專利名稱：：乳桿菌用于增加選自鐵、鋅、鈣的金屬及其離子的吸收的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及至少一種植物乳桿菌特效菌林在增加哺乳動(dòng)物的金屬/金屬離子吸收中的用途。本發(fā)明還涉及至少一種植物乳桿菌特效菌林在制備藥用組合物中的用途以及包含至少一種植物乳桿菌特效菌抹的組合物。
背景技術(shù)：
：在西方和發(fā)展中國家，嬰兒、青少年和育齡女性都普遍存在鐵缺乏癥和鐵儲備低。鐵缺乏癥的原因之一是來自食物的鐵的生物利用度低，部分歸因于膳食中的抑制因素，如植酸和酚類化合物。其它因素增強(qiáng)鐵吸收。這些因素包括肌肉組織、抗壞血酸和某些其它有機(jī)酸。植酸主要位于谷類、蔬菜和水果的纖維部分。植酸的抑制效應(yīng)是由于在腸內(nèi)pH與鐵形成了不溶性絡(luò)合物。減少這些食物的植酸含量或者抑制與鐵絡(luò)合鍵合將解決從富含鐵或者被視為健康和有營養(yǎng)的食物中鐵吸收少的問題。植酸由某些植物、微生物和動(dòng)物組織的植酸酶水解。大部分谷類植酸酶的最佳pH在5.0-5.6范圍。通過降低食物的pH，可激活谷類和蔬菜的內(nèi)源性植酸酶，從而減少植酸含量，如在酵母發(fā)酵時(shí)。EP1003532描述乳桿菌在制備非發(fā)酵腸內(nèi)組合物中的用途，所述組合物用于促進(jìn)或增加膳食礦物質(zhì)的吸收。其中支持所述權(quán)利要求的吸收的唯一實(shí)驗(yàn)是用Caco-2腸細(xì)胞系(致癌細(xì)胞系)進(jìn)行的4丐反應(yīng)或釣轉(zhuǎn)運(yùn)體外模型。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)在人體進(jìn)行金屬/金屬離子吸收的體內(nèi)研究。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)并非所有乳桿菌都具有如EP1003532要求的所需吸收。還發(fā)現(xiàn)某些植物乳桿菌特效菌林在體內(nèi)令人驚奇地實(shí)現(xiàn)了所述金屬/金屬離子的良好吸收。發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及至少一種植物乳桿菌菌林及其部分在制備組合物中的用途，所述植物乳桿菌選自植物乳桿菌299，DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313、植物乳桿菌HEAL99,DSM15316,所述組合物用于增加至少一種金屬/金屬離子在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人中的吸收。通過使用上述組合物，可通過增加所述金屬/金屬離子在體內(nèi)的吸收，明顯增強(qiáng)哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人且特別優(yōu)選女性和兒童的一般健康狀況。因此，人體可利用消耗的食物中大部分金屬/金屬離子，獲得更好的健康狀況，個(gè)人感覺更好。本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是為了獲得所需吸收，個(gè)體不需要增力口攝入各種金屬/金屬離子如Fe。不需要添加補(bǔ)充量的各種金屬/金屬離子即可發(fā)生這種情況。因此，可避免以前用于增加某些金屬吸收時(shí)增加如Fe消耗的情況可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。通過本發(fā)明可避免的此類不良反應(yīng)的實(shí)例包括結(jié)腸癌，也就是說已經(jīng)顯示過高消一€Fe可導(dǎo)致結(jié)腸癌，參閱如"Ironintakeandtheriskofcolorectalcancer",WurzelmannJI等，CancerEpidemiolBiomarkersPrev.1996Jul;5(7):503-7。本發(fā)明另一方面涉及通過給予包含至少一種植物乳桿菌菌抹及其部分的組合物，增加至少一種金屬/金屬離子在哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的吸收的方法，所述植物乳桿菌選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和植物乳桿菌HEAL99,DSM15316。本發(fā)明又一方面涉及至少一種選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、才直物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和植物乳桿菌HEAL99,DSM15316的植物乳桿菌菌抹及其部分在制備藥用組合物中的用途，所述藥用組合物用于治療貧血、骨質(zhì)疏松癥或任何其它其中存在至少一種選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子的金屬/金屬離子缺乏問題的疾病?？捎帽景l(fā)明的藥用組合物治療或預(yù)防其中缺乏一種上述金屬/金屬離子的任何紊亂或疾病。本發(fā)明還有另一方面涉及一種組合物，所述組合物包含至少一種選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、才直物乳桿菌HEAL19,DSM15313、植物乳桿菌HEAL99，DSM15316的植物乳桿菌菌4朱及其部分以及至少一種選自Fe、Zn、Ca、Mg及其離子的金屬/金屬離子。