專利名稱：檢測(cè)bk病毒的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及BK病毒的檢測(cè)。 交叉引用本申請(qǐng)要求2005年8月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/705,217號(hào)和2005年 10月6日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)11/246,904號(hào)的權(quán)益，這些申請(qǐng)通過(guò)引用其全部?jī)?nèi) 容并入本文。
背景技術(shù)：
人多瘤病毒BK型(Human polymavirus type BK)(BK病毒)是具有大約 5,300bp的環(huán)狀雙鏈DNA基因組的無(wú)包被病毒。在1971年，BK病毒在從腎移植 受體的尿中分離后，被首次承認(rèn)為多瘤病毒家族的成員。隨后的研究表明，全世 界成人的血清陽(yáng)性率為80%以上。 一般地，BK病毒的原發(fā)感染在兒童時(shí)期通過(guò)呼 吸道發(fā)生，隨后病毒潛伏在泌尿生殖道中。尿中病毒的無(wú)癥狀再活化和間歇性脫 落在具有免疫能力的人中自然發(fā)生，但是在那些細(xì)胞免疫改變的人如孕婦、正在 接收化療的癌癥患者、感染HIV-1的個(gè)體和腎或其它同種異體移植的受體中頻率 更高。BK病毒感染引起的明顯臨床疾病很少，并且與免疫抑制的程度明顯相關(guān)。
BK病毒相關(guān)性腎病已經(jīng)越來(lái)越多地被認(rèn)為是腎移植患者腎功能障礙的原 因。根據(jù)回顧性研究，在l-5y。的腎移植受體中發(fā)生BK病毒性腎病，在多達(dá)45% 的被感染患者中發(fā)生同種異體移植功能損耗。盡管得不到BK病毒特異性的抗病毒 治療，但在一些情況下，可以通過(guò)降低維持免疫抑制的水平控制BK病毒復(fù)制。最 近的證據(jù)表明，BK病毒DNA的檢測(cè)緊密跟隨BK病毒性腎病的過(guò)程，并且可以 作為用于診斷和監(jiān)測(cè)的非侵入性手段。因此，腎移植患者的BK病毒負(fù)荷的定量化 對(duì)于診斷BK病毒性腎病和監(jiān)測(cè)對(duì)治療的反應(yīng)即免疫抑制的減低二者，都將是有用 的。另外，BK病毒涉及了其它疾病，如前列腺癌。因此，需要開發(fā)出可靠的診斷試驗(yàn)，以便以能夠檢測(cè)低滴度的病毒的靈敏 度來(lái)檢測(cè)BK病毒，以及用于檢測(cè)不同的BK病毒基因型。另外，需要可靠的診斷 試驗(yàn)，以便區(qū)分BK病毒和其它多瘤病毒如JC病毒。這樣的檢測(cè)對(duì)于防止病毒通 過(guò)血液和血漿衍生物或者通過(guò)密切的身體接觸傳播是重要的。本發(fā)明致力于這些 需要。文獻(xiàn)值得注意的文獻(xiàn)包括美國(guó)專利5,213,796號(hào)；6,605,602號(hào)；WO 92/19774; Watzinger等，Journal of Clinical Microbiology, 42(11): 5189-5198 (2004); Anna Marta Degener等，J Medical Virology 58:413 (1999);和Stoner等，American J of Kidney Diseases. 33:1102 (2002)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于快速、靈敏和高度特異性地基于核酸(例如，基于DNA) 檢測(cè)樣品中的BK病毒的方法和組合物。 一般地，所述方法涉及檢測(cè)具有BK病毒 基因組保守區(qū)域的靶序列的靶核酸。本發(fā)明也表征了用于本發(fā)明方法的組合物和 試劑盒，所述組合物包括引物、探針。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它提供用于BK病毒的檢測(cè)，同時(shí)避免了遺傳上密 切相關(guān)的病毒的檢測(cè)。因此，本發(fā)明減少了假陽(yáng)性的發(fā)生。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它減少了可以由于不能檢測(cè)BK病毒的遺傳變體
(如，不同基因型或者毒株的BK病毒)而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果的發(fā)生。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明包括只需要檢測(cè)相對(duì)短的靶序列的實(shí)施方式。這對(duì)
利用基于擴(kuò)增的技術(shù)如實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)可以具有特別的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明可以被發(fā)展為檢驗(yàn)(assays)或者制造為試劑盒，以在相關(guān)實(shí)驗(yàn)室或者
醫(yī)院中用于診斷BK病毒。所述檢驗(yàn)也可以在用于治療BKV感染導(dǎo)致的疾病的治
療藥物的開發(fā)和臨床實(shí)驗(yàn)中使用。這些優(yōu)點(diǎn)和其它優(yōu)點(diǎn)對(duì)于閱讀本說(shuō)明書后的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易 見的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-圖1AAA顯示了 32個(gè)BK病毒基因型的核酸序列的比對(duì)。用于檢測(cè) 根據(jù)本發(fā)明的BK病毒(BKV)的靶核酸區(qū)域一所述區(qū)域被命名為BK1、 BK2、 BK3、 BK4和BK5(本文也分別稱為靶區(qū)域I、 II、 III、 IV和V)，如以下劃線字體和起始 及結(jié)束箭頭表示。圖右側(cè)的編號(hào)系統(tǒng)表示各基因型的序列編號(hào)一其根據(jù)各基因型的各自的 Genbank登錄號(hào)(GenBank Accession Numbers),或者被測(cè)序基因組的編號(hào)。如沒(méi)有 另外說(shuō)明，本文對(duì)序列編號(hào)的所有引用都是基于Genbank登錄號(hào)AY628224的序 列編號(hào)。適合用于本發(fā)明方法的靶區(qū)域I-V中的示例性引物和探針用黑體表示。適 合用于本發(fā)明的探針包括位于用兩條選擇引物(selected primer)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物序 列中的任何序列。圖2是顯示BK1、 BK2、 BK3、 BK4和BK5中的每一個(gè)的Taqman實(shí)時(shí)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。模板濃度范圍是每個(gè)反應(yīng)50個(gè)拷貝至每個(gè)反應(yīng)50,000個(gè)拷貝。 一式兩份進(jìn)行所有檢測(cè)。對(duì)于BK1檢測(cè)斜率=-3.58，截距=43.428， R2 =0.997。 對(duì)于BK2檢領(lǐng)ij:斜率=-3.48，截距=44.053， R2 =0.999。對(duì)于BK3檢領(lǐng)lj:斜率=-3.49， 截距=44.819， R2 =0.999。對(duì)于BK4檢測(cè)斜率=-3.21,截距=41.466, R2 =0.999。 對(duì)于BK5檢測(cè)斜率=-3.61,截距=47.324， R2 =0.994。
定義如本文所用的術(shù)語(yǔ)"BK病毒"或者"BKV"指來(lái)自與腎病和腎功能障礙相 關(guān)的多瘤病毒家族的病毒。BK病毒是小的無(wú)包被病毒，其基因組包括大約5,300 bp 的環(huán)狀、雙鏈DNA分子。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"在本文中可 互換使用，包括聚合形式的核苷酸，或是核糖核苷酸或是脫氧核糖核苷酸。該術(shù) 語(yǔ)僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括三鏈、雙鏈和單鏈DNA，以及三鏈、 雙鏈和單鏈RNA。其也包括修飾，如通過(guò)甲基化和/或通過(guò)加帽，和未修飾形式的 多核苷酸。更具體地，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核酸分 子"包括多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、 為嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷或C-糖苷的任何其它形式的多核苷酸、和含有非核苷 酸骨架的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNAs))和聚嗎啉(可商業(yè)得自 Anti-Virals,Inc.,CorvaIlis，Oreg.，為Neugene)聚合物、和其它合成的序列特異性核 酸聚合物一只要這些聚合物含有處于允許堿基配對(duì)和堿基堆積的構(gòu)型中的核堿 基，如在DNA和RNA中所見的。除非另外具體說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核 酸分子"在長(zhǎng)度上沒(méi)有預(yù)期的不同，并且這些術(shù)語(yǔ)將被相互交換使用。這些術(shù)語(yǔ) 僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括，例如，3'-脫氧-2'，5'-DNA、寡脫氧核 糖核苷酸N3'P5'氨基磷酸酯、2'-0-烷基取代的RNA、雙鏈和單鏈DNA、以及雙鏈 和單鏈RNA、 DNA: RNA雜合體(hybrids)、和PNAs與DNA或者RNA之間的雜 合體；也包括已知類型的修飾，如本領(lǐng)域已知的標(biāo)記，甲基化，"帽"，用類似 物取代一個(gè)或多個(gè)天然發(fā)生的核苷酸，核苷酸間修飾如，例如那些帶有不帶電的 連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶有負(fù)電荷連 接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、和帶有正電荷連接(例如，氨烷基氨基 磷酸酯、氨烷基磷酸三酯)的修飾，那些含有懸垂部分(pendantmoieties)如例如蛋白 質(zhì)(包括核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴氨酸等)的修飾，那些具有嵌入劑(例 如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾，那些含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、 氧化性金屬等)的修飾，那些含有烷化劑的修飾，那些具有修飾連接(例如，a端基 異構(gòu)核酸等)的修飾；以及未修飾形式的多核苷酸或寡核苷酸。特別地，DNA是脫 氧核糖核酸。
在整個(gè)說(shuō)明書中，應(yīng)用縮寫指代核苷酸(也指代為堿基)，其包括指代多個(gè)核 苷酸的縮寫。如本文所用，0=鳥嘌呤，八=腺嘌呤，丁=胸腺嘧啶，C-胞啼啶、和 11=尿嘧啶。另外，R-嘌呤核苷酸(A或者G); Y^密啶核苷酸(A或者T(U)); S=C 或者G; W^A或者T(U); M-A或者C; K=G或者T(U); V=A、 C或者G;和 N—壬何核苷酸(A、 T(U)、 C或者G)。各處的核苷酸可以應(yīng)用小寫字母或大寫字母 表示。也理解，在說(shuō)明書中，提供用于DNA的核苷酸序列也代表RNA的核苷酸 序列，其中T替換為U。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"脫氧核糖核酸"和"DNA"意味著由脫氧核糖核苷酸 組成的聚合物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"核糖核酸"和"RNA"指由核糖核苷酸組成的聚合物。 其中核酸序列用DNA序列的核苷酸提供，可以理解，這樣的序列包括互補(bǔ)DNA 序列，也進(jìn)一步包括基于給出的DNA序列或者其互補(bǔ)序列的RNA序列，其中尿 嘧啶(U)取代了 DNA序列或其互補(bǔ)序列中胸腺嘧啶(T)。當(dāng)其分子共享堿基對(duì)結(jié)構(gòu)同源性時(shí)，兩個(gè)核苷酸序列是彼此"互補(bǔ)的"。"互 補(bǔ)的"核苷酸序列在合適的雜交條件下將會(huì)特異地結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈體。例如， 當(dāng)部分第一序列能夠以反向平行方向結(jié)合到部分第二序列，其中每條序列的3'-端 結(jié)合到另一序列的5'-端并且隨后一條序列的每個(gè)A、 T(U)、 G和C分別匹配另一 序列的T(U)、 A、 C和G時(shí)，則兩條序列是互補(bǔ)的。RNA序列也可以包括互補(bǔ)的 G^或者l^G堿基對(duì)。因此，在本發(fā)明下，兩條序列不必具有完全的同源性以便 是"互補(bǔ)的"。通常，當(dāng)在規(guī)定長(zhǎng)度的分子中，至少大約85%(優(yōu)選地，至少大約 卯％，最優(yōu)選地，至少大約95%)的核苷酸具有堿基對(duì)結(jié)構(gòu)時(shí)，兩條序列充分互補(bǔ)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"分離的"當(dāng)用在分離化合物的情況下時(shí)，是指目標(biāo)化 合物處于與該化合物在其中天然發(fā)生的環(huán)境不同的環(huán)境中。"分離的"意味著包括 大量富含目標(biāo)化合物、和/或者其中目標(biāo)化合物被部分或者基本純化的樣品內(nèi)的化 合物。術(shù)語(yǔ)"分離的"包括這樣的情況其中所述材料不伴有在其天然狀態(tài)下通 常與之結(jié)合的至少一些材料，優(yōu)選地，構(gòu)成給定樣品總蛋白重量的至少大約0.5%， 更優(yōu)選地，至少大約5%。例如，關(guān)于多核苷酸的術(shù)語(yǔ)"分離的" 一般是指，完全 或者部分地缺乏通常在天然狀態(tài)下與其結(jié)合的序列的核酸分子；或者如其天然存 在、但具有與其結(jié)合的異源序列的序列；或者從染色體解離的分子。
如本文的所用的"純化的"意味著，所述材料包括總材料重量的至少大約 75%，優(yōu)選至少大約80%，特別優(yōu)選至少大約90%。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"基本純 的"是指化合物從其天然環(huán)境移去并且至少60%、優(yōu)選75%、和更優(yōu)選90%不含 有與其天然結(jié)合的其它成分。"衍生自"或者"特異于(對(duì)…具有特異性)"指定序列一如靶核酸的靶序列 一的多核苷酸是指這樣的多核苷酸序列，其包括與指定的核苷酸序列的區(qū)域?qū)?yīng)， 即相同或者互補(bǔ)的大約至少約6個(gè)核苷酸，優(yōu)選地，至少大約8個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地，至少大約10-12個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選地，至少大約15-20個(gè)核苷酸的連續(xù) 序列。衍生的多核苷酸不必物理上來(lái)自目標(biāo)核苷酸序列，而是可以以許多方式產(chǎn) 生，包括但不限于化學(xué)合成、復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄，這基于該多核苷酸從其衍 生的區(qū)域或?qū)ζ渚哂刑禺愋缘膮^(qū)域(一個(gè)或多個(gè))中的堿基序列提供的信息。"衍生 自"或者"特異于"指定序列的多核苷酸包括相對(duì)于原始多核苷酸為有義或者反 義取向的多核苷酸。"同源性"指兩個(gè)多核苷酸或者兩個(gè)多肽部分之間的相似性百分?jǐn)?shù)。當(dāng)兩 個(gè)DNA或者兩個(gè)多肽序列在限定長(zhǎng)度的分子上顯示至少大約50%，優(yōu)選地至少大 約75%，更優(yōu)選地至少大約80%，至少大約85%，優(yōu)選地至少大約90%，最優(yōu)選 地至少大約95%或者至少大約98%的序列相似性時(shí)，所述序列是彼此"基本上同 源的"。如本文所述，基本上同源也指序列顯示出與指定的DNA或者多肽序列完 全的同一性。 —般，"同一性"是指兩個(gè)多核苷酸或者多肽序列分別具有精確的核苷酸-核苷酸或者氨基酸-氨基酸一致性。同一性百分?jǐn)?shù)可以通過(guò)比對(duì)序列進(jìn)行兩個(gè)分子 之間的序列信息的直接比較，計(jì)數(shù)兩個(gè)比對(duì)序列之間的匹配的精確數(shù)目，除以較 短序列的長(zhǎng)度、和將結(jié)果乘以100來(lái)確定。在同源性和同一性分析中，可以使用容易獲得的計(jì)算機(jī)程序加以輔助，如 來(lái)自DNASTAR， Inc.的Lasergene，禾卩ALIGN, Dayhoff， M. O.， Atlas of Protein Sequence and Structure M. 0. Dayhoff ed.， 5 Suppl. 3:353-358， National biomedical Research Foundation, Washington, DC，其采用Smith and Waterman Advance， Appl. Math. 2:482-489, 1981的局部同源性算法進(jìn)行肽分析。確定核苷酸序列同源性的程 序可在Wisconsin序歹U分析軟件包版本8( Wisconsin Sequence Analysis Package Version 8，從Genetics Computer Group, Madison， Wis.獲得)中獲得，例如，BESTFIT、 FASTA和GAP程序，它們也依賴于Smith and Waterman算法。這些程序容易應(yīng) 用制造商推薦的和在上述Wisconsin序列分析軟件包中描述的缺省參數(shù)而使用。 例如，用Smith and Waterman同源性算法和缺省評(píng)分表和六核苷酸位置(six nucleotidepositions)空位罰分，可以確定特定核苷酸序列與參照序列的同源性百分 數(shù)。