雜質(zhì)的 溶解度即可，所述上限的濃度優(yōu)選為至多1摩爾/升，更優(yōu)選為0.1摩 爾/升。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述水溶性鹽為氯化鈉，并且特別優(yōu)選的 是氯化鈉的濃度為20毫摩爾/升或更高。優(yōu)選的是，洗滌液中不含有離液物質(zhì)。這樣，可以減少在回收 步驟中離液物質(zhì)造成污染的可能性。當(dāng)在回收步驟中離液物質(zhì)造成污 染時，該物質(zhì)會抑制在進(jìn)行RT-PCR等反應(yīng)時的酶反應(yīng)，因此，考慮 到之后進(jìn)行的酶反應(yīng)等的情況，理想的是洗滌液中不含有離液物質(zhì)。 此外，離液物質(zhì)具有腐蝕性并且是有害的，鑒于這些性質(zhì)，為了安全 地進(jìn)行試驗(yàn)操作，不使用離液物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)人員來說是特別有利的。就這一點(diǎn)而言，離液物質(zhì)是指上文所述的尿素、鹽酸胍、異硫 氰酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、碘化鈉、碘化鉀等。傳統(tǒng)上，在進(jìn)行核酸分離純化過程的洗滌步驟中，由于洗滌液 對柱等容器具有高度的潤濕性，所以洗滌液常常被保留在容器中，結(jié) 果在實(shí)施回收步驟時殘留有洗滌液，使核酸的純度降低并使后續(xù)步驟 的反應(yīng)性降低。因此，當(dāng)使用柱等容器來進(jìn)行核酸的吸附和解吸附時，34重要的是，在吸附步驟和洗滌步驟中使用的溶液(特別是洗滌液)未 殘留在柱內(nèi)，這樣洗滌液就不會對下一步及其后的步驟產(chǎn)生影響。因此，為了防止洗滌步驟中使用的洗滌液殘留在回收步驟中使 用的回收液中，并由此使殘留在柱內(nèi)的洗滌液最少，優(yōu)選的是洗漆液的表面張力為小于0.035 J/m2。當(dāng)表面張力小時，洗滌液對柱的潤濕性能提高，這樣可以控制殘留的液體的體積。然而，雖然為了提高洗滌效率，可增加水的比例，但在這種情 況下，洗滌液的表面張力增大并且殘留的液體的體積也增多。當(dāng)洗滌液的表面張力為0.035 J/i^或更大時，可通過增強(qiáng)柱的斥水性來控制 殘留的液體的體積。當(dāng)柱的斥水性增強(qiáng)時，會形成液滴，并且可以通 過使液滴滴落下來來控制殘留的液體的體積。作為用于增強(qiáng)斥水性的 方法，存在這樣的方法在柱的表面上涂敷硅或類似的防水劑；在柱 成型時混入硅或類似的防水劑，但不限于此。使用本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜可以簡化洗滌步驟。(1)可將 洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜的次數(shù)設(shè)定為一次。(2)可在室溫下 實(shí)施洗滌步驟。(3)在洗滌步驟之后，可以立即實(shí)施隨后的步驟。(4)也可將上述(1) 、 (2)和(3)中的一者或兩者或多者組合起 來。在傳統(tǒng)方法中，為了快速地除去洗滌液中所含有的有機(jī)溶劑，在 許多情況下需要干燥步驟，但是由于本發(fā)明中所使用的核酸吸附性多 孔膜是一種薄膜，因此可以省略干燥步驟。在傳統(tǒng)的RNA分離和純化方法中，存在以下問題在實(shí)施洗滌 步驟時，洗滌液經(jīng)常濺散并附著在其它部位上，從而造成樣品污染。 通過設(shè)計核酸分離純化柱的形狀和廢液容器的形狀，可以防止洗滌步 驟中的這類污染，其中所述的核酸分離純化柱是通過將核酸吸附性多 孔膜密封在具有兩個開口的容器中而制備得到的。為了從含有DNA和RNA的裂解物溶液中選擇性地只分離和純化 RNA，該目的可以通過以下過程實(shí)現(xiàn)，所述過程為使溶液穿過容納 有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱，由此使核酸被核酸吸附性多 孔膜吸附(吸附步驟)，然后進(jìn)行洗滌(洗滌步驟l)，并進(jìn)行脫氧 核糖核酸酶處理的步驟。對脫氧核糖核酸酶沒有特別限定，可使用任何脫氧核糖核酸酶。 在脫氧核糖核酸酶對核酸分離純化柱中的核酸吸附性多孔膜進(jìn)行處理的步驟中，處理所需時間根據(jù)含有DNA和RNA的核酸混合物 溶液中DNA的量和起作用的脫氧核糖核酸酶的濃度而變化，但是處 理所需時間優(yōu)選為5秒鐘到360分鐘、更優(yōu)選為30秒鐘到130分鐘。 此外，在脫氧核糖核酸酶對核酸分離純化柱中的核酸吸附性多孔膜進(jìn) 行處理的步驟中所采用的溫度可以為4'C或更高、優(yōu)選為l(TC到50 °C，當(dāng)需要提高反應(yīng)效率時，可以在更高的溫度(例如5(TC到70°C) 下進(jìn)行反應(yīng)。就這一點(diǎn)而言，表述"使脫氧核糖核酸酶對核酸吸附性 多孔膜進(jìn)行處理"是指使被核酸吸附性多孔膜所吸附的核酸所處的部 分與脫氧核糖核酸酶發(fā)生反應(yīng)；表述"在核酸吸附性多孔膜上"不僅 包括在核酸吸附性多孔膜的上面，而且還包括多孔膜的孔內(nèi)，或者膜 孔的出口處等地方。此外，本發(fā)明中加入脫氧核糖核酸酶的操作還具有縮短洗滌液的穿 過時間或改善堵塞情況的目的。除了脫氧核糖核酸酶之外，還可以加入蛋白降解酶、脂降解酶、糖 降解酶、核酸降解酶以及氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑、或者它們的混合物中 的任意一種。通過加入這些物質(zhì)，可以將殘留在膜上的造成堵塞的物質(zhì) 的組成成分降解，這樣可以提高洗滌液的穿過能力，縮短洗滌液的穿過 時間和改善堵塞的情況?？梢栽诹呀馕锶芤捍┻^之后加入所述的物質(zhì)，但是更優(yōu)選的是使用 洗滌液進(jìn)行多次洗滌。這是因?yàn)樘貏e是在使用了蛋白降解酶、脂降解酶、 糖降解酶或核酸降解酶時，受到殘留在膜上的離液鹽的影響使得這些降 解酶發(fā)生變性并且使它們的活性受到抑制，這樣非常有可能使降解造成 堵塞的物質(zhì)的能力降低并且洗滌液的穿過時間不能縮短。使用試管、移液管、自動注入裝置或具有類似功能的供給部件將 回收液供給到容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱中。將回收 液由核酸分離純化柱的開口1(核酸混合物溶液己通過該開口注入) 供入，并且使用與所述開口 l連接的壓力差產(chǎn)生裝置(例如滴液管、 注射器、泵、電動移液管等)在核酸分離純化柱的內(nèi)部被調(diào)節(jié)為加壓狀態(tài)的條件下通過使溶液穿過核酸吸附性多孔膜而從不同于所述開 口 1的另一個開口排出。此外，回收液也可以由開口 1供入并由該開 口 1排出。還可以將回收液由核酸分離純化柱的不同于所述開口 l(核 酸混合物溶液已通過該開口注入)的另一個開口供入和排出。在這些 方法中，更優(yōu)選的方法如下回收液由核酸分離純化柱的開口 1供入， 并使溶液穿過核酸吸附性多孔膜而從不同于所述開口l的另一個開口 排出，這是因?yàn)樵摲椒ň哂袃?yōu)異的回收效率?；谟煞治鑫锼频玫暮怂峄旌衔锶芤旱牧?，通過調(diào)節(jié)回收液的量來進(jìn)行RNA的解吸附。含有分離和純化后的RNA的回收液的體積 取決于所使用的分析物的量?；厥找旱囊话愠Ｓ皿w積為幾十微升到幾 百微升，但是當(dāng)分析物的量極少時，或者相反，當(dāng)需要分離和純化大 量的RNA時，回收液的量可在1微升到幾十毫升的范圍內(nèi)變化。作為回收液，可優(yōu)選使用精制后的蒸餾水、Tds/EDTA緩沖液等。 此外，當(dāng)將經(jīng)過所述步驟后所回收的RNA進(jìn)行RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))時，還可使用用于RT-PCR的緩沖液(例如，含有最 終濃度分別為75毫摩爾/升的KC1、 50毫摩爾/升的Tris-HCl、 3.0毫 摩爾/升的MgCh以及10毫摩爾/升的DDT的水溶液)。