發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種金屬/金屬離子選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子。還可能所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。因此，即使任何上述金屬/金屬離子以另一種形式存在，也可增加金屬/金屬離子的吸收。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種菌抹可以是有活力的、滅活或抑制或者死亡的，只要獲得金屬/金屬離子吸收的所需增加。而且，所述至少一種菌抹可以是基因修飾的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含載體材料。所述載體材料可選自麥片粥、乳酸發(fā)酵食物、抗性淀粉、菊粉、果聚糖和糖醇、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖基化蛋白和脂類。載體還可以是上述載體的組合，例如脂類、碳水化合物和蛋白質(zhì)的混合物?？蓪⑺鲚d體材料與一種或多種選自植物乳桿菌299，DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和才直物乳桿菌HEAL99,DSM15316的菌林發(fā)酵。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物選自食品、膳食補(bǔ)充劑、營養(yǎng)品、功能食品和醫(yī)療食品。所述食品可選自飲料、酸奶、果汁、冰淇淋、面包、餅干、谷類、健康棒和醬。上述組合物可以發(fā)酵或非發(fā)酵，優(yōu)選發(fā)酵組合物。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少一種選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子的金屬/金屬離子。通過將金屬/金屬離子包含在待攝入的組合物內(nèi)，可在增加的濃度下觀察到甚至更高的吸收。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種菌林在組合物中的量為約1乂106-約lx014CFU，優(yōu)選lxl08-lx;io12,更優(yōu)選Ixl09-lxl0]。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥用組合物是液體制劑或固體制劑。固體制劑可選自片劑、含片(suckingtablet)、糖、咀嚼片、口香糖、膠囊劑、香嚢劑、散劑、顆粒劑、包衣顆粒和包衣片、腸溶片和膠嚢劑以及熔解條帶(strips)和薄膜。所述液體制劑可選自口服溶液、混懸液、乳液和糖漿劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所迷藥用組合物包含至少一種選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子的金屬/金屬離子。只要獲得所需吸收，還可使所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。所述至少一種在藥用組合物中的菌林可以是有活力的、滅活或抑制或者死亡的。所述至少一種菌林也可以是基因修飾的。使用的菌株也可以是上述的組合，也就是說例如一種菌林有活力而另一種菌林是滅活的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種菌林在藥用組合物中的量為約lxlC)6-約lxlOMCFU，優(yōu)選Ixl0s-lxl012，更優(yōu)選Ixl09-lxl0"。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種組合物，所述組合物包含至少一種選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313、植物乳桿菌HEAL99,DSM15316的植物乳桿菌及其部分以及至少一種選自Fe、Zn、Ca、Mg及其離子的金屬/金屬離子，其中所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。所述至少一種菌林可以有活力、滅活或抑制或者死亡的。所述至少一種菌林也可以是基因修飾的。通過給予本發(fā)明組合物，可提高人的一般健康狀況。通過使用本發(fā)明組合物，特別可提高經(jīng)期女性或其它鐵儲備低的人的健康狀況。雖然所述人不一定貧血，但可增強(qiáng)一般健康狀況。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含載體材料，其中所述載體材料選自麥片粥、乳酸發(fā)酵食品、抗性淀粉、膳食纖維、菊粉、果聚糖和糖醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖基化蛋白和脂類。