在本發(fā)明的背景中，確立同源性百分?jǐn)?shù)的另一方法是用MPSRCH程序包， University of Edinburgh擁有其版權(quán)，由John F. Collins和Shane S. Sturrok開發(fā)，由 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif.)分銷。依據(jù)該組程序包，可以使用 Smith-Waterman算法，其中評(píng)分表使用缺省參數(shù)(例如，空位開放罰分12，空位延 伸罰分1和空位(gap)6)。從所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，"匹配"值反映了"序列同源性"。用于計(jì) 算序列之間的同一性或者相似性百分?jǐn)?shù)的其它合適的程序在本領(lǐng)域中一般是已知 的，例如，另一個(gè)比對(duì)程序是使用缺省參數(shù)的BLAST。例如，可以用以下缺省參 數(shù)使用BLASTN和BLASTP:遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)，過(guò)濾器(filter"無(wú)，鏈=雙鏈，截?cái)?cutof;t)=60，期望(expect)-10，矩陣二BLOSUM62，描述(Descriptions)-50個(gè)序列， 篩選(sort by"高分，數(shù)據(jù)庫(kù)-非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。這些程序的細(xì)節(jié)可以在因特網(wǎng)上、 在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 和美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館(National Library of Medicine)主辦的網(wǎng)站上找到(見萬(wàn)維網(wǎng) 站ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)?？蛇x地，通過(guò)在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下雜交多核苷酸，接 著通過(guò)用單鏈特異性核酸酶(一種或者多種)消化，和確定消化片段的大小，可以確 定同源性。基本同源的DNA序列可以在例如，該具體系統(tǒng)規(guī)定的嚴(yán)格條件下、以 DNA雜交(Sourthernhybridization)實(shí)驗(yàn)鑒定。限定合適的雜交條件在本領(lǐng)域的技術(shù) 范圍內(nèi)。參見例如，Sambrook等人，見上；DNA Cloning,見上；Nucleic Acid Hybridization見上。如本文所用描述核酸分子的"重組的"是指，根據(jù)其來(lái)源或者操作，或者 二者，基因組多核苷酸、cDNA多核苷酸、哺乳動(dòng)物多核苷酸、細(xì)菌多核苷酸、病 毒多核苷酸、半合成多核苷酸、合成多核苷酸或者其它來(lái)源的多核苷酸不與在天 然狀態(tài)下與其結(jié)合的全部或者部分多核苷酸結(jié)合。如針對(duì)蛋白或者多肽所用的術(shù) 語(yǔ)"重組的"是指通過(guò)重組多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生的多肽。
"控制元件"是指幫助與其連接的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或者翻譯的多核苷 酸序列。該術(shù)語(yǔ)包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)域、聚腺苷酸化信號(hào)、非 翻譯區(qū)包括5'-UTRs和3'-UTRs、和適當(dāng)時(shí)包括前導(dǎo)序列和增強(qiáng)子，其共同提供用 于宿主細(xì)胞中編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯或者協(xié)助宿主細(xì)胞中編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻 譯。"依賴DNA的DNA聚合酶"是從DNA模板合成互補(bǔ)DNA拷貝的酶。例 子包括來(lái)自大腸桿菌(E. cdi)的DNA聚合酶I和噬菌體T7 DNA聚合酶。所有已知 的依賴DNA的DNA聚合酶需要互補(bǔ)引物來(lái)起始合成。在合適的條件下，依賴DNA 的DNA聚合酶可以從RNA模板合成互補(bǔ)的DNA拷貝。如本文所述，術(shù)語(yǔ)"耙核酸區(qū)域"或者"靶核酸"或者"靶分子"是指具 有待檢測(cè)(例如，通過(guò)擴(kuò)增)的"靶序列"的核酸分子。靶核酸可以是單鏈的或者雙 鏈的，并且可以包括或者可以不包括除靶序列之外的其它序列(例如，靶核酸可以 包括或者可以不包括上游核酸序列或者5'側(cè)翼序列，可以包括或者可以不包括下 游序列或者3'側(cè)翼序列，在一些實(shí)施方式中，可以不包括相對(duì)于靶序列為上游(5') 或者下游(3')的核酸序列)。當(dāng)采用擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，靶序列以外的這些其它的序列可 以隨耙序列擴(kuò)增或者可以不隨靶序列擴(kuò)增。術(shù)語(yǔ)"耙序列"或者"靶核酸序列"指待檢測(cè)(例如，通過(guò)擴(kuò)增)的靶核酸的 特定核苷酸序列。靶序列可以包括靶分子內(nèi)包含的探針雜交區(qū)域，探針與該區(qū)域 在期望的條件下會(huì)形成穩(wěn)定的雜合體。"靶序列"也可以包括寡核苷酸引物與其復(fù)合并以靶序列作為模板被延伸的復(fù)合序列(complexing sequence)。當(dāng)靶核酸為單鏈 時(shí)，術(shù)語(yǔ)"靶序列"也指與如存在于靶核酸中的"靶序列"互補(bǔ)的序列。如果"耙 核酸"最初是雙鏈的，術(shù)語(yǔ)"靶序列"是指正鏈(+)和負(fù)鏈(-)。本發(fā)明也考慮具有 本文提供的序列全長(zhǎng)的靶區(qū)域，以及這樣的靶區(qū)域的片段或者子序列，和其互補(bǔ) 序列。術(shù)語(yǔ)"片段"和"子序列"在該情況下可互換。而且，在本文提供"靶序 列"的序列時(shí)，可以理解，該序列可以是DNA或者RNA。因此，在提供DNA序 列時(shí)，RNA序列也被考慮，并且通過(guò)用"U"取代DNA序列的"T"以提供RNA 序列而被容易地提供。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"引物"或者"寡核苷酸引物"是指，在被置于其中引 物延伸產(chǎn)物的合成被誘導(dǎo)的條件下時(shí)，例如，在核苷酸和聚合-誘導(dǎo)劑如DNA或 者RNA聚合酶存在和在合適的溫度、pH、金屬濃度和鹽濃度下，發(fā)揮作用以起始 互補(bǔ)核酸鏈的合成的寡核苷酸。引物的長(zhǎng)度一般是與其在引物延伸產(chǎn)物合成中的 應(yīng)用相適合的長(zhǎng)度，長(zhǎng)度范圍通常在8至100個(gè)核苷酸之間，如10至75、 15至 60、 15至40、 18至30、 20至40、 21至50、 22至45、 25至40等，更典型地， 在18-40、 20-35、 21-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的范圍，和在所述范圍之間的任何長(zhǎng)度。典型 地，引物可以是10-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)的范圍，如15-45、 18-40、 20-30、 21-25等，以 及在所述范圍之間的任何長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方式中，引物通常不超過(guò)大約IO、 12、 15、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65或者70個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。為了獲得最大的擴(kuò)增效率，引物通常是單鏈的，但是可以可選地是雙鏈的。 如果引物是雙鏈的，在用于制備延伸產(chǎn)物之前，引物通常首先被處理以分開其鏈。 該變性步驟典型地通過(guò)熱引起，但可以可選地用堿進(jìn)行，隨后中和。因此，"引物" 與模板互補(bǔ)，并且通過(guò)氫鍵或者雜交與模板復(fù)合以形成引物/模板復(fù)合物，用于起 始通過(guò)聚合酶的合成，在DNA合成過(guò)程中，引物通過(guò)添加共價(jià)結(jié)合的堿基而延伸， 所述堿基在其3'端連接，與模板互補(bǔ)。本文所用的"引物對(duì)"是指具有適合于靶核酸的基于核酸擴(kuò)增的核酸序列 的第一引物和第二引物。這樣的引物對(duì)一般包括第一引物一其具有與靶核酸的第 一部分序列相同或者相似的序列，和第二引物一其具有與靶核酸的第二部分互補(bǔ) 的序列，以提供用于擴(kuò)增靶核酸或者其片段。除非另外特別指出，本文對(duì)于"第 一"和"第二"引物的引用是隨意的。例如，第一引物可以被設(shè)計(jì)為"正向引物" (其引發(fā)從靶核酸的5'端的核酸合成)或者"反向引物"(其引發(fā)從正向引物引發(fā)的 合成產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物從5'端的核酸合成)。同樣，第二引物可以被設(shè)計(jì)為正向引物 或者反向引物。如本文所用，本文可互換使用的術(shù)語(yǔ)"探針"或者"寡核苷酸探針"是指 由如上定義的多核苷酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，其含有與靶核酸序列分析物(例如，核酸擴(kuò)增 產(chǎn)物)中存在的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。探針的多核苷酸區(qū)域可以由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸類似物構(gòu)成。探針一般具有與其在靶核酸的所有或部分靶 序列的具體檢測(cè)中的應(yīng)用相適應(yīng)的長(zhǎng)度，其范圍通常在8至100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之 間，如8至75、 10至74、 12至72、 15至60、 15至40、 18至30、 20至40、 21 至50、 22至45、 25至40等，更典型的在18-40、 20-35、 21-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)之間 的范圍，和在上述范圍之間的任何長(zhǎng)度。典型的探針是10-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)之間的范 圍，如15-45、 18-40、 20-30、 21-28、 22-25等，以及在所述范圍之間的任何長(zhǎng)度。 在一些實(shí)施方式中，引物通常不超過(guò)大約10、 12、 15、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65或者70個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
本文考慮的探針包括含有可檢測(cè)標(biāo)記的探針。例如，當(dāng)"寡核苷酸探針" 被用于5'核酸酶分析如TaqManTM分析時(shí)，所述探針包括至少一種熒光劑和至少一 種被反應(yīng)中使用的聚合酶的5'內(nèi)切核酸酶活性消化的猝滅劑，以檢測(cè)任何擴(kuò)增的靶 寡核苷酸序列。在這種情況下，寡核苷酸探針將具有足夠數(shù)目的鄰近其5'端的磷酸 二酯鍵，這樣所應(yīng)用的5'到3'核酸酶活性能夠有效地降解所結(jié)合的探針，以分離熒 光劑和猝滅劑。當(dāng)寡核苷酸探針用于TMA技術(shù)時(shí)，它將被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記，如下所述。
如本文所述，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"和"可檢測(cè)標(biāo)記"指能夠檢測(cè)的分子，包括但 不限于放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、生色團(tuán)、酶、酶底物、酶輔因子、 酶抑制劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(例如，生物素、親和素、 鏈霉親和素或半抗原)等。術(shù)語(yǔ)"熒光劑(fluorescer)"是指能夠顯示可檢測(cè)范圍熒
光的物質(zhì)或者其部分。術(shù)語(yǔ)"雜交"(hybridize)和"雜交"(hybridization)是指，在通過(guò)Watson-Crick
堿基配對(duì)充分互補(bǔ)形成復(fù)合物的核苷酸序列之間形成復(fù)合物。當(dāng)引物與靶(模板) "雜交"時(shí)，這樣的復(fù)合物(或者雜合體)足夠穩(wěn)定以發(fā)揮如DNA聚合酶起始DNA
合成所需的引發(fā)功能。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"是指這樣的條件在該條件下，引物將優(yōu)選地與其互補(bǔ) 結(jié)合配偶體(partner)雜交或特異性結(jié)合，并較少程度地與其它序列雜交或結(jié)合、或 者根本不與其它序列雜交或結(jié)合。換言之，本文所用的術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格雜交條件"是
指這樣的條件其適合于在互補(bǔ)結(jié)合成員之間一例如，在探針和樣品中的互補(bǔ)靶 之間一的陣列(array)表面上產(chǎn)生雙鏈體，例如，核酸探針雙鏈體，如DNA探針和 樣品中存在的它們的相應(yīng)核酸靶，例如，樣品中存在的它們相應(yīng)的mRNA分析物。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"結(jié)合對(duì)"是指彼此特異性結(jié)合的第一分子和第二分子， 如能夠形成核酸雙鏈體的互補(bǔ)多核苷酸對(duì)。結(jié)合對(duì)的第一成員與樣品中結(jié)合對(duì)的 第二成員的"特異性結(jié)合"通過(guò)第一成員以比對(duì)樣品中其它成分的結(jié)合更大的親
和力和特異性結(jié)合于第二成員而證明，或者反之亦然。結(jié)合對(duì)成員之間的結(jié)合一 般是非共價(jià)的。"選擇性結(jié)合"意味著，分子優(yōu)選地結(jié)合到目標(biāo)靶或者以比與其它分子的 結(jié)合更大的親和力結(jié)合到靶上。例如，DNA分子會(huì)結(jié)合到基本互補(bǔ)的序列但不會(huì)結(jié)合到非相關(guān)序列。在核酸雜交情況下(例如，如在陣列，DNA雜交或者RNA雜交中)，"嚴(yán)格 雜交"和"嚴(yán)格雜交洗脫條件"是序列依賴性的，在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。能 夠用于鑒定本發(fā)明的范圍內(nèi)的核酸的嚴(yán)格雜交條件可以包括，例如，在包括50% 甲酰胺、5xSSC和1% SDS的緩沖液中在42'C下雜交，或者在包括5xSSC和1% SDS 的緩沖液中在65'C下雜交，二者都用0.2xSSC和0.1。/。 SDS在65'C下洗脫。示范 性嚴(yán)格雜交條件也可以包括在40%甲酰胺、1 MNaCl和P/。SDS的緩沖液中在37'C 下雜交，并在lxSSC中在45r下洗脫。可選地，可以采用在0.5MNaHPO4、 7% 十二垸基硫酸鈉(SDS)、 1 mnM EDTA中在65。C下與濾膜上結(jié)合的DNA雜交，并 在O.lxSSC/0.1% SDS中在68。C下洗脫。再其它的嚴(yán)格雜交條件包括在60'C或者 更高的溫度下和3xSSC (450 mM氯化鈉/45 mM檸檬酸鈉)中雜交或者在42'C下在 含有30%甲酰胺、1MNaCl、 0.5%肌氨酸鈉、50mMMES， pH6.5的溶液中溫育。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易知道，可以利用可選而相當(dāng)?shù)碾s交和洗脫條件以提供 相似嚴(yán)格性的條件。在某些實(shí)施方式中，洗脫條件的嚴(yán)格性闡明了確定核酸是否與探針特異性 雜交的條件。用于鑒定核酸的洗脫條件可以包括，例如pH 7、鹽濃度大約0.02 摩爾、和溫度至少大約5(TC或者大約55'C到大約6(TC;或者，鹽濃度為大約0.15 MNaCl、 72'C，進(jìn)行大約15分鐘；或者，鹽濃度大約為0.2xSSC，溫度至少大約 50'C或者大約55'C到大約60°C ，進(jìn)行大約15到大約20分鐘；或者，用具有含0.1% SDS的大約2xSSC鹽濃度的溶液在室溫下洗脫雜交復(fù)合物15分鐘兩次，隨后用含 有0.1。/。SDS的0.1xSSC在68'C下洗脫15分鐘2次；或者等同條件。用于洗脫的 嚴(yán)格條件也可以是，例如，在42'C下、0.2xSSC/0.1% SDS。在核酸分子是脫氧寡 核苷酸("寡核苷酸(oligos)")的情況下，嚴(yán)格條件可以包括，在6xSSC/0.05n/。焦磷酸 鈉中在37'C下(對(duì)14個(gè)堿基的寡核苷酸)、48'C下(對(duì)17個(gè)堿基的寡核苷酸)、55'C 下(對(duì)20個(gè)堿基的寡核苷酸)和6(TC下(對(duì)23個(gè)堿基的寡核苷酸)洗脫。等同的雜交 和洗脫條件和試劑與緩沖液如SSC緩沖液和等同的試劑和條件的詳細(xì)描述參見 Sambrook、 Ausubel或者Tijssen (下文引用)。嚴(yán)格雜交條件是至少如上述代表性條件那樣嚴(yán)格的雜交條件，其中如果雜 交條件具有上述具體的嚴(yán)格條件的至少大約80%，典型地至少大約90%的嚴(yán)格性，