優(yōu)選的是，回收液的pH為pH 1到pH 10、更優(yōu)選為pH2到pH 7。此外，特別是離子強(qiáng)度和鹽濃度會對被吸附的RNA的洗脫產(chǎn)生影 響。優(yōu)選的是，回收液的離子強(qiáng)度為500毫摩爾/升或更低。鹽濃度 優(yōu)選為0.5摩爾/升或更低、更優(yōu)選為至少0.01毫摩爾/升且至多50毫 摩爾/升。這樣，RNA的收率提高，從而可回收更多量的RNA。通過減少回收液的量，可以得到含有濃縮后的核酸的回收液。優(yōu) 選的是，(回收液的體積):(核酸混合物溶液的體積)=1:100到99:100， 更優(yōu)選的是，(回收液的體積):(核酸混合物溶液的體積)=1:10到9:10。 由此，可以方便地濃縮核酸，而無需在核酸分離純化之后的步驟中實(shí) 施濃縮操作。通過這些方法，可提供一種用于得到與分析物相比其核 酸被濃縮的核酸溶液的方法。作為另一個實(shí)施方案，通過調(diào)節(jié)回收液的體積來進(jìn)行核酸的解吸 附，可獲得含有所需濃度的核酸的回收液，并且可以獲得具有適合于后續(xù)步驟(例如當(dāng)實(shí)施RT-PCR時)的核酸濃度的回收液。優(yōu)選的是， (回收液的體積):(核酸混合物溶液的體積)=1:1到50:1，更優(yōu)選的是， (回收液的體積):(核酸混合物溶液的體積)=1:5到5:1。由此，可得到 這樣的優(yōu)點(diǎn)能夠避免在核酸分離純化之后進(jìn)行繁瑣的濃度調(diào)節(jié)操 作。此外，通過使用足量的回收液，可以提高從多孔膜上回收的核酸 的回收量。當(dāng)使用回收液使被吸附的核酸從固體材料上解吸附時，可 以通過延長固體材料在回收液中的浸漬時間來提高核酸的回收量?；?收液的浸漬時間優(yōu)選為0.1秒至1，600秒、更優(yōu)選為5秒至600秒。此外，根據(jù)目的不同來改變回收液的溫度，可以方便地回收核酸。 例如，通過將回收液的溫度調(diào)節(jié)為0"C到l(TC來使核酸從多孔膜上解 吸附，此時不用加入能夠抑制酶的降解作用的某些試劑也不用采取特 殊的操作，就可以通過抑制核酸降解酶的作用來抑制核酸的降解，因 此可以方便有效地得到核酸溶液。此外，在將回收液的溫度調(diào)節(jié)為1(TC到35'C時，可在通常的室 溫條件下進(jìn)行核酸的回收，從而使核酸解吸附并進(jìn)行分離和純化，而 無需復(fù)雜的步驟。作為另一個實(shí)施方案，當(dāng)將回收液的溫度設(shè)定為較高的溫度(例 如35。C到7(TC)時，可方便地使核酸從多孔膜上解吸附并具有較高 的回收量，而無需復(fù)雜的操作。對回收液的注入次數(shù)沒有限定，注入次數(shù)可以是一次或兩次或 多次。通常，在方便快捷地分離和純化核酸時，可進(jìn)行一次回收操作， 但是在回收大量核酸時，可兩次或多次注入回收液。在回收步驟中，可以將核酸回收液配制成可以用于后續(xù)步驟的 組合物。在許多情況下，經(jīng)分離和純化后的核酸有時要進(jìn)行RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))操作。在此情況下，必須用適合于RT-PCR 方法的緩沖液來稀釋經(jīng)分離和純化后的核酸。當(dāng)在本方法的回收步驟 的回收液中使用適合于RT-PCR方法的緩沖液時，可方便快捷地進(jìn)入 隨后的RT-PCR步驟。此外，在回收步驟中，為了抑制被回收在核酸回收液中的核酸 的降解，可加入穩(wěn)定劑。作為穩(wěn)定劑，可加入抗菌劑、抗真菌劑、核酸降解抑制劑等。作為核酸降解抑制劑，可舉例為核酸酶類抑制劑， 具體來說可提及EDTA等。此外，作為其它的實(shí)施方案，可以預(yù)先 向回收容器中加入穩(wěn)定劑。對回收步驟中所使用的回收容器沒有特別限定，但可使用由在260 nm處無吸收的材料所制成的回收容器。在此情況下，無需把回 收的核酸溶液轉(zhuǎn)移到其它容器中就可以測量該溶液的濃度。作為在 260 nm處無吸收的材料，可使用(例如)石英玻璃等，但不限于此。使用可以實(shí)施上述方法中所包括的步驟的自動裝置來實(shí)施以下 操作使用在具有至少兩個開口的容器中容納有核酸吸附性多孔膜的 核酸分離純化柱以及壓力差產(chǎn)生裝置，從含有核酸的分析物中分離和 純化核酸。此外，通過利用可以自動使用成套用具的自動裝置來實(shí)施 所述操作。通過這樣的自動裝置，不僅可使操作簡單快速，而且不管 操作者的技能如何，都可以得到一定水平的核酸。以下示出自動裝置的實(shí)例，該自動裝置通過使用在具有至少兩 個開口的容器中容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱以及壓 力差產(chǎn)生裝置來從含有核酸的分析物中自動地進(jìn)行分離和純化核酸 的步驟，但本發(fā)明的自動裝置不限于此。所述的自動裝置是這樣的裝置，該裝置可以自動地實(shí)施用于選 擇性地分離和純化RNA的分離純化操作，該操作包括以下步驟使 用容納有溶液可穿過的核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱；將含有 核酸的核酸混合物溶液注入到所述核酸分離純化柱中；通過加壓使所 述核酸混合物溶液中的核酸吸附到上述的核酸吸附性多孔膜上；向所 述核酸分離純化柱中注入洗滌液并通過加壓除去雜質(zhì)；向所述核酸分 離純化柱中注入脫氧核糖核酸酶，從而在核酸吸附性多孔膜上使脫氧 核糖核酸酶發(fā)生作用；通過加壓使脫氧核糖核酸酶穿過核酸吸附性多 孔膜的內(nèi)部；向所述核酸分離純化柱中注入洗滌液，并通過加壓除去 被降解的DNA;然后，向所述核酸分離純化柱中注入回收液，從而 使被核酸吸附性多孔膜所吸附的RNA解吸附，并且將解吸附的RNA 與回收液一起回收。優(yōu)選的是所述裝置裝配有負(fù)載機(jī)構(gòu)，用于承載 所述的核酸分離純化柱；廢液容器，用于容納所述核酸混合物溶液的殘余物、脫氧核糖核酸酶和洗滌液的排出液；回收容器，用于容納含 有RNA的所述回收液；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，用于將壓縮空氣導(dǎo)入到 所述核酸分離純化柱中；以及注入機(jī)構(gòu)，用于分別向所述核酸分離純 化柱中注入洗滌液、脫氧核糖核酸酶和回收液。優(yōu)選的是，所述負(fù)載機(jī)構(gòu)裝配有安裝在裝置主體上的立架；承 載于所述立架上并可上下移動的柱支架，所述柱支架用于保持所述的 核酸分離純化柱；以及用于承載所述的廢液容器和回收容器的容器支 架，在所述柱支架的下方該廢液容器和回收容器相對于所述核酸分離 純化柱可互換它們的位置。此外，優(yōu)選的是所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)裝配有用于從底部噴 射壓縮空氣的氣嘴；壓頭，用于承載所述氣嘴、并用于使所述氣嘴可 以相對于承載在所述柱支架上的所述核酸分離純化柱而上下移動；以 及設(shè)置在所述壓頭中的定位部件，該定位部件用于對位于所述負(fù)載機(jī) 構(gòu)的臺架上的核酸分離純化柱進(jìn)行定位。此外，優(yōu)選的是所述的注入機(jī)構(gòu)裝配有注入所述洗滌液的洗滌 液注入嘴；注入所述脫氧核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶注入嘴；注入 所述回收液的回收液注入嘴；注入嘴移動臺，該移動臺用于承載所述 洗滌液注入嘴、所述脫氧核糖核酸酶注入嘴和所述回收液注入嘴并可 以在由所述負(fù)載機(jī)構(gòu)所承載的核酸分離純化柱上按順序移動；洗滌液 供給泵，用于從容納有洗滌液的洗滌液瓶中抽吸洗滌液并把洗滌液供 給到所述的洗滌液注入嘴中；脫氧核糖核酸酶供給泵，用于從容納有 脫氧核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶瓶中抽吸脫氧核糖核酸酶并把脫 氧核糖核酸酶供給到所述的脫氧核糖核酸酶注入嘴中；以及回收液供 給泵，用于從容納有回收液的回收液瓶中抽吸回收液并把回收液供給 到所述的回收液注入嘴中。