還可將所述栽體材料用一種或多種選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和植物乳桿菌HEAL99,DSM15316的菌株發(fā)酵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物選自食品、膳食補(bǔ)充劑、營養(yǎng)品、功能食品和醫(yī)療食品。所述食品可選自飲料、酸奶、果汁、水洪淋、面包、餅干、谷類、^fc康棒和醬。所述至少一種菌株在組合物中的量可為約lM()6-約lx1014CFU,優(yōu)選Ixl08-lxl012,更優(yōu)選lxl。9-lx1011。在本說明書中菌抹的"部分，，指細(xì)菌細(xì)胞部分如DNA、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜部分，或者具有增加上述金屬/金屬離子吸收需要的活性的細(xì)菌細(xì)胞的任何其它部分。在本文中菌抹的部分也可以是全部或部分勻漿。用于本文時(shí)，"金屬/金屬離子"分別指純金屬和金屬離子，如Fe、Zn、Ca和Mg以及Fe2+、Fe3+、Zn2+、Ca"和Mg2+。即使所述金屬/金屬離子處于另一種形式如與其它元素絡(luò)合鍵合或締合，本文描述的吸收也可自然發(fā)生。"與元素絡(luò)合鍵合"或"與元素締合"在本文指金屬/金屬離子可存在并且將發(fā)生所需吸收的任何形式。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案的詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)l在本研究中，用交叉設(shè)計(jì)研究植物乳桿菌299v及其發(fā)酵產(chǎn)物、乳酸和乙酸對從低鐵生物利用度膳食中吸收非血紅素鐵的作用。用四種不同的麥片粥測試植物乳桿菌299v和有機(jī)酸的特殊作用含活性植物乳桿菌299v的發(fā)酵麥片粥、含發(fā)酵制品但滅活細(xì)菌的巴氏發(fā)酵麥片粥、pH調(diào)節(jié)的非發(fā)酵麥片粥以及含添加有機(jī)酸的非發(fā)酵麥片粥。受試者和方法受試者在研究前對70名女性志愿者篩選2-4周，選擇24名女性進(jìn)行研究，選擇的基礎(chǔ)是無貧血但鐵儲備相對低，即血清鐵蛋白濃度S40昭/L和血紅蛋白濃度^110g/L。24名志愿者是健康年輕女性，平均年齡(±SD)為25±4歲，平均體重為62±7kg，平均體重指數(shù)為21.3±1.9kg/m2。所有受試者都不吸煙，無妊娠或哺乳，或者在研究前22月或研究期間沒有攝入任何維生素或礦物質(zhì)補(bǔ)充劑。18名受試者使用口服避孕藥，但受試者沒有常規(guī)攝入任何其它藥物。研究前S2月或研究期間沒有捐血。對每個(gè)參加者告知關(guān)于本研究的口頭和書面信息，然后獲得知情同意書。本研究得到MunicipalEthicalCommitteeofCopenhagenandFrederiksberg,Denmark(檔案號KF01-219/03)和NationalInstituteofRadiationHygiene,Denmark的浙匕準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)沒計(jì)本研究是完全隨機(jī)化、雙盲交叉試驗(yàn)，其中每個(gè)受試者進(jìn)食4種試驗(yàn)餐(A)發(fā)酵麥片粥，(B)巴氏消毒發(fā)酵麥片粥，(C)非發(fā)酵麥片粥(用乳酸調(diào)節(jié)pH),和(D)含添加有機(jī)酸(乳酸和乙酸)的非發(fā)酵麥片粥。用雙重標(biāo)簽外標(biāo)記法測定4種試驗(yàn)餐的鐵吸收。使用這種方法時(shí)，通過在兩個(gè)周期內(nèi)每個(gè)周期同時(shí)從兩種試驗(yàn)餐吸收的鐵測定來自4種試驗(yàn)餐的鐵吸收。將每個(gè)周期內(nèi)兩種不同的試驗(yàn)餐分別用"Fe和"Fe外標(biāo)記，連續(xù)4個(gè)早晨服用兩次，使每天變化的潛在效應(yīng)最小，例如以ABBA的順序。總計(jì)使用12種服用順序，隨機(jī)分配給受試者，以便所有試驗(yàn)餐在本周期作為第一餐服用的次數(shù)相等。這對于能夠確認(rèn)在周期內(nèi)含活定居菌的發(fā)酵麥片粥的可能后續(xù)效應(yīng)很重要。進(jìn)食18天后測定血液樣品內(nèi)兩種同位素的活性，然后用其余試驗(yàn)餐實(shí)施第二周期。用第二周期血液樣品的同位素活性水平減去第一周期殘留的同位素活性。試驗(yàn)餐的構(gòu)成和食用程序用麥片和水混合制備麥片粥，然后用酶和巴氏消毒處理(通過ProbiAB獲得)。然后將麥片粥A用植物乳桿菌299v(DSM9843,活菌計(jì)數(shù)Ux109cfu/g)發(fā)酵[20]。麥片粥B是巴氏消毒的麥片粥A(活菌計(jì)數(shù)<10cfu/g)，麥片粥C是非發(fā)酵的堿性麥片粥，用L-乳酸酸化至與麥片粥A、B和D相等的pH，麥片粥D是非發(fā)酵的堿性麥片粥，加入預(yù)期在麥片粥A發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的等量有機(jī)酸DL-乳酸和乙酸。對于每份試驗(yàn)餐，100g麥片粥(A、B、C或D)與140g全麥小面包(60.0g小麥面粉，20.0g全麥面粉,2.0g鹽,2.0g酵母,16.0g菜籽油,40.0g超純水)和10g黃油以及一玻璃杯超純水(200mL)—起進(jìn)食。制備一批麥片粥，冷藏(4。C)待用。制備一批全麥小面包，冷凍儲藏，食用前在200。