則認(rèn)為該條件是至少嚴(yán)格的。其它的嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域已知的，也可以被適 當(dāng)采用。雙鏈DNA的"解鏈溫度"或者"Tm"被定義為，由于熱或者例如通過(guò)酸 或堿處理或類似處理造成的堿基對(duì)之間氫鍵的其它解離，失去一半DNA螺旋結(jié)構(gòu) 時(shí)的溫度。DNA分子的Tm依賴于其長(zhǎng)度和其堿基組成。富含GC堿基對(duì)的DNA 分子比那些具有大量AT堿基對(duì)的DNA分子具有更高的Tm。當(dāng)溫度降低到Tm以 下時(shí)，分開的DNA互補(bǔ)鏈自發(fā)地重締合或者退火形成雙鏈DNA。最高的核酸雜交率發(fā)生在低于Tm大約25攝氏度下。Tm可以用以下關(guān)系式估計(jì)Tm =69.3+0.41 (GC)。/。(Marmur等人，(1962) ， J. Mol. Biol. 5:109-118)。如本文所用，"生物樣品"是指從對(duì)象分離的組織或者流體樣品，其在本發(fā) 明的背景下， 一般是指被懷疑為含有BK病毒的核酸和/或病毒顆粒的樣品，該樣 品在任選地操作后，可以在體外試驗(yàn)中進(jìn)行分析。典型的目標(biāo)樣品包括但不限于， 呼吸道分泌物(例如，從鼻道、肺等的流體或組織獲得的樣品)、血液、血漿、血清、 血細(xì)胞、腦脊液、糞便物、尿、眼淚、唾液、乳、器官、活組織檢査和腸道與呼 吸道的分泌物。樣品也包括體外細(xì)胞培養(yǎng)物組分樣品，其包括但不限于由培養(yǎng)基 中的細(xì)胞和組織生長(zhǎng)得到的條件培養(yǎng)基，例如重組細(xì)胞和細(xì)胞組分。
術(shù)語(yǔ)"評(píng)價(jià)"包括任何形式的測(cè)定，并包括確定一個(gè)要素存在與否。術(shù)語(yǔ) "確定"、"測(cè)定"、"評(píng)估"、"評(píng)價(jià)"和"檢測(cè)(分析，試驗(yàn))"可互換使用，包括定 量和定性測(cè)定。評(píng)價(jià)可以是相對(duì)的或者絕對(duì)的。"評(píng)價(jià)存在"包括確定存在物的量， 和/或確定其存在與否。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"確定"、"測(cè)定"和"評(píng)價(jià)"和"檢測(cè)(分 析，試驗(yàn))"可互換使用，并包括定量和定性測(cè)定。在涉及基于核酸擴(kuò)增靶序列的方法的背景下，術(shù)語(yǔ)"參照范圍"是指來(lái)自 BK病毒明性祥品的Ct (循環(huán)閥值)值的范圍，其代表了被認(rèn)為表明樣品(例如，患 者樣品)是BK病毒陰性的結(jié)果。在涉及基于核酸擴(kuò)增靶序列的方法的背景下，術(shù)語(yǔ)"報(bào)告范圍"指BK病 毒陽(yáng)性樣品產(chǎn)生的Ct僮的范國(guó)，其代表了被報(bào)告為BK病毒陽(yáng)性患者樣品的結(jié)果。
如本文所用的"檢測(cè)特異性"是指檢測(cè)系統(tǒng)特異性地檢測(cè)靶病毒、和不檢 測(cè)其它相關(guān)病毒或者正被驗(yàn)證的樣本類型中發(fā)現(xiàn)的病原或者共生群系(flora)的能 力。例如，關(guān)于利用BK病毒引物和探針進(jìn)行檢測(cè)的"檢測(cè)特異性"是指，檢測(cè)系 統(tǒng)特異性地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)靶病毒和不檢測(cè)其它相關(guān)病毒或者正被驗(yàn)證的樣本類型中 發(fā)現(xiàn)的病原或者共生群系的能力。在涉及基于核酸擴(kuò)增耙序列的方法的背景下，"檢測(cè)靈敏度"是指對(duì)每個(gè)被
驗(yàn)證的樣品類型，能夠被檢測(cè)的BK病毒靶DNA的最低可檢測(cè)量。"精密度"是指檢測(cè)對(duì)給定樣品能夠重復(fù)產(chǎn)生相同或者相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果的能力。"準(zhǔn)確度"是指檢測(cè)正確地測(cè)定含有陽(yáng)性和陰性二種樣品的盲組(blinded
panel)中的靶分子的能力。進(jìn)一步指出的是，可以起草權(quán)利要求以排除任何任選的要素。同樣地，該 陳述旨在充當(dāng)使用與敘述權(quán)利要求要素相關(guān)的排除性術(shù)語(yǔ)如"獨(dú)有地"、"僅僅" 等的先行基礎(chǔ)，或者使用"負(fù)"限定的先行基礎(chǔ)。在進(jìn)一步描述本發(fā)明前，可以理解本發(fā)明不限于所述的具體實(shí)施方式
，同 樣地，當(dāng)然可以變化。也可以理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述具體的實(shí)施 方式，并不意圖于是限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求所限制。
當(dāng)值的范圍被提供時(shí)，可以理解，如果上下文沒(méi)有清楚地說(shuō)明，在該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值到下限的十分位(tenth of the unit of the lower limit) 和所述范圍內(nèi)的任何其它陳述值或中間值，都包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的 上和下限可以獨(dú)立地包括在較小的范圍內(nèi)，并且也包括在發(fā)明內(nèi)，適用于所述范 圍中任何特別排除的限值。當(dāng)所述范圍包括一個(gè)或者兩個(gè)限值時(shí)，排除那些被包 括的限值的任一或者兩個(gè)的范圍也包括在本發(fā)明中。除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普 通技術(shù)人員通常所理解的意義相同的意義。盡管與本文所述的方法和材料相似或 者等價(jià)的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明實(shí)踐或檢測(cè)，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法 和材料。本文提及的所有出版物通過(guò)引用包含在此，以便公開和描述與所引用的 出版物相關(guān)的方法和/或材料。必須注意，如本文和所附權(quán)利要求所用，除非上下文另外清楚地說(shuō)明，單 數(shù)形式"一個(gè)或一種(a)"、"一個(gè)或一種(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)的所指對(duì)象。 因此，例如，對(duì)"寡核苷酸引物"的提及包括多個(gè)這樣的引物，對(duì)"引物"的提 及包括指代一條或者多條引物和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。
本文所述的出版物被提供只是因?yàn)樗鼈冊(cè)诒旧暾?qǐng)?zhí)峤蝗罩肮_。本文中 的任何出版物都不被解釋為承認(rèn)本發(fā)明由于現(xiàn)有發(fā)明而沒(méi)有資格先于這些出版 物。而且，所提供的出版日期可能與實(shí)際的出版日期不同，這可能需要單獨(dú)地證 實(shí)。除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施將利用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)的化學(xué)、生物化 學(xué)、重組DNA技術(shù)和病毒學(xué)方法。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分地解釋。例如，見 Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.); A. L丄ehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook，等 人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed.， 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)。
現(xiàn)在本發(fā)明將被更加詳細(xì)地陳述。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)包括耙核酸序列(本文也稱為靶序列)的BK病毒(BKV)基因 組中的共有靶核酸區(qū)域，用于具有特異性和靈敏度地檢測(cè)樣品、尤其是生物樣品 中的BKV。特別地，檢測(cè)一個(gè)或者多個(gè)靶核酸序列區(qū)域一般允許檢測(cè)樣品中的 BKV，而也能夠區(qū)分，例如BKV與JC病毒(JCV)和/或BKV與SV40。這些檢測(cè) 的特異性和簡(jiǎn)便性促進(jìn)了用于一般性地測(cè)定BKV的快速、可靠和廉價(jià)的檢測(cè)。本 發(fā)明在多種不同應(yīng)用中具有用處，包括研究、醫(yī)療、藥品開發(fā)和診斷應(yīng)用。
—般地，本方法提供用于通過(guò)檢測(cè)BKV基因組的靶核酸區(qū)域來(lái)檢測(cè)樣品如 生物樣品中的BKV。本文描述了 5個(gè)這樣的靶核酸區(qū)域，分別稱為靶區(qū)域I-V，如圖l所指明。在一些實(shí)施方式中，本方法提供用于檢測(cè)樣品如生物樣品中的任何BKV分 離物。在這樣的實(shí)施方式中，本方法通過(guò)應(yīng)用相應(yīng)于耙區(qū)域中的序列的引物和探 針檢測(cè)靶核酸區(qū)域或其片段。適用于本發(fā)明方法的靶區(qū)域I-V內(nèi)的示例性引物提供 在表1中。適用于本發(fā)明的探針包括位于用選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物序列內(nèi)的任 何序列。選擇適用于這樣的實(shí)施方式的探針，以便其對(duì)應(yīng)于待測(cè)的不同BKV分離 物之間的共享核苷酸序列的區(qū)域。我們注意到，本文提供的序列，尤其是共有序列被提供為DNA序列?？梢?br> 理解，提供的DNA序列可以是單鏈的或者雙鏈的，同樣地，下文對(duì)DNA序列的
描述也旨在同時(shí)提供互補(bǔ)序列?，F(xiàn)在更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的組合物和方法。
靶核酸區(qū)域通過(guò)比對(duì)不同的BKV分離基因組鑒定靶核酸序列區(qū)域。本發(fā)明提供用于通 過(guò)檢測(cè)一個(gè)或者多個(gè)耙核酸區(qū)域或者其部分鑒定樣品如生物樣品中的BKV。 一般 地，檢測(cè)通過(guò)核酸擴(kuò)增進(jìn)行，在一些實(shí)施方式中，隨后用雜交探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。 下文進(jìn)一歩具體描述靶核酸區(qū)域。可以理解，由于BKV含有在病毒復(fù)制期間從其中產(chǎn)生RNA的雙鏈DNA 基因組，本文所述的引物和探針包括那些具有本文所述核酸序列的引物和探針， 以及具有這些核酸序列的互補(bǔ)序列的引物和探針。而且，可以理解，用于本發(fā)明的引物對(duì)包括具有與本文提供的BKV序列相 同或者相似的序列的第一引物和具有與本文提供的BKV序列互補(bǔ)的序列的第二引 物，以便提供用于擴(kuò)增本文所述的BKV靶核酸區(qū)域或者其片段(例如，第一引物 是"正向"引物和第二引物是"反向"引物)。進(jìn)一步理解的是，用于本發(fā)明的引 物對(duì)也包括具有與本文提供的BKV序列互補(bǔ)的序列的第一引物和具有與本文提供 的BKV序列相同或者相似的序列的第二引物，以便提供用于擴(kuò)增本文所述的BKV 耙核酸區(qū)域或者其片段(例如，第一引物是"反向"引物和第二引物是"正向"引 物)。也將理解，本文所述的探針的核酸序列可以與所提供的BKV序列或者其互 補(bǔ)序列的核酸序列相同或者相似。另外，本文所述的引物也可以被用作探針，例 如，以便檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。 靶區(qū)域I(BK1)在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品如生物樣品中的BKV，通過(guò) 檢測(cè)如下靶核酸序列區(qū)域I(圖1，靶區(qū)域I(也稱為BK1)，基于Genbank登錄號(hào) AY628224的編號(hào)的比對(duì)位置435-585):GCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT (SEQ IDNO:Ol)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段實(shí)施，其中核酸的5鄰3'端包含在SEQ IDNO:Ol中。 BKV基因組中的該保守序列顯示在圖1中的比對(duì)中。在尤其值得注意的一個(gè)實(shí)施 方式中，靶區(qū)域是靶區(qū)域I的子序列，如
CTTTACCTGCTGTAA (SEQ ID NO:55)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段。適于設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶區(qū)域I核酸的引物和適用于本發(fā)明方法的示例性核酸 序列在圖1中用下劃線字體表示。用于擴(kuò)增靶區(qū)域I核酸的引物的合適序列對(duì)應(yīng)于 SEQIDNO:Ol的核苷酸序列的核苷酸1-26和94-119，或其互補(bǔ)序列。
適用于本發(fā)明的探針可以從位于用兩條選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物序列內(nèi)的 任何序列設(shè)計(jì)。用作檢測(cè)耙區(qū)域I核酸的探針的合適序列對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:Ol的 核苷酸序列的核苷酸57-90,或其互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，靶區(qū)域I核酸的檢測(cè)包括產(chǎn)生SEQ ID NO:Ol的至少 151、至少145、至少140、至少135、至少130、至少125、至少120、至少115、 至少IIO、至少105、至少100、至少95、至少90、至少85、至少80、至少75、 至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至 少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明的方法可以包括單獨(dú)檢測(cè)耙區(qū)域I核酸或者聯(lián)合檢測(cè)本文所述的靶 區(qū)域II-V中的一個(gè)或多個(gè)。例如，本發(fā)明的方法可以包括檢測(cè)靶區(qū)域I(BK1)和靶 區(qū)域II(BK2)，耙區(qū)域I(BK1)和靶區(qū)域III(BK3)，靶區(qū)域I(BKl)和靶區(qū)域IV(BK4)， 耙區(qū)域I(BKl)和耙區(qū)域V(BK5)，靶區(qū)域1(BK1)、靶區(qū)域H(BK2)和靶區(qū)域UI(BK3)， 靶區(qū)域I(BKl)、靶區(qū)域IV(BK4)和靶區(qū)域V(BK5)，靶區(qū)域I(BKl)、靶區(qū)域IU(BK3) 和耙區(qū)域V(BK5)等?？梢岳斫?，檢測(cè)靶區(qū)域I-V的所有組合為本方法所預(yù)期。
下面更加詳細(xì)地討論示例性引物和探針。 靶區(qū)域IKBK2)在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品如生物樣品中的BKV，通過(guò) 檢測(cè)如下耙核酸序列區(qū)域II(圖1，靶區(qū)域II(也稱為BK2),基于Genbank登錄號(hào) AY628224的編號(hào)的比對(duì)位置1418-1545):
ACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段實(shí)施，其中核酸的5'和3'端包含在SEQIDNO:02中。 BKV基因組中發(fā)現(xiàn)的這一保守序列在圖1中的比對(duì)中說(shuō)明。在尤其值得注意的一個(gè)實(shí)施方式中，靶區(qū)域是靶區(qū)域II的子序列，如
ACTTCTAGGCCTGTACGGGA (SEQ ID NO:56)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段。適于設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶區(qū)域II核酸的引物和適用于本發(fā)明方法的示例性核酸 序列在圖1中用下劃線字體表示。用于擴(kuò)增靶區(qū)域II核酸的引物的適當(dāng)序列對(duì)應(yīng) 于SEQ ID NO: 02的核苷酸序列的核苷酸33-50和82-104，或其互補(bǔ)序列。
適用于本發(fā)明的探針可以從位于用兩條選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物序列內(nèi)的 任何序列設(shè)計(jì)。用作檢測(cè)靶區(qū)域II核酸的探針的合適序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:02 的核苷酸序列的核苷酸52-80，或其互補(bǔ)序列。
在一個(gè)實(shí)施方式中，靶區(qū)域 II核酸的檢測(cè)包括產(chǎn)生SEQIDNO:02的至少128、至少120、至少110、至少100、 至少90、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至 少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少 20個(gè)連續(xù)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明方法可以包括單獨(dú)檢測(cè)耙區(qū)域II核酸或者聯(lián)合檢測(cè)本文所述的耙區(qū) 域I和III-V中的一個(gè)或者多個(gè)。例如，本發(fā)明方法可以包括檢測(cè)靶區(qū)域H(BK2) 和靶區(qū)域I (BK1)，靶區(qū)域11(BK2)和靶區(qū)域in(BK3)，靶區(qū)域11(BK2)和靶區(qū)域 IV(BK4)，耙區(qū)域II(BK2)和耙區(qū)域V(BK5)，耙區(qū)域I(BK1)、耙區(qū)域II(BK2)和耙 區(qū)域ni(BK3),耙區(qū)域H(BK2)、靶區(qū)域IV(BK4)和耙區(qū)域V(BK5)，或靶區(qū)域 11(BK2)、靶區(qū)域III(BK3)和靶區(qū)域V(BK5)等?？梢岳斫?，檢測(cè)靶區(qū)域I-V的所有 組合為本方法所預(yù)期。下面更加詳細(xì)地討論示例性的引物和探針。 耙區(qū)域HI(BK3)在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品如生物樣品中的BKV，通 過(guò)檢測(cè)如下靶核酸序列區(qū)域III(圖1 ，靶區(qū)域m(也稱為BK3)，基于Genbank登錄 號(hào)AY628224的編號(hào)的比對(duì)位置4097-4560):
AGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段實(shí)施，其中核酸的5'和3'端包含在SEQ IDNO:03中。BKV基因組中的這一保守序列顯示在圖l三個(gè)基因組的比對(duì)中。在尤其值得注意的一個(gè)實(shí)施方式中，所述耙區(qū)域是靶區(qū)域III的子序列，如
TTGAGAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATG(SEQ IDNO:57)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段。適于設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶區(qū)域III核酸的引物和適用于本發(fā)明方法的示例性核酸序列在圖1中用下劃線字體表示。用于擴(kuò)增靶區(qū)域III核酸的引物的序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 03核苷酸序列的核苷酸280-306和355-380，或其互補(bǔ)序列。
適用于本發(fā)明的探針能夠從位于用兩條選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物序列內(nèi)的任何序列設(shè)計(jì)。用作檢測(cè)靶區(qū)域III核酸的探針的合適序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:03的核苷酸序列的核苷酸330-354，或者其互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，靶區(qū)域III核酸的檢測(cè)包括產(chǎn)生SEQIDNO:03的至少464、至少425、至少400、至少375、至少350、至少325、至少300、至少275、至少250、至少225、至少200、至少175、至少150、至少125、至少120、至少115、至少IIO、至少100、至少95、至少卯、至少85、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明的方法可以包括單獨(dú)檢測(cè)靶區(qū)域III核酸或者聯(lián)合檢測(cè)本文所述的靶區(qū)域I-II和IV-V中的一個(gè)或者多個(gè)。例如，本發(fā)明方法可以包括檢測(cè)靶區(qū)域IU(BK3)和耙區(qū)域IV(BK4)，靶區(qū)域IU(BK3)和靶區(qū)域V(BK5)，靶區(qū)域IH(BK3)和靶區(qū)域I(BKl)，靶區(qū)域m(BK3)和靶區(qū)域H(BK2)，靶區(qū)域I (BK1)、靶區(qū)域II(BK2)和靶區(qū)域IH(BK3)，耙區(qū)域m(BK3)、靶區(qū)域IV(BK4)和靶區(qū)域V(BK5)，或者靶區(qū)域m(BK3)、靶區(qū)域I (BK1)和靶區(qū)域V(BK5)等?？梢岳斫猓瑱z測(cè)靶區(qū)域I-V的所有組合為本方法所預(yù)期。下面更加詳細(xì)地討論示例性的引物和探針。耙區(qū)域IV(BK4)在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品如生物樣品中的BKV，通過(guò)檢測(cè)如下靶核酸序列區(qū)域IV(圖1，靶區(qū)域IV(也稱為BK4)，基于Genbank登錄號(hào)AY628224編號(hào)的比對(duì)位置612-864):
TAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA(SEQ ID NO:04)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段實(shí)施，其中核酸的5'和3'端包含在SEQ IDNO:04中。BKV基因組中的這一保守序列顯示在圖1三個(gè)基因組的比對(duì)中。在尤其值得注意的一個(gè)實(shí)施方式中，靶區(qū)域是靶區(qū)域IV的子序列，如
CTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGG(SEQ ID NO:58)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段。適于設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶區(qū)域IV核酸的引物和適用于本發(fā)明方法的示例性核酸序列在圖1中用下劃線字體表示。用于擴(kuò)增耙區(qū)域IV核酸的合適引物的序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 04的核苷酸序列的核苷酸1-19和76-95，或其互補(bǔ)序列。
適用于本發(fā)明的探針可以從位于用兩條選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物序列內(nèi)的任何序列設(shè)計(jì)。用作檢測(cè)靶區(qū)域IV核酸的探針的合適序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:04的核苷酸序列的核苷酸36-62，或其互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，靶區(qū)域IV核酸的檢測(cè)包括產(chǎn)生SEQ ID NO:04的至少253、至少250、至少225、至少200、至少175、至少150、至少125、至少120、至少115、至少IIO、至少IOO、至少95、至少90、至少85、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明的方法可以包括單獨(dú)檢測(cè)靶區(qū)域IV核酸或者聯(lián)合檢測(cè)本文所述的耙區(qū)域I-III和V中的一個(gè)或者多個(gè)。例如，本發(fā)明的方法可以包括檢測(cè)靶區(qū)域IV(BK4)和耙區(qū)域I(BKl)，靶區(qū)域IV(BK4)和靶區(qū)域H(BK2)，靶區(qū)域IV(BK4)和靶區(qū)域III (BK3)，靶區(qū)域IV(BK4)和靶區(qū)域V(BK5),靶區(qū)域I (BK1)、靶區(qū)域I1 (BK2)和靶區(qū)域IV(BK4)，靶區(qū)域III(BK3)、靶區(qū)域IV(BK4)和靶區(qū)域V(BK5)，或者靶區(qū)域I (BK1)、耙區(qū)域IV (BK4)和耙區(qū)域V(BK5)等?？梢岳斫?，檢測(cè)靶區(qū)域I-V的所有組合為本方法所預(yù)期。下面更加詳細(xì)地討論示例性的引物和探針。耙區(qū)域V在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品如生物樣品中的BKV，通過(guò)檢測(cè)如下靶核酸序列區(qū)域V(圖1，靶區(qū)域V(也稱為BK5)，基于Genbank登錄號(hào)AY628224編號(hào)的比對(duì)位置2810-2895):
CTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC(SEQ ID NO:05)或者其互補(bǔ)序列，或者其片段，其中核酸的5'和3'端包含在SEQ ID NO:05中。BKV
基因組中的這一保守序列顯示在圖1三個(gè)基因組的比對(duì)中。在尤其值得注意的一個(gè)實(shí)施方式中，耙區(qū)域是耙區(qū)域V的子序列，如
TTGATCCATGTC (SEQ ID NO:59)
或者其互補(bǔ)序列，或者其片段。
適于設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶區(qū)域V核酸的引物和適用于本發(fā)明方法的示例性核酸序列在圖1中用下劃線字體表示。用于擴(kuò)增靶區(qū)域V核酸的合適引物的序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 05的核苷酸序列的核苷酸2-18和47-64，或其互補(bǔ)序列。
適用于本發(fā)明的探針可以從位于用兩條選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物序列內(nèi)的任何序列設(shè)計(jì)。用作檢測(cè)靶區(qū)域V核酸的探針的合適序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:05的核苷酸序列的核苷酸19-41，或其互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，靶區(qū)域V核酸的檢測(cè)包括產(chǎn)生SEQIDNO:05的至少86、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20個(gè)連
續(xù)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可以包括單獨(dú)檢測(cè)耙區(qū)域V核酸或者聯(lián)合檢測(cè)本文所述的靶區(qū)域I-IV中的一個(gè)或者多個(gè)。例如，本發(fā)明方法可以包括檢測(cè)靶區(qū)域V(BK5)和靶區(qū)域I (BK1)，靶區(qū)域V(BK5)和靶區(qū)域11(BK2)，靶區(qū)域V(BK5)和靶區(qū)域III(BK3)，耙區(qū)域IV(BK4)和耙區(qū)域V(BK5)，耙區(qū)域V(BK5)、耙區(qū)域II (BK2)禾口靶區(qū)域III(BK3)，耙區(qū)域III(BK3)、耙區(qū)域IV(BK4)和靶區(qū)域V(BK5)，或者靶區(qū)域I(BK1)、耙區(qū)域III (BK3)和耙區(qū)域V(BK5)等。可以理解，檢測(cè)靶區(qū)域I-V的所有組合為本方法所預(yù)期。下面更加詳細(xì)地討論示例性的引物和探針。引物和探針如上述，耙核酸序列區(qū)域I-V是不同的BKV基因型中的保守核酸區(qū)域。用于這些檢測(cè)的引物和探針優(yōu)選地來(lái)自如上述的靶核酸序列區(qū)域I-V。在一個(gè)尤其值得注意的實(shí)施方式中，本檢測(cè)使用的引物和探針從靶核酸序列區(qū)域I-V的高度保守的核苷酸序列設(shè)計(jì)。 —般地，引物提供用于擴(kuò)增靶核酸以產(chǎn)生靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物(也稱為"擴(kuò)增子")。引物可以，并且優(yōu)選地與探針結(jié)合使用。5'引物一般結(jié)合到一個(gè)區(qū)域以提供用于耙核酸的擴(kuò)增，并且優(yōu)選地結(jié)合到靶序列的5'部分，如圖1所示。3'引物一般結(jié)合到與從5'引物延伸產(chǎn)生的核酸的3'部分互補(bǔ)的序列，如圖1所示。5'和3'引物可以被大約IO、 20、 30或者40個(gè)相鄰的核苷酸、通常是大約30個(gè)相鄰的核苷酸分開。在某些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)引物以便具有與靶區(qū)域序列中的一個(gè)或多個(gè)變異核苷酸互補(bǔ)的序列，和/或具有與靶區(qū)域序列的變異核苷酸相鄰的3端。 一般地，設(shè)計(jì)探針以便具有與靶區(qū)域序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)變異核苷酸互補(bǔ)的序列。在一些涉及基于擴(kuò)增的檢測(cè)的實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)探針以便具有與下述序列互補(bǔ)的序列所述序列的側(cè)翼是與用于擴(kuò)增的一條或者多條引物互補(bǔ)的序列。
本文檢測(cè)中應(yīng)用的引物和探針是基于本文公開的序列設(shè)計(jì)的，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)容易合成，例如通過(guò)亞磷酰胺化學(xué)的固相合成，如通過(guò)引用包含在本文中的美國(guó)專禾U 4,458,066和4,415,732號(hào)；Beaucage等(1992) Tetrahedron48:2223-2311;禾卩Applied Biosystems User Bulletin No. 13 (1 Apr. 1987)中公開。其 它的化學(xué)合成方法包括，例如，Narang等，Meth. Enzymol. (1979) 68:90中所述的 磷酸三酯法和Brown等，Meth. Enzymol. (1979) 68:109中所述的磷酸二酯法。聚 腺苷酸(Poly(A))或者聚胞苷酸(poly(C))或者其它非互補(bǔ)核苷酸延伸物(extensions) 可以用這些相同方法包含到探針中。六氧化乙烯(Hexaethylene oxide)延伸物可以通 過(guò)本領(lǐng)域己知的方法被偶聯(lián)到探針上。Cload等(1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6324-6326;Levenson等的美國(guó)專利4,914,210號(hào)；Durand等(1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359;和Horn等(1986) Tet. Lett. 27:4705-4708。
典型地，引物序列的長(zhǎng)度范圍是10-75個(gè)核苷酸之間，如10至70、 12至 65、 15至60、 20至55、 25至50、 30至45等。更典型地，引物的長(zhǎng)度范圍是18 至40、 19至35、 20至30、 21至29、 22至28、 23至27、 24-25個(gè)核苷酸之間， 和所述范圍之間的任何長(zhǎng)度。尤其值得注意的是長(zhǎng)度大約20至22個(gè)核苷酸的引 物。典型的探針的長(zhǎng)度范圍是10-50個(gè)核苷酸之間，如10至50、 12至45、 15 至40、 20至35、 25至30等。更典型地，探針的長(zhǎng)度范圍是18至40、 19至35、 20至30、 21至29、 22至28、 23至27、 24-25個(gè)核苷酸之間，和所述范圍之間的 任何長(zhǎng)度。尤其值得注意的是長(zhǎng)度大約20至22個(gè)核苷酸的探針。
在一些實(shí)施方式中，本方法提供用于檢測(cè)樣品如生物樣品中的任何BKV 基因型。在這樣的實(shí)施方式中，本方法通過(guò)用與靶區(qū)域內(nèi)的序列對(duì)應(yīng)的引物和探 針檢測(cè)靶核酸區(qū)域或者其片段。靶區(qū)域I-V內(nèi)的適用于本發(fā)明方法的示例性引物用 黑體在圖1中指出。適用于本發(fā)明的探針可以從位于用兩條選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò)增 產(chǎn)物序列內(nèi)的任何序列設(shè)計(jì)。選擇適用于這樣的實(shí)施方式的探針，使其對(duì)應(yīng)于待 檢測(cè)的不同BKV基因型之間的共享核苷酸序列的區(qū)域。在其它實(shí)施方式中，本方法提供用于檢測(cè)和區(qū)分樣品如生物樣品中的不同 基因型。在這樣的實(shí)施方式中，本方法通過(guò)應(yīng)用與靶區(qū)域內(nèi)的序列對(duì)應(yīng)的引物和 探針檢測(cè)耙核酸區(qū)域或者其片段。靶區(qū)域I-V內(nèi)的適用于本發(fā)明方法的示例性引物 用黑體在圖1中指出。適用于本發(fā)明的探針可以從位于用兩條選擇引物產(chǎn)生的擴(kuò) 增產(chǎn)物序列內(nèi)的任何序列設(shè)計(jì)。在這樣的實(shí)施方式中，選擇探針序列，以便使其 對(duì)應(yīng)于待檢測(cè)的不同BKV基因型之間的一個(gè)或者多個(gè)核苷酸序列不同的區(qū)域。
適合用作本發(fā)明檢測(cè)中的引物和探針的BKV基因型的示例性核酸序列在 表1中描述。表1中示出的序列編號(hào)是圖1中GenBank登錄號(hào)AY628224的編號(hào)。
表l:用于檢測(cè)BKV核酸的靶區(qū)域I-V的示例性引物和探針序列(序列基于BKV 基因組序列提供；序列編號(hào)基于圖1中的GenBaiik登錄號(hào)AY628224的編號(hào))SEQIDNO.: 起點(diǎn)終點(diǎn)長(zhǎng)度序列5'到3'
靶區(qū)域I (BK1)(對(duì)應(yīng)于AY628224的核苷酸435-585)
SEQIDNO:06 F 43546026 AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTT SEQIDNO:07 R 52755226 AAGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAA SEQIDNO:08 P 4卯52434 TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGG
AAAAA
靶區(qū)域II (BK2)(對(duì)應(yīng)于AY628224的核苷酸1418-1545) SEQIDNO:09F 1450 1467 18 TTGCCCCAGGAGGTGCTA SEQIDNO:IO R 1498 1520 23 TTTACTTCTAGGCCTGTACGGGA SEQIDNO:llP1469 1497 29 TCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGC
靶區(qū)域III (BK3)(對(duì)應(yīng)于AY628224的核苷酸4097-4560)
SEQIDNO:12F 4375 4404 27 GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTT SEQIDNO:13R 4452 4478 26 TCATCACTGGCAAACATATCTTCATG SEQIDNO:14 P 4426 4450 25 GTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCT
靶區(qū)域IV (BK4)(對(duì)應(yīng)于AY628224的核苷酸612-864) SEQIDNO:15F 612620 19 ATGGGTGCTGCTCTAGCAC SEQEDNO:16 R 67769620 GTGGCTGAAATTGCTGCTGG SEQIDNO:17 P 64666327 TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC
靶區(qū)域V (BK5)(對(duì)應(yīng)于AY628224的核苷酸2810-2895) SEQIDNO:18F 2811 2827 17 GGGCTGAAGTATCTGAG SEQIDNO:19 R 2856 2873 18 CAGTGCTTGATCCATGTC SEQIDNO:20 P 2828 2950 23 CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG ~""F"指正向引物，"R"指反向引物，"P"指探針。探針可以被偶聯(lián)到標(biāo)記上用于檢測(cè)。已知有幾種方法和組合物用于用允許 加入標(biāo)記的活性官能團(tuán)衍生寡核苷酸。例如，有幾種方法可用于生物素化探針， 以便使放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶標(biāo)記、或者電子致密標(biāo)記能夠 通過(guò)親和素被連接。例如，見Broken等，Nucl. Acids Res. (1978) 5:363-384，其公 開了鐵蛋白-親和素-生物素標(biāo)記的使用；和Chollet等，Nucl. Acids Res. (1985) 13: 1529-1541，其公開了寡核苷酸5'端經(jīng)氨垸基磷酰胺連接臂的生物素化。也有幾種 可用于合成氨基衍生的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸容易通過(guò)熒光或者其它類 型的由氨基活性基團(tuán)衍生的化合物標(biāo)記，如異硫氰酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺或類 似物，例如，見Connolly (1987) Nucl. Acids Res. 15:3131-3139, Gibson等，(1987) Nucl. Acids Res. 15:6455-6467和Miyoshi等，美國(guó)專利4,605,735號(hào)。也可以利用合成巰基衍生的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸能夠與硫羥-特異性標(biāo)記反應(yīng)，例 如，參見Fung等，美國(guó)專利4,757,141號(hào)，Connolly等，(1985) Nuc. Acids Res. 13:4485-4502和Spoat等，(1987) Nucl. Acids Res. 15:4837-4848。在Matthews等， Anal. Biochem. (1988) 169:1-25中提供了用于標(biāo)記DNA片段的方法的綜述。
例如，通過(guò)將熒光分子連接到探針的非連接端，可以對(duì)探針進(jìn)行熒光標(biāo)記。 用于選擇合適的熒光標(biāo)記的指南可以在Smith等，Meth. Enzymol. (1987) 155:260-301; Karger等,Nucl. Acids Res. (1991) 19:4955-4962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.)中找到。優(yōu)選的熒光標(biāo)記包括如在美國(guó)專利4,318,846號(hào)和Lee等, Cytometry (1989) 10:151-164中公開的熒光素及其衍生物，禾卩6-FAM、 JOE、 TAMRA、 ROX、 HEX-I、 HEX-2、 ZOE、 TET-1或NAN-2等。
另外，探針可以用吖啶酯(Acridinium Ester, AE)標(biāo)記。目前的技術(shù)允許AE 標(biāo)記位于探針內(nèi)的任何位置。例如，參見Nelson等(1995)在Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, Calif.中的 "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence"; Nelson等(1994)在The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al, (eds.) Birkhauser, Boston, Mass.中的 "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR"; Weeks等，Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry等，Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090。 AE分子可 以用基于非核苷酸的連接臂化學(xué)被直接連接到探針上，其允許將標(biāo)記放在探針內(nèi) 的任何位置，例如，參見，美國(guó)專利5,585,481和5,185,439號(hào)。
如果在檢測(cè)中使用固相支持物(例如，利用探針捕獲靶核酸的擴(kuò)增子)，則 寡核苷酸探針可以用不同的方式被連接到固相支持物上。例如，通過(guò)將探針的3' 或者5'端核苷酸連接到固相支持物，可以將探針連接到固相支持物上。更優(yōu)選地， 探針通過(guò)起到將探針與固相支持物隔開作用的接頭被連接到固相支持物上。接頭 通常為至少15-30個(gè)原子的長(zhǎng)度，更優(yōu)選地，至少15-50個(gè)原子的長(zhǎng)度。接頭的期 望長(zhǎng)度將取決于所應(yīng)用的具體固相支持物。例如，當(dāng)應(yīng)用高度交聯(lián)的聚苯乙烯作 為固相支持物時(shí)，6個(gè)原子的接頭通常是足夠的。本領(lǐng)域已知眾多的接頭，它們可以用于將寡核苷酸探針連接到固相支持 物。接頭可以由不顯著干擾靶序列與連接到固相支持物上的探針雜交的任何化合 物形成。接頭可以由能夠通過(guò)自動(dòng)合成容易地加到接頭上的同聚寡核苷酸形成。 可選地，聚合物如官能化聚乙二醇可以被用作接頭。這樣的聚合物比同聚寡核苷 酸優(yōu)選，因?yàn)樗鼈儾幻黠@地干擾探針與靶寡核苷酸的雜交。聚乙二醇特別優(yōu)選。
在堿性條件和高溫下，在去除堿基保護(hù)基期間，固相支持物、接頭和探針 之間的連接通常不被切割。優(yōu)選的連接的例子包括氨基甲酸酯和酰胺鍵。
用于固定寡核苷酸探針的優(yōu)選類型的固相支持物的例子包括可控孔度玻 璃、玻璃板、聚苯乙烯、親和素包被的聚苯乙烯珠子、纖維素、尼龍、丙烯酰胺凝膠和活化葡聚糖。在某些實(shí)施方式中，加入內(nèi)參照(internal control, IC)或者內(nèi)標(biāo)(internal standard)作為對(duì)照，以便說(shuō)明任何陰性結(jié)果不是因?yàn)闄z測(cè)失敗所引起。IC的使用 使得能夠控制分離過(guò)程、擴(kuò)增過(guò)程和檢測(cè)系統(tǒng)，并且使得能夠監(jiān)控檢測(cè)行為和對(duì) 樣品(一個(gè)或多個(gè))進(jìn)行定量。IC可以在任何合適的點(diǎn)被包含，例如，在裂解緩沖液 中。在一個(gè)實(shí)施方式中，IC包括噬菌體核酸。當(dāng)在檢測(cè)中使用固相支持物時(shí)，固 相支持物可以另外包括特異于內(nèi)標(biāo)的探針(IC探針)，從而在使用IC探針時(shí)協(xié)助捕 獲。IC探針可以任選地與不同于靶序列的可檢測(cè)標(biāo)記的可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)。在可檢 測(cè)的標(biāo)記是熒光團(tuán)的實(shí)施方式中，IC可以通過(guò)分光光度法和通過(guò)探測(cè)限研究(limit of detection studies)定量。 檢測(cè)樣品中的BKV在一個(gè)方面，檢測(cè)測(cè)定樣品中BKV的存在。在這樣一個(gè)方面，檢測(cè)是利 用簡(jiǎn)并引物和探針的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中引物和探針被設(shè)計(jì)以便提供用于擴(kuò)增 BKV基因組的靶核酸序列區(qū)域。如上述，檢測(cè)測(cè)定一個(gè)或者多個(gè)靶核酸區(qū)域(例如，靶區(qū)域I-V)或者其部 分的存在。靶核酸序列區(qū)域I-V是在不同的BKV基因型中的保守核酸區(qū)域。這些 檢測(cè)中使用的引物和探針優(yōu)選地來(lái)自上述靶核酸序列區(qū)域I-V。本檢測(cè)中使用的特 別優(yōu)選的引物和探針設(shè)計(jì)自耙核酸序列區(qū)域I-V的高度保守的核苷酸序列。
如上所述，在一個(gè)實(shí)施方式中，引物和/或探針被設(shè)計(jì)進(jìn)行基于核酸的檢 領(lǐng)'J，特別是擴(kuò)增方法，測(cè)定具有上述靶核酸序列例如靶核酸序列區(qū)域I-V的靶核酸。 即，在這樣的實(shí)施方式中，引物被設(shè)計(jì)以便擴(kuò)增具有上述核酸序列的核酸序列的 耙序列，例如靶核酸序列區(qū)域I-V。在另一個(gè)實(shí)施方式中，引物和/或探針被設(shè)計(jì)進(jìn)行基于核酸的檢測(cè)，特別 是擴(kuò)增方法，測(cè)定具有為上述靶核酸序列例如靶核酸序列區(qū)域I-V的片段的核酸序 列的耙核酸。即，在這樣的實(shí)施方式中，引物被設(shè)計(jì)以便擴(kuò)增具有比上述完整核 酸序列例如靶核酸序列區(qū)域I-V小的部分的核酸序列的靶序列。
樣品中BKV核酸的具體檢測(cè)一般通過(guò)檢測(cè)靶序列區(qū)域I-V中的一個(gè)或者 多個(gè)、或者其片段來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)用根據(jù)靶序列區(qū)域V的序列 設(shè)計(jì)的引物和探針檢測(cè)BKV靶核酸。在特別值得注意的實(shí)施方式中，用具有序列ATGGGTGCTGCTCTAGCAC (5'引物)(SEQ IDNO: 15)、 GTGGCTGAAATTGCTGCTGG (3'引物)(SEQIDNO: 16)的引物檢測(cè)靶序列，具有序列TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC (SEQ IDNO:n)的探針特別值得注意。在另一個(gè)特別值得注意的實(shí)施方式中，用具有序列 GGGCTGAAGTATCTGAG (5'引物)(SEQ ID NO: 18)、 CAGTGCTTGATCCATGTC (3'引物)(SEQ ID NO: 19)的引物檢測(cè)靶序列，具有序列CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG (SEQ ID NO:20)的探針特別值得注意。
特別值得注意的是在實(shí)時(shí)RT-PCR方法中使用這些引物和探針和使用雙標(biāo) 記的TaqMan探針檢測(cè)樣品中的BKV。 檢測(cè)方法本發(fā)明提供基于DNA的檢測(cè)，用于測(cè)定樣品中的BKV。檢測(cè)可以用各種 方法進(jìn)行，包括直接測(cè)序、用序列特異性寡聚體雜交、凝膠電泳和質(zhì)譜。這些方 法可以使用不同類或者同類的方式，同位素或者非同位素標(biāo)記，以及根本無(wú)標(biāo)記。
優(yōu)選地，所述方法涉及擴(kuò)增來(lái)自樣品的核酸。如果獲得診斷核酸，就表明 樣品中存在BKV。 一般地，所述方法涉及用檢測(cè)引物和至少一條其它引物擴(kuò)增來(lái) 自樣品的核酸，如上述，和評(píng)價(jià)擴(kuò)增的核酸。盡管檢測(cè)可受線性范圍檢測(cè)的限制， 但所述方法高度靈敏，并可以檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)少至5個(gè)拷貝的BKV，其相當(dāng)于每mL 樣品中200個(gè)拷貝的DNA。因此，本發(fā)明一般性地提供用于檢測(cè)樣品中的BKV， 其中存在的BKV為每mL樣品中至少200個(gè)拷貝的DNA。如本領(lǐng)域所知，可以通過(guò)許多方法評(píng)價(jià)擴(kuò)增的核酸，包括例如，確定核酸 的存在或者不存在，確定核酸的大小或者確定核酸相對(duì)于另一擴(kuò)增的核酸的豐度。 在大多數(shù)實(shí)施方式中，用凝膠電泳、核酸雜交、測(cè)序和/或檢測(cè)結(jié)合到擴(kuò)增核酸的 標(biāo)記的信號(hào)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的核酸。擴(kuò)增核酸的方法(例如，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng))、進(jìn)行引 物延伸的方法、和評(píng)價(jià)核酸的方法一般為本領(lǐng)域公知(例如，見Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed" Wiley & Sons, 1995禾口 Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (2001) Cold Spring Harbor, N. Y.)，不需要任何更詳細(xì)的描述。例如，上述引物和探針可以用在基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的技術(shù)中，以檢 測(cè)生物樣品中的BKV。 PCR是用于擴(kuò)增包含在核酸分子或者分子混合物中的期望 靶核酸序列的技術(shù)。在PCR中，使用過(guò)量的引物對(duì)與靶核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。 引物利用靶核酸作為模板通過(guò)聚合酶被各自延伸。延伸產(chǎn)物從原始靶鏈上解離后 本身成為靶序列。隨后新的引物被雜交并通過(guò)聚合酶延伸，該循環(huán)被重復(fù)以便幾 何學(xué)地增加耙序列分子的數(shù)目。用于擴(kuò)增樣品中靶核酸序列的PCR方法為本領(lǐng)域 公知，并已經(jīng)在如I皿is等人(eds.) PCR Protocols (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) Polymerase chain reaction: basic principles and automation, PCR， A Practical Approach, McPherson等人(eds.) IRL Press, Oxford; Saiki等人(1986) Nature 324:163; 以及在美國(guó)專利4,683,195, 4,683,202和4,889,818號(hào)中被描述，所有這些文獻(xiàn)通過(guò) 引用其全部被包含在本文中。特別地，PCR使用位于待擴(kuò)增的靶核苷酸序列兩側(cè)的相對(duì)短的寡核苷酸引 物，其方向是它們的3'端互相面對(duì)，每條引物朝著另一引物延伸。提取多核苷 酸樣品和優(yōu)選地通過(guò)熱變性，并與存在的摩爾數(shù)過(guò)量的第一和第二引物雜交。在 存在四種脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs-dATP、 dGTP、 dCTP禾Q dTTP)時(shí)，用引物和模板依賴性多核苷酸聚合劑催化聚合，所述聚合劑如任何能夠產(chǎn)生引物延伸產(chǎn) 物的酶，例如，大腸桿菌(E. coli)DNA聚合酶I、 DNA聚合酶I的Klenow片段、 T4 DNA聚合酶、從水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)分離的熱穩(wěn)定性DNA聚合 酶，它們從各種來(lái)源獲得(例如Perkin Elmer)，嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(United States Biochemicals)、 嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stereothermophilus)(Bio-Rad)或者海濱熱球菌(Thermococcus litoralis)("Vent"聚合酶， New England Biolabs)。這得到兩個(gè)"長(zhǎng)的產(chǎn)物"，它們?cè)谄?'端含有各自的引物， 共價(jià)連接到新合成的原始鏈的互補(bǔ)鏈上。隨后將反應(yīng)混合物例如通過(guò)降低溫度、失活變性劑或者加入更多的聚合酶 返回聚合條件，起始第二循環(huán)。第二循環(huán)提供兩條原始鏈，來(lái)自第一循環(huán)的兩條 長(zhǎng)產(chǎn)物，從原始鏈復(fù)制的兩條新的長(zhǎng)產(chǎn)物、和從長(zhǎng)產(chǎn)物復(fù)制的兩條"短產(chǎn)物"。短 產(chǎn)物具有靶序列的序列，每端含有引物。在每個(gè)附加循環(huán)中，產(chǎn)生附加的兩個(gè)長(zhǎng) 產(chǎn)物，和與前一循環(huán)結(jié)束時(shí)保留的長(zhǎng)產(chǎn)物和短產(chǎn)物的數(shù)目相等的許多短產(chǎn)物。因 此，含有耙序列的短產(chǎn)物數(shù)隨著每一循環(huán)呈指數(shù)增長(zhǎng)。優(yōu)選地，PCR應(yīng)用商業(yè)可 得的熱循環(huán)儀如Perkin Elmer進(jìn)行。被稱為TAQMANTM分析(Perkin-Elmer)的熒光5'核酸酶分析(fluorogenic 5， nuclease assay),是強(qiáng)大的和多用途的基于PCR的核酸靶檢測(cè)系統(tǒng)。關(guān)于 TAQMANtm分析、其中使用的試劑和條件的具體描述，參見，如Holland等人， Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276-7280;美國(guó)專利5,538,848、 5,723,591 和5,876,930號(hào)，所有文獻(xiàn)通過(guò)引用其全部被包含于本文中。因此，來(lái)自本文所述 BKV基因組區(qū)域的引物和探針可以用于TAQMANtm分析，以檢測(cè)生物樣品中感 染的存在。結(jié)合熱循環(huán)通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的產(chǎn)生進(jìn)行分析。所述分析系統(tǒng)不需要 凝膠電泳分析，并且具有產(chǎn)生允許測(cè)定靶拷貝數(shù)的定量數(shù)據(jù)的能力。