采用本發(fā)明的諸如上述自動裝置之類的裝置(該自動裝置裝配 有核酸分離純化柱；負(fù)載機(jī)構(gòu)，用于承載廢液容器和回收容器； 壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，用于把壓縮空氣導(dǎo)入到核酸分離純化柱中；以 及注入機(jī)構(gòu)，用于分別把洗滌液、脫氧核糖核酸酶和回收液注入到 核酸分離純化柱中)，通過自動地實(shí)施分離和純化RNA的步驟，可以構(gòu)建在短時間內(nèi)能有效地自動對核酸混合物溶液中的RNA進(jìn)行 分離和純化的機(jī)構(gòu)，其中所述分離和純化RNA的步驟為向容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱內(nèi)注入含有核酸的樣品溶液；通 過加壓使核酸混合物溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；通過 注入洗滌液來洗滌并排出雜質(zhì)；向所述核酸分離純化柱中注入脫氧核 糖核酸酶，使脫氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上發(fā)生作用；通過 加壓使脫氧核糖核酸酶穿過核酸吸附性多孔膜的內(nèi)部；向所述核酸分 離純化柱中注入洗滌液，從而通過加壓除去降解的DNA;然后注入回 收液，從而使被核酸吸附性多孔膜所吸附的RNA解吸附，并回收解 吸附的RNA。此外，當(dāng)所述負(fù)載機(jī)構(gòu)是通過裝配有立架、可上下移動的柱支架 (該柱支架用于承載核酸分離純化柱)以及容器支架(該容器支架用 于承載廢液容器和回收容器，并且使所述廢液容器和回收容器可交換 位置)而構(gòu)成時，就可以容易地設(shè)定核酸分離純化柱和上述兩個容器 的位置，并可使廢液容器和回收容器容易地互換位置。此外，當(dāng)所述壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)是通過裝配有氣嘴、用于使所述 氣嘴上下移動的壓頭以及用于確定核酸分離純化柱的位置的定位部 件而構(gòu)成時，通過這樣簡單的機(jī)構(gòu)就可穩(wěn)妥地供給壓縮空氣。此外，當(dāng)所述注入機(jī)構(gòu)是通過裝配有注入嘴移動臺(該移動臺可 使洗滌液注入嘴、脫氧核糖核酸酶注入嘴、回收液注入嘴在核酸分離 純化柱上依次移動)、洗滌液供給泵(其從洗滌液瓶中抽吸洗滌液并 把洗滌液供給到洗滌液注入嘴中)以及回收液供給泵(其從回收液瓶 中抽吸回收液并把回收液供給到回收液注入嘴中)而構(gòu)成時，就可以 通過簡單的機(jī)構(gòu)依次分別注入洗滌液和回收液。對本發(fā)明中所使用的分析物沒有特別限定，例如在診斷領(lǐng)域中， 作為分析物而采集的全血、血漿、血清、尿液、糞便、精液、唾液等 體液，或者植物(或其一部分)、動物(或其一部分)、細(xì)菌、病毒、 培養(yǎng)的細(xì)胞、其裂解物、其勻漿物等生物材料都可以成為目的物。作 為培養(yǎng)的細(xì)胞，可舉例為浮游細(xì)胞、粘附細(xì)胞等。浮游細(xì)胞是指這樣 的細(xì)胞其浮游在培養(yǎng)基中進(jìn)行生長和繁殖，而不是粘著在容器壁上，例如，可提及HL60細(xì)胞，U 937細(xì)胞、HeLa S3細(xì)胞等作為代表性 的細(xì)胞株。粘附細(xì)胞是指在培養(yǎng)基中粘著在容器壁上進(jìn)行生長和繁殖 的細(xì)胞，例如，可提及NIH3T3細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、 COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞等作為代表性的細(xì)胞株。作為用作分析物的動 物(或其一部分)，可舉例為動物組織。例如，可以使用在動物解剖 或活體解剖時采集到的可構(gòu)成肝臟、腎臟、脾臟、腦、心臟、肺、胸 腺等器官的所有組織。優(yōu)選的是使用含有可以使細(xì)胞膜和核膜裂解的試劑的水溶液(所 謂的核酸溶解試劑)來處理這些分析物，并由此使核酸溶出。由此， 可以得到其細(xì)胞膜和核膜被裂解并且核酸分散于水溶液中的核酸混 合物溶液。根據(jù)本發(fā)明，"核酸"可以是單鏈、雙鏈、三鏈和四鏈中的任意一 種或者是它們的混合物中的任意一種，并且對分子量沒有限定。此外， "核酸"可以是DNA、 RNA、其修飾產(chǎn)物和它們的混合物中的任意一 種。例子下面基于例子詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下例子。 (發(fā)明例1)分散介質(zhì)的替換對RNA的回收量和穿過時間的影響準(zhǔn)備約IO,OOO，OOO個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60 (該細(xì)胞經(jīng)過PBS 洗滌，離心后除去洗滌液，然后冷凍保存)。所得到的粒狀細(xì)胞中含 有PBS。將冷凍保存的粒狀細(xì)胞解凍后進(jìn)行表1所示的處理。表1(a) 未處理(直接使用粒狀細(xì)胞)(b) 將30 |iL份的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)加入(a)中(c) 盡可能除去PBS(d) 將30 |iL份的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)加入(c)中在(b)和(d)的情況中，通過進(jìn)行移液操作和渦漩處理使細(xì)胞分散。向其中加入610 |iL的LR 001 (由Fuji Photo Film株式會社生 產(chǎn))，然后立刻進(jìn)行5次移液處理。使用由3.66摩爾/升的硫氰酸胍、 1體積％的2-巰基乙醇和30 pL的乙醇所構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后， 使用CUTE MIXER CM-1000 (由EYELA株式會社生產(chǎn))進(jìn)行1分鐘 的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入190 的乙醇并立刻進(jìn)行漩渦處理5秒 鐘。在這種情況下，以一個樣品接一個樣品的方式對樣品進(jìn)行攪拌處 理。然后，使用CUTE MIXER CM-1000攪拌(2,500 rpm) 55秒鐘。 在這種情況下，每次對4個樣品進(jìn)行攪拌處理。在通過離心進(jìn)行沉淀 之后，制得裂解物溶液。將NEXT柱(由Fuji Photo Film株式會社生產(chǎn)，開口為7 mm， 細(xì)孔為2.5 pm)、洗滌液(WRC)和回收液(CRC)放置在Quick Gene 800 (由Fuji Photo Film株式會社生產(chǎn))上，然后將裂解物溶液加入 到NEXT柱中，通過Quick Gene 800的RNA模式來進(jìn)行提取。在這 種情況下，將洗滌液的體積設(shè)定為500 pL，將回收液的體積設(shè)定為 100 nL，將回收液的浸漬時間設(shè)定為30秒，將加壓時間(即，堵塞 判斷時間)設(shè)定為120秒。使用紫外可見分光光度計NanoDrop (由NanoDrop Technologies 株式會社生產(chǎn))來對所回收的RNA進(jìn)行定量以及純度測定，根據(jù)260 nm處的吸光度來對回收量進(jìn)行定量，根據(jù)260 nm與280 nm處的吸 光度之比來測定核酸的純度，當(dāng)該比值為1.8或更大時，可判斷為純 度良好。利用凝膠電泳對DNA等污染物進(jìn)行分析。關(guān)于凝膠電泳的 條件，以TAE (Tris-乙酸)作為緩沖液，將5 (iL的樣品與上樣緩沖 液(10XBlue Juice)混合，然后將全部量的混合物進(jìn)行電泳。所得結(jié)果如圖1所示。未經(jīng)處理的樣品(a)發(fā)生堵塞。PBS被 除去后的樣品(c)沒有造成堵塞，但是裂解物的穿過時間為比較長 的77秒鐘。