C烤箱再加熱IO分鐘。在禁食12小時(shí)后于早晨食用試驗(yàn)餐。整夜允許攝入最多0.5L水。在攝入試驗(yàn)餐前12小時(shí)內(nèi)不允許進(jìn)行中度或強(qiáng)烈的體力活動(dòng)或者攝入任何酒精或藥物。食用試驗(yàn)餐后，受試者不允許進(jìn)食或喝水2小時(shí)，禁止:f氛入酒精24小時(shí)。受試者填寫與每份試驗(yàn)餐有關(guān)的調(diào)查表，確保她們堅(jiān)持完成所有程序，她們按照指示交替進(jìn)食和喝水，用水徹底沖洗裝麥片粥的玻璃杯，確保攝入全部同位素劑量。工作人員保證她們要吃完所有東西。在實(shí)驗(yàn)期間，受試者填寫關(guān)于其日常進(jìn)食習(xí)慣的詳細(xì)調(diào)查表。同位素和標(biāo)記程序在同位素交換食用前18小時(shí)，將1mL同位素溶液["FeCl3(NENLifeScienceProducts,Inc.,Boston,MA)或59FeCl3(AmershamBiosciencesCorp.,Piscataway,NJ)在0.1mol/LHC1中]直接力口入麥片粥內(nèi)，從外部標(biāo)記所有試驗(yàn)餐。在第一周期每劑量包含37kBq55FeCl3或59FeCl3,第二周期包含74kBq55FeCl3或59FeC3。食譜分析將4種麥片粥和面包冷凍干燥，勻漿處理，對總鐵、4丐、鋅和植酸進(jìn)行雙重分析。用國家食物構(gòu)成數(shù)據(jù)庫(DanishTablesofFoodComposition,DANKOST2000,1.20版，Herlev,Denmark)計(jì)算能量含量。在含65%(w/v)超純硝酸(MerckKgaA,Darmstadt,Germany)的MES1000SolventExtractionSystem(CEMCorp.,Matthews,NC)中濕式灰化后通過原子吸收光"i普法(Spectra畫AA200，Varian,Mulgrave,Australia)測定總鐵、鈣和鋅。用典型膳食標(biāo)準(zhǔn)參考物1548a(NationalInstituteofStandardsandTechnology,Gaithersburg,MD)作為鐵(均數(shù)士SD:35.3±3.77pg/g)、鈣(1.96士0.11mg/g)和鋅(24.6士1.79iLig/g)的參考，分析值分別是33.38嗎/g、2.00mg/g和23.25|ng/g。通過高效離子層析分析作為單獨(dú)肌醇三-至六磷酸鹽(IP3.6)1的植酸。通過毛細(xì)管氣相層析測定麥片粥中的有機(jī)酸濃度。鐵狀態(tài)的確定在抽取血液樣品之前的攝入和活動(dòng)限制如對試驗(yàn)餐所述。讓受試者仰臥位休息10分鐘后從肘靜脈抽取血液樣品。用SysmexKX-21自動(dòng)血液分斥斤4義(SysmexAmericaInc.，Mundelein,IL)和適當(dāng)?shù)膶φ?Eightcheck-3WP,22490822,SysmexAmericaInc.)對收集在裝有溶解EDTA的管(Vacutainersystem,BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)內(nèi)的靜脈血(3.5mL)進(jìn)行血紅蛋白分析。測定內(nèi)和測定間差異分別是0.5%(n=12)和0.6%(n=27)。對收集在光滑管(Vacutainersystem,BectonDickinson)內(nèi)的靜脈血(5.0mL)進(jìn)行血清鐵蛋白和a-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)分析。用Immulite1000分析儀(DiagnosticProductsCorporation,LosAngeles,CA)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定血清鐵蛋白，也分析適當(dāng)?shù)膮⒖佳?3"鐵蛋白國際標(biāo)準(zhǔn)(80/578),WHO，NIBSC,SouthMimms,UnitedKingdom)。測定內(nèi)和測定間差異分別是2.7%(n=15)和5.0%(n=15)。用免疫比濁技術(shù)在CobasMiraanalyzer(RocheDiagnosticSystems,F.Hoffman-LaRocheLtd.,Basel,Switzerland)上測定ACT,也分析適當(dāng)?shù)膮⒖佳?歐洲委員會批準(zhǔn)的參考物470,11924號，IRMM，Geel,Belgium)。測定內(nèi)和測定間差異分別是1.4%(n=12)和3.2%(n=14)。非血紅素鐵吸收的確定測定收集在裝有肝素作為抗凝劑的管(Vacutainersystem,BectonDickinson)中的血液樣品(60mL)的55Fe和59Fe的活性。同時(shí)通過干式灰化，接著再結(jié)晶和溶解，然后通過上文描述的方法用自動(dòng)猝滅校正在Tricarb2100TR液體閃爍分4斤儀(PackardInstruments,Meriden,CT)中計(jì)數(shù)，測定55Fe和59Fe。