應(yīng)用例如AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶可以方便地進(jìn)行熒光5'核酸酶 分析，所述聚合酶具有5'核酸內(nèi)切酶(endogenous 5' nuclease)活性以消化用熒光報(bào) 告染料和猝滅劑二者標(biāo)記的內(nèi)部寡核苷酸探針(見，Holland等人，Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1991) 88:7276-7280，禾卩Lee等人，Nucl. Acids Res. (1993) 21:3761-3766)。通過(guò)測(cè)量擴(kuò)增循環(huán)中發(fā)生的熒光改變檢測(cè)分析結(jié)果，所述改變是 由于熒光探針被消化、染料和猝滅劑標(biāo)記解偶聯(lián)和引起熒光信號(hào)增加，所述增加 與耙核酸的擴(kuò)增成正比。擴(kuò)增產(chǎn)物可以在溶液中被檢測(cè)或者用固相支持物檢測(cè)。在該方法中，設(shè)計(jì) taqmantm探針使其與期望PCR產(chǎn)物內(nèi)的靶序列雜交。TAQMANtm探針的5'端 含有熒光報(bào)告染料。探針的3'端被封閉以阻止探針的延伸，并且含有會(huì)猝滅5'熒光 團(tuán)的熒光的染料。在隨后的擴(kuò)增中，如果反應(yīng)中存在具有5'外切核酸酶活性的聚合 酶，5'熒光標(biāo)記就被切割掉。5'熒光團(tuán)的切除導(dǎo)致熒光增加，其能夠被檢測(cè)。
特別地，構(gòu)建寡核苷酸探針，這樣，當(dāng)探針未雜交時(shí)，其以至少一種單鏈構(gòu)象存在，其中猝滅劑分子距報(bào)告分子足夠近以猝滅報(bào)告分子的熒光。當(dāng)寡核苷 酸探針雜交到靶多核苷酸時(shí)，其也可以以至少一種構(gòu)象存在，這樣猝滅劑分子不 位于與報(bào)告分子足夠近以猝滅報(bào)告分子的熒光的位置。通過(guò)采用這些雜交和未雜 交構(gòu)象，當(dāng)探針雜交和未雜交時(shí)，探針上的報(bào)告分子和猝滅劑分子顯示不同的熒 光信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果，基于報(bào)告分子、猝滅劑分子或者其結(jié)合的熒光強(qiáng)度的改變， 可以確定探針是否雜交或者未雜交。另外，因?yàn)樘结樐軌虮辉O(shè)計(jì)為當(dāng)探針未雜交 時(shí)猝滅劑分子猝滅報(bào)告分子，所以探針能夠被設(shè)計(jì)為使報(bào)告分子顯示有限的熒光 一除非探針被雜交或者消化。因此，本發(fā)明涉及應(yīng)用具有5'到3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能夠雜交到 耙BKV序列或者其延伸產(chǎn)物的一種或者多種引物、和能夠雜交到相對(duì)于引物3' 端的耙BKV序列的寡核苷酸探針擴(kuò)增靶BKV核苷酸序列的方法。在擴(kuò)增過(guò)程中， 當(dāng)寡核苷酸探針雜交到靶序列上時(shí)，聚合酶消化寡核苷酸探針，從而將報(bào)告分子 與猝滅劑分子分開。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)報(bào)告分子的熒光，熒光相應(yīng)于核酸擴(kuò) 增的發(fā)生。報(bào)告分子優(yōu)選為熒光染料，猝滅劑分子優(yōu)選為羅丹明染料。
另一個(gè)檢測(cè)方法涉及利用靶序列特異性寡核苷酸探針，其含有與上述靶序 列互補(bǔ)的區(qū)域。所述探針可以用于雜交保護(hù)實(shí)驗(yàn)(hybridization protection assays, HPA)。在該實(shí)施方式中，探針被方便地標(biāo)記有高度化學(xué)發(fā)光分子吖啶酯(AE)。例 如見Nelson等(1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence", Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego， Calif.; Nelson等(1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR", The Polymerase Chain Reaction, Mullis等人(eds.) Birkhauser, Boston, Mass.; Weeks等，Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry等,Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090。用基于非核苷酸的連接臂化學(xué)將一個(gè)AE分子直接連接到探針上， 所述連接臂化學(xué)允許將標(biāo)記放在探針內(nèi)的任何位置。例如，見美國(guó)專利5,585,481 和5,185,439號(hào)?；瘜W(xué)發(fā)光通過(guò)與堿性過(guò)氧化氫的反應(yīng)觸發(fā)，該反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的 N-甲基吖啶酮，其隨后衰落到基態(tài)發(fā)出光子。另外，AE引起酯水解，這產(chǎn)生了非 化學(xué)發(fā)光-甲基吖啶羧酸。當(dāng)AE分子被共價(jià)連接到核酸探針上時(shí)，在弱堿性條件下水解是快速的。 當(dāng)AE標(biāo)記的探針精確地與靶核酸互補(bǔ)時(shí)，AE水解的速度被大大降低。因此，雜 交和未雜交的AE標(biāo)記的探針可以直接在溶液中檢測(cè)，不需要物理分離。
HPA—般由以下步驟組成(a)在溶液中將AE標(biāo)記的探針與靶核酸雜交 大約15到大約30分鐘。接著加入弱堿性溶液，水解偶聯(lián)到未雜交的探針上的AE。 這個(gè)反應(yīng)大約需要5到10分鐘。檢測(cè)剩余的雜合體結(jié)合的AE作為存在的靶量的 度量。該步驟大約需要2到5秒。優(yōu)選地，在與雜交步驟相同的溫度下， 一般是 50到70攝氏度下，進(jìn)行差示水解(differential hydrolysis)步驟?？蛇x地，可以在室 溫下進(jìn)行第二差示水解步驟。這允許使用例如范圍在10-11的增加的pH值，這在雜交和未雜交的AE標(biāo)記的探針之間產(chǎn)生了更大的水解速率差異。HPA在例如美 國(guó)專利6,004,745、 5,948,899和5,283,174號(hào)中被詳細(xì)描述，其公開內(nèi)容通過(guò)引用 其全部被包含在本文中。本發(fā)明的寡核苷酸分子也可以用在基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)中。該方 法是啟動(dòng)子指導(dǎo)的酶法，其誘導(dǎo)特定核酸的體外連續(xù)、均一和等溫地?cái)U(kuò)增，以提 供核酸的RNA拷貝。進(jìn)行NASBA的試劑包括具有含啟動(dòng)子的5'尾的第一 DNA 引物、第二DNA引物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNAse-H、T7RNA聚合酶、NTP(多種)和dNTP(多 種)。利用NASBA從單鏈RNA或者DNA，或者雙鏈DNA產(chǎn)生大量的單鏈RNA。 當(dāng)RNA待被擴(kuò)增時(shí)，ssRNA充當(dāng)模板，通過(guò)延伸含有RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)的第 一引物，合成第一條DNA鏈。該DNA鏈又充當(dāng)模板，通過(guò)延伸第二引物合成第 二條互補(bǔ)的DNA鏈，產(chǎn)生了雙鏈活性RNA聚合酶啟動(dòng)子位點(diǎn)，并且第二條DNA 鏈作為模板，在RNA聚合酶的幫助下，用于合成大量的第一模板ssRNA。NASBA 技術(shù)為本領(lǐng)域已知，并在如歐洲專利329,822號(hào)、國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 91/02814 和美國(guó)專利6,063,603、 5,554,517和5,409,818號(hào)中描述，所有文獻(xiàn)整體并入本文。
本文所述的BKV序列也用于使用分支DNA分子的核酸雜交和擴(kuò)增技術(shù) 中。在基本的核酸雜交試驗(yàn)中，單鏈分析物核酸被雜交到標(biāo)記的單鏈核酸探針， 并檢測(cè)產(chǎn)生的標(biāo)記雙鏈體。已經(jīng)開發(fā)出該基本方法的變化方法，以便將待檢測(cè)的 雙鏈體從異物中分離和/或擴(kuò)增被檢測(cè)的信號(hào)。 一種用于擴(kuò)增信號(hào)的方法應(yīng)用為多 核苷酸的擴(kuò)增多聚體，其帶有特異性雜交于分析物核酸或與分析物結(jié)合的核酸鏈 的第一片段和特異性雜交于標(biāo)記探針的重復(fù)的第二片段。所述擴(kuò)增在理論上與第 二片段的重復(fù)數(shù)目成正比。所述多聚體可以是線性的或者分支的。在這些技術(shù)中 使用兩種一般類型的分支多聚體叉狀和梳狀。制備和使用分支核酸分子的方法 為本領(lǐng)域已知，并在如美國(guó)專利5,849,481號(hào)中描述，其通過(guò)引用其全部被包含在 本文中。顯而易見的是，對(duì)本文所述的試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以進(jìn)行很多改變，并且許多形式 是本領(lǐng)域已知的。上述描述僅僅作為指南提供，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用本領(lǐng)域公 知的技術(shù)容易地修改上述方案。 試劑盒與本發(fā)明結(jié)合使用的試劑盒也被提供。試劑盒中可以提供上述檢測(cè)試劑， 包括引物、探針、帶有結(jié)合探針的固相支持物、以及其它檢測(cè)試劑，和適當(dāng)?shù)恼f(shuō) 明書和其它需要的試劑，以便進(jìn)行如上述的檢測(cè)。通常，試劑盒在單獨(dú)的容器中 包含引物和探針的結(jié)合(或是已經(jīng)結(jié)合到固相支持物；或是單獨(dú)地，帶有將它們 結(jié)合到基質(zhì)的試劑)、對(duì)照配制物(陽(yáng)性和減陰性)、標(biāo)記試劑一當(dāng)檢測(cè)形式需要時(shí)、 和信號(hào)產(chǎn)生試劑(例如酶底物)一如果標(biāo)記不直接產(chǎn)生信號(hào)。進(jìn)行檢測(cè)的說(shuō)明書(例 如，書寫的、磁帶、VCR、 CD-ROM等)通常包含在試劑盒中。根據(jù)所應(yīng)用的具體 檢測(cè)，所述試劑盒也可以包含其它的包裝試劑和材料(即，洗脫緩沖液等)。用這些試劑盒可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)，如上述檢測(cè)。說(shuō)明書一般記錄在合適的記錄介質(zhì)上。例如，說(shuō)明書可以被印刷在基底如 紙或者塑料等上。同樣地，說(shuō)明書可以作為包裝插頁(yè)(packageinsert)存在于試劑盒 中、在試劑盒或其組分的容器的標(biāo)簽(例如，與包裝或者分包裝相連)中等。在其它 的實(shí)施方式中，說(shuō)明書作為合適的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)上的電子存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件存 在，所述介質(zhì)例如CD-ROM、磁盤等，包括其上存在程序的相同介質(zhì)。
在另外的實(shí)施方式中，試劑盒中不存在說(shuō)明書本身，但提供了從遠(yuǎn)的來(lái)源 例如經(jīng)因特網(wǎng)獲得說(shuō)明書的手段。該實(shí)施方式的一個(gè)例子是包括網(wǎng)址的試劑盒， 其中說(shuō)明書可從所述網(wǎng)址閱讀或者說(shuō)明書可從所述網(wǎng)址下載。
更進(jìn)一步地，試劑盒可以是其中說(shuō)明書得自或下載自遙遠(yuǎn)來(lái)源如因特網(wǎng)或 萬(wàn)維網(wǎng)的試劑盒?？梢詰?yīng)用一些形式的訪問(wèn)安全或者識(shí)別協(xié)議以限制那些有權(quán)使 用本發(fā)明的人的訪問(wèn)。根據(jù)本教導(dǎo)，獲得說(shuō)明書和/或程序設(shè)計(jì)的方法一般記錄在 合適的記錄介質(zhì)上。 —般，本發(fā)明的試劑盒包括至少一種引物、通常至少兩種引物(5'引物和3' 引物)，通常是至少兩種引物和探針，如上述。試劑盒也可以含有說(shuō)明書，用于使 用試劑盒，用上述方法、包括上述的PCR方法檢測(cè)樣品中BKV。本試劑盒中也可 以包括緩沖液、dNTPs和對(duì)照(例如，陽(yáng)性和陰性對(duì)照核酸)，用于實(shí)施本方法。本 試劑中的引物可以被可檢測(cè)地標(biāo)記或者不標(biāo)記。
實(shí)施例提出以下實(shí)施例，以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何進(jìn)行和應(yīng)用本發(fā)明 的完全公開和描述，其意圖不是限制發(fā)明者認(rèn)為是其發(fā)明的范圍，也不是表明下 面的實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)或者僅僅進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)做出努力確保關(guān)于所用數(shù) 字的準(zhǔn)確性(例如，量、溫度等)，但是應(yīng)該存在一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外說(shuō) 明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或者 接近大氣壓。 材料和方法在以下實(shí)施例中使用下面的方法和材料。樣品類型和處理。用于檢測(cè)本發(fā)明所述的BKV的樣品可以是任何合適的 生物樣品，如血清、血漿、羊水和組織樣品。組織樣品應(yīng)該在-20士l(TC下冷凍貯 藏在鹽水或者磷酸緩沖鹽水中(PBS)中。血清、血漿和羊水應(yīng)該在-20ilO'C下冷凍 貯藏。所有上述樣品類型可以根據(jù)需要經(jīng)隔夜快運(yùn)在干冰上運(yùn)輸。
引物和探針。利用標(biāo)準(zhǔn)的程序(Primer Express, Applied Biosystems)，通過(guò) 計(jì)算機(jī)分析，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物和探針并分析它們對(duì)于PCR和雜交的適用性。寡 核苷酸引物和熒光探針由合格的供應(yīng)商合成。對(duì)寡核苷酸引物脫鹽和凍干。用于 檢測(cè)BKV的寡核苷酸引物對(duì)組如下SEQ ID NO.: 序列5'到3'
靶區(qū)域I (BK1)
SEQ ID NO: 06 f~~AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTT
SEQ ID NO: 07 R AAGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAA
SEQ ID NO: 08 P TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAA
耙區(qū)域II (BK2)
SEQ ID NO: 09 F~TTGCCCCAGGAGGTGCTA
SEQ ID NO: 10 R TTTACTTCTAGGCCTGTACGGGA
SEQIDNO:ll P TCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGC
耙區(qū)域HI (BK3)
SEQ ID NO: 12 "~GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTT
SEQ ID NO: 13 R TCATCACTGGCAAACATATCTTCATG
SEQ ID NO: 14 P GTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCT
耙區(qū)域IV (BK4)
SEQ ID NO: 15 ^~~ATGGGTGCTGCTCTAGCAC
SEQ ID NO: 16 R GTGGCTGAAATTGCTGCTGG
SEQ ID NO: 17 P TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC
靶區(qū)域V (BK5)SEQ ID NO: 18 f~~GGGCTGAAGTATCTGAG SEQ ID NO: 19 R CAGTGCTTGATCCATGTC SEQ ID NO:20 P CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG "F，，指正向引物，"R"指反向引物，"P"指探針。探針以100pM的濃度冷凍， 探針的工作濃度是5pM，其用lOmMTris-HCl， pH 8.0以1:10稀釋，分裝成100 ^L的等份。探針可以被貯存在-20'C或者以下并避光。酶。使用以下酶2xTaqMan Universal PCR Master Mix ， Applied Biosystems Cat. #4304437或4318157，其包括Applied Biosystems的AmpliTaq Gold
DNA聚合酶。試劑和緩沖液。以下物質(zhì)在檢測(cè)中被使用QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGENCat. No.51106);設(shè)備。所應(yīng)用的設(shè)備包括ABI PRISM Sequence Detection System 7500。