與此形成對比的是，其中加入有Bis-Tris緩沖液的樣品 (b)和(d)，其裂解物的穿過時間為50秒左右，這個時間是相當(dāng) 低的。(對比例1)分散介質(zhì)的種類和體積與RNA回收量和穿過時間的關(guān)系將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 預(yù)定量的PBS或0.5摩爾/升的Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移 液或渦漩處理使所得細(xì)胞分散。向其中加入540 (iL份的裂解液，然 后立刻進(jìn)行5次移液處理。使用由3.66摩爾/升的硫氰酸胍(GTC)、 1體積％的2-巰基乙醇和30 pL的乙醇所構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后， 使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2，500 rpm)， 然后通過離心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入230 pL的乙醇并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩 處理。然后，使用CUTE MIXER CM-1000對所得到的物質(zhì)進(jìn)行攪拌 (2,500 rpm) 55秒鐘，并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。 然而，當(dāng)樣品的數(shù)量為1時，在加入乙醇后攪拌時間不分為5秒和55 秒，而是在加入乙醇后立刻進(jìn)行60秒鐘的渦漩處理，從而制得裂解 物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。所得結(jié)果如圖2所示。當(dāng)未加有分散介質(zhì)時，裂解物的穿過時間 為比較長的90秒鐘，并且在第二次洗滌時發(fā)生堵塞。另一方面，當(dāng) 加入有分散介質(zhì)時，裂解物的穿過時間縮短約35%至約60%，從而使 穿過能力顯著改善。在此，設(shè)定這樣的條件當(dāng)穿過時間超過120秒 時可判斷為堵塞。關(guān)于分散介質(zhì)的種類與穿過時間的關(guān)系，與PBS 緩沖液的情況相比，Bis-Tds緩沖液可以有效地使裂解物的穿過時間 縮短約20%至約30%，并且使洗滌液的穿過時間顯著縮短約70%。關(guān) 于分散介質(zhì)的液體體積與穿過時間的關(guān)系，當(dāng)分散介質(zhì)的體積較多 時，可以稍微縮短穿過時間，但是分散介質(zhì)的體積大于或等于30 就足夠了?；谏厦嫠?，優(yōu)選的是存在分散介質(zhì)，并且當(dāng)以Bis-Tds 緩沖液作為分散介質(zhì)并且其液體量為至少30 pL時就可以得到優(yōu)選的 結(jié)果。(發(fā)明例2)分散介質(zhì)的濃度與RNA的回收量和穿過時間的關(guān)系 將被冷凍保存的約IO,OOO，OOO個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與30 pL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩 處理將所得細(xì)胞分散。向其中加入490 pL份的裂解液。使用由5摩 爾/升的鹽酸胍(GuHCl) 、 1體積％的2-巰基乙醇和2.5體積％的吐 溫20(在裂解液中的濃度)所構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離 心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入280 的乙醇，并使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行l(wèi)分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉 淀，從而制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。所得結(jié)果如圖3所示。當(dāng)Bis-Tris的濃度為0.1摩爾/升時，洗滌 液的穿過時間相當(dāng)長，為118秒；但是當(dāng)Bis-Tris的濃度為1摩爾/ 升時，洗滌液的穿過時間顯著縮短為約55秒。此時，細(xì)胞沒有被很 好地分散而是凝聚在一起。基于上面所述，優(yōu)選的是Bis-Tris的濃度為0.5摩爾/升。 (發(fā)明例3)裂解液的種類與RNA的回收量和穿過時間的關(guān)系將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 |iL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。在使用裂解液1、 3和4的情況下，向所得物中 加入540 ^L份的裂解液；在使用裂解液2的情況下，向所得物中加 入510 )iL份的裂解液，并立刻進(jìn)行5次移液操作。使用具有如表2 所示成分的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行 l分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉淀。表2<裂解液>1. GTC (3.66摩爾/升)，乙醇(5.5體積％)2. RLT (由Qiagen公司生產(chǎn))3. GuHCl (3.66摩爾/升)，乙醇(5.5體積％)4.LR001 (由Fuji Photo Film株式會社生產(chǎn)) 所有溶液中均含有1體積％ (在裂解液中)的2-巰基乙醇 各濃度均為在裂解液中的濃度然后，在使用裂解液1、 3和4的情況下，向所得物中加入230 (iL 的乙醇；在使用裂解液2的情況下，向所得物中加入260 nL的乙醇， 并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，使用CUTE MIXER CM-1000 對由此得到的物質(zhì)進(jìn)行攪拌(2,500 rpm) 55秒鐘，并通過離心進(jìn)行 沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，當(dāng)樣品的數(shù)量為l時，在加入乙 醇后攪拌時間不分為5秒和55秒，而是在加入乙醇后立刻進(jìn)行60秒 的渦漩處理，從而制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。所得結(jié)果如圖4所示。裂解液3 (即，由GuHCl構(gòu)成的裂解液) 導(dǎo)致裂解物的穿過時間延長，導(dǎo)致洗滌液的穿過時間顯著延長，并且 與其它裂解液相比，裂解液3還導(dǎo)致回收量降低。特別是在這些裂解 液中，裂解液1 (即，由GTC構(gòu)成的裂解液)顯示出優(yōu)異的效果。(發(fā)明例4)裂解液中離液鹽的濃度與RNA的回收量和穿過時間的 關(guān)系將冷凍保存的約1,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 nL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入350 pL份的裂解液。使用由預(yù)定濃 度的GTC和1體積％的2-巰基乙醇(均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成 的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的 攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入350 nL的70體積％的乙醇，并使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行60秒的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心 進(jìn)行沉淀，從而制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。