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將非血紅素鐵吸收數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為對數(shù)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將結(jié)果再轉(zhuǎn)化為反對數(shù)。用于統(tǒng)計(jì)分析的所有數(shù)據(jù)都呈正態(tài)分布，殘差曲線檢驗(yàn)呈方差齊性。使用線性混合模型比較不同餐的非血紅素鐵吸收，用log(非血紅素鐵吸收)作為因變量，餐、交替餐和鐵蛋白作為固定的自變量，受試者和受試者x周期相互作用作為隨機(jī)效應(yīng)Log(非血紅素鐵吸收)=jx(餐,)+a(交替餐i)+bx鐵蛋白！+A(受試者0+B(受試者,周期，)+ei將數(shù)據(jù)用最小二乘平均估計(jì)值表示，平均估計(jì)值之間的差異用95%CI表示。用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包，8.2版(SASInstituteInc.,Caiy,NC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將P〈0.05的值視為顯著差異。結(jié)果試驗(yàn)餐的構(gòu)成試驗(yàn)餐的構(gòu)成和麥片粥中有機(jī)酸的含量在以下表1列出。表l包括含黃油的全麥小面包在內(nèi)試驗(yàn)餐的構(gòu)成，以及麥片粥中有機(jī)酸的pH和濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>代表單獨(dú)肌醇四-至六磷酸鹽鐵狀態(tài)和非血紅素鐵吸收受試者的血紅蛋白濃度在111-137g/L范圍，血清鐵蛋白濃度在12-40嗎/L范圍。因?yàn)檠彖F蛋白濃度對炎癥敏感，所以將血清中測定的急性期蛋白ACT作為急性期反應(yīng)的標(biāo)志。濃度在0.20-0.37g/L范圍內(nèi)，提示無急性期反應(yīng)(ACT<0.6g/L),因此有效測定受試者的鐵狀態(tài)。通過混合線性模型分析計(jì)算的4種試驗(yàn)餐的非血紅素鐵吸收在以下表2顯示。表2來自含有4種不同麥片粥的試驗(yàn)餐的非血紅素鐵吸收<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>1混合線性;虞型分析最小二乘估計(jì)值的幾何均數(shù)，括弧內(nèi)為95%CI,n=242混合線性模型分析差異估計(jì)值的幾何均數(shù)，括弧內(nèi)為95。/。CI，n=24*該數(shù)值與各列內(nèi)所有其它數(shù)值顯著差異(P<0.0001)當(dāng)比較非血紅素鐵吸收的絕對值和相對于pH調(diào)節(jié)的非發(fā)酵麥片粥餐的比值時(shí)，結(jié)果顯示含發(fā)酵麥片粥試驗(yàn)餐具有非常顯著的作用(P<0.0001)，其中考慮了個(gè)體間差異。因?yàn)橹参锶闂U菌299v可在人腸粘膜定居約2周和因?yàn)楹l(fā)酵麥片粥的試驗(yàn)餐增加非血紅素鐵吸收，所以評估該試驗(yàn)餐對周期內(nèi)接著攝入的試驗(yàn)餐的特殊后續(xù)效應(yīng)。雖然沒有觀察到試驗(yàn)餐的廣泛后續(xù)效應(yīng)，但就含發(fā)酵麥片粥試驗(yàn)餐的特殊效應(yīng)而言，該后續(xù)效應(yīng)幾乎達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P二0.06)。不同試驗(yàn)餐的吸收率顯示含乳酸發(fā)酵麥片粥的試驗(yàn)餐的非血紅素鐵吸收非常顯著地增加，而作為不同對照食用的巴氏消毒發(fā)酵麥片粥餐和非發(fā)酵麥片粥餐則無效應(yīng)。因?yàn)殍F和植酸鹽在4種試驗(yàn)餐中的含量是恒定不變的，所以這種顯著效應(yīng)可直接是植物乳桿菌299v發(fā)酵的作用。應(yīng)該通過比較含發(fā)酵麥片粥餐的吸收率與含滅活植物乳桿菌299v(巴氏消毒發(fā)酵麥片粥)和添加有機(jī)酸的非發(fā)酵麥片粥餐的吸收率，確定是活性植物乳桿菌299v的作用或是發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的有機(jī)酸的作用，因?yàn)榧尤牒笳叩氖前l(fā)酵處理時(shí)正常產(chǎn)生的濃度的乳酸和乙酸。有機(jī)酸的分析結(jié)果顯示在進(jìn)食3種麥片粥時(shí)不可能達(dá)到有機(jī)酸的相似水平(表2)。與發(fā)酵麥片粥的有機(jī)酸濃度差異最小的試驗(yàn)餐是巴氏消毒發(fā)酵麥片粥，其中乳酸和乙酸的濃度分別降低19%和8%。當(dāng)比較這2種餐的鐵吸收率時(shí)，巴氏消毒發(fā)酵麥片粥的吸收率減少至50%。因?yàn)樘砑佑袡C(jī)酸的麥片粥中乳酸水平比巴氏消毒發(fā)酵麥片粥低52%而吸收率只減少9%，所以發(fā)酵麥片粥鐵吸收的增加不可能主要?dú)w因于有機(jī)酸的作用。因此本研究的結(jié)果提示活性乳酸菌，植物乳桿菌299v(Uxl011cfii)能夠增加年輕女性從低鐵生物利用度餐吸收非血紅素鐵。通常認(rèn)為在十二指腸和近端小腸發(fā)生鐵吸收。食物中的小有機(jī)酸，如巴氏消毒發(fā)酵麥片粥和添加有機(jī)酸的麥片粥中的乳酸和乙酸，在胃腸道內(nèi)非常迅速地吸收。