擴(kuò)增。通過(guò)廣泛使用的上述PCR方法完成DNA擴(kuò)增(例如，見Persing等， 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Amplifications, American Society for Microbiology, Washing D.C.)。擴(kuò)增的DNA序列通過(guò)雜交和通過(guò)Taqman
方法切割雙標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，擴(kuò)增和檢測(cè)方案如下在含有各引物500 nM、 100 nM的雙標(biāo)記探針(Taqman探針)、各200 pM的四種dNTPs 的25 pi PCR反應(yīng)混合物中(PCR Master Mix, Applied Biosystems)，擴(kuò)增從臨床樣品 提取的DNA。在混合物中使用AmpliTaq Gold聚合酶，所述酶是熱激活(熱啟動(dòng)) 酶，以提高擴(kuò)增的特異性和靈敏度。通過(guò)用ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(ABI7500 Real Time PCR System)使PCR反應(yīng)物接受熱循環(huán)(95'C， 10 min，接著95。C30秒、60 'C 30秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán))。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增和檢測(cè)，并在PCR循環(huán)完成后用ABI序 列檢測(cè)軟件(vl.2.2)分析。特異性。在一組臨床BKV陽(yáng)性和陰性樣品上，對(duì)來(lái)自測(cè)序DNA和在 GenBank獲得的序列的寡核苷酸引物和探針的特異性進(jìn)行測(cè)定。也在JCV陽(yáng)性和 陰性樣品上以及許多對(duì)照上測(cè)定引物和探針。將結(jié)果與目前在臨床實(shí)驗(yàn)室中使用 的PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)一些擴(kuò)增核酸進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證檢測(cè)的特異性。擴(kuò)增 序列的測(cè)序證實(shí)，所有的PCR片段的確是BKV序列。這些序列片段都不與JCV 序列或者來(lái)自任何其它種類的序列相關(guān)。靈敏度。通過(guò)滴定已知濃度系列的BKVDNA和將濃度轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)曲線， 分析檢測(cè)的靈敏度。因?yàn)橛邪邢虿煌瑓^(qū)域的幾組引物/探針，靈敏度輕微變化?？?之，分析的靈敏度達(dá)到每個(gè)反應(yīng)管5個(gè)拷貝或更低?；跇悠分苽涑绦蚝腕w積調(diào) 整方案，對(duì)臨床樣品(例如，血清、尿或者其它形式的液體樣品)而言，本分析的靈 敏度等同于每ml大約200個(gè)拷貝。
實(shí)施例1
BKV全基因組的完整測(cè)序?yàn)榱死斫釨KV基因組多樣性和鑒定用于其診斷應(yīng)用的候選序列，對(duì)病毒 全基因組進(jìn)行測(cè)序。從13個(gè)BKV陽(yáng)性患者收集尿樣品。為了避免密切的臨床關(guān) 聯(lián)，這些患者從地理上多樣的來(lái)源選擇或隨機(jī)挑選。通過(guò)常規(guī)方法提取樣品獲得 病毒RNA。隨后通過(guò)長(zhǎng)PCR方案(Stratagene)擴(kuò)增提取的DNA以獲得其完整的 5.1kb基因組。用預(yù)先設(shè)計(jì)的一組測(cè)序引物通過(guò)四色雙脫氧終止法對(duì)擴(kuò)增的病毒 DNA測(cè)序，并在ABI377測(cè)序儀系統(tǒng)上分離。對(duì)每個(gè)BKV基因組，將序列片段通 過(guò)Lasergene 6軟件組裝成完整的5.1-5.2 kb重疊群，進(jìn)行分析。
將十三個(gè)組裝的BKV重疊群相互比對(duì)，也與所有公布的BKV序列比對(duì)。 從公共數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank、 EMBL和Swiss-Port)獲得公布的序列信息。比較32個(gè) BKV全基因組序列，包括13個(gè)新測(cè)序的BKV序列和19個(gè)公布的BKV序列 (GenBank登錄號(hào)AY628224、 AY628225、 AY628226、 AY628227、 AY628228、 AY628229、 AY628230、 AY628231、 AY628232、 AY628233、 AY628234、 AY628235、 AY628236、 AY628237、 AY628238、 M23122、 NC001538、 V01108和V01109)。
首先，相互比較來(lái)自BKV株的所有序列。隨后，將BKV序列與其它密切 相關(guān)的種類的基因組相比較。在被篩選的所有種類中，特別值得注意的是多瘤病毒家族的另一個(gè)成員，人多瘤病毒JC病毒(JCV)。 BKV基因組內(nèi)的全序列比對(duì)允許選擇幾個(gè)候選序列區(qū)域用于診斷檢測(cè)。這 些區(qū)域享有所有32個(gè)BKV基因組中的共有序列，并且它們的序列中有最小的變 異。這些區(qū)域外的序列或是不一致或是高度多態(tài)，這使得它們很難被用于診斷應(yīng) 用中的普遍檢測(cè)。對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有其它種的序列進(jìn)一步進(jìn)行比較性分析。 顯著地，JCV與BKV共享高度的同源性。盡管具有高度的同源性，但是BKV與 JVC的選擇區(qū)域的比較顯示出一些序列差異。這些序列差異盡管有限，但是對(duì)鑒 別檢測(cè)BKV和JCV是關(guān)鍵的。在來(lái)自全基因組的5100+個(gè)堿基對(duì)中，總共有142個(gè)以前未公布的核苷酸 變異被鑒定。在這些核苷酸變異中，105個(gè)是核苷酸取代(單個(gè)或者多個(gè)堿基對(duì))， 37個(gè)是缺失或者插入(多個(gè)堿基對(duì))。新鑒定的變異分布在整個(gè)BKV基因組上。通 過(guò)結(jié)合新鑒定的序列變異與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的變異，建立BKV遺傳多樣性精細(xì)圖譜。 如圖1所示，該圖譜說(shuō)明了高度多態(tài)的區(qū)域和相對(duì)保守的區(qū)域。對(duì)該精密圖譜的 分析允許選擇候選序列用于診斷應(yīng)用。
實(shí)施例2
靶區(qū)域BK1("BK1")的鑒定如圖l所示，對(duì)所有新完成的核酸序列和公布的核酸序列的序列比較允許 選擇一個(gè)以上的保守序列區(qū)，和會(huì)提供對(duì)生物樣品中BKV存在或者不存在的特異 的和靈敏的基于核酸的檢測(cè)。選擇由GenBank登錄號(hào)AY628224的核苷酸435到 585組成的BK1區(qū)域進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)。BK1靶序列的核酸序列是
(SEQ IDNO:Ol)。用于設(shè)計(jì)基于核酸的擴(kuò)增引物的策略是基于對(duì)所有BKV基因組序列和密 切相關(guān)病毒序列的多序列比對(duì)分析。設(shè)計(jì)該分析以便包括BKV的所有變體。也對(duì) 該分析進(jìn)行設(shè)計(jì)以排除任何密切相關(guān)但不是BKV的序列，如JCV序歹U。對(duì)這些比 對(duì)的仔細(xì)分析允許選擇覆蓋所有BKV變體的序列、但區(qū)分來(lái)自任何其它密切相關(guān) 屬的序列的寡核苷酸序列，從而允許BKV的屬特異性擴(kuò)增和廣泛檢測(cè)及鑒定。用 于BK1耙區(qū)域的引物和探針的序列如下
SEQIDNO.: 序列5'到3'
耙區(qū)域I (BK1)
SEQ ID NO:06 F~~AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTT
SEQ ID NO:07 R AAGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAA
SEQ ID NO:08 P TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAA
為了證實(shí)BKV的特異性檢測(cè)，對(duì)來(lái)自BKV樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序和分析。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與BKV序列比對(duì)良好，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物序列被鑒定為JCV 序列或者任何其它屬的序列。檢測(cè)結(jié)果顯示在圖2中。模板濃度范圍是每個(gè)反應(yīng) 50個(gè)拷貝到每個(gè)反應(yīng)50,000個(gè)拷貝，檢測(cè)一式兩份進(jìn)行。BK1檢領(lǐng)"斜率=-3.58， 截距=43.428, R2 = 0.997。
實(shí)施例3
耙區(qū)域IK"BK2")的鑒定對(duì)所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比較使 得能夠選擇BK2靶區(qū)域。BK2靶區(qū)域包括GenBank登錄號(hào)AY628224的核苷酸 1418 到 1545。 BK2 耙序列的核酸序列是
ACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。用于設(shè)計(jì)基于核酸擴(kuò)增的引物和探針的策略是基于對(duì)所有BKV序列和密 切相關(guān)病毒序列的多重序列比對(duì)的分析。設(shè)計(jì)該分析以包括所有的BKV變體。也 對(duì)該分析進(jìn)行設(shè)計(jì)以排除任何密切相關(guān)但非BKV的序列，如JCV序列。對(duì)這些比 對(duì)的仔細(xì)分析允許選擇覆蓋所有BKV變體序列、但區(qū)分來(lái)自任何其它密切相關(guān)屬 的序列的寡核苷酸序列，從而允許BKV的屬特異性擴(kuò)增和廣泛檢測(cè)及鑒定。用于 BK2耙區(qū)域的引物和探針的序列如下
SEQ ID NO.: 序列5'到3'
耙區(qū)域II (BK2) ~
SEQ ID NO:09 F~~TTGCCCCAGGAGGTGCTA
SEQ ID NO: 10 R TTTACTTCTAGGCCTGTACGGGA
SEQ ID NO: 11 P TCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGC為了證實(shí)BKV的特異性檢測(cè)，對(duì)來(lái)自BKV樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序和分析。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與BKV序列比對(duì)良好，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物序列被鑒定為JCV 序列或者任何其它屬的序列。檢測(cè)結(jié)果顯示在圖2中。模板濃度范圍是每個(gè)反應(yīng) 50個(gè)拷貝到每個(gè)反應(yīng)50,000個(gè)拷貝，檢測(cè)一式兩份進(jìn)行。BK2檢測(cè)斜率=-3.48， 截距=44.053和R2 = 0.999。
實(shí)施例4
靶區(qū)域III("BK3")的鑒定對(duì)所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比較允 許選擇BK3靶區(qū)域。BK3靶區(qū)域包括GenBank登錄號(hào)AY628224的核苷酸4097 到4560。 BK3靶序列的核酸序列是(SEQ IDNO:03)。用于設(shè)計(jì)基于核酸的擴(kuò)增引物和探針的策略是基于對(duì)所有BKV序列和密 切相關(guān)病毒的序列的多重序列比對(duì)的分析。設(shè)計(jì)該分析以包括所有的BKV變體。 也對(duì)該分析進(jìn)行設(shè)計(jì)以排除任何密切相關(guān)但非BKV的序列，如JCV序列。對(duì)這些 比對(duì)的仔細(xì)分析允許選擇覆蓋所有BKV變體的序列但區(qū)分來(lái)自任何其它密切相關(guān) 屬的序列的寡核苷酸序列，從而允許BKV的屬特異性擴(kuò)增和廣泛檢測(cè)及鑒定。用 于BK3靶區(qū)域的引物和探針的序列如下
SEQ ID NO.: 序列5'到3，
耙區(qū)域III (BK3)
SEQ ID NO: 12 F GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTT SEQ ID NO: 13 R TCATCACTGGCAAACATATCTTCATG SEQ ID NO: 14 P GTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCT為了證實(shí)BKV的特異性檢測(cè)，對(duì)來(lái)自BKV樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序和分析。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與BKV序列比對(duì)良好，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物序列被鑒定為JCV 序列或者任何其它屬的序列。檢測(cè)結(jié)果顯示在圖2中。模板濃度范圍是每個(gè)反應(yīng) 50個(gè)拷貝到每個(gè)反應(yīng)50，000個(gè)拷貝，檢測(cè)一式兩份進(jìn)行。BK3檢測(cè)斜率=-3.49， 截距=44.819和112 = 0.999。
實(shí)施例5
靶區(qū)域IV("BK4")的鑒定對(duì)所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比較允 許選擇BK4靶區(qū)域。BK4靶區(qū)域包括GenBank登錄號(hào)AY628224的核苷酸612到 864。 BK4耙序列的核酸序列是
TAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ IDNO:04)用于設(shè)計(jì)基于核酸的擴(kuò)增引物和探針的策略是基于對(duì)所有BKV序列和密 切相關(guān)病毒的序列的多重序列比對(duì)的分析。設(shè)計(jì)該分析以包括所有的BKV變體。 也對(duì)該分析進(jìn)行設(shè)計(jì)以排除任何密切相關(guān)但非BKV的序列，如JCV序列。對(duì)這些 比對(duì)的仔細(xì)分析允許選擇覆蓋所有BKV變體的序列、但區(qū)分來(lái)自任何其它密切相 關(guān)屬的序列的寡核苷酸序列，從而允許BKV的屬特異性擴(kuò)增和廣泛檢測(cè)及鑒定。 用于BK4靶區(qū)域的引物和探針的序列如下
SEQ ID NO.: 序列5'到3'
靶區(qū)域IV (BK4)
SEQIDNO:15~F~~ATGGGTGCTGCTCTAGCAC SEQIDNO:16R GTGGCTGAAATTGCTGCTGG SEQIDNO:17 P TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC為了證實(shí)BKV的特異性檢測(cè)，對(duì)來(lái)自BKV樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序和分析。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與BKV序列比對(duì)良好，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物序列被鑒定為JCV 序列或者任何其它屬的序列。檢測(cè)結(jié)果顯示在圖2中。模板濃度范圍是每個(gè)反應(yīng) 50個(gè)拷貝到每個(gè)反應(yīng)50,000個(gè)拷貝，檢測(cè)一式兩份進(jìn)行。BK4檢湖!l:斜率=-3.21， 截距=41.466和112 = 0.999。寡核苷酸引物和探針的分析靈敏度通過(guò)滴定已知濃度系列的DNA檢測(cè)和 用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計(jì)算而檢測(cè)。其顯示，檢測(cè)的分析靈敏度達(dá)到每個(gè)反應(yīng)管5個(gè)拷 貝或者更低。從樣品制備程序和體積調(diào)整方案校正，該分析靈敏度等同于每ml液 體臨床樣品中大約200個(gè)拷貝。在總共333個(gè)以前檢測(cè)的臨床樣品組上檢測(cè)引物/探針組。樣品組包括47 個(gè)已知的BKV陽(yáng)性(已檢測(cè))和286個(gè)已知的BKV陰性(未檢領(lǐng)'J)樣品。寡核苷酸引 物/探針組檢測(cè)所有47個(gè)陽(yáng)性樣品。而且，在284個(gè)陰性樣品中，其檢測(cè)34個(gè)為 BKV陽(yáng)性。為了證實(shí)那些"遺漏的"陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)28個(gè)樣品測(cè)序。所有28個(gè)測(cè) 序的擴(kuò)增產(chǎn)物被鑒定為BKV。剩余的6個(gè)樣品因?yàn)闃悠敷w積不足沒(méi)能夠被測(cè)序。 總之，通過(guò)新的引物/探針策略，至少10%的臨床陰性樣品被檢測(cè)為BKV陽(yáng)性， 并且通過(guò)測(cè)序證實(shí)為真陽(yáng)性。檢測(cè)這樣的真陽(yáng)性百分率的失敗可能是由變異位點(diǎn) 上的引物/探針錯(cuò)配或者PCR效率差或者上述二者造成的。
實(shí)施例6
靶區(qū)域V("BK5")的鑒定對(duì)所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比較允 許選擇BK5靶區(qū)域。BK5靶區(qū)域包括GenBank登錄號(hào)AY628224的核苷酸2810 到2895。 BK5靶序列的核酸序列是CTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC(SEQ ID NO:05)。