46回收量的結(jié)果如圖5所示，穿過時間的結(jié)果如圖6所示。當(dāng)GTC 的濃度大于或等于3摩爾/升時，可獲得較高的回收量；當(dāng)GTC的濃 度大于或等于3.66摩爾/升時，穿過時間變短。 (發(fā)明例5)裂解物溶液的體積與RNA回收量和穿過時間的關(guān)系將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入397 (iL份(當(dāng)裂解物溶液的體積為 600i!L時)或469 ^L份(當(dāng)裂解物溶液的體積為700 |LiL時)或540 pL份(當(dāng)裂解物溶液的體積為800 pL時)的裂解液。使用由3.66摩 爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和5.5體積％的乙醇(均為在裂 解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行l(wèi)分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉 淀。然后，向所得物中加入173 |iL (當(dāng)裂解物溶液的體積為600 |iL 時)或202 nL (當(dāng)裂解物溶液的體積為700 |liL時)或230 (當(dāng)裂 解物溶液的體積為800 pL時)的乙醇(在所有情況下在裂解物溶液 中乙醇的濃度均為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后， 使用CUTE MIXER CM-1000對由此得到的物質(zhì)進(jìn)行攪拌(2,500 rpm) 55秒鐘，并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，當(dāng)樣品 的數(shù)量為1時，在加入乙醇后攪拌時間不分為5秒和55秒，而是在 加入乙醇后立刻進(jìn)行60秒的渦漩處理，從而制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。穿過時間的結(jié)果如圖7所示。隨著液體體積的增大，裂解物的穿 過時間延長，但是洗滌液的穿過時間減少。不管液體體積為多少，回 收量基本穩(wěn)定。(發(fā)明例6)裂解液中乙醇的量與RNA的回收量和穿過時間的關(guān)系 將冷凍保存的約IO,OOO，OOO個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 (iL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入510 (iL至770 的裂解液。使用由3.66摩爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和0 pL至260 的乙醇 (在所有情況下均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入260 pL至0^L的乙醇(在所有情況下在裂解物溶液中乙醇的濃度均為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，將由此得到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000攪拌 (2,500 rpm) 55秒鐘，并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，當(dāng)樣品的數(shù)量為1時，在加入乙醇后攪拌時間不分為5秒和55秒，而是在加入乙醇后立刻進(jìn)行60秒的渦漩處理，從而制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例i相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。穿過時間的結(jié)果如圖8所示。當(dāng)裂解液中乙醇的量為30fiL時， 洗滌液的穿過時間較短，當(dāng)裂解液中乙醇的量為60 pL時，洗滌液的 穿過時間變長，其后，隨著裂解液中乙醇的體積％增加，穿過時間變 短。裂解液中乙醇的濃度與回收量的關(guān)系如圖9所示。不管乙醇的量 為哪個量時，都可以得到幾乎恒定的110 pg的回收量，但是，不管 乙醇的量較少或較大時，都需要較大液體體積的回收液。基于上面所述，優(yōu)選的是裂解液中乙醇的量為30 pL。 (發(fā)明例7)裂解物中乙醇的量與RNA的回收量和穿過時間的關(guān)系將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 |iL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入580 ^L至500 nL的裂解液。使用由 3.66摩爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和30 |aL的乙醇(在各種 情況下均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用 CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2,500 rpm),然后 通過離心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入190 pL至270 nL的乙醇(在裂解物溶液 中乙醇的濃度為27.5體積％至37.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，將由此得到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行攪 拌(2,500 rpm) 55秒鐘，并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶 液。然而，當(dāng)樣品的數(shù)量為l時，在加入乙醇后攪拌時間不分為5秒 和55秒，而是在加入乙醇后立刻進(jìn)行60秒的渦漩處理，從而制得裂 解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。RNA回收量的結(jié)果如圖IO所示。當(dāng)裂解物中乙醇的濃度為32.5 體積％時，回收量最高。(發(fā)明例8)加入乙醇后的攪拌時間與RNA的回收量和穿過時間的 關(guān)系將冷凍保存的約IO，OOO，OOO個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 jiL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入540 pL份的裂解液。使用由3.66摩 爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和30 nL的乙醇(在各種情況下 均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2，500 rpm)，然后通過離 心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入230 [iL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 濃度為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，將由此得 到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行攪拌(2,500 rpm)預(yù)定的 一段時間，并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，當(dāng)樣 品的數(shù)量為1時，在加入乙醇后攪拌時間不分為5秒和55秒，而是 在加入乙醇后立刻進(jìn)行60秒的渦漩處理，從而制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。