對發(fā)酵麥片粥增強(qiáng)非血紅素鐵吸收的可能解釋可以是植物乳桿菌299v定居在大部分近端小腸或者可能在結(jié)腸粘膜，其中活性菌局部產(chǎn)生的有機(jī)酸可能降低兩者的局部pH，乳酸可能與鐵形成可溶性絡(luò)合物，如Derman等描述。含發(fā)酵麥片粥餐的后續(xù)效應(yīng)幾乎達(dá)到顯著性(P二0.06)，表明在細(xì)菌仍定居于腸道的接下來的幾天內(nèi)植物乳桿菌299v對從攝入的餐內(nèi)吸收非血紅素鐵的作用，通過這一事實(shí)可強(qiáng)化這種4叚設(shè)。當(dāng)將含發(fā)酵麥片粥、巴氏消毒發(fā)酵麥片粥和添加有機(jī)酸麥片粥的試驗(yàn)餐(如上文描述)的吸收率相比，顯然不可將含發(fā)酵麥片粥試驗(yàn)餐吸收率的增加指定為只是有機(jī)酸的作用，如上文假設(shè)，但清楚看到活性植物乳桿菌299v的特殊作用。實(shí)驗(yàn)2試劑。除非另外標(biāo)明，否則所有試劑購自GTF(G6teborg,Sweden)。Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)物。第17代Caco-2細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心(Rockvile，MD)，在第20-35代用于實(shí)驗(yàn)。在37。C和95。/?？諝?5%C02的潮濕氣氛下，將培養(yǎng)物原液保存在補(bǔ)充20%(v/v)胎牛血清(FSC)、100單位/L青霉素G和100mg/L鏈霉素的Dulbecco's改良a必需培養(yǎng)液(DMEM)中。每2-3天更換生長培養(yǎng)液。用含0.5mmol/LEDTA的0.5g/L胰蛋白酶在Dulbecco's磷酸鹽緩沖液(PBS)中使80。/。融合的細(xì)胞分離。在實(shí)驗(yàn)之前，將100000個(gè)細(xì)胞/0.5mL補(bǔ)充DMEM種在0.4pm微孔聚碳酸酯膜插入物(lcm2Tranwellinserts;Coming,Acton,MA)上。底外側(cè)室裝有1.5mL補(bǔ)充DMEM。每2-3天更換濾芯兩側(cè)的培養(yǎng)液。在接種后14-17天進(jìn)行所有鐵攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌培養(yǎng)物。將植物乳桿菌299v(DSM9843),(5)、植物乳桿菌299,(1)、植物乳桿菌Heal9(DSM15312),(2)、植物乳桿菌Heal19(DSM15313),(4)、植物乳桿菌299v突變體(AMJ12")，(3)和羅伊乳桿菌，(6)培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)振蕩器上的MRS肉湯(37。C,200rpm)中。在指數(shù)期收集細(xì)菌(OD600,max二1.3)。用預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對應(yīng)于一定細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)液體積。<吏細(xì)胞以5000rpm旋轉(zhuǎn)(Sorvallhemeus,multifuge)2分鐘，然后再懸浮于HBSS(PAA)、HEPES2.5%(1M,PAA)和FeCl310pM轉(zhuǎn)運(yùn)溶液中。所有樣品都以6.7xl(^個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度進(jìn)行試驗(yàn)，但羅伊乳桿菌的添加濃度為3.35x107個(gè)細(xì)胞/ml。將試驗(yàn)重復(fù)2次。細(xì)胞s5Fe攝入和跨單細(xì)胞層轉(zhuǎn)運(yùn)的測定。在攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)測定前1天將新鮮補(bǔ)充的DMEM提供給細(xì)胞。為了研究Caco-2細(xì)胞的Fe(III)攝入和跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，用55Fe(PerkinElmer)追蹤細(xì)菌懸液。將0.5mL體積的懸液置于Caco-2細(xì)月包頂側(cè)，同時(shí)底外側(cè)室包含1.5mlHBSS/HEPES。在37°C和95%空氣-5%C02的潮濕氣氛下培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)2小時(shí)后，將細(xì)胞用水冷洗滌緩沖液(150mmol/LNaCl,10mmol/LHEPES,1mmol/LEDTA,pH7)洗滌4次，在0.5MNaOH中勻漿化。用液體閃爍計(jì)數(shù)測定轉(zhuǎn)運(yùn)至底外側(cè)室或者與Caco-2細(xì)胞溶解液締合的55Fe。在測定之前和之后通過測量TEER監(jiān)測單細(xì)胞層的完整性。加入不同菌林后在HBSS/HEPES中FeCl3(10pmol/l)的轉(zhuǎn)運(yùn)(參閱方法的描述)。對照同上但無細(xì)菌。轉(zhuǎn)運(yùn)％對照0.061.植物乳桿菌2990.582.植物乳桿菌Heal90.233.植物乳桿菌299v突變體0.324.植物乳桿菌heal190.695.植物乳桿菌299v0.386.