用于設(shè)計(jì)基于核酸的擴(kuò)增引物和探針的策略是基于對(duì)所有BKV序列和密 切相關(guān)病毒序列的多重序列比對(duì)的分析。設(shè)計(jì)該分析以包括所有的BKV變體。也 對(duì)該分析進(jìn)行設(shè)計(jì)以排除任何密切相關(guān)但非BKV的序列，如JCV序歹ij。對(duì)這些比 對(duì)的仔細(xì)分析允許選擇覆蓋所有BKV變體的序列、但區(qū)分來(lái)自任何其它密切相關(guān) 屬的序列的寡核苷酸序列，從而允許BKV的屬特異性擴(kuò)增和廣泛檢測(cè)及鑒定。用 于BK5耙區(qū)域的引物和探針的序列如下
SEQIDNO.: 序列5'到3'
耙區(qū)域V (BK5)
SEQIDNO: 18~ ~~GGGCTGAAGTATCTGAG
SEQIDNO:19R CAGTGCTTGATCCATGTC
SEQ ID NO:20 P CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG為了證實(shí)BKV的特異性檢測(cè)，對(duì)來(lái)自BKV樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序和分析。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與BKV序列比對(duì)良好，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物序列被鑒定為JCV 序列或者任何其它屬的序列。檢測(cè)結(jié)果顯示在圖2中。模板濃度范圍是每個(gè)反應(yīng) 50個(gè)拷貝到每個(gè)反應(yīng)50,000個(gè)拷貝，檢測(cè)一式兩份進(jìn)行。BK5檢領(lǐng)"斜率=-3.61， 截距=47.324和112 = 0.994。上述結(jié)果和論述顯而易見地說(shuō)明，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)BK病毒以及區(qū) 分不同BK病毒基因型或者毒株的重要的新方法。同樣地，本方法和系統(tǒng)在各種不 同應(yīng)用，包括研究、醫(yī)學(xué)、治療、診斷、軍事和其它應(yīng)用中有用。因此，本發(fā)明 表現(xiàn)出了對(duì)本領(lǐng)域的重要貢獻(xiàn)。盡管本發(fā)明針對(duì)其具體實(shí)施方式
進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解， 可以進(jìn)行各種變化并且可以替換為等同物，而不偏離本發(fā)明的真正精神和范圍。 另外，可以進(jìn)行許多修改，使得具體的情況、材料、物質(zhì)組分、方法、處理步驟 或者多個(gè)步驟適應(yīng)于本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有的這樣的修改意圖包含在 所附權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 檢測(cè)樣品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的樣品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第一核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGCTGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT(SEQ ID NO01)，其中，所述第一核酸的5′端和3′端包含在SEQ ID NO01內(nèi)；其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的檢測(cè)表明，所述樣品含有BKV核酸。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述檢測(cè)是通過(guò)基于核酸的擴(kuò)增進(jìn)行的。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度是大約30個(gè)核苷酸或以下。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一歩包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣品 中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序 列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。
5.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一歩包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸AATACAGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTA GGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAAT CTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAA ATCTTCATCCCATTTTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCT TCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ IDNO:03)。
6. 權(quán)利要求1所述的方法,進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣品 中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTG AGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGG AGGCTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAG AGGGCATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)。
7. 權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣品 中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序 列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸-GTGCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)。
8. 檢測(cè)樣品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括 檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的樣品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第一核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸-TAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTG TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)， 其中，所述第一核酸的5'端和3'端包含在SEQ ID NO:02內(nèi)； 其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的檢測(cè)表明，所述樣品含有BKV核酸。
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述檢測(cè)是通過(guò)基于核酸的擴(kuò)增進(jìn)行的。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度是大約30個(gè)核苷酸或 者以下。
11. 權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTG CTGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGG TACCACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGT AAGTAAT (SEQ ID NO:Ol)。
12.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述耙序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸GGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATTCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)。
13.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸AGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)。
14.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCA
15.檢測(cè)樣品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括 檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的樣品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第 一核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸-ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGGCTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)，其中，所述第一核酸的5'端和3'端包含在SEQ ID NO:04內(nèi)； 其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的檢測(cè)表明，所述樣品含有BKV核酸。
16. 權(quán)利耍求15所述的方法，其中所述檢測(cè)是通過(guò)基于核酸的擴(kuò)增進(jìn)行的。
17. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度是大約30個(gè)核苷酸或 者以下。
18. 權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述耙序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸AAGTAAT (SEQ ID NO:Ol)。
19.權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸GGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATTCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)。
20. 權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGC TAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTG TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。
21. 權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCA GTGCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)。
22. 檢測(cè)樣品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括 檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的樣品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第一核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ)序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸-GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCA其中，所述第一核酸的5'端和3'端包含在SEQ ID NO:05內(nèi)； 其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的檢測(cè)表明，所述樣品含有BKV核酸。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述檢測(cè)是通過(guò)基于核酸的擴(kuò)增進(jìn)行的。
24. 權(quán)利要求23所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度是大約30個(gè)核苷酸或 者以下。
25. 權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸CTGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGG AAGTAAT (SEQ ID NO:01)。
26. 權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸TGAAAGTTACAGAATATTTTTCCATAAGTTTTTTATACAGAATTTGAGCAATACAGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATCTTCATCCCATTTTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCT TCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)。
27.權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。
28. 權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)被懷疑具有BKV核酸的所述樣 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互補(bǔ) 序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸AGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGG AGGCTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTT TGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)。
29. 試劑盒，其包括適于產(chǎn)生靶區(qū)域I、 II、 III、 IV或者V中的一種或者多種 的核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)。
30. 權(quán)利要求29所述的試劑盒，進(jìn)一步包括用于檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。
31. 權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括用于產(chǎn)生至少兩種靶區(qū) 域的擴(kuò)增產(chǎn)物的至少兩對(duì)引物。
32. 下述序列的至少20個(gè)相鄰核苷酸的分離核酸T(SEQIDNO:01)，或者其互補(bǔ)序列，其中所述核酸的長(zhǎng)度不超過(guò)大約151個(gè)核苷 酸；(ii)TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGT ACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)或者其互補(bǔ)序列，其中所述核酸的長(zhǎng)度不超過(guò)大約128個(gè)核苷酸；(iii)ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATC TGAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGA(SEQ IDNO:04)，或者其互補(bǔ)序列，其中所述核酸的長(zhǎng)度不超過(guò)大約253個(gè)核苷酸; (iv)GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATT者其互補(bǔ)序列，其中所述核酸的長(zhǎng)度不超過(guò)大約86個(gè)核苷酸。 °
33.權(quán)利要求32所述的分離核酸，其中所述核酸被可檢測(cè)地標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于快速、靈敏和高度特異性地基于核酸(例如，基于DNA)檢測(cè)樣品中的BK病毒的方法和組合物。一般地，所述方法涉及檢測(cè)具有BK病毒基因組保守區(qū)域的靶序列的靶核酸。本發(fā)明也表征了用于本發(fā)明方法的組合物和試劑盒，所述組合物包括引物、探針。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101511995SQ200680034771
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2006年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者F·陳, J·陳, L·I·孔, M·捷納提保 申請(qǐng)人:焦點(diǎn)診斷公司