穿過時間的結(jié)果如圖11所示。在加入乙醇后隨著攪拌時間的延 長，穿過時間變短。當(dāng)加入乙醇后的攪拌時間為35秒或更長時，RNA 的回收量可以保持在較高水平；攪拌時間為35秒鐘時，即使回收液 的體積為200 pL，也可以使核酸洗脫下來(參見圖12)，因此，優(yōu)選的是在加入乙醇后攪拌55秒或更長的時間。(發(fā)明例9)加入乙醇后的移液處理與攪拌處理之間的差異對RNA 的回收量和穿過時間的影響將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 (iL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入540 )LiL份的裂解液。使用由3.66摩 爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和30 的乙醇(在各種情況下 均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2，500 rpm)，然后通過離 心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入230 ^L的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 濃度為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理或5次移液處理。 然后，將由此得到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行攪拌(2,500 rpm) 55秒鐘，并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的計算以及純度的測定。在分別實(shí)施移液處理和攪拌處理的兩種情況下，洗滌液的穿過時 間幾乎都為相同的約70秒鐘。然而，在實(shí)施移液處理的情況下，RNA 的回收量為75pg，而在實(shí)施攪拌處理的情況下，RNA的回收量顯著 提高至104嗎。基于上面所述，在加入乙醇后實(shí)施攪拌處理比實(shí)施移液操作更優(yōu)選。(發(fā)明例10)濾膜的孔徑與穿過時間和回收量的關(guān)系將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入540 nL份的裂解液。使用由3.66摩 爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和30 pL的乙醇(在各種情況下 均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2，500 rpm)，然后通過離 心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入230 iiL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 濃度為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，將由此得 到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行攪拌(2,500 rpm)55秒鐘， 并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。穿過時間的結(jié)果如圖13所示。雖然隨著孔徑的增大裂解物的穿 過時間稍微增大，但是洗滌液的穿過時間顯著縮短?；厥樟康慕Y(jié)果如 圖14所示。當(dāng)孔徑增大時，RNA的回收量減少了 15%。 (發(fā)明例11)使用兩個柱時的情況與穿過時間和回收量的關(guān)系將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 |iL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入1,000 (iL份的裂解液。使用由3.66 摩爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和55 pL的乙醇(在各種情況 下均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離 心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入400 )iL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 濃度為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，將由此得 到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行攪拌(2,500 rpm) 55秒鐘， 并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。將兩個NEXT柱、洗滌液(WRC)和回收液(CRC)放置在Quick Gene 800上，然后將500 的裂解物溶液加入到每個NEXT柱中， 通過Quick Gene 800的RNA模式來進(jìn)行提取。在這種情況下，將回 收液的浸漬時間設(shè)定為30秒。按照與發(fā)明例1相同的方式來計算RNA的回收量及測定純度。當(dāng)使用一個柱時(裂解物溶液的體積為800 pL)，裂解物的穿過 時間為50秒；但是，當(dāng)使用兩個柱時，穿過時間分別顯著減少至31 秒和34秒。當(dāng)使用一個柱時，洗滌液的穿過時間為約70秒；但是， 當(dāng)使用兩個柱時，穿過時間顯著減少至20秒或更短的時間。在使用1個柱的情況下，回收量為104pg;但是，在使用2個柱的情況下，回收量分別為50 (ig和54 pg (總和為104 (iL)，由此顯示出與使用1 個柱的情況相同的結(jié)果。 (發(fā)明例12)使用粘附細(xì)胞Hek 293和HeLa時的情況與穿過時間和 回收量的關(guān)系在3.5 cm的盤上分別培養(yǎng)粘附細(xì)胞Hek 293 (細(xì)胞數(shù)量為約 1,700,000個)禾B HeLa (細(xì)胞數(shù)量為約1,500,000個)，通過抽吸除 去培養(yǎng)基，向所得物中加入1 ml的PBS并輕微振蕩，然后通過抽吸 除去所述盤中的溶液。向所得物中加入540 pL份的裂解液。使用由 3.66摩爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和30 (iL的乙醇(在各種 情況下均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。通過使用移液管吸頭 的底部進(jìn)行摩擦來將粘著在所述盤上的細(xì)胞從該盤上剝離下來，并將 所得細(xì)胞裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.7ml容積的Eppendorf管中，使用 CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后 通過離心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入230 (iL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 濃度為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，將由此得 到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行攪拌(2,500 rpm)55秒鐘， 并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。