羅伊乳桿菌0.11結(jié)果與凈Fe溶液相比，菌林l-5影響Fe的轉(zhuǎn)運(yùn)。可見增加3-9倍。雖然在含羅伊乳桿菌的樣品中顯示轉(zhuǎn)運(yùn)增加，但與不同的植物乳桿菌菌4朱無法相比。因此，在不同植物乳桿菌菌抹觀察到轉(zhuǎn)運(yùn)的增加，顯示鐵吸收的類似增加，如上述人體研究所示。權(quán)利要求1.至少一種選自下列的植物乳桿菌菌株及其部分在制備組合物中的用途，所述菌株選自植物乳桿菌299，DSM6595、植物乳桿菌299v，DSM9843、植物乳桿菌HEAL9，DSM15312、植物乳桿菌HEAL19，DSM15313、植物乳桿菌HEAL99，DSM15316，所述組合物用于在哺乳動(dòng)物優(yōu)選人中增加至少一種金屬/金屬離子的吸收。2.權(quán)利要求1的用途，其中所述至少一種金屬/金屬離子選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子。3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種菌抹是有活力、滅活或抑制或者死亡的。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種菌林M因-修飾的。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含載體材料。7.權(quán)利要求6的用途，其中所述載體材料選自麥片粥、乳酸發(fā)酵食物、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖基化蛋白和脂類。8.權(quán)利要求6或7的用途，其中所述載體材料用一種或多種選自植物乳桿菌299,DSM6595、才直物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和植物乳桿菌HEAL99,DSM15316的菌抹發(fā)酵。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物選自食品、膳食補(bǔ)充劑、營養(yǎng)品、功能食品和醫(yī)療食品。10.權(quán)利要求9的用途，其中所述食品選自飲料、酸奶、果汁、冰洪淋、面包、餅干、谷類、健康棒和醬。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含至少一種選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子的金屬/金屬離子。12.權(quán)利要求ll的用途，其中所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種菌林在組合物中的量為約lxl0、約lxlOMCFU,優(yōu)選Ixl08-lxl012，更優(yōu)選]xl()9-lxl011。14.一種在哺乳動(dòng)物優(yōu)選人中增加至少一種金屬/金屬離子的吸收的方法，所述方法通過給予包含至少一種選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和植物乳桿菌HEAL99,DSM15316的植物乳桿菌菌株及其部分的組合物進(jìn)行。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種金屬/金屬離子選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。17.權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種菌抹是有活力的、滅活或抑制或者死亡的。18.權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種菌林是基因修飾的。19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含載體材料。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述載體材料選自麥片粥、乳酸發(fā)酵食物、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖基化蛋白和脂類。21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述載體材料用一種或多種選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v，DSM9843、植物乳桿菌HEAL9，DSM15312、；f直物乳桿菌HEAL19,DSM15313和植物乳桿菌HEAL99,DSM15316的菌株發(fā)酵。22.權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物選自食品、膳食補(bǔ)充劑、營養(yǎng)品、功能食品和醫(yī)療食品。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述食品選自飲料、酸奶、果汁、冰淇淋、面包、餅干、谷類、1變康棒和醬。24.權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物包含至少一種選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子的金屬/金屬離子。