Hek 293細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的穿過時間分別為27秒和25秒。洗 滌液的穿過時間分別為9秒和11秒。RNA的回收量分別為30 iig和 39 pg。另外，采用離心和濾膜(由作為主要成分的二氧化硅構(gòu)成) 的提取方法可以獲得比本發(fā)明的方法顯著減少的回收量，該回收量分 別為20 iig禾卩19 ^g。 (發(fā)明例13)回收液的浸漬時間與回收量的關(guān)系將冷凍保存的約20,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 |iL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入630 pL份的裂解液。使用由3.66摩爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇、120 jiL的乙醇和2.5體積％的 吐溫80 (在各種情況下均為在裂解物中的濃度)構(gòu)成的裂解液。細(xì)胞 裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉淀。然后，向所得物中加入140 ^L的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 濃度為32.5體積％)并立刻進(jìn)行5秒鐘的渦漩處理。然后，將由此得 到的物質(zhì)使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行攪拌(2,500 rpm)55秒鐘， 并通過離心進(jìn)行沉淀，然后制得裂解物溶液。將NEXT柱(開口為7mm，細(xì)孔為3.5 pm)、洗滌液(WRC) 和回收液(CRC)放置在Quick Gene 800上，然后將裂解物溶液加入 到NEXT柱中，通過Quick Gene 800的RNA模式進(jìn)行提取。在這種 情況下，將回收液的浸漬時間設(shè)定為30秒或120秒。當(dāng)回收液的浸漬時間為30秒時，使用100 )LiL的回收液只能回收 48pg的RNA;但是，當(dāng)回收液的浸漬時間為120秒時，RNA的回收 量顯著增加到98 pg。 (發(fā)明例14)裂解物溶液的體積與回收量的關(guān)系將冷凍保存的約10,000,000個培養(yǎng)的粒狀細(xì)胞HL 60解凍，并與 30 pL的0.5摩爾/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通過移液或渦漩處 理將所得細(xì)胞分散。向其中加入25 )iL至1,500 jiL的裂解液。使用由 3.66摩爾/升的GTC、 1體積％的2-巰基乙醇和30 的乙醇構(gòu)成的裂 解液。細(xì)胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行1分鐘的攪拌 處理(2,500 rpm)，然后通過離心進(jìn)行沉淀。將所得溶液與25 pL至1,500 i!L的70。/。乙醇混合，使裂解物中 乙醇的濃度為35% (總液體體積為50 |iL至3,000 |iL)，使用CUTE MIXER CM-1000進(jìn)行5秒鐘的攪拌處理(2,500 rpm)，然后通過離 心進(jìn)行沉淀，從而制得裂解物溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來實(shí)施RNA的提取方法、回收量的 計算以及純度的測定。結(jié)果如圖15所示。隨著裂解物溶液體積的增加，RNA的回收量 也增大，并且當(dāng)裂解物液體體積為900 時，可以得到預(yù)計的0.9叫的回收量，但是，當(dāng)裂解物液體體積進(jìn)一步增大時，回收量反而減少。 (發(fā)明例15)當(dāng)預(yù)先用裂解液涂敷固相時回收量的依賴性通過以下方法用RLT (由Qiagen公司生產(chǎn))來涂敷用于吸附核 酸的固體材料，所述方法為將600 pL含有1體積％的2-巰基乙醇的 RLT加入至U RNeasy小柱(由Qiagen公司生產(chǎn))中，在10,000 rpm 下離心15秒鐘。此外，還準(zhǔn)備未經(jīng)涂敷的RNeasy小柱。在直徑為6 cm的盤上培養(yǎng)粘附細(xì)胞Hek 293 (細(xì)胞數(shù)量為約 5,800，000個)，通過抽吸除去培養(yǎng)基，向所得物中加入1 ml的PBS 并輕微振蕩，然后通過抽吸除去所述盤中的溶液。向所得物中加入600 份的含有1體積％的2-巰基乙醇的細(xì)胞裂解液RLT，通過使用移 液管吸頭的底部進(jìn)行摩擦來將粘著在所述盤上的細(xì)胞從該盤上剝離， 并同時使所得細(xì)胞裂解。將該裂解液加入到Shredder小柱(由Qiagen 公司生產(chǎn))中，并在15,000 rpm下離心2分鐘。將600 ^1^份的70% 乙醇加入到穿過溶液中，并進(jìn)行7次移液操作。將按照所述方法制備的裂解物溶液加入到涂敷有RLT的RNeasy 小柱或未經(jīng)涂敷的Neasy小柱中，并在10,000 rpm下離心15秒。棄去穿過溶液，并將700 pL的RW1溶液(由Qiagen公司生產(chǎn)) 加入到RNeasy小柱中，隨后，將該小柱在10,000 rpm下離心15秒。 棄去穿過溶液，并將500 pL的RPE溶液(由Qiagen公司生產(chǎn))加入 到RNeasy小柱中，隨后，將該小柱在10,000 rpm下離心15秒。再 次棄去穿過溶液，并將500 |LiL的RPE溶液加入到RNeasy小柱中， 隨后，將該小柱在10,000 rpm下離心2分鐘。將50 ^L份的DEPC (焦碳酸二乙酯)溶液加入到RNeasy小柱 中，并在IO，OOO rpm下離心1分鐘，回收穿過的溶液。再次將50 pL 份的DEPC溶液加入到RNeasy小柱中，并在10,000 rpm下離心1分 鐘，回收穿過的溶液。按照與發(fā)明例1相同的方式來計算RNA的回收量以及測定其純度。所得結(jié)果如圖16所示。預(yù)先使用RLT涂敷的用于吸附核酸的固體材料顯示出幾乎恒定的100 p&的RNA回收量。然而，未經(jīng)涂敷的材料雖然顯示出平均回 收量為100 Mg，但是回收量的值在88pg至124pg之間變化。因此，預(yù)先向用于吸附核酸的固體材料中加入裂解液可以使RNA 的回收量保持穩(wěn)定。工業(yè)適用性由于分析物中的核酸可以被固相的表面所吸附，所以經(jīng)過洗滌等 類似的操作后使核酸解吸附可以方便快捷地分離、純化和提取核酸， 而無需特殊的技術(shù)、復(fù)雜的操作和特殊的裝置。此外，本發(fā)明的提取 方法可以提供這樣的核酸提取方法，該方法可以使裂解物溶液和洗滌 液穿過，而不會造成細(xì)胞物質(zhì)(其易于發(fā)生堵塞)發(fā)生堵塞，與傳統(tǒng) 方法相比，該方法能夠處理更多數(shù)量的細(xì)胞并且所需要的時間更短， 此外在細(xì)胞數(shù)量相同時，該方法比傳統(tǒng)方法更快速。本申請中要求外國優(yōu)先權(quán)的每一份外國專利申請的全部內(nèi)容 均以引用方式并入本文，就如同全部列出一樣。
權(quán)利要求
1.一種核酸提取方法，該方法包括(a)通過以下步驟(i)或(ii)制備含有溶液的生物材料步驟(i)，制備含有磷酸鹽緩沖液或Bis-Tris(N，N-雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷)緩沖液的生物材料；或步驟(ii)，用Bis-Tris緩沖液替換所述生物材料中所含有的緩沖液；(b)通過使所述的生物材料與裂解液接觸來使所述生物材料溶解，并溶出所述生物材料中所含有的核酸；(c)通過向由所述步驟(b)制得的含有溶出的核酸的溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑來制備裂解物溶液；(d)通過使所述的裂解物溶液與固體材料接觸來使所述裂解物溶液中所含有的所述核酸被所述的固體材料吸附；(e)洗掉殘留在所述固體材料中的除了待提取的所述核酸之外的雜質(zhì)、和裂解液；以及(f)通過回收液使所述的被吸附的核酸從所述固體材料上解吸附。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(a)中的所述溶液為分散介質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(a)中的所述溶液的濃度為0.01摩爾/升至10摩爾/升，并且其pH為3至9。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(b)中的所述裂解液含有離液鹽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸提取方法，其中所述離液鹽的濃度為0.1摩爾/升至10摩爾/升。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(b)中的所述裂解液含有濃度為小于等于50體積%的水溶性有機(jī)溶劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸提取方法，其中所述裂解液中所含有的所述水溶性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、 異丙醇或丁醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(b)中的所述裂解液含有表面活性劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸提取方法，其中所述裂解液中所含有的所述表面活性劑的濃度為0.001質(zhì)量 %至30質(zhì)量％。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(b)中在加入所述的裂解液之后進(jìn)行至少一次的移液操作。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(b)中在加入所述的裂解液之后或在所述的移液操作之后再進(jìn)行攪拌操作。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述步驟(c)中的所述裂解物溶液是通過以下過程制備的，所述過程為向所述的含核酸的裂解液中加入所述的水溶性有機(jī)溶劑， 使得所述的裂解物溶液含有濃度為10體積％至60體積％的所述水溶 性有機(jī)溶劑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸提取方法，其中在所述步驟(C)中使用的所述的水溶性有機(jī)溶劑為甲醇、 乙醇、異丙醇或丁醇。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(c)中在加入所述的水溶性有機(jī)溶劑之后進(jìn)行至少一次移液操作或攪拌操作。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸提取方法， 其中攪拌時間為0.1秒至600秒。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(c)中在加入所述的水溶性有機(jī)溶劑以及進(jìn)行攪拌操作或移液操作之后，進(jìn)一步進(jìn)行移液操作或攪拌操作。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸提取方法， 其中攪拌時間為0.1秒至600秒。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(f)中所述回收液的浸泡時間為0.1秒至1,600秒。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中當(dāng)細(xì)胞的數(shù)目為小于等于500,000個時，所用的所述裂解物溶液的液體量為小于等于800 ^L。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中當(dāng)細(xì)胞的數(shù)目為大于等于500，000個時，所用的所述裂解物溶液的液體量為大于等于300 nL。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(d)中的所述固體材料為其表面具有羥基的固體材料。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在柱中保持有所述固體材料的容器被用于所述的步驟(d)中。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步驟(d)中，將所述的裂解物溶液與其中預(yù)先使含有離液鹽的溶液穿過的所述固體材料接觸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1至23中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中通過將所述步驟(c)中制得的所述裂解物溶液注入兩個或更多個容器中來進(jìn)行提取操作。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1至24中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中向一個柱中兩次或多次注入在所述步驟(c)中制得的所述裂解物溶液。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1至25中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中在所述步驟(d)、所述步驟(e)和所述步驟(f)中，通過改變壓力或通過離心使所述的裂解物溶液、所述的洗滌液和所述的 回收液中的至少一種與所述的固體材料接觸。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1至26中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法， 其中所述核酸是DNA、 RNA、 mRNA、質(zhì)粒或它們的混合物中的一者。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1至27中任意一項(xiàng)所述的核酸提取方法，其中所述的生物材料是經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞、動物細(xì)胞、動物組織、 植物細(xì)胞、植物組織、病毒、細(xì)菌、真菌或核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸提取方法，該方法包括(a)通過以下步驟(i)或(ii)制備含有溶液的生物材料步驟(i)，制備含有磷酸鹽緩沖液或Bis-Tris(N，N-雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷)緩沖液的生物材料；或步驟(ii)，用Bis-Tris緩沖液替換所述生物材料中所含有的緩沖液；(b)使用裂解液溶解所述生物材料，并溶出所述生物材料中所含有的核酸；(c)通過向由所述步驟(b)制得的含有溶出的核酸的溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑來制備裂解物溶液；(d)使所述裂解物溶液中所含有的所述核酸被所述的固體材料吸附；(e)洗掉殘留在所述固體材料中的雜質(zhì)和所述裂解液；以及(f)通過回收液使所述的被吸附的核酸從所述固體材料上解吸附。
文檔編號C12N15/09GK101243186SQ20068003037
公開日2008年8月13日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者佐佐木翼, 金原秀行 申請人:富士膠片株式會社