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。26.權(quán)利要求14-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種菌抹在組合物中的量為約lxio、約lxlO"CFU，優(yōu)選Ixl08-lxl012，更優(yōu)選lxl。9-lxl011。27.至少一種選自下列的植物乳桿菌菌林及其部分在制備藥用組合物中的用途，所述菌林選自才直物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和植物乳桿菌HEAL99,DSM15316，所述藥用組合物用于治療貧血、骨質(zhì)疏;^癥或者其中存在至少一種選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子的金屬/金屬離子缺乏問題的任何其它疾病。28.權(quán)利要求27的用途，其中所述藥用組合物是液體制劑或固體制劑。29.權(quán)利要求28的用途，其中所述固體制劑選自片劑、含片、糖、咀嚼片、口香糖、膠嚢劑、香嚢劑、散劑、顆粒劑、包衣顆粒和包衣片、腸溶片和膠嚢劑以及熔解條帶和薄膜。30.權(quán)利要求27的用途，其中所述液體制劑選自口服溶液、混懸液、乳液和糖漿劑。31.權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物包含至少一種選自Fe、Zn、Ca和Mg及其離子的金屬/金屬離子。32.權(quán)利要求31的用途，其中所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。33.權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種菌林是有活力的、滅活或抑制或者死亡的。34.權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種菌林是基因修飾的。35.權(quán)利要求27-34中任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種菌林在藥用組合物中的量為約lxl0、約lxl014CFU,優(yōu)選Ixl08-lxl012,更優(yōu)選lxl()9-lx1011。36.—種組合物，所述組合物包含至少一種選自下列的植物乳桿菌菌抹及其部分以及至少一種選自Fe，、Zn、Ca、Mg及其離子的金屬/金屬離子，所述菌抹選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v:DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313、植物乳桿菌HEAL99，DSM15316。37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述至少一種金屬/金屬離子與另一種元素締合或者與另一種元素絡(luò)合鍵合。38.權(quán)利要求36或37的組合物，其中所述至少一種菌林是有活力的、滅活或抑制或者死亡的。39.權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種菌株B因修飾的。40.權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含載體材料。41.權(quán)利要求40的組合物，其中所述載體材料選自麥片粥、乳酸發(fā)酵食物、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖基化蛋白和脂類。42.權(quán)利要求40或41的組合物，其中所述載體材料用一種或多種選自植物乳桿菌299,DSM6595、植物乳桿菌299v,DSM9843、植物乳桿菌HEAL9,DSM15312、植物乳桿菌HEAL19,DSM15313和才直物乳桿菌HEAL99，DSM15316的菌林發(fā)酵。43.權(quán)利要求38-42的組合物，其中所述組合物選自食品、膳食補(bǔ)充劑、營養(yǎng)品、功能食品和醫(yī)療食品。44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述食品選自飲料、酸奶、果汁、冰淇淋、面包、餅干、谷類、健康棒和醬。45.權(quán)利要求38-44中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種菌株在組合物中的量為約lxl0、約lxlO"CFU，優(yōu)選Ixl08-lxl012，更優(yōu)選1x1q9誦1x1011。全文摘要本發(fā)明涉及至少一種選自下列的植物乳桿菌菌株及其部分在制備組合物中的用途，所述菌株選自植物乳桿菌299，DSM6595、植物乳桿菌299v，DSM9843、植物乳桿菌HEAL9，DSM15312、植物乳桿菌HEAL19，DSM15313、植物乳桿菌HEAL99，DSM15316，所述組合物用于在哺乳動(dòng)物優(yōu)選人中增加至少一種金屬/金屬離子的吸收。文檔編號C12R1/25GK101252943SQ200680031271公開日2008年8月27日申請日期2006年7月4日優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日發(fā)明者A·伯格倫,J·阿倫法爾申請人:普羅比公司